Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние этанола на функциональное состояние печени и его коррекция растительными препаратами

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние этанола на функциональное состояние печени и его коррекция растительными препаратами"

Р Г 5 ОД

На правах рукописи

- 9 ОКТ 1305

ФОМЕНКО СВЕТЛАНА ЕВГЕНЬЕВНА

ВЛИЯНИЕ ЭТАНОЛА НА ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ПЕЧЕНИ И ЕГО КОРРЕКЦИЯ РАСТИТЕЛЬНЫМИ ПРЕПАРАТАМИ

03.00.13 - Физиология человека и животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владивосток - 1995 год

Работа выполнена в Тихоокеанском океанологическом институте ДВО РАН ( директор - член-корреспондент РАН В.А.Акуличев )

Научный руководитель: доктор биологических наук

Н.Ф.Кушнерова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Ю.С.Хотимченко кандидат медицинских наук А.В.Кропотов

Ведущая организация : Научно - исследовательский институт

экологии человека и гигиены окружающей среда им. А.Н.Сысина РАМН

Защита диссертации состоится " ,1995г.

в "_" часов на заседании диссертационного совета

К 003.66.02 при Институте биологии моря ДВО РАН по адресе: 690041, Владивосток-41, ул. Пальчевского, 17. Институт биологии моря.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке ДВО РАН.

Автореферат разослан

ЛЬ ■• е^у^^к:

1995 года

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук . м. Гнеэдилова

общая характеристика работы.

Актуальность проблемы. Загрязнение окружающей среды, бесконтрольное применение лекарств и препаратов бытовой химии, алкоголизм и токсикомания являются основными социально-бытовыми факторами, приводящими к поражению внутренних органов. При этом ведущее положение занимают поражения печени, которая является основным органом, участвующим в метаболизме и детоксикации чужеродных соединений (ксенобиотиков).Среди токсических поражений печени особое место занимает интоксикация этанолом.

Длительное воздействие этанола на организм приводит к морфологическим и функциональным изменениям жизненно важных органов и физиологических систем организма.

На основании многочисленных экспериментальных исследований выявлены основные патофизиологические звенья в механизме алкогольного поражения печени: жировая инфильтрация и дистрофия, усиление перекисного окисления липидов, угнетение реакций цикла Кребса и глюконеогенеза ( Никитин и др.,1985; Скакун и др.,1985; Островский и др., 1988; Кершенгольц, 1990; Шишов, 1991; French, 1989; Cuieeard et al., 1991). Следствием этого является нарушение всех обменных процессов в организме.

Одним из новых подходов к поиску средств, снижающих токсические эффекты этанола,следует считать поиск препаратов, оказывающих гепатопротекторное действие,в частности, способствующих сохранению функционального состояния органов и систем в организме.

В последнее время в нашей стране и за рубежом среди лекарственных средств, используемых при поражении организма токсическими веществами различного происхождения (загрязнители атмосферного воздуха, промышленные яды, этанольная интоксикация и др.), начинают применяться растительные полифенольные препараты, обладающие гепатозащитными свойствами ( силибинин, легалон, ЛИВ-52, катерген и др.). Терапевтическая активность названных препаратов не всегда оказывается достаточной (Саратиков, Венгеровский, 1995). Все они являются импортными средствами, что побуждает к поиску новых отечественных гепатоэащитных средств.

Попытки применить растительные препараты, в частности элеутерококк, для восстановления функционального состояния организма при экстремальном воздействии были предприняты О.И.Кирилловым (1966),В.Г.Голотиным и соавт.(1986.1989), И.В.Дардымовым (1986,

- г -

1987),С.Е.Ли (1986).Э.И.Х.асиной <1986,1993),В.Г.Спрыгиным(1989).

Несмотря на имеющиеся данные о влиянии полифенолов и содержащих их растительных средств на отдельные метаболические реакции в организме животных и человека, многие механизмы этого Действия остаются мало изученными. Практически отсутствуют сведения о влиянии растительных экстрактов флавоноидной природы на изменения липидного и углеводного обманов, вызванных воздействием этанола, которые тесно связаны с его метаболизмом в организме.

, Предложенные нами, в качестве возможных гепатозащитных средств, экстракты из гребней винограда и листьев зеленого и черного байхового чая, основными компонентами которых являются флавоноиды, исследовались на модели алкогольной интоксикации в остром и хроническом эксперименте.

Познание механизмов протекторного действия растительных экстрактов на фоне изменения метаболических реакций, вызванных эта-нольной интоксикацией (углеводный и липидный обмен, содержание углеводсодержащих биополимеров, активность лизосональных ферментов, состояние этанолокисляющей ферментативной системы), может быть полезным для практического использования данных экстрактов в качестве средств коррекции, возникающих метаболических изменений в организме под действием этанола.

Паль и ?дпдцм исслапования. Основная цель данной работы состояла в экспериментальном исследовании влияния этанола и его сочетания с экстрактами из гребней винограда, листьев зеленого и черного байхового чая на метаболические реакции в организме животных и человека.

Для поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Сравнить уровень потребления этанола и этанола с добавкой экстракта из гребней винограда у крыс в условиях свободного выбора и изучить особенности элиминации этанола в организме под действием экстракта.

2. Изучить влияние этанола и его сочетания с экстрактом из гребней винограда на ферментативную активность этанолокисляющей системы (алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогеназы) в печени крыс.

3. Изучить состояние липидного и некоторых звеньев углеводного обмена в печени крыс в динамике 3-х и 6-и месячного потребления этанола и этанола с добавкой экстракта из гребней винограда.

4. Изучить влияние этанола и этанола в сочетании с экстракта-

ми из листьев зеленого и черного байхового чая на метаболические реакции в печени мышей.

