Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эритроцит как переносчик антрациклинового антибиотика Митоксантрона и антигемофильного препарата фактора IX системы свертывания крови "Aimafix D.I."

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Эритроцит как переносчик антрациклинового антибиотика Митоксантрона и антигемофильного препарата фактора IX системы свертывания крови "Aimafix D.I.""

На правах рукописи

Вуймо Татьяна Алексеевна

"Эритроцит как переносчик антрациклинового антибиотика Митоксантрон и антигемофильного препарата фактора IX системы свертывания крови "Атайх

Б.!."

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2009 0034В21

003462178

Работа выполнена в Государственном учреждении Гематологический Научный Центр Российской Академии Медицинских Наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Ф.И. Атауллаханов

Официальные оппоненты:

Бирюкова Людмила Семеновна, доктор медицинских наук; руководитель отдела скорой медицинской помощи, полиорганной патологии и гемодиализа; ГУ Гематологический Научный центр РАМН

Рябых Татьяна Павловна, доктор биологических наук; ГУ Российский Онкологический Научный Центр им. Н.Н Блохина РАМН.

Ведущая организация:

НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе

Защита состоится «_»_2009 г. в_

На заседании Диссертационного совета Д.001.042.02. при ГУ Гематологический Научный Центр РАМН по адресу: 125167, г. Москва, Новый Зыковский проезд, д. 4а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ ГНЦ РАМН. Автореферат Разослан «_»_2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д.001.042.02.

кандидат медицинских наук

Зыбунова Е.Е.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В современной фармакологии все более отчетливо проявляются две ведущие тенденции: (1) создание методов направленной («адресной») доставки фармакологических препаратов и (2) разработка новых лекарственных форм, создающих в организме человека депо фармакологических препаратов, обеспечивающих постепенное высвобождение лекарства в необходимой дозировке, получение пролонгированного эффекта, повышение терапевтической эффективности препарата, а также снижение его токсичности.

Огромную роль в решении этих задач играют переносчики лекарственных средств. Они позволяют защитить лекарство от преждевременного разрушения и инактивации ретикулоэндотелиальной системой организма; предотвратить или уменьшить иммунные и аллергические реакции организма на введенный препарат; осуществлять его направленный транспорт в органы и ткани-мишени.

Одной из важнейших предпосылок в успешном применении различных лекарственных препаратов, фармакологически или физиологически активных веществ является их специфичность. Однако большая часть этих лекарственных соединений взаимодействует также и со значительным числом неспецифических мишеней. Это обстоятельство было наглядно продемонстрировано на примере химиотерапии онкологических заболеваний. Медленный прогресс в этой области является следствием неспособности практически всех цитотоксических веществ действовать исключительно на злокачественные клетки [Гаузе Г.Ф., Дудник Ю.В., 1987]. Низкая селективность лекарственного препарата требует повышения дозы вводимого вещества, чтобы обеспечить его терапевтическую эффективность. Это приводит к усилению общего токсического действия препарата на организм и часто сопровождается развитием лекарственной устойчивости опухолевых или патологически измененных клеток к стандартным формам препарата. «Включение» лекарства в несущие микрокапсулы или аутологичные клетки-носители снижает пиковые концентрации свободного препарата в крови в момент введения, что понижает его токсическое действие, а также способствует снижению иммунного ответа организма на препарат, т.е. препятствует быстрому развитию устойчивости по отношению к введенному лекарству.

Переносчики лекарственных препаратов должны удовлетворять всем требованиям, которые предъявляются к любым веществам, вводимым в

организм. Они должны быть нетоксичны, не иметь, или иметь минимальные побочные эффекты и быть способными к биодеградации - разложению и выведению продуктов переработки переносчика системами организма. В этом отношении одними из самых перспективных переносчиков являются собственные клетки организма, и, в первую очередь, эритроциты. Они легко могут быть выделены из крови, где присутствуют в больших количествах, обладают достаточно длительным временем жизни и, по мере старения, подвергаются в организме естественному процессу биодеградации. Таким образом, эритроциты являются перспективными носителями лекарственных препаратов, которые, в зависимости от поставленных задач, могут обеспечить пролонгированность действия лекарства, снижение его токсичности или иммунного ответа организма на введенный препарат. Все это делает задачу разработки новых лекарственных форм на основе эритроцитов-носителей очень перспективной и актуальной.

Цель работы.

Цель работы - создание на основе эритроцитов новых лекарственных форм противоопухолевого антрациклинового антибиотика митоксантрона (Мтн), а также антигемофильного препарата фактора IX системы свертывания крови.

Задачи исследования

1. Разработка оптимальных методов введения данных препаратов в эритроциты.

2. Изучение эффективности «загрузки» и скорости освобождения митоксантрона из эритроцитов-носителей (фармакоцитов).

3. Изучение повреждающего воздействия «загрузки» митоксантрона на эритроциты-носители.

4. Сравнительное исследование фармакокинетики препарата фактора IX, введенного в организм стандартным образом в виде внутривенной инъекции, или внутри эритроцитов-носителей.

Научная новизна

Созданы новые лекарственные формы двух, совершенно различных по химической природе препаратов - противоопухолевого антибиотика

митоксантрона и антигемофильного препарата фактора IX системы свертывания крови. Оба препарата были успешно «включены» в эритроциты.

Разработаны методы, позволяющие в каждом из данных случаев получать фармакоциты, обладающие достаточно продолжительным временем жизни, которые освобождают лекарственный препарат в кровоток постепенно, обеспечивая, таким образом, пролонгированность его действия.

Исследование сравнительной фармакокинетики традиционной и новой лекарственных форм препарата фактора IX показало, что время циркуляции этого фактора в кровяном русле увеличивается при «включении» препарата в эритроциты в 5-10 раз.

В случае применения антибиотика митоксантрона, в фармакоциты может быть «включена» доза лекарства, превышающая ту одноразовую дозу, которую пациент получает обычно при стандартном способе введения препарата. При этом т.к. фармакоциты с препаратом внутри обладают достаточным временем жизни, а препарат освобождается их клеток-носителей постепенно, удается не только получить пролонгированную форму лекарства, но и снизить кардиотоксичность препарата, которая возникает обычно за счет высокой пиковой концентрации свободного лекарства в момент введения [Herman Е.Н et al., 1997].

Практическая ценность работы

Разработаны новые внутриэритроцитарные лекарственные формы синтетического антибиотика митоксантрона и антигемофильного фактора IX системы свертывания крови, позволяющие пролонгировать действие этих лекарственных препаратов по сравнению с введением аналогичной дозы соответствующего лекарственного препарата стандартным путем. В случае митоксантрона возможно также повысить дозу вводимого вещества с одновременным снижением его кардиотоксичности. Это позволяет использовать данный препарат у пациентов с выраженными сердечными или почечными нарушениями, что невозможно для стандартной лекарственной формы препарата. Уменьшение количества и частоты инъекций, необходимых для поддержания терапевтического уровня концентраций лекарственного препарата в крови, снижает общий расход лекарства, необходимого для проведения курса терапии, и улучшает качество жизни пациентов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Разработаны методы «включения» в эритроциты синтетического аналога антибиотиков антрациклинового ряда - митоксантрона и антигемофильного препарата фактора IX.

2. «Загруженный» в эритроциты митоксантрон способен постепенно освобождаться из клеток-носителей, что позволяет создать на их основе пролонгированную форму лекарства.

3. «Включение» терапевтической дозы митоксантрона в эритроциты практически не повреждает клетки-носители. При концентрациях препарата в клетках в 10 раз превышающих ту, что возникает при «загрузке» единичной терапевтической дозы, повреждающее воздействие антибиотика на клетки все еще остается достаточно слабым.

4. На основе изучения фармакокинетики свободной и «загруженной» в эритроциты формы биотинилированного фактора IX показано, что при «включении» препарата в клетки-носители срок его жизни в кровотоке увеличивается в 5-10 раз.

Апробация работы состоялась 11.12.2008 г. на заседании проблемной комиссии №6 «Биохимия, биофизика и реология крови» ГУ Гематологического научного центра РАМН.

