Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эритроциты как носители ферментов для окисления этанола

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Эритроциты как носители ферментов для окисления этанола"

На правах рукописи

Тихонова Анастасия Геннадьевна

Эритроциты как носители ферментов для окисления этанола

03.01.04-биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2010

003490906

003490906

Работа выполнена в Учреждении Российской Академии Медицинских наук Гематологический научный центр РАМН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Атауллаханов Фазоил Иноятович

Официальные оппоненты:

Ажигирова Мария Алексеевна, доктор биологических наук; Учреждение Российской Академии Медицинских наук Гематологический научный центр РАМН.

Косенко Елена Александровна, доктор биологических наук; Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН.

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии медицинских наук НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН

Защита диссертации состоится «л1£>» 2010 года 6 /Я

на заседании Диссертационного совета Д.001.042.02. при Учреждении Российской Академии Медицинских наук Гематологический Научный Центр РАМН по адресу: 125167, г. Москва, Новый Зыковский проезд, д.4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РАМН. Автореферат разослан « 2009 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

ЕЕ. Зыбунова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Более 35 лет назад было показано, что эритроциты как носители могут успешно использоваться в клинической практике. Это возможно потому, что данные клетки отличаются некоторыми уникальными преимуществами по сравнению с другими системами доставки лекарств. Эритроциты являются не только натуральными, безопасными и доступными в препаративном количестве, но и способны к биодеградации, длительно циркулируют в крови (в среднем 120 дней (Гайтон А.К. и др. 2008]), снижают аллергические и иммунологические реакции на введение белковых препаратов в кровь. Существует рад направлений в использовании эритроцитов-переносчиков, одно из которых состоит в том, что клетки рассматриваются не как пассивные переносчики, а как биореакторы. Это подразумевает под собой «включение» ферментов, которые в ряде случаев не содержатся в нативных эритроцитах, и благодаря тому, что субстраты и продукты реакций, катализируемых данными ферментами, достаточно хорошо проходят через мембрану эритроцита. Такие носители могли бы эффективно перерабатывать токсическое вещество непосредственно в кровотоке. Идея использовать эритроциты в качестве биореакторов была высказана около 30 лет назад [Adriaenssens К., et al. 1976; Updike S.J., et al. 1976; Ihler S.I., et al. 1976] и доведена до применения в клинической практике на примере ряда ферментов (L-аспараганаза, аденозиндеаминаза) [Kravtzoff R., et al. 1996; Вах В.Е., et al. 2007]. В эритроциты был «включен» целый ряд ферментов, которые были предложены для терапии таких болезней и состояний как: острый лимфобластный лейкоз, лимфосаркома, подагра, болезнь Гоше, гипераммониемия, интоксикация метанолом и др. Результаты ряда работ подтверждают, что нагруженные ферментами эритроциты удаляют из кровеносного русла токсические и повышенные концентрации различных соединений, таких как метанол и формальдегид при отравлении метанолом [Magnani М., et al. 1993], глюкоза при диабете [Rossi L., et al. 1992].

Эритроциты-биореакторы для снижения в крови концентрации этанола и ацетальдегида - главного токсического продукта метаболизма спирта, были предложены около 10 лет назад. С этой целью в эритроциты были «включены» два фермента: алкогольдегидрогеназа и альдегидцегидрогеназа. К сожалению, данная разработка как и многие другие не используются в клинике в настоящее время. Мы полагаем, что проблема может заключаться в неэффективной скорости -работы биореакторов. В данной работе были изучены возможные причины, ограничивающие высокую скорость биореактора на примере окисления этанола.

Цель работы.

Целью работы было выяснение причин ограничивающих скорость окисления этилового спирта эритроцитами-биореакторами в условиях in vitro и преодоление этих ограничений с целью увеличения скорости окисления спирта в ацетат.

Задачи исследования

1. Исследование зависимости эффективности работы ферментов (алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогеназы) от их количества и от доступности субстратов (пирувата, НАД*, НАДН).

2. Выбор оптимальных условий для «включения» максимального количества ферментов в эритроциты.

3. Изучение влияния процедуры «загрузки» ферментов на функциональную полноценность клеток.

4. Оценка стабильности «включенных» в эритроциты ферментов в процессе хранения.

Научная новизна

В результате работы были выяснены причины, ограничивающие высокую эффективность эритроцитов-биореакторов по окислению этанола, и найдены способы их преодоления. Были разработаны методы, позволяющие эффективно включать белки с достаточно большим молекулярным весом и получать «нагруженные» эритроциты близкие по биохимическим и биофизическим свойствам с нативными эритроцитами. Был произведен сравнительный анализ биореакторов, полученных различными методами по следующим характеристикам: определение осмотической резистентности эритроцитов, распределение нагруженных эритроцитов по плотностям, измерение эритроцитарных индексов. Было показано, что метод одноступенчатого гипоосмотического диализа является предпочтительным по сравнению с двух- и трехступенчатым как по проценту «включения» ферментов, так и по жизнеспособности эритроцитов. Изучение эритроцитов во время хранения показало, что в течение 7 суток не происходит значительного снижения активности «включенных» в эритроциты ферментов.

Практическая ценность работы

Полученные результаты важны для понимания причин, которые ограничивают скорость не только окисления этанола, но и иных субстратов в случае создания других эритроцитов-биореакторов, В данной работе было показано, что скорость работы эритроцитов-биореакторов по окислению этанола и ацетальдегида можно многократно

увеличить, в 45 и более раз. Такое увеличение эффективности может, например, улучшить терапию пациентов при отсутствии митохондриальной формы альдегиддегидрогеназы с низким значением константы Михаэлиса или при алкогольной интоксикации, зачастую сопровождающейся алкогольной болезнью печени.

Положения, выносимые на защиту:

1. Одним из ограничителей эффективной работы биореактора по окислению этанола является гшруват, поступление которого только за счет гликолиза недостаточно. В его присутствии скорость увеличивается в 17 раз.

2. Вторым ограничителем служит пул НАД+ и НАДН, добавление которых при диализе позволяет восстановить их близкие к исходным концентрации в эритроцитах, увеличивая эффективность работы эритроцитов-биореакторов в 3 раза.

3. Разработаны методы «включения» алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогеназы в эритроциты человека позволяющие получать высокий процент «включения» белков и клетки сходные по биохимическим и биофизическим свойствам с нативными. Оптимальным методом «включения» ферментов является одноступенчатый метод диализа.

4. При хранении эритроцитов-биореакторов в течение 7 суток происходит снижение активности альдегиддегидрогеназы в 2 раза, тогда как активность алкогольдегидрогеназы снижается незначительно.

Апробация работы состоялась 09.11.2009 г. на заседании проблемной комиссии № 6 «Биохимия, биофизика и реология крови» в Учреждении Российской академии медицинских наук Гематологическом Научном Центре РАМН.

Материалы диссертации были представлены на ряде российских и международных научных конференций: IV Московский международный конгресс «Биотехнология и медицина», 14-17 марта 2006, Москва, Россия; VI Международная молодежная конференция ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика», 23-24 ноября 2006, Москва, Россия; 11-я Путинская международная школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века», 29 октября - 2 ноября 2007, Пущино, Россия; Gordon Research Conferences «Drug Carriers in Medicine and Biology», 24-29 Aug., 2008, B.S., Montana, USA; Международный форум по нанотехнологиям, 03-05 декабря 2008, Москва, Россия; Всероссийская научная конференция с международным участием «Нанотехпологии в онкологии 2008», 06 декабря 2008, Москва, Россия; 14 Европейский конгресс по биотехнологии «Симбиозис», 13-16 Sep., 2009, Barcelona, Spain.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 8 работ из которых, 2 статьи в рецензируемых журналах и 6 тезисов в сборниках трудов отечественных и международных конференций.

Объем и структу ра диссертации

Диссертация изложена на 105 страницах машинописного текста и состоит из следующих основных разделов: введение; литературный обзор (содержит 4 рисунка); постановка задачи (содержит 1 рисунок); материалы и методы; результаты (содержит 20 рисунков и 5 таблиц); обсуждение; выводы и список цитированной литературы - 223 источников из них 6 русскоязычных.

Диссертационная работа выполнена в Гематологическом Научном Центре РАМН (лаборатория физической биохимии системы крови; заведующий лабораторией д.б.н., профессор Ф.И. Атауллаханов).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Литературный обзор

Представлен обзор литературных данных о свойстве эритроцитов и преимуществ применения данных клеток в качестве переносчиков. Рассмотрены 7 методов приготовления эритроцитов-переносчиков: гипоосмотический гемолиз; электропорация; эндоцитоз; увеличение проницаемости мембраны эритроцитов с помощью антибиотиков; ультразвук; метод, использующий низкомолекулярный протамин и метод инкубации. Отмечены преимущества и недостатки их применения. Рассмотрены примеры использования эритроцитов-переносчиков. Проанализированы данные по созданию эритроцитов-биореакторов по окислению этанола полученные разными методами. Описаны дрожжевые ферменты, использованные в данной работе.

Материалы и методы

Приготовление суспензии эритроцитов. Для приготовления суспензии эритроцитов кровь здоровых доноров центрифугировали при 900xg 7 минут и комнатной температуре, после чего плазма и лейкоцитарный слой были удалены. Выделенные эритроциты были отмыты дважды в трехкратном объеме фосфатного солевого буфера, содержащего 0.01 М фосфатного буфера, 0.0027 М калия хлорида, 0.137 М натрия хлорида, рН 7.4 (PBS, Sigma, США). К отмытым клеткам добавлялся буферный раствор (0,9% NaCl, 5 мМ NaH2P04,pH 7,4) для получения суспензии клеток с требуемым значением гематокрита.

Часть приготовленной суспензии tie подвергалась в дальнейшем процедуре диализа и использовалась как контрольная (нативные эритроциты).

Получение эритроцитов-биореакторов. «Включение» ферментов проводилось методом одно-, двух- и трехступенчатого гипоосмотического диализа. Перед диализом к суспензии отмытых эритроцитов с гематокритом 45% добавлялся раствор ферментов (алкогольдегидрогеназы (АДГ) и альдегидцегидрогеназы (АдДГ)) в различных концентрациях. Гипотонические растворы готовились го буферного раствора (0,9% NaCl, 5 мМ NaH2P04i pH 7,4) путем разбавления дистиллированной водой.