5. Изучить действие чистых катехинов: (-)эпикатехина и (-опигаллокатехина, вводимых животным одновременно с этанолом, на метаболические реакции печени.

6. Изучить динамику концентрации этанола и некоторых параметров липидного и углеводного обмена в крови здоровых добровольцев при однократном приеме этанола и этанола с экстрактом из гребней винограда.

Научная новизна. В представленной работе на основании результатов комплексного исследования впервые установлено регулирующее влияние экстракта из гребней винограда на функциональное состояние печени в условиях интоксикации этанолом. Под действием экстракта из гребней винограда меняется алкогольная мотивация животных, что проявлялось в снижении количества потребляемого с ним этанола. Механизм антитоксического действия экстракта из гребней винограда в условиях интоксикации этанолом обусловлен изменением метаболизма этанола в организме: происходит замедление наработки ацетальдегида в связи с восстановлением его в этанол. Введение экстракта из гребней винограда в качестве добавки в этанол сопровождается восстановлением этерифицирующей функции печени и оказывает защитное влияние на биомембраны гепатоцитов.

Впервые установлено выраженное действие экстрактов из листьев зеленого и черного чая на восстановление этерифицирующей функции печени, подавленной этанолом, что проявлялось в снижении повышенного уровня триацилглицеридов и холестерина, увеличении образования эфиров холестерина и метаболически активных фракций фос-фолипидов. Установлено, что протекторный эффект чайных экстрактов обусловлен, в первую очередь, входящими в их состав флавоно-идами. Впервые показано регулирующее влияние как экстрактов из листьев чая, так и чайных катехинов на сохранение концентрации кофермента НАД"*" в пределах нормы, что особенно важно в условиях алкогольной интоксикации.

Положения, выносимые на защиту:

1. Экстракт из гребней винограда, вводимый в качестве добавки в этанол,меняет алкогольную мотивацию и метаболизм этанола в организме, путем восстановления образовавшегося ацетальдегида в этанол.

2. Экстракт из гребней винограда обладает выраженным гепато-

и мембранопротекторным эффектом против токсического действия этанола.

3. Уменьшение гепатотоксического действия этанола на метаболические реакции в организме животных при введении экстрактов из листьев зеленого и черного чая обусловлено, в первую очередь, катехинами,преимущественно входящими в состав чайных экстрактов.

Практическая значимость- Проведенные экспериментальные исследования позволили обосновать и сформулировать научные положения, способствующие пониманию механизмов, лежащих в основе гепато- и мембранопротекторных эффектов экстрактов природного происхождения против повреждающего действия этанола.

Представленные в работе результаты изученных параметров у экспериментальных животных и испытуемых добровольцев, дают основания рекомендовать экстракты из гребней винограда и листьев зеленого и черного байхового чая в качестве средств коррекции.возникающих метаболических изменений в организме,вызванных этанолом.

Апробяпия. Основные результаты работы были представлены на годичной отчетной сессии Ученого Совета Тихоокеанского океанологического института ДВО РАН ( Владивосток,1994), Российской научной конференции "Антигипоксанты и актопротекторы" (С.-Петербург ,1994), на заседании Совета Отделения проблем регуляции биологических процессов ТОЙ ДВО РАН, на Цитофизиологическом семинаре Института биологии моря ДВО РАН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ.

Объем и структура писсортдпии. Работа изложена на 170 страницах машинописного текста и состоит из введения, главы, посвященной обзору литературы, главы с общей характеристикой материалов и методов исследования, 4-х глав собственных наблюдений и обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и библиографического указателя, включающего 239 названий, в том числе 92 работ зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 20 таблицами и 12 рисунками.

Характеристика материалов и метолов исслеловяния. В экспериментальных исследованиях применялись растительные экстракты из гребней винограда и листьев зеленого и черного байхового чая, утвержденные Институтом питания АН СССР, как пищевые добавки (заключение N 72-1881/14 от 13.02.82г.).Также было исследовано действие чистых катехинов: (-)эпикатехина и (-)эпигаллокатехина,

любезно предоставленных нам лабораторией биологически активных веществ НИИ садоводства,виноградарства и виноделия Грузии. Там же было проведено исследование химического состава экстракта, выделенного из гребней винограда.

Экстракты иэ гребней винограда и листьев зеленого и черного чая готовили на 40% растворе этилового спирта, где в процессе реперколяции на 1 кг сырья выход экстракта составлял 1л (1:1). Готовый спиртовый экстракт упаривали на водяной бане до 1/3 объема для удаления этанола и затем доводили дистиллированной водой до исходного объема.

Эксперименты выполнены на половозрелых крысах-самцах линии Вистар (200 шт), беспородных крысах (100шт) массой 180-200 г и белых мышах-самцах (80 шт) массой 18-20г.

Изучение действия этанола и этанола в сочетании с растительными препаратами на функциональное состояние печени включало следующие разделы:

- В хроническом эксперименте (15 недель) на крысах линии Вистар изучалось количество потребляемого этанола в условиях свободного выбора между водой и 15% этанолом и свободного выбора между водой и комбинированным раствором 15% этанола с экстрактом (5%) из гребней винограда (5 мл экстракта на 100 мл 15% этанола ).Через 13 недель добровольной алкоголизации животных лишали доступа к растворам на 10 дней (период депривации), а затем вновь помещали в прежние условия свободного выбора на 1 неделю.