Материалы диссертации были представлены на ряде российских и международных научных конференций: Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 14-18 марта 2005, Москва, Россия; IV Московский международный конгресс «Биотехнология и медицина»,14-17 марта 2006, Москва, Россия; VI Международная молодежная конференция ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика», 23-24 ноября 2006, Москва, Россия; 11-я Пущинская международная школа-конференция молодых ученых «Биология -наука XXI века», 29 октября - 2 ноября 2007, Пущино, Россия; 7th Central European Symposium on Pharmaceutical Technology and Biodelivert Systems., 1820 Sept., 2008, Ljubljna, Slovenia; Gordon Research Conferences «Drug Carriers in Medicine and Biology», 24-29 Aug., 2008, B.S., Montana, USA.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 4 статьи и 6 тезисов в сборниках трудов отечественных и международных конференций.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 70 страницах машинописного текста и состоит из следующих основных разделов: введение; литературный обзор (содержит 4 рисунка); постановка задачи; материалы и методы; результаты (содержит 10 рисунков и 4 таблицы); обсуждение; заключение; выводы и список цитированной литературы -110 источников- из них 16 русскоязычных.

Диссертационная работа выполнена в ГУ ГНЦ РАМН (лаборатория физической биохимии системы крови; заведующий лабораторией д.б.н., профессор Ф.И. Атауллаханов).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Литературный обзор

Представлен обзор литературных данных о возможности использования различных типов переносчиков для адресной доставки и создания пролонгированных форм лекарственных препаратов. Рассмотрены 4 группы переносчиков: адъюванты, макромолекулы, липосомы и другие микрокапсулы, эритроциты. Отмечены преимущества и недостатки их применения в сравнении со стандартными формами препаратов. Рассмотрены способы получения эритроцитов, нагруженных лекарственными препаратами. Приведены сведения о синтетическом аналоге антибиотиков антрациклинового ряда - митоксантроне (Мтн) и факторе IX системы свертывания крови.

Материалы и методы

Во всех экспериментах непосредственное участие принимала Александрович Ю.Г.

Использованные в работе эритроциты были выделены стандартным методом из крови здоровых доноров (для «включения» митоксантрона), а также из аутологичной крови (для работ по «включению» препарата фактора IX).

Для изучения кинетики «загрузки» митоксантрона в эритроциты, готовили растворы митоксантрона разной концентрации в забуференном фосфатом изотоническом солевом растворе (PBS). Отмытые эритроциты смешивали с раствором митоксантрона (конечная концентрация от 0.06 до 14.0

мг/мл суспензии) и инкубировали суспензию в течение определенного времени. Гематокрит суспензии (10%, 40% или 70%), температуру (7°С, 21°С или 37°С) и длительность инкубации (1-2 часа) варьировали в зависимости от задачи. В процессе инкубации отбирали пробы суспензии для определения концентрации митоксантрона в инкубационной среде и внутри эритроцитов. Для этого использовали хлороформные экстракты супернатанта эритроцитарной суспензии или лизата эритромассы «загруженных» препаратом клеток. Концентрацию митоксантрона в экстрактах определяли спектрофотометрически на длине волны 682 нм.

Для измерения выхода митоксантрона из «загруженных» эритроцитов препарат сначала «загружали» в клетки методом прямой инкубации суспензии эритроцитов (Ht 40%) с Мтн, растворенным в PBS в концентрации 0.06 мг/мл, в течение 1 часа при 37°С. Измеряли содержание препарата в супернатанте и нагруженных эритроцитах. После этого суспензию центрифугировали 10 мин при I250g и комнатной температуре, снимали супернатант и доливали свежий буфер до исходного объема. Через 1 час инкубации при 37°С повторяли измерения концентрации препарата в эритроцитах и новом супернатанте. Производили очередную смену буфера, а еще через час инкубации снова измеряли концентрации прапарата в супернатанте и эритроцитах.

Повреждающее воздействие митоксантрона на эритроциты определяли двумя методами: по степени гемолиза «загруженных» препаратом клеток и по изменению распределения клеток по плотностям в присутствии разных концентраций митоксантрона. 1). Суспензию эритроцитов, «загруженных» различными концентрациями Мтн, в PBS (Ht 40%) инкубировали 2-4 часа при 37°С и определяли степень гемолиза клеток по выходу свободного гемоглобина (НЬ) в среду. Концентрацию гемоглобина определяли спектрофотометрически при длине волны 415 нм. 2) Распределение эритроцитов по плотностям для исходных ненагруженных клеток, прошедших процедуру 3-х часовой инкубации в PBS при 37°С без препарата (контроль), а также для эритроцитов, инкубированных аналогичным образом в PBS, содержащем Мнт в концентрации 0.06 мг/мл (концентрация, соответствующая терапевтической дозе) или 0.6 мг/мл измеряли фталатным методом [Danon Marikovsky V., 1964], используя серию смесей фталатов с разными плотностями.

Биотинширование препарата фактора IX и определение степени биотинилирования белка проводили согласно методике фирмы Pierce. [Hermanson G.T., 1996]. При этом содержимое 5 флаконов препарата "AIMAFIX D.I. 500 I.U." растворяли в 5 мл деионизованной воды и подвергали диализу

против PBS в течение 12 часов при температуре 4°С. Концентрацию белка в полученном растворе доводили с помощью PBS до 2 мг/мл, после чего добавляли по 10 мкл/мл раствора N-гидроксисукцинимидобиотина в диметилформамиде (исходная концентрация 10 мг/мл). Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч, затем концентрировали с помощью центрифугирования в присутствии непроницаемой для белка мембраны и стерилизовали, пропуская через фильтр с диаметром пор 0.22 мкм. Объем раствора препарата после диализа и стерилизации составил около 3 мл, а концентрация белка в нем, измеренная методом Lowry, была равна 5.8 мг/мл.

В основу методики определения степени биотинилирования положен процесс вытеснения биотином 4-гидроксиазобензен-2-карбоксиловой кислоты (HABA) из ее комплекса с авидином [Gitlin G., Bayer Е.А., Wilchec М., 1987]. Концентрацию комплекса НАВАд-авидин измеряли спектрофотометрически на планшетном инструменте Microplate Reader Benchmark, Bio-Rad (/^„=500 nm, £5oonm=34000 iVr'cm"'). Для препарата фактора IX степень биотинилирования (количество молекул биотина, связанных с одной молекулой белка) составила 1:4, т.е. на одну молекулу белка связывалось примерно 4 молекулы биотина.

«Включение» препарата биотиттироеанного фактора IX (фактор 1X¡,IM) в эритроциты проводили методом ступенчатого диализа [Синауридзе Е.И., 1988; Sinauridze E.I. et al, 1992] в полностью стерильных условиях. В диализный мешок помещали 2 мл отмытой эритромассы (Ht 88%) и 0.8 мл биотинилированного фактора IX (5.8 мг/мл) разбавленного в растворе PBS, содержащего 5 мМ глюкозы. Мешок помещали в стакан с мешалкой, содержащий 200 мл охлажденного до +4°С гипоосмотического буфера (pH 7.45), содержащего 12.5 мМ КН2Р04, 5 мМ MgCl2, 12.5 мМ глюкозы и 3.75 мМ аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ). Для доведения pH был использован раствор гидроксида калия. Диализ проводили при +4°С. После 20 мин диализа в стакан с буфером добавляли 60 мл стерильной дистиллированной воды и диализ продолжался еще 20 мин. Процесс повторяли. На каждой ступени диализный мешок с эритроцитарной массой выдерживали при определенной концентрации внешнего буфера в течение 20 минут. Суммарно делали 5 добавлений дистиллированной воды, после чего объем диализующего буфера стал равным 500 мл, т.е. концентрации всех составляющих буфера уменьшились в 2.5 раза.

После этого проводили "запечатывание" эритроцитов с фактором 1ХЫ01 внутри. Для этого диализный мешок переносили в 200 мл предварительно нагретого изоосмотического буфера (pH 7.45) и инкубировали 1 час при 37°С. В состав изоосмотического буфера входили 10 мМ КН2РО4/КОН, 2мМ MgCl2,145

MMNaCl, 10 мМ глюкозы и 5 мМ аденозина. Полученные эритроциты-носители переносили в стерильную пробирку, отделяли от супернатанта, а потом отмывали 3-4 раза стерильным физиологическим раствором путем центрифугирования (10 минут, 1250g) до полного отсутствия следов гемоглобина в супернатанте.