Одноступенчатый диализ. Суспензию эритроцитов с ферментами однократно пропускали через диализатор с осмотичностью внешнего раствора 101-106 мОсм/кг при +4°С. После этого к полученному гемолизату добавлялся «запечатывающий» раствор (1,606 М KCl, 0,194 М NaCl, 33 мМ NaH2P04, 5 мМ аденина, 20 мМ АТФ, 0,1 М глюкозы, 0,1 М пирувата, 4 мМ MgCl2, 0,1 М инозина) в таком объеме, чтобы значение осмотичности полученной суспензии было около 300 мОсм/кг. Далее суспензия инкубировалась при 37°С в течение 30 минут. После инкубации суспешию центрифугировали при 210 х g 10 минут'при комнатной температуре и удаляли надосадок. Полученные эритроциты трижды отмывали путем ресуспендирования в трехкратном объеме теплого (37 °С) буфера PBS с добавлением 6 мМ глюкозы с последующим центрифугированием (210 * g, 10 минут при комнатной температуре) и удалением надосадка.

Двухступенчатый диализ. На 1-й ступени диализа суспензию эритроцитов с ферментами пропускали через диализатор при осмотичности внешнего раствора 157166 мОш/кг при +4°С. После смены 1-го раствора на раствор с осмотичностью 100 -122 мОсм/кг, содержащий 100 мкМ НАД*, суспешию сферулированных эритроцитов снова пропускали через диализатор при +4°С (2-я ступень). Затем полученный гемолизат «запечатывали» и проводили отмывание клеток, как описано выше при одноступенчатом диализе.

В экспериментах по включению АДГ и АдДГ методом трехступенчатого диализа суспензию «открытых» на 2-й ступени эритроцитов пропускали 3-й раз через диализатор, омываемый гипотоническим раствором с осмотичностью 79 — 104 мОсм/кг при +4°С. Раствор, как и на 2-й ступени, содержал 100 мкМ НАД*. Затем проводили «запечатывание» получешюй суспензии и отмывание клеток, как описано выше для одноступенчатого диализа.

В работе также была изучена зависимость «включения» ферментов от осмотичности гипоосмотического раствора на 2-й ступени диализа (осмотичности раствора, при которой происходит образование пор в мембране эритроцитов). При этом 1-ю ступень обработки эритроцитов (их сферуляция) выполняли в пробирках. Сферуляция эритроцитов выполненная таким способом была предпочтительней в

7

данных экспериментах, так как позволяла получить значительное количество клеток за короткое время. Для этого в каждой пробирке к отмытым клеткам добавляли гипотонический раствор с осмотичностью 153-159 мОсм/кг в соотношении 1:5, и полученную суспензию эритроцитов выдерживали 15 минут при комнатной температуре. Затем суспензию центрифугировали 7 минут при 210 х g при комнатной температуре. Полученный надосадок удаляли. К выделенным сферулированным клеткам добавляли определенный объем того же гипотонического раствора для получения суспензии с гематокритом 60 %. Далее суспензию эритроцитов разделяли на 3 равные части, в которые перед началом диализа (2-й ступени) добавляли раствор ферментов. Каждую суспензию подвергали гипоосмотическому диализу при одной из указанной осмотичности внешнего раствора: 56-64 мОсм/кг, 88-89 мОсм/кг и 116-118 мОсм/кг при +4°С. Клетки, прошедшие диализ, «запечатывали» описанным выше способом.

Измерение активности ферментов. Для измерения активности ферментов были взяты пробы на различных этапах получения эритроцитов-биореакторов (после добавления ферментов в исходную суспензию, из суспензии «запечатанных» клеток, из надосадка и клеток, полученных после центрифугирования суспензии «запечатанных» клеток, и из клеток после их трехкратной процедуры отмывания). Активность ферментов измеряли спектрофотометрически в лизатах проб по начальной скорости восстановления НАД+ в НАДН для АДГ и АдДГ и по скорости окисления НАДН в НАД* для лактатдегидрогеназы (ЛДГ) на длине волны 340 нм (спектрофотометр AMINCO, США или микропланшетный спектрофотометр Multiskan Ascent, Финляндия).

Кювета для измерения активности алкгольдегидрогеназы в случае использования спектрофотометра AMINCO содержала: фосфатно-глициновый буфер (75 мМ Na2HP04, 75 мМ дигидрохлорида гидразина, 21 мМ глицина, 10 мМ ЭДТА, рН 8.7), 1.8 мМ НАД\ 0.58 М этанола и лизат пробы. Измерения проводились при 37°С.

Активность альдегиддегидрогеназы измеряли согласно [Bostian К.A., et al. 1978] и Sigma (St. Louis, МО, USA). В кювету были добавлены: деионизованная вода, 1 М буфер Tris НС1 (рН 8.0), 20 мМ НАД+, ЗМ раствор калия хлорида, 100 мМ ацетальдегида, 1 М 2-меркаптоэтанол и лизат пробы. Измерения проводили при температуре 25°С.

При измерении активности лактатдегидрогеназы в кювету добавляли буфер Na3P04 (рН 7.5), содержащий 0.125 мМ НАДН; далее 34 мМ пирувата и лизат пробы. Измерения проводили при 37°С.

Для оценки степени «включения» алкоголь- и альдегиддегидрогеназы рассчитывали процент «включения» ферментов по концентрации и по активности. В случае расчета процента «включения» по концентрации брали отношение активности

8

фермента (в U/мл), полученной в «запечатанных» клетках (после 3-х кратной отмывки) к активности фермента в суспензии после стадии «запечатывания» (в U/мл), в процентах. Для расчета процента «включения» ферментов по активности рассчитывали отношение активности фермента в «запечатанных» клетках (в U, с учетом объема полученных клеток) к активности фермента в суспензии «запечатанных» клеток (в U, с учетом объема получешюй суспензии), в процентах.

Приготовление перхлориых экстрактов проб. К эритроцитарной массе добавляли ледяной 10-процентный раствор НС104 в соотношении 1:1. Пробы выдерживали на ледяной бане в течение 15 минут. После центрифугирования при 4100 * g в течение 3 минут надосадок отбирали и к нему добавляли насыщенный раствор К2С03 для нейтрализации кислоты. Через 10 минут смесь снова центрифугировалась при тех же условиях, полученный надосадок замораживали при - 80°С и хранили до проведения измерений концентрации этилового спирта и пирувата [Bcutler Е. 1971].

Измерение концентрации этанола и пирувата. В течение инкубации эритроцитов-биореакторов в среде при 37°С (50 mM HEPES, 5 гаМ MgSQ<, 110 тМ NaCl, 3 тМ КС1, 1.2 тМ NaH2PO„, 2 мМ СаС12, 16 тМ глюкозы, рН 7.5) отбирали пробы через определишые промежутки времени и готовили перхлорные экстракты, которые использовали для измерения концентрации этанола и пирувата.

Концентрацию этанола измеряли энзиматически в ходе реакции окисления спирта до ацетальдегида, катализируемой алкогольдегидрогеназой, по образованию НАДН, регистрируемого на длине волны 340 им. Смесь для определения концентрации этанола содержала: фосфатно-глициновый буфер (75 мМ Na2HP04, 75 мМ дигидрохлорида гидразина, 21 мМ глицина, 10 мМ ЭДТА, рН 8.7), 1.8 НАД+, 2000 U/мл АДГ и перхлорный экстракт.

Определение концентрации пирувата проводили согласно методике Beutler Е., энзиматически в ходе реакции окисления пирувата до лактата с окислением флюоресцентного продукта НАДН, регистрируемого на длине волны 340 нм [Beutler Е. 1975]. В кювету добавляли 100 мМ буфера фосфата натрия (рН 7.5), 2 мМ НАДН, перхлорный экстракт, деионизованную воду, 100 U/мл лактатдегидрогеназы.

После измерения концентрации этанола строили графики зависимости его концентрации от времени. Для расчета начальной скорости окисления этанола проводили апроксимацию экспериментальных точек экспоненциальной функцией в программе OriginPro 8. Представленные в разделе Результаты скорости рассчитывали при условии, что гематокрит равен 100%.

Измерение эритроцитарных индексов. Количество клеток, средний объем эритроцита (MCV - mean corpuscular volume), среднее содержание гемоглобина в эритроците (МСН - mean corpuscular hemoglobin), средняя концентрация гемоглобина в

эритроците (МСНС - mean corpuscular hemoglobin concentration) были определены с помощью счетчика клеток Sysmex (Россия).

Изучение осмотической резистентности эритроцитов-биореакторов. Оценку осмотической резистентности эритроцитов-биореакторов проводили согласно работе [Shcherbachenko I.M., et al. 2007]. Кривые осмотической резистентности нативных эритроцитов и эритроцитов-биореакторов были получены при инкубации суспензии клеток (с гематокритом 5%) в буфере PBS при ступенчатом снижении осмотичности от 300 мОсм/кг до 0 мОсм/кг. Инкубацию проводили при постоянном перемешивании в течение 30 минут при комнатной температуре, после чего добавляли 20-процентрый раствор натрия хлорида для восстановления объема и формы нелизированных клеток. Затем на микропланшетном спектрофотометре измеряли значение светопропускания на длине волны 650 нм, которое показывает концентрацию клеток, устойчивых к лизису. Значение светопропускания, полученное для пробы, которую инкубировали при 300 мОсм/кг, было принято за 0 % гемолиза.

Измерение снижения активности «включенных» в эритроциты ферментов во время хранения. Эритроциты-биореакторы с «включенными» ферментами полученные в условно стерильных условиях добавляли к модифицированному раствору CPDA-1 в соотношении 8:1. Суспензию эритроцитов инкубировали при 4 °С в течение 7 суток. На первые, четвертые и седьмые сутки были взяты пробы для определения активности «включенных» ферментов. Для этого суспензию центрифугировали (1000 * g, 7 минут) для выделения эритроцитов. Затем клетки 3 раза отмывались трехкратным объемом буфера PBS. В полученных клеггках измеряли активность алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогеназы. Далее рассчитывали отношение активности фермента в клетках каждой пробы к активности фермента измеренной сразу после получения «нагруженных» эритроцитов (в процентах).