- Для исследования элиминации этанола использовались беспородные крысы, которым вводили внутрибрюшинно 25Х этанол в тест-дозе 1г/кг массы на фоне предварительного потребления 15% этанола или 15% этанола с добавкой экстракта иэ гребней виногра-

В работе приняты следующие сокращения: АДГ-алкогольдегидроге-наза, АлДГ-альдегиддегидрогеназа, АлАТ-аланинаминотрансфераза, В -гал - 0-галактозидаза, 3-глю - О-глюкозидаза, ПВК- пирови-ноградная кислота, ТАГ-тризцилглицериды,ХС-холестерин, ЭХС-эфиры холестерина,СЖК-свободные жирные кислоты, ЭЖК-эфиры жирных кислот, ФХ-фосфатидилхолин, ЛФХ-лизофосфатидилхолин, СМ-сфингомие-лин, ФЭ-фосфатидилэтаноламин, ФС-фосфатидипсерин, ФИ-фосфатидили-нозит, ДФГ-дифосфатиднпглицерин,ФК-фосфатидная кислота, об.ФЛ -общие фосфолипиды, НЛ-нейтральные липиды.

да (5%) в течение 3 недель. Контролем служили животные, получавшие в этот период воду. Кровь отбирали из разреза хвоста по 100 мкл через 30, 60, 120, 240 мин после введения этанола.

- Изучение влияния в течение 3-х и 6-ти месяцев 15% этанола и этанола с экстрактом из гребней винограда. Предложенные растворы животные (крысы линии Вистар) получали с помощью поилочного способа. Контрольные животные потребляли воду.

- Изучение влияния экстрактов из листьев зеленого и черного байхового чая, а также (-)эпикатехина и (-)эпигаллокатехина, выделенных из чайных листьев,на фоне острой интоксикации этанолом. В связи с этим, мышам-самцам ежедневно через зонд вводили экстракты из листьев зеленого или черного чая в дозе 2 мл на 1кг массы. Чайные катехины животные получали в виде водных растворов перорально ежедневно в дозе 200 мг на 1кг массы. Одновременно 2 раза в сутки животным внутрибрюшинно вводили 33% этанол в дозе 7,5 мл/кг. Контролем служили животные, находившиеся в стандартных условиях вивария.Все растворы вводились в течение 10 дней. Использована схема эксперимента, разработанная A.Gaidos et al. (1973).Через сутки после последнего введения растворов,часть животных была декапитирована,оставшиеся животные находились в стандартных условиях вивария в течение 15 дней (период депривации).

- Изучение влияния этанола и экстракта из гребней винограда на динамику метаболических реакций у здоровых мужчин-добровольцев (3 группы по 10 человек в каждой) : lrpynna - испытуемые получали 40% раствор этанола ,2 группа - комбинированный раствор из 40% этанола и экстракта из гребней винограда (5%),3 группа -водный раствор с экстрактом (5%). Все растворы испытуемые получали однократно в количестве Змл/кг массы тела ( 1г/кг массы тела абсолютного спирта). Исследование крови проводили в динамике: до приема растворов (фон), через 1,2 и 4 часа после приема.

В число испытуемых включали психически и соматически здоровых мужчин в возрасте 25-30 лет, у которых исключался прием спиртных напитков в течение 15 дней до начала эксперимента.

Метаболические реакции в печени и крови изучались с помощью следующих биохимических методов:

Методы исследования липидного обмена. 1.Экстракция липидов из ткани печени и сыворотки крови( (Folch et al., 1957). 2.Определение общих фосфолипидов (Vaekovsky et al.,1975). 3. Определение нейтральных липидов (Amenta,1964).

4.Фракции фосфолипидов методом тонкослойной хроматографии в двух направлениях (Svetashev,Vaskovsky.1972). 5.Количественное содержание фракций фосфолипидов (Vaskovsky et al.,1975). 6.Системы растворителей для микротонкослойной хроматографии (Rouser,1967, Wagner et al.,1961, Кейтс,1975, Vaskovsky et al.,1975).

Методы исследования углеводного обмена. 8.Содержание глюкозы,активности АлАТ определяли с помощью стандартных наборов реактивов "Био-тест" фирмы "Лахема" (ЧССР).9.Активность 3-галактозидаэы и 3-глюкозидазы в печени по методу А.А.Покровского (1969).10.Содержание молочной кислоты в сыворотке крови ( Баркер и Соммерсон в модификации Р.В.Меркурьевой и др.,1982).11.Содержание пировиноградной кислоты (Умбрайт,1951). 12.Концентрация окисленной формы кофермента НАД-' (Kllngenberg, 1963).13.Определение содержания углеводов, связанных с белками: гексоэ (Holt,1954).гексуроновых кислот (Dleche,1949).гексозами-нов (Elson,Morgan,1933) - в модификации Р.В.Меркурьевой (1963).

Методы изучения метаболизма этанола.

14.Активность АДГ ( Bonnichen, Brink,1955, Scursky et al., 1979.

15. Активность АлДГ ( Tottmar et al.,1973). Î6. Концентрация этанола в крови ( Кудрявцев, Ушаков, 1980). j

При изучении метаболизма этанола использована однокамерная модель с выведением ( Соловьев и др.,1980).Статистический анализ проводился методом вариационной статистики и корреляционного анализа ( Каминский, 1974).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Особенности метаболизма этанола v крис при сочетанмом его действии с экстрактом из гребней винограпа.

При исследовании уровня потребления 15% этанола и 15% этанола с добавкой экстракта из гребней винограда у крыс в условиях свободного выбора,отмечалась выраженная тенденция к снижению потребления этанола с экстрактом .начиная с 8-й недели эксперимента. Среднесуточное количество потребляемого животными этанола с добавкой экстракта снизилось в этот период на 43% (Р<0,01) и составило 15,3 ¿1,49 по сравнению с 26,8 *1,33 мл/кг в группе животных, потреблявших этанол без добавки.