Изучение фармакокинетики фактора Щы, вводимого внутривенно в виде раствора или в эритроцитах-носителях, проводили на здоровых добровольцах (возраст 23-57 лет), давших информированное согласие на проведение исследований. Для 4 участников экспериментов фактор IXbiot был «включен» в аутологичные эритроциты. Двое получили внутривенную инъекцию стандартной формы препарата в растворе. Как исходный раствор биотинилированного фактора, так и суспензии фармакоцитов, содержащие этот фактор, были перед введением разбавлены в 2 раза стерильным физиологическим раствором. Пробы крови (по 1 мл из локтевой вены) для анализа содержания фактора IXbiot в плазме и в эритроцитах пациентов отбирали до, а также через различные промежутки времени после введения препарата (максимально до 15 суток). Пробы центрифугировали (10 мин, 1250g) и отделяли плазму. Эритроциты лизировали в деионизованной воде в соотношении суспензия эритроцитов: вода=1:4 в течение 20 мин, а затем полученный раствор подвергали процедуре замораживания с последующим оттаиванием. Полученные лизаты центрифугировали (10 мин, 12000 g) для удаления обломков мембран разрушенных клеток. До проведения анализа плазмы и лизаты хранили замороженными при -32°С.

Измерения концентрации фактора 1Хы01 в образцах плазмы или лизатах эритроцитов, полученных при изучении фармакокинетики этого препарата, проводили с помощью сэндвич-метода ELISA в присутствии 1 мМ ингибитора протеаз PMSF с использованием моноклональных мышиных антител к фактору IX, конъюгата стрептавидина со щелочной фосфатазой и 0.1% пара-нитрофенилфосфата как субстрата. Измерение оптической плотности в лунках планшета проводили на многоканальном спектрофотометре (Microplate Reader Benchmark, Bio-Rad) при длине волны 405 нм.

Результаты

«Загрузка» митоксантрона в эритроциты

При проведении экспериментов по «включению» митоксантрона в эритроциты методом простой инкубации клеток в среде с препаратом было показано, что при всех использованных концентрациях (от 0.06 до 14.0 мг/мл

суспензии) препарат уходит из среды в эритроциты достаточно эффективно (рис. 1).

При подборе оптимальных условий «загрузки» Мтн была изучена зависимость кинетики входа антибиотика в эритроциты от температуры и гематокрита суспензии. Эксперименты проводили в суспензии с исходной концентрацией препарата 0.06 мг/мл суспензии либо при гематокрите 40% и температурах: 7°С, 21°С и 37°С, либо при температуре 37°С, и различных гематокритах (10%, 40% и 70%). Было показано, что скорость входа Мтн в эритроциты увеличивается при повышении температуры. Оптимальной для «загрузки» антибиотика в эритроциты является температура 37°С.

«Включение» Мтн в эритроциты зависит и от гематокрита. При этом, хотя концентрации Мтн, достигаемые внутри эритроцитов, выше при более низком гематокрите, высокие значения гематокрита позволяют получить более полное суммарное «включение» препарата в клетки (таблица 1).

Время, мин Время, мин

Рис. Кинетика входа Мтн в эритроциты при разных начальных концентрациях препарата в суспензии (мг/мл суспензии): 1 - 0.06 мг/мл; 2- 0.08 ; 3 - 0,12 мг/мл; 4 - 0,16 мг/мл; 5 - 0,45 мг/мл; 6 - 1,75 мг/мл; 7 - 3,5 мг/мл; 8-7 мг/мл; 9-14 мг/мл. Гематокрит суспензии 40%; температура инкубационной среды 37°С; п=5.

Таблица 1. «Включение» митоксантрона в эритроциты при различных гематокритах исходной суспензии.

Гематокрит суспензии, % С эритр., мг/мл клеток С среда, мг/мл среды М эритр., мг М среда, мг «Включение» препарата*', %

10 0.1730 0.0380 0.1730 0.3420 28.8

40 0.1260 0.0054 0.5070 0.0324 84.5

70 0.0746 0.0038 0.5220 0.0114 87

С эритр. - концентрация препарата в эритроцитах после 1 часа инкубации; С среда - концентрация препарата в супернатанте после 1 часа инкубации; М эритр. - суммарное количество Мнт в эритроцитах после 1 часа инкубации; М среда - суммарное количество препарата оставшегося в супернатанте после 1 часа инкубации;

*) Суммарное «включение» препарата в процентах от исходного количества препарата в опыте.

Выход депонированного митоксантрона из эритроцитов-носителей Для этих экспериментов эритроциты предварительно нагружали Мтн в суспензии с гематокритом 40%, при концентрации антибиотика 0.06 мг/мл суспензии, путем инкубации 1 час при 37°С. Подробная методика проведения данных экспериментов приведена в главе «Материалы и методы». Результаты измерения концентрации Мтн в среде после последовательных смен буфера представлены на рис. 2. Из рисунка видно, что препарат достаточно прочно удерживается эритроцитами. После смены буфера быстро достигается новое равновесие в распределении препарата между клетками и средой. При этом новая стационарная концентрация препарата в среде через 1 час после каждой смены буфера составляет примерно 17.4-18 % от суммарной концентрации препарата в системе.

Н'

а 6

Время, мин

Рис. 2. Кинетика выхода Мтн из фармакоцитов при смене буферной среды. Температура инкубации 37°С, Н1 40%, концентрация Мтн в сруспензии при исходной «загрузке» препарата 0.06 мг/мл, п=4.

Влияние присутствия митоксантрона на сохранность эритроцитов Для изучения повреждающего воздействия митоксантрона на мембрану клеток-носителей, эритроциты были сначала «загружены» в присутствии различных концентраций антибиотика в суспензии (от 0.06 до 14.0 мг/мл) (Ht 40%, 1 час инкубации при 37°С). Полученные фармакоциты далее инкубировали при 37°С в течение 2-4 часов в PBS. Измеряли скорость гемолиза нагруженных клеток по выходу свободного гемоглобина в инкубационную среду. Полученные результаты представлены на рис. 3. Видно, что при очень высоких исходных концентрациях Мтн (7.0 и 14.0 мг/мл суспензии), выход свободного гемоглобина с первых же минут превысил допустимые при трансфузиях пределы (0.8% от общего НЬ при переливании одной дозы эритроцитов (Жибурт Е.Б., 2002) в 2 и более раза, а для концентраций в интервале 0.06 - 3.5 мг/мл суспензии выход свободного НЬ оставался в пределах допустимого в течение, по крайней мере, 2 час.

0.50,

Ул 045 и 5

ш*8 о«.

е 2

о £

° 035

изо

Зо

юн

со

015

с? 15 а> п О.Х О X

"*§ 10. £ г

И ^

§1 г»:

щЮ о О

40 60 80 100 120 Врелгс, ми

Рис. 3. Кинетики выхода свободного гемоглобина при гемолизе «загруженных» фармакоцитов при различных концентрациях Мтн в суспензиях при «загрузке» (в мг/мл суспензии): К - 0 (суспензия эритроцитов, предварительно проинкубированная 1 час при 37°С в отсутствии Мтн в среде); 1 - 0.06 мг/мл; 2 - 0.6 мг/мл; 3-0.12 мг/мл; 4 - 0,16 мг/мл; 5 - 0,45 мг/мл; 6 - 1,75 мг/мл; 7 - 3,5 мг/мл; 8-7 мг/мл; и 9- 14 мг/мл суспензии. Температура инкубационной среды 37°С, Ш 40%, п=4.

60-

1,06 1,07 1,08 1,09 1,10 1,11 1,12

плотность, г/мп

Рис. 4. Дифференциальное распределение нагруженных Мнт эритроцитов по плотностям. Концентрации Мтн в суспензии при «загрузке» эритроцитов составляли: □ - 0 мг/мл суспензии (контроль); • - 0,06 мг/мл суспензии; ▲ - 0,6 мг/мл суспензии. (п=6). Пуиктиром указан уровень плотности, соответствующий критическому увеличению объема эритроцитов (30-35%), после которого клетка подвергается гемолизу.