Математическая модель. Для количественного анализа метаболической системы в работе была использована математическая модель, основанная на работе [Martinov M.V. et al. 2000]. Для решения дифференциальных уравнений, описывающих изменения концентраций этанола, пирувата и НАД', использовали пакет программ DBSolve.

Статистическая обработка данных. Статистическая обработка была проведена с помощью программы OriginPro 8. Для определения значимости различий большого числа групп (более 2) использовали дисперсионный анализ с поправкой Бонферрони. Предварительно, данные проверяли на нормальное распределение с помощью критерия Колмогорова-Смирнова.

Результаты

1. Возможные причины, ограничивающие скорость окисления этанола эритроцитами-биореакторами в экспериментах in vitro

Из обзора литературы, посвященной созданию эритроцитов-биореакторов по окислению этанола, можно сделать вывод, что скорости работы биореакторов при их введении пациентам получились бы намного ниже скорости окисления этанола печенью. Причинами неэффективной работы биореакторов могут быть: низкое содержание ферментов внутри эритроцитов; недостаточное количество или скорость образования субстратов для ферментов (рис. I).

Рисунок 1. Схема работы эритроцитов-биореакторов но окислению этанола.

Алкогольдегидрогеиаза (АДГ) катализирует окисление этанола до ацетальдегида, и далее альдегиддегидрогеназа (АдЦГ) окисляет ацетальдегид в ацетат. Обе реакции проходят с восстановлением кофермента НАД*". Поступающий в результате гликолиза пируват превращается в лактат с помощью фермента лактатдегидрогеназы, содержащегося в нативных эритроцитах. При этом НАДН окисляется в НАД*, который требуется для прохождения обеих предыдущих реакций.

1.1. Оценка содержания алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогеназы в

эритроцитах для эффективной работы биореактора по окислению этанола

Для проверки первого предположения был проведен расчет с помощью

математической модели по данным работы рлгапо С., е! а1. 1998] (активность АДГ 13

и/мл, АдДГ 0.3 и/мл, ЛДГ 20 и/мл, гематокрит суспензии 25%) при условии, что

пируват и кофермент НАД1" содержатся в насыщающих концентрациях, т.е.

концентрация пирувата составила 100 мМ, концентрация НАД+ - 1 мМ. Результаты

расчетов представлены на рис. 2, из которого видно, что в среде менее чем за 8 ч

происходит окисление 30 ммоль/л этанола, т.е. начальная скорость окисления этанола в

11

эритроцитах составляет 17,1 ммоль/л эритроцитов в час, что в 10 раз выше скорости полученной авторами.

Рисунок 2. График зависимости концентрации этанола от времени. Результаты получены при расчете с помощью математической модели по данным статьи Lizano С., et al. при условии, что НАД* и пируват содержатся в насыщающих концентрациях. Расчет проводился при следующих условиях: гематокрит суспензии 25%, активность АДГ 13 U/л, АдДГ 0.3 U/л, ЛДГ 20 U/л, начальная концентрация пирувата 100 мМ, НАД* 1мМ.

Проведенный математический расчет показывает, что даже при указанной в работе [Lizano С., et al. 1998] активности ферментов в эритроцитах, достигается высокая скорость окисления этанола.

Из литературы известно, что скорость окисления этанола в организме человека составляет 2.7-7.1 ммоль/л крови в час [Jones A.W. et al. 1988; Keiding S. Et al. 1983; Zorzano A. et al. 1990]. Если исходить из дозы введения модифицированных эритроцитов, равной количеству эритроцитов в лечебной дозе переливаемой крови, то скорость окисления этанола должна быть не менее 40-50 ммоль в час на литр модифицированных эритроцитов, чтобы эффект введения был сравним с эффектом работающей печени.

С помощью математической модели были рассчитаны концентрации ферментов (алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогеназы) в эритроцитах, чтобы при их введении получить скорость близкую к скорости работы печени. Активность ферментов должна составлять: для алкогольдегидрогеназы не менее 5 U/мл, для альдегиддегидрогеназы не менее 2 U/мл. На рис. 3 представлены результаты такого

расчета. Данные концентрации ферментов в эритроцитах можно достаточно легко получить существующими методами «включении» белков.

Время, ч

Рисунок 3. График зависимости концентрации этанола от времени, полученный при расчете с помощью математической модели при следующих условиях: концентрация этанола 30 мМ, пирувата 70 мМ, НАД* 50 мкМ; активность АДГ 5 и/мл, АдДГ 2 и/мл, ЛДГ 19 и/мл; гематокрит суспензии эритроцитов 40%. Начальная скорость окисления этанола составила 40 ммоль/л эритроцитов в час.

1.2. Зависимость скорости окисления этанола от присутствия пирувата в среде

Для проверки гипотезы о том, что скорость окисления этанола ограничивается скоростью образования пирувата в процессе гликолиза, были проведены эксперименты, в которых эритроциты-биореакторы инкубировали в первом случае при концентрации пирувата в среде 60 мМ, во втором случае без добавления пирувата, т.е. пируват образовывался за счет гликолиза.

Как видно из графика (рис. 4), в среде, в которой присутствует пируват, начальная скорость окисления этилового спирта эритроцитами-биореакторами значительно выше - 30.0 ммоль/л эритроцитов в час (более, чем в 16 раз) по сравнению со скоростью, полученной во втором случае.

Начальная скорость окисления этанола в суспензии без пирувата составила 1,8 ммоль/л эритроцитов в час, что соответствует скорости гликолиза. Это подтверждает, что для образования и поддержания необходимой концентрации пирувата только за счет гликолиза недостаточно и, как следствие, необходимой концентрации НАД+, который участвует как в окислении этанола, так и в окислении ацетальдегида.

Время, мин

Рисунок 4. Окисление этанола эритроцитами-биореакторами in vitro в зависимости от концентрации пирувата в среде. ■ - эритроциты-биореакторы с 60 мМ пирувата в среде; о -эритроциты-биореакторы без добавления пирувата в среду. Апроксимация экспериментальных данных изображена сплошной кривой. Активность ферментов в клетках: 10 U/мл, 2.6 U/мл, 10 U/мл, для АДГ, АдДГ и ЛДГ, соответственно. Гематокрит суспензий в среднем составлял 28%. Представлен один из типичных экспериментов (п=5).

1.3. Компенсация потерь НАД* и НАДН

Так как коферментом реакций окисления этанола до ацетата ферментами АДГ и АдДГ является НАД+, превращающийся в НАДН, то уменьшение как концентрации НАД+, так и обоих коферментов может значительно снизить скорость окисления этанола. Снижение концентрации коферментов может происходить во время диализа на стадии образования «пор» в мембране клеток.

Для компенсации потерь НАД+ из клеток на этих стадиях во внешний раствор добавлялся НАД* для получения конечной концентрации 100 мкМ, что приблизительно равно его концентрации в нативных эритроцитах (48-92 мкМ) [Crescentini G., et aL 1984; Marshall W.E., et al. 1974; Omachi A., et al. 1969; Stocchi V., et al. 1985]. Для проверки данной гипотезы были проведены эксперименты, в которых часть суспензии эритроцитов была получена при наличии НАД+ во внешнем растворе, другая часть - в его отсутствии (рис. 5). Начальная скорость окисления этанола в среде в первом случае составила 7.3±1.2 ммоль/л эритроцитов в час, что в 3 раза выше скорости полученной во втором случае (2.5±0.4 ммоль/л эритроцитов в час).

Используя полученные экспериментальные данные, при помощи математической модели были вычислены значения концентрации НАД* в эритроцитах-биореакторах, которые составили 17.2 мкМ и 5.7 мкМ для первого и второго случая, соответственно. Следовательно, можно сказать, что при создании концентрации НАД+ во внешнем

контуре на уровне 100 мкМ, происходит увеличение его концентрации в эритроцитах-биореакторах в 3 раза, как и скорости окисления этанола.

Время, мин

Рисунок 5. Окисление этанола в среде эритропитами-биореакторами, полученными при отсутствии и наличии НАД+ во внешнем контуре. Экспериментальные данные полученные при: отсутствии НАД во внешнем контуре (Ht 32%) - о; при концентрации НАД* во внешнем контуре 100 мкМ (Ht 36%) - я. Результаты расчета по модели представлены в виде сплошной кривой. Активность ферментов в клетках: 4 U/мл и 0.35 U/мл, для АДГ и АдДГ, соответственно. Представлен один из типичных экспериментов.

Так как потери не только НАД+, но и НАДН могут снизить скорость работы биореакторов, для восполнения потерь обоих коферментов во время диализа во внешний раствор добавлялся не только НАД1", ко и НАДН в количествах, создающих концентрацию 100 мкМ каждого кофермента. Также дополнительно добавлялась их смесь к суспензии «открытых» эритроцитов до добавления в нее «запечатывающего» раствора (рис. 6).

Используя экспериментальные данные, при помощи математической модели были рассчитаны концентрации НАД+ для случаев, когда был добавлен не только НАД", но и НАДН, среднее значения которого составило 44±6 мкМ, что находится в пределах данных полученных другими авторами в нативных эритроцитах [Crescentini G., et al. 1984; Marshall W.E., et al. 1974; Omachi A., et al. 1969; Stocchi V., et al. 1985]. Такое восполнение потерь коферментов позволило увеличить скорость окисления этанола в 3.6 в представленном эксперименте (рис. 6). Начальная скорость окисления этанола в случае добавления НАД1" и НАДН составила 37.4 ммоль/л эритроцитов в час, для второго случая 10.4 ммоль/л эритроцитов в час.

Время, мин

Рнсунок 6. Окисление этанола в среде эритроцитами-биореакторамн, полученными при добавлении НАД+ и НАДН. Экспериментальные данные: ш - полученные при восполнении потерь НАД* и ПАДИ; о - полученные без добавления НАД*", НАДН во внешнем контуре; сплошные кривые - результаты расчета с помощью математической модели. Активность ферментов в эритроцитах для первого случая: АДГ 10 U/мл, АдЦГ 1.5 U/мл, ЛДГ 6 U/мл, Ht 27%; для второго: АДГ 9 U/мл, АдЦГ 2 U/мл, ЛДГ 6 U/мл, Ht 25%. Представлен один из типичных экспериментов (п=3).