После 10-дневной депривации у животных,помещенных вновь в условия свободного выбора между этанолом и водой, отмечалось увеличение количества потребляемого этанола (на 19% больше, чем до депривации), что является показателем увеличения степени влече-

»!М0/4,/НАДН/»*«

г.тка»« 8.0

7.0

в.О --

г.о --

1.0

АДГ (сюстрат лисгл/штиО

АДГ

(овстрлт этанол)

ЛлДГ (они.)

АлДГ (с сыс.Км)

ААДГ (с уюк-Ки)

I 1ттттд

Рис. 1. Активность ААГ и АлЛГ в печени крыс после потребления этанола с

и этанола с экстрактом из гребней винограда в течение 3 неаеа

*- Р<0,05; #*- Р<0,01.

вия к алкоголю ( Буров,1985). Потребление этанола в сочетании с экстрактом было в 2раза ниже (13,0 42,41 против 29,4 ¿3,13 мл/кг в сутки у животных, потреблявших этанол без до&авки экстракта (Р< О,001).Таким образом,в условиях хронической интоксикации этанолом добавка экстракта из гребней винограда меняет алкогольную мотивацию у животных, что проявляется в снижении количества потребляемого с ним этанола.

При анализе скорости элиминации этанола из организма было установлено, что добавление экстракта из гребней винограда в эта-"нол сопровождалось достоверным увеличением времени полувыведения этанола (Т1/2) на 10% и уменьшением константы элиминации (К«1) на 9% по сравнению с контролем.

При внутрибрюшинном введении тест-дозы (1г/кг) 25% этанола с экстрактом отмечалось существенное снижение общего клиренса (СМ ( 1,52 ±0,06 по сравнению с 1,91 ¿0,09 л/кг ч у крыс, получивших тест-дозу 25% этанола; Р<0,01) и увеличение площади под фар-макохинетической кривой (Б) на 25%(Р<0,01),что указывает на снижение элиминации этанола из организма под действием экстракта.

При изучении активности этанолокисляющей ферментативной системы в печени крыс, потреблявших в течение 3 недель этанол, а

также этанол в сочетании с экстрактом из гребней винограда,не выявлено достоверных изменений активности АДГ,с этанолом в качестве субстрата, по сравнению с контролем. Активность же АДГ,с ацетальдегидом в качестве субстрата, достоверно повысилась (на 24%) под действием экстракта, по сравнению с аналогичным показателем в печени животных, потреблявших этанол без добавки (рис.1). То есть, под действием экстракта из гребней винограда происходит восстановление ацетальдегида в этанол. В этом случае АДГ функционирует как ацетальдегидредуктаэа.

При исследовании активности АлДГ в печени крыс, потреблявших этанол в течение 3 недель, отмечалось значительное увеличение (в 2раза) активности АлДГ с низкой Км по сравнению с контролем,в то время как активность АлДГ с высокой Км - снижена на 19% (Р<0,05).Это соответствует известным в литературе данным: именно АлДГ с низкой К« играет ведущую роль в окислении ацетальдегида (Koivula et al.,1975; Greenfield et al.,1976; Aokl et al.,1989).

Потребление животными этанола в сочетании с экстрактом приводит к снижению как общей активности АлДГ печени, так и активностей ее изоферментов (Рис.1). Особенно значительно понизилась активность АлДГ с низкой Км (на 52%) по сравнению с аналогичным показателем у животных, получавших этанол без добавки. Эти данные согласуются с выявленным достоверным увеличением редуктазной активности АДГ под действием экстракта: происходит замедление наработки ацетальдегида в связи с восстановлением его в этанол, что и подтверждается снижением активности АлДГ, так как данный фермент является индуцибельным.

Состояние липидного и некоторых звеньев углеводного обмена в печени крып в динамике 3 и 6 мес потребления этанола и этанола в сочетании с экстрактом из гребней винограда. Метаболизм этанола в организме сопряжен с различными путями обмена веществ через ацетил-КоА, образующийся при его полном окислении, что приводит к значительным изменениям углеводного и липидного обменов ( Успенский,1984;Буров,Ведерникова,1985; Скакун и др.,1985; Островский и др.,1988; Lieber,1985). Одним из путей коррекции метаболических реакций, нарушенных воздействием этанола на организм,является, по нашему предположению,добавление в этанол гепатопротекторов в виде экстрактов растительного происхождения .

Исследование содержания фракций НЛ в печени крыс через 3 мес

потребления 15% этанола IРис.2а) показало достоверное увеличение ТАГ на 48% (Р<0,001), снижение СЖК на 17% (Р<0,05) при одновременном увеличении уровня их эфиров на 18% (Р< 0,01).Кроме того, наблюдалось увеличение уровня ХС на 16% (Р<0,05) под действием этанола и снижение ЭХС на 10% (Р<0,05).

При потреблении этанола в течение 6 мес установлена аналогичная направленность изменений в содержании НЛ в печени экспериментальных животных.Содержания ТАГ превысило контрольный уровень на 20% (Р<0,05), снизилось содержание СЖК на 16% (Р<:0,05) {Рис.26). Отмеченная идентичность результатов, полученных при потреблении этанола в течение 3 и 6 мес,свидетельствует о сохранении эффекта неблагоприятного действия этанола при увеличении длительности эксперимента.

■ Таким образом, действие этанола на организм экспериментальных животных проявлялось в активации периферического липолиза, что привело к повышенному поступлению ТАГ в печень. Снижение уровня СЖК связано с усилением их этерификации в ТАГ, а повышенный уровень ЗЖК может быть обусловлен этерификацией жирных кислот с этанолом ( Островский и др.,1986).Повышение содержания свободного ХС в печени происходит эа счет избыточного накопления ацетил-КоА, образующегося при полном окислении этанола (Lieber,1981).