Изучение влияния Мнт на распределение эритроцитов по плотностям (стандартным методом Данон и Мариковского) показало, что распределение для

клеток в суспензии с терапевтической дозой препарата практически не отличается от распределения эритроцитов в контрольной суспензии, тогда как при 10-кратном увеличении концентрации антибиотика наблюдается смещение распределения в область меньших плотностей (рис. 4), т.е. в клетки начинает входить вода, их объем увеличивается, а плотность снижается.

«Включение» биотиншированного фактора IX в эритроциты При «включения» препарата фактора 1ХЬю, в эритроциты 5 различных доноров добровольцев (таблица 2), было показано, что объем получающихся «загруженных» эритроцитов (в % от объема исходной эритроцитной массы) Таблица 2. Параметры процедуры «включения» биотинилированного препарата фактора IX («Атайх Э.и. 500 Ш.») в эритроциты различных доноров.

№ V»» ^фарм г 3> г\ 4> ^■фарм Выход фармакоцитов

(мл) (мл) (мкг/мл) (мкг/мл)

по объему3' по концентрации запечатанного белка6'

1 2.0 1.2 1246 400 60 32.1

2 2.0 1.0 1657 300 50 18.1

3 2.0 1.3 1657 260 65 15.7

4 2.0 1.2 1657 280 60 16.9

5 2.0 0.8 669 260 40 38.9

Среднее+среднеквадратичное отклонение (п=5) 50±10 24.3+10.5

Объем исходной эритроцитной массы (мл). Объем полученных фармакоцитов (мл).

Концентрация препарата фактора 1Хы0| в среде при инкубации (мкг/мл). Концентрация препарата фактора 1Хы01 в лизате фармакоцитов (мкг/мл). В % от объема исходных эритроцитов. В % от концентрации белка в инкубационной среде.

составил в среднем 55.0±10.0%, при этом концентрация препарата в лизате готовых фармакоцитов составляла в среднем 24.3±10.5% от концентрации исходного белка в среде при инкубации.

Изучение фармакокинетики препарата биотиншированного фактора IX, введенного внутривенно в виде раствора

и

2)

3)

4)

5)

6)

В качестве контроля, фактор 1Хы01 был введен двоим добровольцам внутривенно стандартным способом в виде раствора (в количествах 1080 и 1160 мкг). На рис.5 А представлены кривые изменения концентрации фактора 1Хы<* в обеих контрольных плазмах в различные времена после введения препарата. Концентрации выражены в процентах от максимальной, наблюдаемой в ходе опыта для каждого из добровольцев. В обоих случаях концентрация определяемого препарата в плазме резко повышается сразу после введения препарата, а затем начинает падать. Снижение содержания препарата достаточно хорошо описываются одной экспоненциальной кривой. Для расчета времен полувыведения фактора 1Хьы были построены прямые в полулогарифмических координатах, приведенные на рис. 5 Б. Рассчитанная из этих данных усредненная величина Х\а составила 8.8±5.6 часа.

100

* 80-

а 601 л

■в- 40-

и*

э— Контроль 1 * - Контроль 2

0 8 16 24 32 40 48 Время, ч

о 3.6

12 16 20 24 Врея, ч

Рпс.5. Выведение из плазмы биотинилированного фактора IX, введенного добровольцам в виде раствора. А - Изменения концентраций фактора 1Хы01 в контрольных плазмах в ходе экспериментов. Б - Зависимость величины логарифма плазменной концентрации фактора 1Хы„, от времени.

Изучение фармакокинетики препарата биотинилированного фактора IX, «включенного» в эритроциты

Фармакокинетика «включенного» в эритроциты фактора 1Хъю( была изучена у четырех добровольцев, каждый из которых получил внутривенное вливание

100 150 200 250 300 350 400 Время, ч

100 150 200 250 300 350 400 Время, ч

Рис. 6. Изменение концентрации фактора 1Хы0! в плазме добровольцев, получивших внутривенную инъекцию суспензии фармакоцитов, содержащих препарат биотинштированного фактора IX. За 100% принята максимальная концентрация фактора Иыо! в плазме каждого из добровольцев, наблюдавшаяся во время эксперимента.

суспензии аутологичных эритроцитов с «включенным» митоксантроном. Объем перелитой суспензии составлял 1.5-2.4 мл, гематокрит был доведен до 50% стерильным физиологическим раствором. Суммарное количество введенного фактора при этом составляло от 210 до 400 мкг. Концентрации фактора 1ХЬю, были определены в плазмах и лизатах эритроцитов каждого из добровольцев в различные времена после введения фармакоцитов (рис. 6 и рис. 7). Величины концентраций представлены в % от максимальных, наблюдаемых в опыте.

л о.

40 О Е0 100 160 200 250 300 360 400

-60 0 60 100 160 200 260 300 360 400 Время, ч

Рис. 7. Изменение концентрации фактора 1Хы0> в лизатах эритроцитов четырех добровольцев, которым фактор 1Хы01 был введен внутривенно в виде фармакоцитов. За 100% принята максимальная концентрация фактора 1Хы« в эритроцитах каждого из добровольцев, наблюдавшаяся во время эксперимента.

Расчет времени полувыведения фактора УХ^ «включенного» в эритроциты, показал, что во всех случаях снижение концентрации фактора Щм в лизатах эритроцитов, достаточно хорошо описывается одной экспоненциальной кривой. Как видно из графиков (рис. 8), экспериментальные точки хорошо ложатся на прямую в полулогарифмических координатах зависимости логарифма концентрации фактора 1Хь)01 от времени. Рассчитанные из этих данных времена полувыведения фармакоцитов, нагруженных препаратом фактора 1Хы0ь приведены в таблице 3.

А

Рис. 8. Зависимости величин логарифмов концентрации фактора 1Хыы от времени в лизатах эритроцитов четырех добровольцев, получивших инъекцию суспензии фармакоцитов.

Таблица 3. Количество фактора 1Хы01, введенного добровольцам в фармакоцитах, и время его полувыведения

Введенный фактор 11/2, 11/2

Доброволец 1ХЬш1, мкг часов (среднсе±80),

часов

А 400 94.2 73.9±16.0

Б 210 71.1

В 312 55.2

Г 308 75.2

Снижение концентрации фактора Кы« в плазмах добровольцев не подчинялось уравнению первого порядка. При этом в ряде случаев концентрация фактора удерживалась на постоянном уровне на протяжении примерно 6 суток, после чего начинала убывать (рис. 6). Концентрации фактора 1ХЫо1 в плазмах оставались достаточно высоки даже в момент окончания экспериментов (см. таблицу 4).

Таблица 4. Концентрации фактора ¡Хь.с* в плазмах добровольцев в момент окончания экспериментов*'.

Доброволец Концентрация Максимальное время

фактора 1ХЫ01, % эксперимента (1тах), часов

А 12.5 360

Б 42.9 360

В 14.3 360

Г 50 360

Контроль 1 0 24

Контроль 2 0 48

' Концентрации даны в % от максимальных, наблюдавшихся в экспериментах.

Обсуждение

«Включение» митоксантрона в эритроциты

Терапевтическая доза митоксантрона при лечении различных опухолей лимфатической системы и миелопролиферативных заболеваний составляет 1214 мг/м2 поверхности тела, т.е. примерно 24 мг на одно введение (если учитывать, что в среднем площадь поверхности тела человека составляет примерно 2 м2). Если вводить такое количество препарата в 400 мл суспензии эритроцитов, то концентрация препарата в суспензии будет составлять 0.06 мг/мл суспензии. Эту концентрацию мы будем называть условно терапевтической, т.к. очевидно, что она реально не является истинной терапевтической концентрацией препарата в крови, необходимой для проявления его лечебного эффекта, а просто соответствует концентрации препарата в одной дозе эритроцитов при введении в нее единичной терапевтической дозы препарата.

Проведенные эксперименты показали, что митоксантрон хорошо «загружается» в эритроциты в широком диапазоне концентраций, в том числе и превышающих условную терапевтическую (рис. 1). Это указывает на возможность значительно увеличить суммарную концентрацию препарата в крови больного при введении ему новой лекарственной формы.