Из этого можно сделать вывод, что одним из ограничителей высокой скорости окисления этанола эритроцитами-биореакторами служит пул НАД+ и НАДН, добавление которых при диализе позволяет восстановить их близкие к исходным концентрации в эритроцитах, увеличивая эффективность биореакторов более, чем в 3 раза.

2. Зависимость скорости убыли этанола от концентрации пирувата

Выше было показано, что пирувата, образующегося в процессе гликолиза, для эффективной работы биореактора недостаточно, следовательно, требуется дополнительный пригок пирувата. Так как в крови пируват содержится в невысоких (микромолярных) концентрациях (53.3±21.5 мкМ цельной крови [Beutler Е. 1975]) и поддерживается на постоянном уровне, то скорость убыли этанола в экспериментах с исходно высокой концентрацией пирувата может отличаться от скорости окисления этанола в условиях приближенным к in vivo (постояшюй низкой концентрацией пирувата).

С целью создания низких и постоянных концентраций пирувата в среде была разработана установка для постоянной подачи . микрообъемов высококонцентрированного раствора пирувата в суспензию биореакторов для поддержания концентрации на уровне 100 мкМ.

Была проведена серия экспериментов, в которых эритроциты, «нагруженные» ферментами, инкубировались в среде с исходно высокой и постоянно низкой концентрацией пирувата. В первом случае, в суспензии биореакторов присутствовал избыток пирувата - 50 мМ, что в 2,5 раза превышало начальную концентрацию этанола. Во втором, исходная концентрация пирувата была равна 100 мкМ и поддерживалась примерно на этом уровне в течение всей инкубации.

Из графика видно (рис. 7), что в обоих случаях скорости окисления этанола не отличаются. Т.е. такой уровень концентрации пирувата обеспечивает необходимую скорость окисления НАДН в НАД+ для эффективной работы алкогольдегадрогеназы и альдегиддегидрогеназы.

Рисунок 7. Зависимости концентрации этавола от времени в присутствии эритроцитов-биореакторов при различных концентрациях пирувата в инкубационной среде: ■ - постоянная концентрация пирувата в среде 100 мкМ; о - исходная концентрация пирувата в среде 50 мМ. Представлены типичные эксперименты. Активность ферментов в эритроцитах: 5 и/мл, 2 и/мл и 13.5 и/мл для АДГ, АдДГ и ЛДГ, соответственно. Гематокрит обеих суспензий 21%. Представлен один из типичных экспериментов (п=6).

3. «Включение» ферментов в эритроциты.

Поскольку эритроциты-биореакторы рассматриваются как длительно циркулирующие носители, потому как они применяются с целью постоянного снижения токсических концентраций метаболитов, то одним из критериев выбора метода «включения» ферментов в эритроциты является наибольшее сохранение их свойств. При использовании гипотонического диализа эритроциты-носители получаются с незначительными изменениями в структуре мембраны, с более

30

£ 25 о

0 50 100 150 200 250 300 Время, мин

равномерным распределением загруженного вещества среди клеток, с высоким процентом «включения» и высоким «выходом» клеток. Так же биохимические, биофизические и иммунологические свойства эритроцитов остаются близкими к свойствам нативных эритроцитов. «Нагруженные» клетки, полученные данным методом, имеют время жизни сравнимое с временем жизни нормальных клеток in vivo [Alvarez F.J., et al. 1996; Bax B.E., et al. 1999; Perez M.T., et al. 1999; Pitt E., et al. 1983]. Поэтому для получения эритроцитов-биореакторов был использован метод гипотонического диализа.

Для получения максимально возможного количества «нагруженных» клеток, по свойствам близким к нативным, с максимально возможным процентом «включения» алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогеназы, были проведены эксперименты по «включению» ферментов методами одно-, двух- и трехступенчатого диализа. Оценку результатов проводили по двум показателям: проценту «включения» по концентрации и проценту «включения» по активности. Отличие заключается в том, что в первом случае не учитывается выход клеток. Дшшые представлены на рис. 8 и табл. I. На панели А видно, что более высокий процент «включения» по концентрации как для алкогольдегвдрогеназы так и для альдегиддегидрогеназы достигается при одно- и трехступенчатом диализе. По второму показателю (панель Б) лучшим методом является одноступенчатый диализ. В этом случае «включение» ферментов по активности достигает 23,0±1,1% и 16,9±1,3% для алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогеназы, соответственно.

Рисунок 8. «Включение» ферментов (алкогольдегидрогеназы (АДГ) и альдегиддегидрогеназы (АдДГ)) методом одно-, двух- и трехступенчатого диализа. На панели А - «включение» ферментов по концентрации, на панели Б - «включение» ферментов по активности. Приведены средние значения и стандартные отклонения среднего, где п - число экспериментов. *р<0,05 относительно одноступенчатого диализа.

Таблица 1. Выход клеток при использовании одно-, двух-, трехступенчатого диализа.

Одноступенчатый диализ, (п=4) Двухступенчатый диализ, (п=9) Трехступенчатый диализ, (п=4)

Выход клеток, % 73,5±4,4 51,2±1,8 25,3±2,6

Приведены средние значения и стандартные отклонения среднего.

Эритроцитарные индексы, такие как средний объем эритроцитов (МСУ), среднее содержание гемоглобина в эритроците (МСН) и средняя концентрация гемоглобина в эритроците (МСНС), представлены в табл. 2. Из представленных данных видно, что у эритроцитов прошедших процедуру диализа вне зависимости от числа ступней происходит снижение МСУ. Также вследствие образования во время диализ в мембране эритроцитов пор, снижается МСН. И как видно из табл. 2 данные индексы практически не зависят от числа ступеней диализа.

Таблица 2. Индексы эритроцитов, полученных методом одно-, двух- и

трехступенчатого диализа.

Условия «включения» ферментов МСУ, фл МСН, пг МСНС, г/дл

Одноступенчатый диализ 71.4±1.9* 18.5±1.1* 26.0±1.7

Двухступенчатый диализ 77.4±1.3* 20.0±1.5* 26.0±2.3

Трехступенчатый диализ 71.3±3.4* 17.0±1.6* 24.0±3.3

Контрольные клетки 86.2±1.4 29.5±0.7 34.3±0.6

Приведены средние значения и стандартные отклонения среднего для 3 экспериментов. * р<0,05 при сравнении с контрольными клетками.

Для определения оптимальных условий «включения» АДГ и АдДГ была также изучена зависимость «включения» ферментов от осмоляльности раствора на стадии появления в мембране эритроцитов пор на примере двухступенчатого диализа. Данные по «включению» ферментов в экспериментах с разной осмоляльностью 2-го раствора представлены на рис. 9.

Как видно из рис. 9, «включение» обоих ферментов, как по концентрации, так и по активности практически не зависит от осмоляльности диализного раствора. Даже при значительном снижении осмотичности (около 60 мОсм/кг) «включение» ферментов не увеличивается, следовательно, для эффективного «включения» ферментов в

эритроциты осмотичность «открывающего» раствора может мОсм/кг, что позволит получить больший «выход» клеток.

быть снижена до 100-120

Рисупок 9. «Включение» ферментов (АДГ и АдДГ) при различпых осмолильпостях внешнего раствора на 2-й ступени. На панели А - диаграмма «включения» ферментов по концентрации, на панели Б - диаграмма «включения» ферментов по активности. Приведены средние значения и стандартные отклонения среднего (п=5). *р<0,05 при сравнении данных между собой в одной группе.

В табл. 3 представлены данные по МСУ, МСН, МСНС для эритроцитов, прошедших процедуру диализа при различных значениях осмоляльности, и для нативных клеток. Эритроцитарные индексы в пределах погрешности не зависят от осмоляльности диализного раствора. Результаты по средней концентрации гемоглобина согласуются с отсутствием различий в процентах «включения» ферментов при разных осмоляльностях.

Таблица 3. Эритроцитарные индексы при различных значениях осмоляльности внешнего раствора на 2-й ступени.

Осмотичность внешнего раствора MCV, фл МСН, пг МСНС, г/дл

56-67 мОсм/кг 77.0±2.9* 18.9±0.8* 24.6±1.0*

88-96 мОсм/кг 75.5±1.8* 19.б±0.9* 26.Ш.5*

115-118 мОсм/кг 77.5±3.2* 20.0Ü.0* 26.1±2.0*

Контрольные клетки 88.2±0.9 31.7±0.3 36.0±0.2

Приведены средние значения и стандартные отклонения среднего для 4 экспериментов. * р<0,05 при сравнении с контрольными клетками.

4.Исследоеание качества полученных эритроцитов 4.1. Изучение осмотической резистентности биореакторов Метод осмотической резистентности является надежным методом для оценки жизнеспособности эритроцитов-переносчиков in vitro и влияния «включенных» веществ на свойства клетки [Garin M.I., et al. 1996; Shcherbachenko 1.М., et al. 2007; Sprandel U., et al. 1985]. Для выбора оптимального метода «включения» ферментов, эритроциты-биореакторы, полученные при разном числе ступеней диализа, были исследованы методом осмотической резистентности (рис. 10).

Осмоляльность раствора, мОсм/кг

Рисунок 10. Осмотическая резистентность контрольных клеток (□) и эритроцитов, «нагруженных» ферментами с помощью одноступенчатого (•), двухступенчатого (Л) и трехступенчатого (■) диализа. Приведены средние значения и стандартные отклонения среднего, где число проведенных типичных экспериментов равно 3.