В содержании фракций НЛ печени крыс,потреблявших этанол с добавкой экстракта из гребней винограда в течение 3 мес, уровень ТАГ возрос в среднем на 29% (Р<0,001), но это ниже такового показателя у животных, потреблявших этанол без добавки (увеличение на 48%) (Рис.2).Содержание СХК уменьшилось на 10% (Р<0,05) при одновременном увеличении ЭЖК на 13%. Важно отметить, что в этот период под действием экстракта количество ХС и его эфиров находилось в пределах контрольных значений. К концу 6 мес потребления этанола с экстрактом отмечалась тенденция к нормализации количественного содержания фракций НЛ в печени крыс.

Таким образом, эффект экстракта из гребней винограда, сопровождающийся снижением ХС, обусловлен либо активацией включения ацетил-КоА в цикл Кребса, либо мобилизацией ХС по пути синтеза желчных кислот. Как указывают в своих исследованиях Скакун и Степанова (1988).флавоноиды обладают способностью активировать 7 й-холестерингидроксилазу, участвующую в окислении ХС в желчные кислоты.

Известно, что этанол является мембранотропным химическим сое-

+%

+ 50± + 40..

+ 30.. + 20.. + 10..

а <

о а. II -201 о

* -30

-10..

-10.. -20.. -30..

-40.. -%-у

***

***

**

ТАГ

иг

*

сжк

[Ж

эжк хс

ТР

*

эхе

н -40-

0

а+145~,

* +77..

ш х

ш +60 2

П +40 г

+30 ..

н +20..

1

и +10 .. а

ш

Г~|— Этанол

¡Щ-Этанол + экстракт из гребней винограда

ш.

/9-глю /2-гал.

Гексоз— амины

** ***

Гексоэы

А.

**

*** сз

***

**

ИГ

*

ТАГ

т

л

эжк

хс

эхе

*

сжк

**

/9-глю.

** р-Г&П.

** Гексоз— *** амины Гексоаы

Рис.2. Изменение биохимических параметров печени крыс (в % от контроля) при потреблении 15% этанола и комбинированного раствора 15% этанола с экстрактом из гребней винограда в течение 3 месяцев (а) и 6 месяцев (б).

динением v Успенский, 1984-, Буров, Ведерникова, 1985; Chrusci-el,1982; Goldstein, Chin, 1981). Являясь антиоксидантами, поли-фенольные соединения стабилизируют процессы, происходящие на биологических мембранах, ингибируя образование свободных радикалов (Барабой, 1987). в связи с этим, мы исследовали изменения в структурной организации углеводсодержащих биополимеров, входящих в состав мембранных гликопротеидов и гликозаминогликанов.

Определение содержания гексоз и гексозаминов в гликопротеидах печени крыс, потреблявших этанол, выявило снижение их уровня. Особенно существенные отклонения были установлены к концу б мес потребления этанола. При этом отмечалось достоверное снижение белковосвязанных гексоэ и гексозаминов на 42 и 38% (85 - 5,6 ммоль/кг и 169 ±30,2 ммоль/кг против 147 ±8,0 ммоль/кг и 273,5 ±9,8 ммоль/кг в контроле,соответственно) .Одновременно достоверно увеличивалась активность 8-глю на 77% (Р<0,01) и 0-гал на 145% (Р<0,001)(Рис.26).

Таким образом, длительное воздействие этанола (3-6 мес),сопровождающееся снижением белковосвязанных гексоз и гексозаминов, обусловлено усилением катаболизма гликоконьюгатов с участием ли-зосомальных гидролаэ. Отмеченные повышения активности 8-глю и, особенно, матричного фермента лизосом С-гал, свидетельствуют о нарушении структурной целостности лизосомальных мембран и повышении их проницаемости, что согласуется с фактом мембранотроп-ности этанола.

Добавление экстракта из гребней винограда в этанол уменьшает мембранотропное действие этанола, сохраняя структуру углеводсодержащих биополимеров, а также нормализуя активность исследуемых лизосомальных ферментов. Через 6 мес потребления этанола с добавкой экстракта отмечалось достоверное увеличение содержания гексозаминов на 53%(Р<0,01),а в содержании гексоз прослеживалась тенденция к нормализации их уровня. При этом активность 0-гал достоверно снизилась на 26% (Р<0,01).

Анализируя вышеизложенное следует отметить,что экстракт из гребней винограда оказывает протективное влияние на биомембраны, препятствуя нарушению ее проницаемости.

Влияние этанола и экстрактов из листьев зеленого и черного

байхогюго_чая.а также вхоляших в их состав (-Чэпикатехина и

(-)эпигаллокатехина на метаболические реакции печени мышей. Среди пищевых добавок растительного происхождения наиболее

широко используются листья чая. Для чая характерны универсальность действия на все виды обмена, отсутствие побочных действий, сочетание профилактических и лечебных свойств (Иванов, 19УЗ).

Задача исследовании сводилась к выявлению возможности использования экстрактов из листьев зеленого и черного чая в качестве гепатопротекторов в условиях интоксикации этанолом.

В результате 10-дневной интоксикации мышей 33% этанолом,в печени животных были выявлены нарушения липидного обмена. Достоверно возросло содержание ТАГ (на 42%) и ХС (на 18%) при одновременном снижении уровня ЭХС (на 31%)(рис.За ).

Анализ фосфолипидных фракций печени интоксицированных этанолом животных указывает на увеличение проницаемости мембран гепа-тоцитов. Свидетельством тому служит достоверное снижение уровня СМ (на 13%), фосфолипида, уменьшение которого характеризует усиление "текучести" мембран (Куликов,1988), а также наблюдаемая разбалансировка фракционного состава ФЛ ( уменьшение содержания ФС на 20% (Р<0,001), повышение уровня ФИ в 2 раза (Р<0,001) .