Для оптимизации процесса «включения» препарата в эритроциты, мы изучили как кинетика «загрузки» клеток препаратом зависит от гематокрита суспензии и температуры инкубации. Распределение препарата в ходе его «включения» между эритроцитами и средой зависит от гематокрита. Так при высоких гематокритах и концентрации препарата в суспензии 0.06 мг/мл за 2 часа до 90% препарата оказывается в клетках. При гематокрите 10 % эта цифра снижается до 29% (см. таблицу 1).

Эффективность «загрузки» митоксантрона в эритроциты зависит и от температуры инкубации. Препарат быстро накапливается клетками при температурах 21°С и 37°С, однако, скорость «загрузки» резко падает при понижении температуры. Таким образом, оптимальной температурой для входа Мтн в эритроциты является 37°С. Проведенные эксперименты по измерению скорости выхода Мтн из нагруженных эритроцитов показали, что препарат достаточно быстро достигает равновесного распределения между клетками и средой (менее чем за 1 час), при этом концентрация препарата внутри клеток оказывается существенно выше, чем в среде, т.е. препарата достаточно прочно удерживается клетками. В условиях равновесия (при Ш 40 %) концентрация препарата в среде составляет примерно 17.4-18 % от полной его концентрации в суспензии (рис. 2). Учитывая, что при введении препарата в эритроцитах часть нагруженных клеток (иногда до 20-30 %) сначала депонируется в тканях, а затем постепенно выходит в кровь, можно ожидать, что даже при введении дозы в 3 раза превышающей терапевтическую (72 мг), после частичного депонирования препарата в тканях, перераспределения его между всеми эритроцитами крови и плазмой, максимальная концентрация митоксантрона в плазме не будет превышать той, что обнаруживается при введении одной терапевтической дозы препарата в виде раствора.

Еще одним важным моментом является вопрос о том, не вызывает ли присутствие высокой концентрации антибиотика в эритроцитах повреждающего воздействия на клетки-носители. В настоящей работе это воздействие было оценено двумя путями. В результате наших экспериментов было показано, что в широком диапазоне исследованных концентраций митоксантрона (до 3.5 мг/мл суспензии) гемолиз не превосходит допустимых пределов (рис.3). То, что

препарат не оказывает значительного повреждающего воздействия на клетки, было показано также в опытах по измерению влияния препарата на распределение исследуемых эритроцитов-носителей по плотностям. Результаты, представленные на рис. 4, показывают, что инкубация эритроцитов в суспензии с концентрацией препарата, соответствующей условной терапевтической, совсем не влияет на это распределение, в то время как при десятикратном повышении концентрации в суспензии распределение смещается в сторону более низких удельных плотностей. На рис. 4 пунктиром показана плотность, соответствующая критическому увеличению объема эритроцитов, за которым следует их лизис. В случае присутствия в эритроцитах Мтн, даже в концентрации в 10 раз превышающей ту, что несут эритроциты, «загруженные» одной терапевтической дозой этого препарата, смещение центра распределения в сторону уменьшения плотности клеток происходит всего на 10-15 %. Таким образом, даже эта концентрация препарата еще не повреждает клетку настолько, чтобы вызвать быстрый гемолиз.

«Включение» фактора IX в эритроциты

Полученные в работе результаты показывают, что биотинилированный фактор IX достаточно эффективно и стабильно «включается» в эритроциты методом мягкого ступенчатого диализа (таблица 2). Такие эритроциты сохраняют хорошую жизнеспособность и продолжают циркулировать в русле крови достаточно долгое (более 15 суток) время (рис.7). Выведение нагруженных эритроцитов из организма происходит по уравнению первого порядка, о чем свидетельствуют линейные зависимости от времени логарифма концентрации фактора 1ХЬю1 в лизатах эритроцитов добровольцев (рис. 8). Среднее время полувыведения фактора 1Хь!С1 из эритроцитов составило 73.9+16.0 часов (интервал от 94.2 до 55.2 часов) (см. таблицу 3).

Измеренное в настоящей работе среднее время полувыведения фактора 1Хью1 из плазмы добровольцев, которым этот фактор был введен в виде раствора, составило 8.8±5.6 часов (рис. 5). Это время существенно ниже цитируемых в литературе данных [Шиг-Баег А еЫ. 2005]. Мы полагаем, что это связано с тем, что исследованный в нашей работе фактор IX был биотинилирован. Однако это не мешает нам сравнить времена полувыведения препарата введенного в виде свободного раствора или «включенного» в эритроциты, т.к. в обоих случаях в работе был использован фактор Кы^- Данное сравнение показало, что время полувыведения фактора 1ХЫо(, введенного внутри суспензии эритроцитов, более чем в 8 раз превышает аналогичное время при введении раствора свободного фактора.

/

Естественное постоянное разрушение части фармакоцитов в русле крови приводит к тому, что на протяжении всего времени фармакокинетического эксперимента в плазме поддерживаются достаточно существенные концентрации фактора 1ХЬю1 (рис. 6). Средние максимальные концентрации фактора 1ХЫо1 в плазмах участвовавших в опыте добровольцев составляли 24.7±10.6% от уровня максимальных концентраций данного фактора в соответствующих аутологичных лизатах эритроцитов. Даже на 15 сутки концентрации фактора в плазмах не опускались ниже 12-14% от максимально наблюдаемых в данных плазмах в ходе экспериментов (таблица 4). В отличие от выведения «загруженных» препаратом фармакоцитов, снижение концентрации фактора 1ХЬю, в плазмах тех же добровольцев не описывалось уравнением первого порядка. В половине случаев наблюдалось отсутствие падения этой концентрации на протяжении первых 6 суток. Это, по-видимому, связано с тем, что концентрация препарата в данном случае зависит не только от скорости его выведения из плазмы, но и от той скорости, с которой фактор появляется в плазме в результате постепенного разрушения в русле введенных фармакоцитов.

Суммируя полученные результаты, можно сказать, что время присутствия в кровотоке фармакоцитарной формы препарата фактора IX, полученной методом ступенчатого диализа, пролонгировано по сравнению со свободной формой препарата. Это делает данную лекарственную форму перспективной для применения в клинике.

Заключение

Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что новые лекарственные формы разных по природе фармакологических препаратов на основе эритроцитов-носителей, безусловно, являются очень перспективными с точки зрения возможности повышения вводимых доз препаратов, создания их депонированных форм, защиты препаратов от разрушения и вывода иммунной системой организма, увеличения сроков жизни препарата. Все это позволит улучшить терапевтический эффект вводимого препарата, уменьшить количество необходимых для введения инъекции и, таким образом, улучшить качество жизни пациентов.

выводы

1. Разработана новая лекарственная форма противоопухолевого антибиотика митоксантрона на основе эритроцитов. Определены оптимальные условия «включения» митоксантрона в эритроциты путем прямой инкубации клеток в среде с препаратом. Эффективность суммарной «загрузки» антибиотика в клетки максимальна при инкубации эритроцитарной суспензии с гематокритом 70% в среде с митоксантроном (в концентрации от 0.06 до 3.5 мг/мл суспензии) в течение 1 часа при 37°С.

2. «Включение» митоксантрона в эритроциты при концентрациях препарата до 0.6 мг/мл клеток (что соответствует «загрузке» дозы препарата в 10 раз превышающей условную терапевтическую концентрацию) не повреждает клетки-носители существенным образом. Скорость гемолиза не превышает допустимую величину при переливании одной дозы эритроцитов. Распределение «загруженных» клеток по плотностям сдвигается в сторону увеличения объема клеток на 10-15%.

3. Установлено, что «загруженный» в эритроциты митоксантрон постепенно выходит из клеток-носителей (равновесие между клетками и средой достигается примерно за 1 час, при этом концентрация митоксантрона в среде составляет 17.4-18% от суммарной концентрации препарата в суспензии). Это обеспечивает возможность пролонгированного действия лекарства и снижает максимальную концентрацию антибиотика в плазме в момент введения, что понижает его кардио- и нефротоксичность.

4. Разработана новая лекарственная форма антигемофильного препарата фактора IX на основе эритроцитов-носителей, одним из преимуществ которой является снижение иммунного ответа организма на введенный белок. «Включение» фактора в клетки осуществлено методом мягкого ступенчатого диализа.