Как видно из рис. 10, кривые осмотической резистентности «нагруженных» и нативных клеток заметно отличаются. Гемолиз эритроцитов-биореакторов начинается при 220 мОсм/кг, тогда как контрольные клетки при такой осмотичности устойчивы. При осмотичности 100 мОсм/кг биореакторы, наоборот, более устойчивы по сравнению с контрольными клетками, которые уже почти полностью лизированы. При сравнении кривых осмотической резистентности для эритроцитов-биореакторов между собой можно сказать, что менее устойчивые клетки получаются при использовании 3-ступенчатого диализа. Гемолиз эритроцитов-биореакторов наблюдается при всех значениях осмоляльности раствора и увеличивается ступенчато, показывая наличие различных популяций клеток. Из графиков были найдены следующие значения \Ус50: 117 мОсм/кг, 110 мОсм/кг, 117 мОсм/кг и 144 мОсм/кг, для нативных эритроцитов и эритроцитов, полученных с помощью одно-, двух- и трехступенчатого диализа,

соответственно. Значения \Vc50 для одно- и двухступенчатого диализа близки к значению, полученному для нативных эритроцитов. Данные по осмотической резистентности не противоречат выбору одноступенчатого диализа в качестве оптимального.

4.2. Оценка активности «включенных» в эритроциты ферментов Для того, чтобы оценить способность «включенных» ферментов сохранять свою активность внутри эритроцитов после «включения», были проведены эксперименты по определению активности алкоголь- и альдегиддегидрогеназы в эритроцитах во время инкубации при +4 °С. Результаты определения активности ферментов в эритроцитах в течение 7 суток представлены в табл. 4. Из приведенных данных видно, что более стабильным ферментом является АДГ, у которой за 7 суток активность снижается меньше, чем на 13%, в то время как у АдДГ почти на 50%.

Таблица 4. Стабильность АДГ и АдДГ в эритроцитах во время инкубации.

Срок инкубации Относительная активность ферментов, %

Алкогольдегидрогеназа Альдегидаегидрогсназа

До инкубации 100% 100%

1-е сутки 100% 94.7±5.3%

4-е сутки 91.6±6.1% 70.9±3.0%*

7-е сутки 87.8±8.2% 51.8±10.0%*

Представлены средние значения и стандартные отклонения среднего, где п=3-5. *р < 0,05 относительно активности ферментов в эритроцитах сразу после процедуры «включения».

Обсуждение

Проанализировав литературные данные можно сделать вывод, что полученные эритроциты-биореакторы способны окислять этанол с низкой скоростью. Определив возможные причины не эффективной работы эритроцитов нагруженных алкогольдегидрогеназой и альдегиддегидрогеназой, были сделаны расчеты с помощью разработанной математической модели и проведены экспериментальные исследования. Так первой причиной могла быть недостаточная эффективность «включения» ферментов в эритроциты, что не позволяло получить необходимые концентрации

22

ферментов внутри эритроцитов. Используя математическую модель, были проведены расчеты, которые показали, что для получения скоростей окисления этанола в эритроцитах 30-50 ммоль/л эритроцитов в час, активности ферментов должны составлять около 5 U/мл и 2 U/мл, для алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогеназы, соответственно. Проанализировав результаты работы Lizano С. et al., с помощью математической модели, было показано, что при концентрациях ферментов указанных в данной работе можно получить скорость окисления этанола в 10 раз выше. Исходя из того, что ферментов достаточно, следующим этапом работы стал поиск других причин ограничивающих высокую скорость окисления этанола биореакторами и их решение. Идея создания биореактора связана с наличием субстратов для ферментов в необходимом количестве. В данном случае один из субстратов - пируват образуется в процессе гликолиза с максимальной скоростью 3-4 ммоль/л эритроцитов в час. И так как на реокисление двух молекул НАД+ необходимо 2 молекулы пирувата, то скорость окисления этанола будет в 2 раза ниже скорости гликолиза, т.е. 1.5-2 ммоль/л эритроцитов в час. Из чего можно сделать предположение, что неэффективная работа биореактора может быть связана с недостаточной скоростью образования пирувата в процессе гликолиза в эритроцитах. Для проверки такого предположения были проведены экспериментальные исследования, которые показали, что при наличии в суспензии эритроцитов-биореакторов пирувата в концентрации 60 мМ, начальная скорость окисления этанола будет более чем в 16 раз выше, чем в суспензии эритроцитов без пирувата (рис. 4). Это говорит о том, что скорости поступления пирувата только за счет гликолиза действительно недостаточно для эффективного функционирования биореакторов in vitro. Поэтому максимальная скорость гликолиза лимитировала скорость окисления этанола полученную в работе Lizano С., et al. Еще одна причина, ограничивающая скорость окисления этанола в эритроцитах, может заключаться в недостатке пула коферментов НАД* и НАДН. Их потеря может происходить во время диализа на стадии «включения» ферментов, когда в эритроцитах образуются поры, через которые выходит часть его содержимого. Так как данные коферменты участвуют в окислении этанола, то уменьшение их концентраций может значительно снизить скорость работы биореактора. Как показали экспериментальные исследования, восстановление потерь коферментов действительно позволило увеличить начальную скорость в 3.6 раза. Используя математическую модель, по экспериментальным данным были рассчитаны концентрации НАД* в клетках в случае добавления и без добавления пула коферментов. В первом случае были получены значения (38-50 мкМ) близкие к концентрации НАД+ в нативных эритроцитах согласно работам [Crescentini G., et al. 1984; Marshall W.E., et al. 1974; Omachi A., et al. 1969; Stocchi V., et al. 1985]. Во втором случае они составили 5.7-9.5 мкМ

В работе было показано, что скорости образования пирувата только в процессе гликолиза для эффективной работы биореактора in vitro недостаточно. В условиях in vivo концентрация пирувата в крови поддерживается на постоянном уровне (53.3±21.5 мкМ цельной крови [Beutler Е. 1975]) за счет его поступления из тканей. В экспериментах, в которых поддерживалась постоянная концентрация пирувата на уровне 100 мкМ в течение всего времени инкубации биореакторов и при его начальной избыточной концентрации, скорости окисления этанола не отличались. Т.е. в условиях организма, когда возможно поддержание концентрации пирувата, окисление этанола должно проходить эффективно.

Следующей задачей был выбор оптимального метода «включения» алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогеназы в эритроциты. Поскольку одним из важнейших свойств эритроцитов-биореакторов является продолжительное время циркуляции в крови с целью постоянного снижения токсических концентраций метаболитов, то одним из критериев выбора метода «включения» ферментов в эритроциты является наибольшее сохранение их свойств. Из литературы известно, что при приготовлении эритроцитов-носителей методом гипотонического диализа воздействие на клетки минимально. Поэтому для получения эритроцитов-биореакторов был использован метод гипотонического диализа. Сравнивая методы одно-, двух, трехступенчатого диализа по проценту «включения» по активности алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогеназы в эритроциты, наибольший процент «включения» был получен при одноступенчатом диализе для обоих ферментов. При оценке эритроцитарных индексов показано, что при использовании данного метода происходит уменьшение объема эритроцитов по сравнению с нативпыми эритроцитами. Наблюдается также уменьшение содержания гемоглобина вследствие его выхода во время процедуры диализа. В результате снижения среднего объема эритроцитов и содержания гемоглобина в эритроците, наблюдается уменьшение средней концентрации гемоглобина в эритроците. Снижение, как среднего объема эритроцитов, так и среднего содержания гемоглобина в эритроците, было ранее описано в литературе [Magnani М., et al. 1990; Sanz S., et al. 1998]. Сравнение эритроцитарных индексов у биореакторов полученных разными методами показывает отсутствие различий в пределах ошибки.

. При изучении осмотической резистентности эритроцитов «нагруженных» ферментами в сравнении с нативными эритроцитами было показано, что эритроциты полученные методом трехступенчатого диализа менее устойчивы при снижении осмотичности среды. Гемолиз эритроцитов-биореакторов начинается при таких значениях осмотичности, при которых нативные эритроциты еще устойчивы (220-150 мОсм/кг). Эритроциты-биореакторы, которые лизируют при таком значении осмотичности, могут быть отнесены к клеткам, которые недостаточно восстановились

24

после процедуры диализа. При осмоляльности ниже 120 мОсм/кг у эритроцитов после процедуры диализа наоборот наблюдается меньший процент гемолиза, т.е. они более устойчивы к пониженной осмотичности среды. Так как эритроциты, «нагруженные» алкогольдегидрогеназой и альдегиддегидрогеназой, рассматриваются, как длительно циркулирующие биореакторы, для их эффективного функционирования также было важно оценить способность ферментов «включенных» в эритроциты сохранять активность. Из представленных в работе данных можно отметить, что более стабильным ферментом является алкогольдегидрогеназа, активность которой в течение 7 дней снижается незначительно. Активность второго фермента за этот период времени снижается почти в 2 раза. Полученные нами результаты согласуются с литературными данными, в которых биореакторы были получены методом электропорации [Lizano С., et al. 2001].

Таким образом, наши результаты показывают, что скорость работы биореакторов по окислению этанола и ацетальдегида можно многократно увеличить, в 45 и более раз. Такое увеличение эффективности может, например, улучшить терапию пациентов с ферментативной недостаточностью, например, при отсутствии митохоцдриальной формы альдегиддегидрогеназы с низким значением константы Михаэлиса или при алкогольной интоксикации, зачастую сопровождающейся алкогольной болезнью печени.

ВЫВОДЫ

1. Теоретический анализ показал, что низкая скорость окисления этанола эритроцитами лимитируется не концентрацией ферментов, а концентрациями низкомолекулярных субстратов. Существующие методы «включения» белковых препаратов эффективны и позволяют «включать» необходимые концентрации алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогеназы в эритроциты человека.

2. Показано, что одной из главных причин, ограничивающих высокую скорость окисления этанола, является недостаток пирувата. В присутствии избытка пиру вата скорость окисления этанола возрастает в 17 раз.

3. Восстановление пула коферментов НАД+ и НАДН в эритроцитах позволяет увеличить скорость окисления этанола более чем в 3 раза.

4. Определены оптимальные условия «включения» алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогеназы в эритроциты человека методом одноступенчатого гипотонического диализа.

Материалы диссертационной работы изложены в следующих, публикациях:

1. Сарбаш В.И., Тихонова А.Г., Вуймо Т.А., Дербов А.Л., Александрович Ю.Г., Бутылин А.А., Витвицкий В.М., Атауллаханов Ф.И. Эритроциты — носители лекарственных препаратов. Российский Химический Журнал, 2007, т. L1, № 1, стр. 143-149.