Так как, изученные биохимические параметры в печени животных, получавших наряду с этанолом "чайные" препараты, приближались к уровню контрольных значений, то в дальнейшем мы проводили сравнительный анализ полученных данных с таковыми у животных, подвергнутых интоксикации этанолом.

В содержании НЛ печени мышей, получавших наряду с этанолом экстракты из листьев зеленого и черного чая, выявлено снижение ТАГ на 36 (Р<0,01) и 39% (Р< 0,001)»соответственно, и повышение ЭХС на 20 и 50% (Р<0,01) (Рис.Зб.в). В фракционном составе печени мышей.получавших одновременно с этанолом (-)эпикатехин и (-)эпигаллокатехин,отмечались аналогичные снижения ТАГ на 27 и 21% (Р<0,01) и повышение ЭХС на 44 и 24% (Р<0,05), соответственно (Рис.Зг,д).Кроме того, у всех животных, получавших "чайные" препараты, наблюдалась выраженная тенденция к повышению эжк и снижению ХС печени. Такие изменения в содержании НЛ, наблюдаемые как под действием чайных экстрактов, так и их катехинов, свидетельствуют о восстановлении этерифицирующей функции печени, подавленной этанолом.

В фосфолипидном спектре печени мышей, которым вводили "чайные" препараты на фоне интоксикации этанолом, отмечено увеличение содержания метаболически активных фракций фл: фс, ФК, а также структурного компонента мембран см и снижение уровня фи и

у «

таг

НАД

Гексозы

ЭХС НАД+

Гексозы

ЭЖК сжк

Контроль

таг

эжк сжк

таг

НАД

Гехсоэы

НАД

Гексозы

Рис.3. Сравнительная характеристика биохимических

ПАРАМЕТРОВ ПЕЧЕНИ МЫШЕИвПРИ ИЗУЧЕНИИ ГЕПАТО— ПРОТ ЕКТ О РН О ГО ДЕЙСТВИЯ "чАИНЫх" ПРЕПАРАТОВ, ВВОДИМЫХ В СОЧЕТАНИИ С ЭТАНОЛОМ.

к —эта но гц Б —этанол + экстракт из листьев зеленого чая: в —эталол + экстракт из листьев черного чая; Г -этавол + эпикатехин: д —этанол + эпигаллока техкн.

ЛФХ. Это, в свою очередь, способствовало восстановлению мембранной проницаемости, так как ФК и ФС - необходимы для нормального функционирования транспортных АТФаз (Бурлакова,1977; Рыбальчен-ко,Курский, 1977). То есть, чайные экстракты и катехины обладают мембранопротекторным эффектом, о чем также свидетельствует факт снижения уровня ЛФХ. Данный феномен обусловлен известной способностью полифенолов ингибировать фосфолипазу Аг и тем самым препятствовать разрушению соответствующих ФЛ (Венгеровский и др.,1987). Мембранопротекторный механизм действия "чайных" препаратов обусловлен также их способностью нормализовать соотношение углеводов в углеводсодержащих биополимерах.Уровень гексоз, связанных с белками, в печени мышей, получавших с этанолом "чайные" препараты остарался в пределах контрольных значений (Рис.Зб-д). Это,вероятно, обусловлено способностью катехинов ингибировать глюкозидазы и гиалуронидазу, участвующих в катаболизме гликопротеидов и гликозаминогликанов ( Березовская, 1968).

Одним из факторов, регулирующих окисление этанола и ацеталь-дегида, является концентрация кофермента НАД-*-. В печени мышей, интоксицированных этанолом, количество НАД-1- снизилось почти в 2 раза (0,16 ±0,01 против 0,27 ± 0,02 мкмоль/г в контроле; Р<0,001),что говорит о высокой интенсивности окисления этанола и,соответственно, нарушении окислительно-восстановительных функций печени (Скакун и др.,1985; Островский и др.,1986; French, 1989).Выраженный биологический эффект как экстрактов из листьев чая, так и катехинов проявился в увеличении концентрации кофермента НАД-1-. В печени животных, которым в сочетании с этанолом вводили "чайные" препараты, было выявлено достоверное увеличение концентрации НАД-*- в среднем на 33-70%, по сравнению с таковыми показателями у мышей, получавших только этанол (Рис.3 б-г). Данный эффект обусловлен протонофорной способностью катехинов (Ко-жокару и др.,1986; Кожокару,1987).Эта их способность позволяет освобождать восстановленные никотинамидные коферменты от протонов, что особенно важно в случае интоксикации этанолом.

На основании изложенных фактов можно заключить,что как чистые катехины, так и экстракты из листьев зеленого и черного чая, уменьшают гепатотоксическое действие этанола. При этом можно считать, что протекторное действие экстрактов обусловлено, в первую очередь, катехинами, входящими в их состав.

При исследовании функционального состояния печени мышей через

2 недели после отмены этанола, в содержании НЛ наблюдалось достоверное понижение уровня ХС и ЭЖК на 18 (Р<0,05) и 26%(Р<0,01), соответственно, по сравнению с контролем.Уровень ТАГ оставался по прежнему высоким и превышал контрольный показатель на 30% (Р<0,01). в фосфолипидном спектре отмечалось снижение основных компонентов внутреннего монослоя мембран - ФЭ и ФС, оставалось повышенным содержание ФИ и ФК.