5. Проведено изучение фармакокинетики свободной и «загруженной» в эритроциты форм биотинилированного фактора IX. Среднее время полувыведения из кровотока для «включенного» белка более чем в 8 раз превышаете время полувыведения его свободной формы (74 и 9 часов, соответственно).

Материалы диссертационной работы изложены в следующих

публикациях:

1. Vuimo Т.А., Kulikova E.V., Sinauridze ЕЛ., Yurkevich A.M., Kravchenko S.K., Ataullakhanov F.I. Erythrocyte as a Potential Vehicle for Mitoxantrone. In Book «New Research on Biotechnology in Biology and Medicine», eds. Egorov A.M., Zaikov G. Nova Science Publishers, Inc., N.Y., 2005, chapter 9, p. 87-95.

2. Сарбаш В.И., Тихонова А.Г., Вуймо T.A., Дербов A.JI., Александрович Ю.Г., Бутылин A.A., Витвицкий В.М., Атауллаханов Ф.И. Эритроциты -носители лекарственных препаратов. Российский Химический Журнал, 2007, т. LI, №1, стр. 143-149.

3. Вуймо Т.А., Куликова Е.В., Синауридзе Е.И., Александрович Ю.Г., Лисовская И.Л., Юркевич A.M., Атауллаханов Ф.И. Создание новой лекарственной формы антрациклинового антибиотика митоксантрона, путем «включения» его в эритроциты. Молекулярная медицина, 2008, № 2, стр. 37-43.

4. Тихонова А.Г., Александрович Ю.Г., Вуймо Т.А., Синауридзе Е.И., Атауллаханов Ф.И. Эритроциты как переносчики антрациклиновых антибиотиков. Терапевтический архив, 2008, т. 80, №7, стр. 91-94.

5. Вуймо Т.А., Куликова Е.В., Синауридзе Е.И., Юркевич A.M., Кравченко С.К., Атауллаханов Ф.И. Эритроцит как потенциальный переносчик митоксантрона. Материалы III Московского Международного Конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 14-18 марта 2005, Москва, Россия, часть 1, стр. 63.

6. Тихонова А.Г., Вуймо Т.А., Александрович Ю.Г., Синауридзе Е.И., Дербов А.Л., Атауллаханов Ф.И. Сравнение диализных методов «включения» белковых препаратов в эритроциты. Материалы IV Московского Международного Конгресса «Биотехнология и медицина», 14-17 марта 2006, Москва, Россия, стр. 92-95.

7. Александрович Ю.Г., Вуймо Т.А., Синауридзе Е.И., Лисовская И.Л., Атауллаханов Ф.И. Эритроцит - «депо» и переносчик митоксантрона. Материалы IV Московского Международного Конгресса «Биотехнология и медицина», 14-17 марта 2006, Москва, Россия, стр. 96-98.

8. Вуймо Т.А., Синауридзе ЕЛ., Куликова Е.В., Шмырев И.И., Атауллаханов Ф.И. Эритроцит - как переносчик и «депо» IX фактора.

Материалы IV Московского Международного Конгресса «Биотехнология и медицина», 14-17 марта 2006, Москва, Россия, стр. 110-111.

9. Тихонова А.Г., Александрович Ю.Г., Вуймо Т.А., Дербов A.JL, Сарбаш В.И., Атауллаханов Ф.И. Биореактор для переработки этанола на основе эритроцитов. Тезисы VI Международной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика», Москва, Россия, 23-24 ноября 2006, стр. 257-258 .

10. Тихонова А.Г., Александрович Ю.Г., Вуймо Т.А., Дербов A.JI., Сарбаш В.И., Синауридзе Е.И., Атауллаханов Ф.И. «Эритроцит - биореактор для переработки этанола». Сборник тезисов 11-ой Пущинской международной школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», 29 октября - 2 ноября 2007, Пущино, Россия, стр. 284-285.

Подписано в печать 30 января 2009 г. Объем 1,0 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 75

Отпечатано в Центре оперативной полиграфии ООО «Ол Би Принт» Москва, Ленинский пр-т, д.37

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Вуймо, Татьяна Алексеевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. Обзор литературы

1.1 Использование различных типов переносчиков для адресной доставки и создания пролонгировнных форм препаратов

1.1.1. Адъюванты

1.1.2. Моноклональные антитела ■

1.1.3. Макромолекулярные переносчики

1.1.4. Липосомы и другие микрокапсулы

1.1.5. Липосомалъная форма митоксантрона

1.1.6. Изменение концентрации митоксантрона в плазме после введения липосомального или свободного митоксантрона in vivo

1.1.7. Эритроциты как переносчики лекарственных препаратов

1.1.8. Примеры использования эритроцитов в качестве переносчиков лекарственных репаратов

1.2. Способы получения эритроцитов, нагруженных лекарственными препаратами

1.3. Сведения о лекарственных препаратах, использованных в данной работе

1.3.1. Митоксантрон

1.3.2. Фактор IXсистемы свертывания крови 26 ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ

ГЛАВА 2. Материалы и методы

2.1 Материалы

2.2. Методы

2.2.1. Получение эритроцитов нагруженных митоксантроном

2.2.2. Приготовление лизатов эритроцитов

2.2.3. Приготовление хлороформных экстрактов проб

2.2.4. Измерение концентрации свободного гемоглобина

2.2.5. Измерение выхода митоксантрона из загруженных эритроцитов

2.2.6. Измерение распределения эритроцитов по плотностям в суспензиях с различной концентрацией митоксантрона

2.2.7. Биотинилирование препарата фактора IX

2.2.8. Определение степени биотинипирования фактора IX

2.2.9. Включение биотинилированного фактора IXв эритроциты

2.2.10. Изучение фармакокинетики биотинилированного препарата фактора IX 37 2.2.11. Измерение концентрации биотинилированного препарата фактора IXв плазме и внутри эритроцитов

ГЛАВА 3. Результаты

3.1. Загрузка митоксантрона в эритроциты

3.2. Влияние температуры на кинетику загрузки эритроцитов митоксантроном

3.3. Влияние гематокрита суспензии на эффективность загрузки митоксантрона в эритроциты

3.4. Выход депонированного митоксантрона из эритроцитов

3.5. Влияние присутствия митоксантрона на сохранность эритроцитов

3.5.1. Влияние температуры инкубации и концентрации митоксантрона на скорость гемолиза нагруженных эритроцитов

3.5.2. Влияние митоксантрона на распределение эритроцитов по плотностям

3.6. Включение биотинилированного фактора IX в эритроциты

3.7. Изучение фармакокинетики препарата биотинилированного фактора IX, введенного внутривенно в виде раствора

3.8. Изучение фармакокинетики препарата биотинилированного фактора IX, включенного в эритроциты

3.9. Расчет времени полувыведения фактора IXbiot, включенного в эритроциты

ГЛАВА 4. Обсуждение

4.1. Создание новой лекарственной формы антрациклинового антибиотика митоксантрона на основе эритроцитов-носителей

4.2. Антигемофильный фактор IX, включенный в эритроциты 56 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 58 ВЫВОДЫ 59 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Эритроцит как переносчик антрациклинового антибиотика Митоксантрона и антигемофильного препарата фактора IX системы свертывания крови "Aimafix D.I.""

В современной фармакологии все более отчетливо проявляются две ведущие тенденции: 1- создание методов направленной («адресной») доставки фармакологических препаратов; 2 - разработка новых лекарственных форм для создания в организме человека депо фармакологических препаратов, обеспечивающих постепенное высвобождение препарата, получение пролонгированного эффекта, повышение терапевтической эффективности препарата, а также снижение его токсичности.

Определяющую роль в решении этих задач играют переносчики лекарственных средств. Они позволяют не только создать депонированную форму введенного соединения, но и защитить лекарство от преждевременного разрушения и инактивации ретикулоэндотелиальной системой организма; предотвратить или уменьшить иммунные и аллергические реакции организма на введенный препарат; осуществлять его направленный транспорт в органы и ткани-мишени.