2. Тихонова AT., Александрович Ю.Г., Вуймо Т.А., Синауридзе Е.И., Атауллаханов Ф.И. Эритроциты как переносчики антрациклиновых антибиотиков. Терапевтический архив, 2008, т. 80, №7, стр. 91-94.

3. Тихонова А.Г., Вуймо Т.А., Александрович Ю.Г., Синауридзе Е.И., Дербов А.Л., Атауллаханов Ф.И. Сравнение диализных методов «включения» белковых препаратов в эритроциты. Материалы IV Московского Международного Конгресса «Биотехнология и медицина», 14-17 марта 2006, Москва, Россия, стр. 92-95.

4. Тихонова А.Г., Александрович Ю.Г., Вуймо Т.А., Дербов А.Л., Сарбаш В.И., Атауллаханов Ф.И. Биореактор для переработки этанола на основе эритроцитов. Тезисы VI Международной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика», Москва, Россия, 23-24 ноября 2006, стр. 257-258 .

5. Тихонова А.Г., Александрович Ю.Г., Вуймо Т.А., Дербов А.Л., Сарбаш В.И., Синауридзе Е.И., Атауллаханов Ф.И. Эритроцит - биореактор для переработки этанола. Сборник тезисов 11-ой Путинской международной школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», 29 октября - 2 ноября 2007, Пущино, Россия, стр. 284-285.

6. Тихонова А.Г., Александрович Ю.Г., Дербов А.Л., Атауллаханов Ф.И. Применение клеток крови и нанокапсул в качестве биореакторов. Сборник тезисов Международного форума по нанотехнологиям, 03-05 декабря 2008, Москва, Россия, стр. 357-358.

7. Скороход А.А., Витвицкий В.М., Куликова Е.В., Тихонова А.Г., Александрович Ю.Г., Атауллаханов Ф.И. Эритроциты как переносчики антибиотиков антрациклинового ряда. Тезисы Всероссийской научной конференции с международным участием «Нанотехнологии в онкологии 2008», 06 декабря 2008, Москва, Россия, стр. 169.

8. Tikhonova A., Alexandrovich Y., Derbov A., Vuimo Т., Ataullakhanov F. Red blood cells as bioreactors for ethanol processing. 14th European Congress on Biotechnology "Symbiosis", 13-16 September 2009, Barcelona, Spain. New Biotechnology, 2009, 25 (1), pp. S376-S377.

Подписано в печать 16.12.2009 г.

Печать трафаретная

Заказ № 3778 Тираж: 100 экз.

Типография «11 -й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www. autoreferat. ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Тихонова, Анастасия Геннадьевна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Морфология и физиология эритроцитов.

1.2. Преимущества, достигаемые при использовании эритроцитов-переносчиков.

1.3. Методы приготовления эритроцитов-переносчиков.

Гипоосмотический гемолиз.

Электропорация.

Эндоцитоз.

Увеличение проницаемости мембраны с помощью антибиотиков.

Ультразвук.

Включение» белков с помощью низкомолекулярного протамина.

Метод инкубации.

Направленная доставка.

1.4. Примеры использования нагруженных эритроцитов.1S

Эритроциты как переносчики аналогов нуклеотида.

Эритроциты как переносчики глюкокортикоидных аналогов.

Эритроциты как переносчики лекарственных веществ.

Эритроциты как переносчики белков.

1.5. Попытки использования эритроцитов-биореакторов для окисления этанола.

1.6. Метаболизм этанола.

Абсорбция, распределение и элиминация этанола.

Системы, метаболизирующие этанол.

Токсическое действие алкоголя и его метаболитов.

1.7. Сведения о ферментах, использованных в данной работе.

Алкогольдегидрогеназа.

Альдегиддегидрогеназа.

ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.2. Методы.

2.2.1. Исследование работы каскада ферментов вне клетки.

2.2.2. Математическая модель.

2.2.3. Приготовление суспензии эритроцитов человека.

2.2.4. Приготовление суспензии эритроцитов мыши.

2.2.5. Получение биореакторов на основе эритроцитов человека.

2.2.6. Получение биореакторов на основе эритроцитов мышей.

2.2.7. Приготовление лизатов эритроцитов.

2.2.8. Измерение активности ферментов.

2.2.9. Приготовление перхлорных экстрактов проб.

2.2.10. Измерения концентрации этанола и пирувата.

2.2.11. Измерение эритроцитарных индексов.

2.2.12. Изучение осмотической резистентности эритроцитов-биореакторов

2.2.13. Изучение распределения эритроцитов, нагруженных алкогольдегидрогеназой и альдегиддегидрогеназой, по плотностям.

2.2.14. Измерение снижения активности «включенных» в эритроциты ферментов во время хранения.

2.2.15. Измерение степени гемолиза эритроцитов-биореакторов во время хранения.

2.2.16. Окраска эритроцитов мыши флуоресцеин-изотиоционатом и определение количества циркулирующих в кровяном русле флуоресцеин-изотиоционат-положительных клеток.

2.2.17. Статистическая обработка данных.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Сравнение теоретических расчетов с экспериментальными данными.

3.2.Возможные причины, ограничивающие скорость окисления этанола эритроцитами-биореакторами в экспериментах in vitro.

3.2.1.0ценка содержания алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогеназы в эритроцитах для эффективной работы биореактора по окислению этанола

3.2.2. Зависимость скорости окисления этанола от присутствия пирувата в среде.

3.2.3. Компенсация потерь НАД4" и НАДН.

3.3. Зависимость скорости убыли этанола от концентрации пирувата.

3.4. «Включение» ферментов в эритроциты.

3.5. Исследование качества полученных клеток.

3.5.1. Изучение осмотической резистентности эритроцитов-биореакторов, полученных методом одно-, двух- и трехступенчатого диализа.

3.5.2. Изучение распределения эритроцитов, нагруженных алкогольдегдрогеназой и альдегиддегидрогеназой, по плотностям.

3.5.3. Оценка активности «включенных» в эритроциты ферментов и гемолиз эритроцитов-биореакторов во время хранения.

3.5.4. Определение количества циркулирующих в кровяном русле мыши ФИТЦ-положительных клеток.

ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Эритроциты как носители ферментов для окисления этанола"

Актуальность темы

Более 35 лет назад было показано, что эритроциты как носители могут успешно использоваться в клинической практике. Это возможно потому, что данные клетки отличаются некоторыми уникальными преимуществами по сравнению с другими системами доставки лекарств. Эритроциты являются не только натуральными, безопасными и доступными в препаративном количестве, но и способны к биодеградации, длительно циркулируют в крови (в среднем 120 дней [1]), снижают аллергические и иммунологические реакции на введение белковых препаратов в кровь. Существует ряд направлений в использовании эритроцитов-переносчиков, одно из которых состоит в том, что клетки рассматриваются не как пассивные переносчики, а как биореакторы. Это возможно за счет «включения» ферментов, которые в ряде случаев не содержатся в нативных эритроцитах, и благодаря тому, что субстраты и продукты реакций, катализируемых данными ферментами, достаточно хорошо проходят через мембрану эритроцита. Такие носители могли бы эффективно перерабатывать токсическое вещество непосредственно в кровотоке. Идея использовать эритроциты в качестве биореакторов была высказана около 30 лет назад [2-4] и доведена до применения в клинической практике на примере ряда ферментов (L-аспарагиназа, аденозиндеаминаза) [5,6]. В эритроциты был «включен» целый ряд ферментов, которые были предложены для терапии таких болезней и состояний как: острый лимфобластный лейкоз [3,5,7-11], лимфосаркома [3,5,7-11], болезнь Гоше [12,13], гипераммониемия [14-16], интоксикация метанолом [17] и др. Результаты ряда работ подтверждают, что нагруженные ферментами эритроциты удаляют из кровеносного русла токсические и повышенные концентрации различных соединений (таких как метанол и формальдегид при отравлении метанолом, глюкоза при диабете).

Эритроциты-биореакторы для снижения в крови концентрации этанола и ацетальдегида - главного токсического продукта метаболизма спирта, были предложены около 10 лет назад. С этой целью в эритроциты были «включены» два фермента: алкогольдегидрогеназа и альдегиддегидрогеназа. К сожалению, данная разработка как и многие другие не используются в клинике в настоящее время. Мы полагаем, что проблема может заключаться в неэффективной скорости работы биореакторов. В данной работе были изучены возможные причины, ограничивающие высокую скорость биореактора на примере окисления этанола.

Цель работы

Целью работы было выяснение причин ограничивающих скорость окисления этилового спирта эритроцитами-биореакторами в условиях in vitro и преодоление этих ограничений с целью увеличения скорости окисления спирта в ацетат.

Задачи исследования

1. Исследование зависимости эффективности работы ферментов (алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогеназы) от их количества и от доступности субстратов (пирувата, НАД', НАДН).

2. Выбор оптимальных условий для «включения» максимального количества ферментов в эритроциты.

3. Изучение влияния процедуры «загрузки» ферментов на функциональную полноценность клеток.

4. Оценка стабильности «включенных» в эритроциты ферментов в процессе хранения.

Научная новизна

В результате работы были выяснены причины, ограничивающие высокую эффективность эритроцитов-биореакторов по окислению этанола, и найдены пути их преодоления. Были разработаны методы, позволяющие эффективно включать белки с достаточно большим молекулярным весом и получать «нагруженные» эритроциты близкие по биохимическим и биофизическим свойствам с нативными эритроцитами. Был произведен сравнительный анализ биореакторов, полученных различными методами по нескольким характеристикам таким как: определение осмотической резистентности эритроцитов, распределение нагруженных эритроцитов по плотностям, измерение эритроцитарных индексов. Было показано, что метод одноступенчатого гипоосмотического диализа является предпочтительным по сравнению с двух- и трехступенчатым как по проценту «включения» ферментов, так и по жизнеспособности эритроцитов. Изучение эритроцитов во время хранения показало, что в течение 7 суток не происходит значительного снижения активности «включенных» в эритроциты ферментов.

Практическая ценность работы

Полученные результаты важны для понимания причин, которые ограничивают скорость не только окисления этанола, но и иных субстратов в случае создания других эритроцитов-биореакторов, В данной работе было показано, что скорость работы эритроцитов-биореакторов по окислению этанола и ацетальдегида можно многократно увеличить, в 45 и более раз. Такое увеличение эффективности может, например, улучшить терапию пациентов при отсутствии митохондриальной формы альдегиддегидрогеназы с низким значением константы Михаэлиса или при алкогольной интоксикации, зачастую сопровождающейся алкогольной болезнью печени.