Ранее вводимые чайные экстракты, а также катехины способствовали более эффективному восстановлению функций печени в период депривации, чем таковой процесс при введении этанола без препаратов. Это проявлялось в снижении повышенного уровня ТАГ, нормализации содержания ХС, ЭХС и СЖК во всех опытных группах.Также отмечалось восстановление содержания фосфолипидных фракций печени (ФЭ.ФС и ФИ) .углеводных компонентов мембранных биополимеров и окисленной формы НАД-"-.

ДОРРВКШЯ Метаболических реакций в сыворотке крови люлей экстрактом и!=1 гребней винппипа при его приеме с этанолом п Полученные результаты действия экстракта из гребней винограда, как гепатопротектора, в условиях экспериментальной интоксикации этанолом, а также выявленные механизмы протекторного действия катехинов, позволили нам использовать экстракт из гребней винограда в качестве возможного корректора, возникающих метаболических изменений в организме человека, вызванных однократным приемом этанола.

Полученные результаты при исследовании динамики окисления этанола и активности АДГ в крови здоровых мужчин-добровольцев (1гр) после приема 40% этанола соответствовали известным в литературе данным ( Морозов и др.,1983; Латенков, Губин,1987; Wartburg, Buhler,1984).То есть, максимальная концентрация этанола в крови отмечалась через 1 час после его приема,а к 4 часу плавно уменьшилась до исходных значений ( с 0,75 ±0,03 до 0,25 ±0,03 г/л) (рис.4а). Также плавно нарастала активность АДГ. Наибольшая активность АДГ отмечалась на 4-й час эксперимента и составляла к этому времени 4,52 ±0,18 ед/л (исходный уровень - 1,16 ± 0,06 ед/л,Р<0,001).

Добавление в этанол экстракта из гребней винограда значительно меняет картину динамики окисления этанола в крови испытуемых (2гр). На фоне классической картины изменения активности АДГ, окисление этанола в организме задерживается под действием экс-

АДГ Этанол ед/л г/л ***

7(0,7)- **

6(0,6)- / 5(0.5)-- / 4(0.4)-- /

з(о.з)-/ 2(0.2)-1(0.1)

—--. Этанол

- АДГ

***

***

***

X

\

4 час

АДГ Этанол ед/л г/л

9(0.9)--8(0,8)--7(0.7) 6(0.6) 5(0,5) — 4(0.4)-- / 3(0,3)—/

2(0,2) 1(0.1)

/

Г—

***

/

1

\

X

\

\

\ ***

***

4 час

Рис.4. Динамика содержания этанола (г/а) и активности АДГ (ел/а) в крови испытуемых после однократного приема этанола (а) и этанола с экстрактом из гребней винограда (б).

- la -

тракта из грееней винограда. Так, на 2-й и 4-й часы эксперимента было зафиксировано более высокое его содержание в крови, чем в эти же интервалы времени в крови испытуемых 1 группы (Рис.46). Данный феномен обусловлен наработкой этанола из ацетальдегида.

Полученные результаты подтверждают наше предположение,высказанное при анализе данных в эксперименте на животных о том, что добавление в этанол экстракта из гребней винограда приводит к изменению метаболизма этанола в организме. В результате снижается уровень ацетальдегида в связи с восстановлением его в этанол.

В содержании НЛ сыворотки крови испытуемых после однократного приема этанола отмечалась выраженная тенденция к гипертриглице-ридемии, что связано с усилением периферического липолиза в ответ на выброс в кровь катехоламинов 1 Никитин и др.,1985; Островский и др.,1988; Stefan,1989). Достоверно повысился уровень ЭХС (на 25%) через 1 час после приема этанола и оставался повышенным в течение последующих' часов,что, вероятно, объясняется усилением реакций этерификаций ХС с жирными кислотами с участием фермента ацил-КоА:холестерин-0-ацилтрансфераэы (Лопухин и др., 1983). Одновременно отмечалась тенденция к снижению общих ФЛ.

При добавлении в этанол экстракта из гребней винограда в сыворотке крови испытуемых (2гр) отмечалось снижение ТАГ на 15% (Р<0,05) на 4-й час. В содержании об.ФЛ наблюдалась выраженная тенденция к увеличению их количества. По видимому, под действием экстракта из гребней винограда активируется синтез фосфолипидов.

Полученные результаты по исследуемым параметрам б сыворотке испытуемых, получавших водный раствор с экстрактом из гребней винограда (Згр), подтверждают это предположение. Так, под действием водного раствора с экстрактом достоверно возросло содержание об.ФЛ на 18% на 4-й час опыта.Субстратом для синтеза фосфолипидов могут быть ТАГ.так как на 2-й час опыта отмечалась тенденция к их увеличение (на 19%), а на 4-й час снижение до фонового уровня.Средняя корреляционная связь между изменениями этих параметрами на 4-й час эксперимента подтверждает ( г=-0.52, Р<0,05) данный вывод.

Изучение ряда параметров углеводного обмена в кроби обследуемых показало,что однократный прием этанола сопровождается достоверным повышением содержания глюкозы (1-4 час) в среднем на 1014%, что обусловлено активацией гликогенолиза (Груздева, Высокогорский , 1982 ; Латенков, Губин,1987).Причем, концентрация глюкозы

возрастает весь период окисления этанола, то есть, когда высок уровень катехоламинов. Однократный прием этанола сопровождался также достоверным повышением концентрации лактата в крови испытуемых на 2- и 4-й часы опыта ( в среднем на 36-48% относительно фона) при одновременном снижении пирувата (на 7-10%). Возрастание лактата в крови испытуемых свидетельствует об усилении реакций анаэробного гликолиза в период окисления этанола. Снижение концентрации ПВК в крови обусловлено ингибированием реакций глю-конеогенеза под действием этанола, что подтверждается выявленным снижением активности АлАТ (к 4-у часу на 6%). Понижение активности АлАТ тормозит превращение аланина в пируват, являющегося главным субстратом для глюконеогенеза.