Одной из важнейших предпосылок для успешного применения различных лекарственных препаратов, фармакологически или физиологически активных веществ (ФАВ) является специфичность их действия. Однако большая часть этих лекарственных соединений взаимодействует также и со значительным числом неспецифических мишеней. Это обстоятельство было наглядно продемонстрировано на примере химиотерапии онкологических заболеваний. Медленный прогресс в этой области является следствием неспособности практически всех цитотоксических веществ действовать исключительно на злокачественные клетки [2]. Низкая избирательность лекарственного препарата требует повышения дозы вводимого вещества, чтобы обеспечить его терапевтическую эффективность. Это приводит к усилению общего токсического действия препарата на организм и часто сопровождается развитием лекарственной устойчивости опухолевых или патологически измененных клеток к стандартным формам препарата. Включение лекарства в несущие микрокапсулы или аутологичные клетки-носители снижает пиковые концентрации свободного препарата в крови в момент введения, что понижает его токсическое действие, а также способствует снижению иммунного ответа организма на препарат, т.е. препятствует быстрому развитию устойчивости по отношению к введенному лекарству.

Переносчики лекарственных препаратов должны удовлетворять всем требованиям, которые предъявляются к любым веществам, вводимым в организм. Они должны быть нетоксичны, не иметь, или иметь минимальные побочные эффекты и быть способными к биодеградации - разложению и выведению продуктов переработки переносчика системами организма. В этом отношении одними из самых перспективных переносчиков являются собственные клетки организма, и, в первую очередь, эритроциты. Они легко могут быть выделены из крови, где присутствуют в больших количествах, обладают достаточно длительным временем жизни и, по мере старения, подвергаются в организме естественному процессу биодеградации. Таким образом, эритроциты являются перспективными носителями лекарственных препаратов, которые, в зависимости от поставленных задач, могут обеспечить пролонгированное действия лекарства, снижение его токсичности или иммунного ответа организма на введенный препарат. Все это делает задачу разработки новых лекарственных форм на основе эритроцитов-носителей очень перспективной и актуальной.

Цель работы

Цель работы - создание на основе эритроцитов-носителей новых лекарственных форм противоопухолевого антрациклинового антибиотика митоксантрона (Мтн), а также антигемофильного препарата фактора IX системы свертывания крови.

Задачи исследования

1. Разработка оптимальных методов введения данных препаратов в эритроциты.

2. Изучение эффективности загрузки и скорости освобождения Мтн из эритроцитов-носителей (фармакоцитов).

3. Изучение повреждающего воздействия загрузки Мтн на эритроциты-носители.

4. Сравнительное исследование фармакокинетики препарата фактора IX, введенного в организм стандартным способом (в виде внутривенной инъекции раствора свободного фактора) и внутри эритроцитов-носителей.

Научная новизна

В результате работы впервые были созданы новые лекарственные формы двух, совершенно различных по химической природе препаратов - противоопухолевого антибиотика митоксантрона и антигемофильного препарата фактора IX системы свертывания крови. Оба препарата были успешно включены в эритроциты.

Разработаны методы, позволяющие в каждом из данных случаев получать фармакоциты, обладающие достаточно продолжительным временем жизни, которые освобождают лекарственный препарат в кровоток постепенно, обеспечивая, таким образом, его пролонгированное действие.

Исследование сравнительной фармакокинетики традиционной и новой лекарственных форм препарата фактора IX показало, что время циркуляции этого фактора в кровяном русле увеличивается при включении препарата в эритроциты в 5-10 раз.

В случае антибиотика митоксантрона в фармакоциты может быть включена доза лекарства, превышающая одноразовую дозу, которую вводят обычно при стандартном способе введения препарата. При этом фармакоциты обладают достаточным временем жизни, а препарат освобождается их клеток-носителей постепенно, удается не только получить пролонгированную форму лекарства, но и снизить его кардиотоксичность, которая возникает обычно за счет высокой пиковой концентрации препарата в момент введения [52].

Практическая ценность работы

Разработанные новые лекарственные формы синтетического антибиотика митоксантрона и антигемофильного фактора IX системы свертывания крови на основе эритроцитов-носителей позволяют сильно пролонгировать действие этих лекарственных препаратов по сравнению с введением аналогичной дозы стандартного лекарственного препарата. В случае митоксантрона возможно также повысить дозу вводимого вещества с одновременным снижением его кардиотоксичности. Это позволяет использовать данный препарат у пациентов с выраженными сердечными или почечными нарушениями, что невозможно для стандартной лекарственной формы препарата. Уменьшение количества и частоты инъекций, необходимых для поддержания терапевтического уровня концентраций лекарственного препарата в крови, снижает общий расход лекарства, необходимого для проведения курса терапии, и улучшает качество жизни пациентов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Разработаны методы включения в эритроциты синтетического аналога антибиотиков антрациклинового ряда - митоксантрона и антигемофильного препарата фактора IX.

2. Загруженный в эритроциты митоксантрон способен постепенно освобождаться из эритроцитов-носителей, что позволяет создать на их основе пролонгированную форму лекарства.

3. Включение терапевтической дозы митоксантрона в эритроциты практически не повреждает клетки-носители. При концентрациях препарата в клетках в 10 раз превышающих ту, что возникает при загрузке единичной терапевтической дозы, повреждающее воздействие антибиотика на клетки все еще остается достаточно слабым.

4. На основе изучения фармакокинетики свободной и загруженной в эритроциты формы биотинилированного фактора ГХ показано, что при включении препарата в эритроциты-носители срок его жизни в кровотоке увеличивается в 5-10 раз.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Вуймо, Татьяна Алексеевна

выводы

1. Разработана новая лекарственная форма противоопухолевого антибиотика митоксантрона на основе эритроцитов-носителей. Определены оптимальные условия включения митоксантрона в эритроциты путем прямой инкубации клеток в среде с препаратом. Эффективность суммарной загрузки антибиотика в клетки максимальна при инкубации эритроцитарной суспензии с гематокритом 70% в среде с митоксантроном (в концентрации от 0.06 до 3.5 мг/мл суспензии) в течение 1 часа при 37°С.

2. Включение митоксантрона в эритроциты при внутриклеточных концентрациях препарата до 0.6 мг/мл клеток (что соответствует загрузке дозы препарата в 10 раз превышающей условную терапевтическую концентрацию) не повреждает клетки-носители существенным образом. Скорость гемолиза не превышает допустимую при переливании эритроцитов. Распределение загруженных клеток по плотностям сдвигается в сторону 10-15% увеличения объема клеток.

3. Установлено, что загруженный в эритроциты митоксантрон постепенно выходит из эритроцитов-носителей (равновесие между клетками и средой достигается примерно за 1 час, при этом концентрация митоксантрона в среде составляет 17.4-18% от суммарной концентрации препарата в суспензии). Это обеспечивает возможность пролонгированного действия лекарства и снижает максимальную концентрацию антибиотика в плазме в момент введения, что понижает его кардио- и нефротоксичность.

4. Впервые разработана новая лекарственная форма антигемофильного препарата фактора IX на основе эритроцитов-носителей, одним из преимуществ которой является снижение иммунного ответа организма на введенный белок. Включение фактора в клетки осуществлено методом мягкого ступенчатого диализа.

5. Проведено изучение фармакокинетики свободной и загруженной в эритроциты форм биотинилированного фактора IX. Среднее время полувыведения из кровотока для инкапсулированного белка более чем в 8 раз превышаете время полувыведения его свободной формы (74 и 9 часов, соответственно).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработаны две новые лекарственные формы на основе эритроцитов-носителей. Низкомолекулярный синтетический аналог антрациклиновых антибиотиков — митоксантрон, был включен в эритроциты методом прямой инкубации суспензии клеток в среде, содержащей препарат. Для включения белкового препарата антигемофильного фактора IX использовали метод ступенчатого диализа. В обоих случаях препараты были успешно включены в эритроциты. Созданные лекарственные формы обладают рядом преимуществ перед используемыми в клинике стандартными способами введения данных лекарств.

В случае противоопухолевого антибиотика Мтн появляется возможность создания пролонгированной формы и существенного повышения дозы введенного препарата без увеличения его токсичности. Это очень важно для клинического применения данного лекарства, т.к., несмотря на его высокую противоопухолевую активность, применять его в достаточно высоких дозах невозможно из-за сильной кардио- и нефротоксичности.