Положения, выносимые на защиту

1. Одним из ограничителей эффективной работы эритроцитов-биореакторов по окислению этанола является пируват, поступление которого только за счет гликолиза недостаточно. В его присутствии скорость увеличивается в 17 раз.

2. Вторым ограничителем служит пул НАД4" и НАДН, добавление которых при диализе позволяет восстановить их близкие к исходным концентрации в эритроцитах, увеличивая эффективность работы эритроцитов-биореакторов в 3 раза.

3. Разработаны методы «включения» алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогеназы в эритроциты человека позволяющие получать высокий процент «включения» белков и клетки сходные по биохимическим и биофизическим свойствам с нативными. Оптимальным методом «включения» ферментов является одноступенчатый метод диализа.

4. При хранении эритроцитов-биореакторов в течение 7 суток происходит снижение активности альдегиддегидрогеназы в 2 раза, тогда как активность алкогольдегидрогеназы снижается незначительно.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Тихонова, Анастасия Геннадьевна

выводы

1. Теоретический анализ показал, что низкая скорость окисления этанола эритроцитами лимитируется не концентрацией ферментов, а концентрациями низкомолекулярных субстратов. Существующие методы «включения» белковых препаратов эффективны и позволяют «включать» необходимые концентрации алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогеназы в эритроциты человека.

2. Показано, что одной из главных причин, ограничивающих высокую скорость окисления этанола, является недостаток пирувата. В присутствии его избытка скорость окисления этанола возрастает в 17 раз.

3. Восстановление пула коферментов НАД+ и НАДН в эритроцитах позволяет увеличить скорость окисления этанола более чем в 3 раза.

4. Определены оптимальные условия «включения» алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогеназы в эритроциты человека методом одноступенчатого гипотонического диализа.

БЛАГОДАРНОСТИ

За помощь в получении биореакторов на основе эритроцитов человека A.JI. Дербова. Благодарю и.о. руководителя и сотрудников Лаборатории метаболического моделирования и биоинформатики Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН за помощь в исследовании количества циркулирующих в кровяном русле мыши ФИТЦ-положительных клеток. За критическое прочтение манускрипта Ю.Г. Александрович, д.м.н. Л.И. Ершову, к.б.н. Е.С. Шурхину. Огромная благодарность научному руководителю д.б.н. Ф.И. Атауллаханову.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тихонова, Анастасия Геннадьевна, Москва

1. Гайтон АК, Холл ДжЭ. Медицинская физиология. Логосфера, 2008.

2. Adriaenssens К, Karcher D, Lowenthal A, Terheggen HG. Use of enzyme-loaded erythrocytes in in-vitro correction of arginase-deficient erythrocytes in familial hyperargininemia. Clin Chern 1976; 22: 323-326.

3. Updike SJ, Wakamiya RT, Lightfoot EN, Jr. Asparaginase entrapped in red blood cells: action and survival. Science 1976; 193: 681-683.

4. Ihler G, Lantzy A, Purpura J, Glew RH. Enzymatic degradation of uric acid by uricase-loaded human erythrocytes. J Clin Invest 1975; 56: 595-602.

5. Kravtzoff R, Desbois I, Lamagnere JP, Muh JP, Yalat C, Chassaigne M, Colombat P, Ropars C. Improved pharmacodynamics of L-asparaginase-loaded in human red blood cells. Eur J Clin Pharmacol 1996; 49: 465-470.

6. Bax BE, Bain MD, Fairbanks LD, Webster AD, Ind PW, Hershfield MS, Chalmers RA. A 9-yr evaluation of carrier erythrocyte encapsulated adenosine deaminase (ADA) therapy in a patient with adult-type ADA deficiency. Eur J Haematol 2007; 79: 338-348.

7. Updike SJ. Entrapment of L-asparaginase in red blood cells. A strategy to improve treatment of acute lymphoblastic leukemia. Bibl Haematol 1985; 6574.

8. Kravtzoff R, Desbois I, Doinel C, Colombat P, Lamagnere JP, Chassaigne M, Ropars C. Immunological response to L-asparaginase loaded into red blood cells. Adv Exp Med Biol 1992; 326: 175-182.

9. Alpar HO, Lewis DA. Therapeutic efficacy of asparaginase encapsulated in intact erythrocytes. Biochem Pharmacol 1985; 34: 257-261.

10. Sinauridze EI, Vitvitsky VM, Pichugin AV, Zhabotinsky AM, Ataullakhanov FI. A new chemotherapeutic agent: L-asparaginase entrapped in red blood cells. Adv Exp Med Biol 1992; 326: 203-206.

11. Kwon YM, Chung HS, Moon C, Yockman J, Park YJ, Gitlin SD, David AE, Yang VC. L-Asparaginase encapsulated intact erythrocytes for treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL). J Control Release 2009.

12. Beutler E, Dale GL, Guinto DE, Kuhl W. Enzyme replacement therapy in Gaucher's disease: preliminary clinical trial of a new enzyme preparation. Proc Natl Acad Sci USA 1977; 74: 4620-4623.

13. Bax BE, Bain MD, Ward CP, Fensom AH, Chalmers RA. The entrapment of mannose-terminated glucocerebrosidase (Alglucerase) in human carrier erythrocytes. Biochem Soc Trans 1996; 24: 44IS.

14. Sanz S, Lizano C, Luque J, Pinilla M. In vitro and in vivo study of glutamate dehydrogenase encapsulated into mouse erythrocytes by a hypotonic dialysis procedure. Life Sci 1999; 65: 2781-2789.

15. Venediktova N1, Kosenko EA, Kaminsky YG. Studies on ammocytes: development, metabolic characteristics, and detoxication of ammonium. Bull Exp Biol Med 2008; 146: 730-732.

16. Kosenko EA, Venediktova N1, Kudryavtsev AA, Ataullakhanov FI, Kaminsky YG, Felipo V, Montoliu C. Encapsulation of glutamine synthetase in mouse erythrocytes: a new procedure for ammonia detoxification. Biochem Cell Biol 2008; 86: 469-476.

17. Magnani M, Fazi A, Mangani F, Rossi L, Mancini U. Methanol detoxification by enzyme-loaded erythrocytes. Biotechnol ApplBiochem 1993; 18 ( Pt 3): 217-226.

18. Greer JP, Foerster J, Rodgers GM, Paraskevas F, Glader B, Arber DA, Means RT. Wintrobe's Clinical Hematology. Wolters Kluwer Health, 2008.

19. Lichtman MA, Beutler E, Seligsohn U, Kauchansky K, Kipps TJ. Williams Hematology. McGrew-Hill Medical, 2005.

20. Козинец ГИ, Шишканова ЗГ, Сарычева ТГ, Новодержкина ЮК, Дягилева OA, Проценко ДД. Нормальное кроветворение. In: Козинец ГИ (editor). Клетки крови и костного мозга. Москва: Медицинское информационное агенство, 2004; 23-57.

21. Исследование системы крови в клинической практике. Москва: Триада-Х, 1998.

22. Ihler GM. Erythrocyte carriers. Pharmacol Ther 1983; 20: 151-169.

23. Lewis DA, Alpar HO. Therapeutic possibilities of drugs encapsulated in erythrocytes. Int JPharm 1984; 22: 137-146.

24. Talwar N, Jain NK. Erythrocyte based delivery system of primaquine: in vitro characterization. JMicroencapsul 1992; 9: 357-364.

25. Bax BE, Bain MD, Talbot PJ, Parker-Williams EJ, Chalmers RA. Survival of human carrier erythrocytes in vivo. Clin Sci (Lond) 1999; 96: 171-178.

26. Eichler HG, Gasic S, Bauer K, Korn A, Bacher S. In vivo clearance of antibody-sensitized human drug carrier erythrocytes. Clin Pharmacol Ther 1986; 40: 300-303.

27. Pitt E, Johnson CM, Lewis DA, Jenner DA, Offord RE. Encapsulation of drugs in intact erythrocytes: an intravenous delivery system. Biochem Pharmacol 1983; 32: 3359-3368.

28. Seeman P, Cheng D, lies GH. Structure of membrane holes in osmotic and saponin hemolysis. J Cell Biol 1973; 56: 519-527.

29. Ihler GM, Tsang HC. Hypotonic hemolysis methods for entrapment of agents in resealed erythrocytes. Methods Enzymol 1987; 149: 221-229.

30. Dale GL. High-efficiency entrapment of enzymes in resealed red cell ghosts by dialysis. Methods Enzymol 1987; 149: 229-234.

31. Ropars C, Avenard G, Chassaigne M. Large-scale entrapment of drugs into resealed red blood cells using a continuous-flow dialysis system. Methods Enzymol 1987; 149: 242-248.

32. Сарбаш ВИ, Тихонова АГ, Вуймо ТА, Дербов AJI, Александрович ЮГ, Бутылин АА, Витвицкий ВМ, Атауллаханов ФИ. Эритроциты носители лекарственных препаратов. Рос хим ж (Ж Рос хим об-ва им Д И Менделеева) 2007; LI: 143-149.

33. Hoffman JF, Eden М, Bedell RHS. The hemolytic volume of human erythrocytes. J Cell and Comp Physiol 1958; 51: 405-414.

34. Lieber MR, Steck TL. A description of the holes in human erythrocyte membrane ghosts. J Biol Chem 1982; 257: 11651-11659.

35. Lieber MR, Steck TL. Dynamics of the holes in human erythrocyte membrane ghosts. J Biol Chem 1982; 257: 11660-11666.

36. Seeman P. Transient holes in the erythrocyte membrane during hypotonic hemolysis and stable holes in the membrane after lysis by saponin and lysolecithin. J Cell Biol 1967; 32: 55-70.

37. Stewart GN. The conditions that underlie the peculiarities in the behaviour of the coloured blood-corpuscles to certain substances. J Physiol 1901; 26: 470496.

38. Stewart GN. The mechanism of haemolysis with special reference to the relations of electrolytes to cells. JPharm Exp Therap 1909; 1: 49-121.

39. Adair GS. The identity of haemoglobin in human beings. J Physiol 1921; 55: 332-338.

40. Bayliss LE. Reversible haemolysis. J Physiol 1924; 59: 48-60.

41. Hoffman JF. Physiological characteristics of human red blood cell ghosts. J Gen Physiol 1958; 42: 9-28.

42. Hanahan DJ, Ekholm JE, Luthra MG. Is lipid lost during preparation of erythrocyte membranes? Biochim Biophys Acta 1974; 363: 283-286.

43. Schrier SL, Zachowski A, Herve P, Kader JC, Devaux PF. Transmembrane redistribution of phospholipids of the human red cell membrane during hypotonic hemolysis. Biochim Biophys Acta 1992; 1105: 170-176.

44. Hoffman JF. The active transport of sodium by ghosts of human red blood cells. J Gen Physiol 1962; 45: 837-859.

45. Sprandel U. Temperature-induced shape transformation of carrier erythrocytes. Res Exp Med (Berl) 1990; 190:267-275.

46. Ihler GM, Glew RH, Schnure FW. Enzyme loading of erythrocytes. Proc Natl AcadSci USA 1973; 70: 2663-2666.

47. Rechsteiner MC. Uptake of proteins by red blood cells. Exp Cell Res 1975; 93: 487-492.

48. Humphreys JD, Ihler G. Enhanced stability of erythrocyte-entrapped glucocerebrosidase activity. J Lab Clin Med 1980; 96: 682-692.

49. Billah MM, Finean JB, Coleman R, Michell RH. Preparation of erythrocyte ghosts by a glycol-induced osmotic lysis under isoionic conditions. Biochim Biophys Acta 1976; 433: 54-62.

50. Sprandel U, Hubbard AR, Chalmers RA. In vitro studies on resealed erythrocyte ghosts as protein carriers. Res Exp Med (Berl) 1979; 175: 239-245.

51. Deloach J, Ihler G. A dialysis procedure for loading erythrocytes with enzymes and lipids. Biochim Biophys Acta 1977; 496: 136-145.

52. DeLoach JR, Harris RL, Ihler GM. An erythrocyte encapsulator dialyzer used in preparing large quantities of erythrocyte ghosts and encapsulation of a pesticide in erythrocyte ghosts. Anal Biochem 1980; 102: 220-227.

53. DeLoach JR. Dialysis method for entrapment of proteins into resealed red blood cells. Methods Enzymol 1987; 149: 235-242.

54. Small WC, Goldstein JH. The effect of the cryoprotectants, dimethylsulfoxide and glycerol on water transport in the human red blood cell. Biochim Biophys Acta 1982; 720: 81-86.

55. Mosca A, Paleari R, Russo V, Rosti E, Nano R, Boicelli A, Villa S, Zanella A. IHP entrapment into human erythrocytes: comparison between hypotonic dialysis and DMSO osmotic pulse. Adv Exp Med Biol 1992; 326: 19-26.

56. Franco RS, Weiner M, Wagner K, Martelo О J. Incorporation of inositol hexaphosphate into red blood cells mediated by dimethyl sulfoxide. Life Sci 1983; 32: 2763-2768.

57. Franco RS, Wagner K, Weiner M, Martelo OJ. Preparation of low-affinity red cells with dimethylsulfoxide-mediated inositol hexaphosphate incorporation: hemoglobin and ATP recovery using a continuous-flow method. Am JHematol 1984; 17: 393-400.

58. Franco RS, Barker R, Novick S, Weiner M, Martelo О J. Effect of inositol hexaphosphate on the transient behavior of red cells following a DMSO-induced osmotic pulse. J Cell Physiol 1986; 129: 221-229.

59. Tsong TY. Electroporation of cell membranes. Biophys J 1991; 60: 297-306.

60. Kinosita K, Jr., Tsong TT. Hemolysis of human erythrocytes by transient electric field. Proc Natl Acad Sci USA 1977; 74: 1923-1927.

61. Kinosita K, Jr., Tsong TY. Voltage-induced pore formation and hemolysis of human erythrocytes. Biochim Biophys Acta 1977; 471: 227-242.

62. Kinosita К, Jr., Tsong TY. Formation and resealing of pores of controlled sizes in human erythrocyte membrane. Nature 1977; 268: 438-441.

63. Bliss JG, Harrison GI, Mourant JR, Powell KT, Weaver JC. Electroporation: the population distribution of macromolecular uptake and shape changes in red blood cells following a single 50 (is square wave pulse. Bioelectrochem Bioenerg 1988; 20: 57-71.

64. Chang DC, Reese TS. Changes in membrane structure induced by electroporation as revealed by rapid-freezing electron microscopy. Biophys J 1990; 58: 1-12.

65. Sowers AE, Lieber MR. Electropore diameters, lifetimes, numbers, and locations in individual erythrocyte ghosts. FEBSLett 1986; 205: 179-184.

66. Lizano C, Sanz S, Luque J, Pinilla M. In vitro study of alcohol dehydrogenase and acetaldehyde dehydrogenase encapsulated into human erythrocytes by an electroporation procedure. Biochim Biophys Acta 1998; 1425: 328-336.

67. Dong Q, Jin W. Monitoring diclofenac sodium in single human erythrocytes introduced by electroporation using capillary zone electrophoresis with electrochemical detection. Electrophoresis 2001; 22: 2786-2792.

68. Zeira M, Tosi PF, Mouneimne Y, Lazarte J, Sneed L, Volsky DJ, Nicolau C. Full-length CD4 electroinserted in the erythrocyte membrane as a long-lived inhibitor of infection by human immunodeficiency virus. Proc Natl Acad Sci U SA 1991; 88:4409-4413.

69. Schrier SL, Junga I, Krueger J, Johnson M. Requirements of drug-induced endocytosis by intact human erythrocytes. Blood Cells 1978; 4: 339-359.

70. Schrier SL, Zachowski A, Devaux PF. Mechanisms of amphipath-induced stomatocytosis in human erythrocytes. Blood 1992; 79: 782-786.

71. Ben-Bassat I, Bensch KG, Schrier SL. Drug-induced erythrocyte membrane internalization. J Clin Invest 1972; 51: 1833-1844.

72. Schrier SL. Drug-induced endocytosis and entrapment in red cells and ghosts. Methods Enzymol 1987; 149: 260-270.

73. Matovcik LM, Junga IG, Schrier SL. Drug-induced endocytosis of neonatal erythrocytes. Blood 1985; 65: 1056-1063.

74. Ginn FL, Hochstein P, Trump BF. Membrane alterations in hemolysis: Internalization of plasmalemma induced by primaquine. Science 1969; 164: 843-845.

75. Ihler MG. Entrapment of DNA and fluorescent compounds in erythrocyte carriers by endocytosis. Bibl Haematol 1985; 127-133.

76. Deuticke B, Kim M, Zollner C. The influence of amphotericin В on the permeability of mammalian erythrocytes to nonelectrolytes, anions and cations. Biochim Biophys Acta 1973; 318: 345-359.

77. Kitao T, Hattori K. Erythrocyte entrapment of daunomycin by amphotericin В without hemolysis. Cancer Res 1980; 40: 1351-1353.

78. Yamagata K, Kawasaki E, Kawarai H, lino M. Encapsulation of concentrated protein into erythrocyte porated by continuous-wave ultrasound. Ultrasound Med Biol 2008; 34: 1924-1933.

79. Tonetti M, Astroff B, Satterfield W, De FA, Benatti U, DeLoach JR. Construction and characterization of adriamycin-loaded canine red blood cells as a potential slow delivery system. Biotechnol Appl Biochem 1990; 12: 621629.

80. Ataullakhanov FI, Kulikova EV, Vitvitsky VM. Doxorubicin binding by humanerythrocytes. Advances in the Biosciences 1994; 92: 163-168.90

81. Атауллаханов ФИ, Баташева ТВ, Витвицкий ВМ. Влияние температуры, концентрации даунорубицина и гематокрита суспензии на связывание даунорубицина эритроцитами человека. Антибиотики и химиотерапия 1994; 39: 9-10.

82. Вуймо ТА, Куликова ЕВ, Синауридзе ЕИ, Александрович ЮГ, Лисовская ИЛ, Юркевич AM, Атауллаханов ФИ. Создание новой лекарственной формы антрациклинового антибиотика митоксантрона путем включения его в эритроциты. Молекулярная Медицина 2008; 37-43.

83. Magnani М, Rossi L, Brandi G, Schiavano GF, Montroni M, Piedimonte G. Targeting antiretroviral nucleoside analogues in phosphorylated form to macrophages: in vitro and in vivo studies. Proc Natl Acad Sci USA 1992; 89: 6477-6481.

84. Chiarantini L, Rossi L, Fraternale A, Magnani M. Modulated red blood cell survival by membrane protein clustering. Mol Cell Biochem 1995; 144: 53-59.

85. Gourley DR. Human erythrocyte ghosts prepared to contain various metabolites. JAppl Physiol 1957; 10: 511-518.

86. Marsden NV, Ostling SG. Accumulation of dextran in human red cells after haemolysis. Nature 1959; 184(Suppl 10): 723-724.

87. Zimmermann U, Riemann F, Pilwat G. Enzyme loading of electrically homogeneous human red blood cell ghosts prepared by dielelctric breakdown. Biochim Biophys Acta 1976; 436: 460-474.

88. Magnani M, Giovine M, Fraternale A, Damonte G, Rossi L, Scarfi S, Benatti U, De FA. Red blood cells as a delivery system for AZT. DrugDeliv 1995; 2: 5761.

89. Ascenzo MD, Antonelli A, Chiarantini L, Mancini U, Magnani M. Red blood cells as glucocorticoids delivery system. In: Sprandel U, Way JL (editors). Erythrocytes as drug carriers in medicine. New York: Plenum Press, 1997; 8188.

90. Crinelli R, Antonelli A, Bianchi M, Gentilini L, Scaramucci S, Magnani M. Selective inhibition of NF-kB activation and TNF-alpha production in macrophages by red blood cell-mediated delivery of dexamethasone. Blood Cells MolDis 2000; 26: 211-222.92.