Инкапсуляция антигемофильного фактора IX в эритроциты также, позволяет создать пролонгированную форму лекарства. Время жизни этого препарата в крови при введении его в эритроцитах-носителях увеличивается примерно в 5-10 раз. При этом большую часть времени препарат находится внутри собственных клеток хозяина, т.е. не вызывает сильного иммунного ответа организма на введение постороннего белка. Можно надеяться, что данная форма лекарства не будет сильно провоцировать, появление ингибиторов к вводимому фактору.

Для успешного клинического использования разработанных форм препаратов необходимы дополнительные исследования. Однако уже полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что новые лекарственные формы разных по природе фармакологических препаратов на основе эритроцитов-носителей, безусловно, являются очень перспективными с точки зрения возможности повышения вводимых доз препаратов, создания их депонированных форм, защиты препаратов от разрушения и вывода иммунной системой организма, увеличения сроков жизни препарата. Все это позволит улучшить терапевтический эффект вводимого препарата, уменьшить количество необходимых для введения инъекции и, таким образом, улучшить качество жизни пациентов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Вуймо, Татьяна Алексеевна, Москва

1. Атауллаханов ФИ, Баташева ТВ, Витвицкий ВМ. Влияние температуры, концентрации даунорубицина и гематокрита суспензии на связывание даунорубицина эритроцитами человека. Антибиотики и химиотерапия, Москва, 1994, №39: 9-10.

2. Гаузе ГФ, Дудник ЮВ. Противоопухолевые антибиотики, М., "Медицина", 1987, стр.53-78.

3. Дранов AJI, Дудниченко АС, Мезин ИА, Мензелеев РФ, Краснопольский ЮМ, Швец ВИ. Эффективность липосомальных форм цитостатиков Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. Москва,1996, № 1: 85-89.

4. Жибурт ЕБ. Трансфузиология. Санкт-Петербург, 2002, с.348-357.

5. Каледин ВИ, Ильницкая СИ. Эффективность свободных и липосомальных форм платины и антрациклиновых антибиотиков в отношении метастазов в печени опухолей GA-1 и Р-388 у мышей. Вопросы онкологии, 1996, 42(3): 64-6.

6. Каплун АП, Ле Банг Шон, Краснопольский ЮМ, Швец ВИ. Липосомы и другие наночастицы как средство доставки лекарственных веществ. Вопросы медицинской химии, Москва, 1999, № 4(1): 3-12.

7. Краснопольский ЮМ, Дранов АЛ, Степанов АЕ, Швец ВИ. Липосомальные формы цитостатиков в онкологии. Вестник Российской Академии медицинских наук, Москва, 1998, № 5: 35-40.

8. Куликова ЕВ, Витвицкий ВМ, Кохно АВ, Исаев ВГ, Паровичникова ЕН, Савченко ВГ, Атауллаханов ФИ: Введение эритроцитов, нагруженных доксорубиципом, больным с лимфопролиферативными заболеваниями. Гематология и трансфузиология, 1998, 43 (4): 26-29

9. Основы физиологии человека. Под. ред. Ткаченко БИ. Санкт-Петербург: Международный фонд истории науки, 1994. Т. 1.

10. Сарбаш В.И, Тихонова АГ, Вуймо ТА. и др.; Эритроциты носители лекарственных препаратов; Ж. Рос.хим. об-ва им. Д.И. Менделеева, 2007, T.L1, №1:143-149.

11. Семенов ФМ, Андреев ЮН, Плющ ОП, Иванова BJI, Вдовин ВВ. Информационное письмо Правительства Москвы Департамента Здравоохранения №31-211 инф. От 23.09.2004 г.

12. Синауридзе ЕИ. Способ получения эритроцитов, заполненных лекарственным веществом. Авторское свидетельство СССР, № 1469609, 1 декабря 1988 г.

13. Справочник Видаль 2000. Лекарственные прапараты в России. Изд. АстраФармСервис, издание 5, Москва, 1999, стр.155

14. Шальков ЮЛ, Дудниченко АС, Краснопольский ЮМ. Опыт и перспективы использования липосомальной формы противоопухолевых препаратов в клинической онкологии. Клиническая хирургия, Москва, 1995, № 5: 21—23.

15. Швец ВИ, Краснопольский ЮМ. Липиды в лекарственных препаратах Вестник АМН СССР, Москва, 1990, № 6: 19-28.

16. Alpar НО, Lewis DA. Therapeutic efficacy of asparaginase encapsulated in intact erythrocytes. Biochem Pharmacol, 1985, Jan 15, 34(2):257-61.

17. Ataullakhanov F.I., Kulikova E.V., Vitvitsky B.M. Doxorubicin Binding by Human Erythrocytes. Advances in the Biosciences, 1994, №92:163-168.

18. Bandak S, Goren D, Horowitz A, Tzemach D, Gabizon A. Pharmacological studies of cisplatin encapsulated in long-circulating liposomes in mouse tumor models. Anticancer Drugs, 1999, Nov;10(10):911-20

19. Beutler E, Dale GL, Guinto DE, Kuhl W. Enzyme replacement therapy in Gaucher's disease: preliminary clinical trial of a new enzyme preparation. Proc Natl Acad Sci USA.- 1977.- Oct;74( 10):4620-3.

20. Cannon EP, Leung P, Hawkins A, Petrikovics I, DeLoach J, Way J.L. Antagonism of cyanide intoxication with murine carrier erythrocytes containing bovine rhodanese and sodium thiosulfate. J Toxicol Environ Health, 1994, Mar;41(3):267-74.

21. Chiarantini L, Droleskey R, Magnani M, DeLoach J.R. In vitro targeting of erythrocytes to cytotoxic T-cells by coupling of Thy-1.2 monoclonal antibody. Biotechnol Appl Biochem, 1992, Apr;15(2):171-84.

22. Collette N., Auwera P., Mevinier F., Lambert C., Sculier I., Coune A. Tissue distribution and bioactivity of amphotericin В administered in liposomes to cancer patients. J of Antimicrobial Chemotherapy 1991; 27: 535-548.

23. Cornu G., Michaux J.L., Sokal G., Trouet A. Daunorubicin-DNA: further clinical trials in acute non-lymphoblastic leukemia. Eur J Cancer, 1974, Nov;10(l l):695-700.

24. Cortes J, O'Brien S, Estey E, Giles F, Keating M, Kantarjian H. Phase I study of liposomal daunorubicin in patients with acute leukemia. Invest New Drugs, 1999, 17(l):81-7

25. Danon, D., Marikovsky, Y. 1964. Determination of density distribution of red cell population. J. Lab. Clin. Med. 64:668-674.

26. Dass C. R., Walker T. L., Burton M. A., Decruz E. E. Enhanced anticancer therapy mediated by specialized liposomes. J Pharm. Pharmacol, 1997; 49(10): 972-975.

27. DeLoach J, Ihler G.A. Dialysis procedure for loading erythrocytes with enzymes and lipids. Biochim Biophys Acta, 1977, Jan 24;496(1): 136-45.

28. Deloach JR, Corrier DE, Wagner GG Effect of carrier erythrocytes containing inositol hexaphosphate on Babesia microti infection. Res. Yet. Sci., 1988 Sep;45(2):262-3

29. DeLoach JR, Tangner CH, Barton C. Hepatic pharmacokinetics of glutaraldehyde-treated methotrexate-loaded carrier erythrocytes in dogs. Res. Exp. Med. (Berl), 1983,183(3): 167-75.

30. Determine reactivity of NHS ester biotinilation and cross-linking reagents. Technical resource of Pierce Biotechnology Inc., 10/2002, USA.

31. Diaz A., Alfonso M., Alonso R. et al. Immune responses in breast cancer patients immunized with an anti-idiotype antibody mimicking NeuGc-containing gangliosides. Clin Immunol., 2003; 107 (2): 80-9

32. Fazi A, Mancini U, Mangani F, Accorsi A, Piatti E, Rossi L, Magnani M. In vitro and in vivo methanol degradation by alcohol oxidase-loaded erythrocytes. Advances In The Bioscience, 1994.-92:93-101.37.