Анализ показателей углеводного обмена в сыворотке обследуемых 2-группы выявил, что добавка в этанол экстракта из гребней винограда сопровождалась сохранением реакций глкжонеогенеза. В пользу этого свидетельствует факт значительно меньшей концентрации лактата (увеличение лишь на 17 и 22%), повышение концентрации ПВК (на 7 и 6%) и активности АлАТ (на 3 и 6%) на 2- и 4-й часы после приема этанола с экстрактом.

Полученные результаты по исследуемым параметрам углеводного обмена в крови испытуемых 3 гр (водный раствор с экстрактом), подтверждают факт активации реакций глюконеогенеза. Так, к 4-у часу опыта у испытуемых выявлено увеличение ПВК на 8% (Р<0,05), активности АлАТ на 21% (Р<0,05) при одновременном снижении молочной кислоты на 18%(Р<0,05).

Таким образом,на основании эксперимента, проведенного на добровольцах, следует отметить,что добавление в этанол экстракта из гребней винограда сопровождается восстановлением метаболических путей, подавленных этанолом,а именно: восстановление синтеза ФЛ, нормализация содержания ЭХС, сохранение реакций глюконеогенеза.

Полученные результаты настоящего комплексного экспериментального исследования, позволяют считать изученные растительные экстракты выраженными мембрано- и гепатопротекторами.

ВЫВОДЫ:

1. Установлено, что введение экстракта из гребней винограда в качестве добавки в этанол экспериментальным животным, приводит к изменению метаболизма этанола в организме. В результате меняется алкогольная мотивация, что проявляется в снижении количества

потребляемого с ним этанола.

2. Сохранение функционального состояния печени при добавлении в этанол экстракта из гребней винограда обусловлено:

а) увеличением редуктазной активности алкогольдегидрогеназы, в результате которого происходит восстановлением ацетальдегида в этанол, являющегося менее токсичным химическим соединением, чем его метаболит;

б) снижением повышенного под действием этанола уровня триа-цилглицеридов и холестерина, а также повышением уровня эфиров холестерина и эфиров жирных кислот в печени, что определяет восстановление ее этерифицирующей функции, нарушенной этанолом;

в) стабилизирующим эффектом экстрактивных веществ на структуру углеводсодержащих биополимеров и снижением активности лизосо-мальных гидролаз, что препятствует нарушению мембранной проницаемости гепатоцитов;

г) активацией глюконеогенеза в печени, сопровождающейся увеличением концентрации глюкозы, пировиноградной кислоты, активности аланинаминотрансферазы при одновременном снижении уровня лактата в крови;

3. При одновременном введении экспериментальным животным этанола и экстрактов из чайных листьев уменьшается гепатотоксичес-кое действие этанола. При этом снижается повышенный уровень три-ацилглицеридов и холестерина, увеличивается образование эфиров холестерина и фосфолипидов в печени.

4.Под действием чайных экстрактов уменьшается мембранотокси-ческое действие этанола. Это проявляется в повышении содержания сфингомиелина, нормализации соотношения углеводов в мембранных гликопротеидах и снижении уровня лизофосфатидилхолина в печени.

5. Защитные эффекты экстрактов из листьев зеленого и черного байхового чая обусловлены действием,главным образом,флавоноидов, в частности (-)эпикатехина и (-)эпигаллокатехина, так как была обнаружена идентичность влияния их и чайных экстрактов на функциональное состояние печени животных,интоксицированных этанолом.

6. Введение экспериментальным животным экстрактов из чайных листьев одновременно с этанолом сопровождается сохранением в печени содержания окисленной формы кофермента НАД-' в пределах нормы, за счет протонофорной способности катехинов, входящих в состав данных экстрактов.

7. Экстракты из чайных листьев, вводимые животным, интоксици-

рованным этанолом, способствуют более эффективному восстановлению функционального состояния гепатоцитов в период депривации.

8. Обнаруженные в экспериментальных исследованиях биологические эффекты экстрактов из гребней винограда и листьев зеленого и черного байхового чая,позволяют оценить значение данных растительных препаратов,как выраженных гепатопротекторов, действие которых сопровождается коррекцией метаболических реакций в организме животных и человека, находящихся в условиях интоксикации этанолом.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Способ определения эфиров жирных кислот - как показатель употребления этанола //Рац. предложение N99/5 от 25.10.88 ТОЙ ДВО АН СССР ( в соавт.с Н.Ф.Кушнеровой, М.В.Палагиной.

2. Способ биохимического тестирования лиц с хронической алкогольной интоксикацией и случайным употреблением алкоголя // Рац. предложение N98/4 от 25.10.88 ТОЙ ДВО АН СССР ( в соавт. с Н.Ф.Кушнеровой, М.В.Палагиной.

3. Сравнительная характеристика биохимических параметров крови здоровых людей в зависимости от этнической принадлежности // Деп. в ВИНИТИ N280-B90 от 16.01.90 (в соавт.с Н.Ф.Кушнеровой и А.Е.Булановым.

4. Метаболизм липидов при однократном приеме этанола у представителей разных этнических групп // Деп. в ВИНИТИ N 2445 -В90 от 8.05.90 (в соавт.с Н.Ф.Кушнеровой .А.Е.Булановым и др.

5. Реоксидация восстановленных никотинамидных коферментов при острой и хронической алкогольной интоксикации у представителей разных этнических групп //Деп. в ВИНИТИ N 2444-В90 от 8.05.90 (в соавт.с Н.Ф.Кушнеровой, А.Е.Булановым.

6. Динамика липидов в эритроцитарных мембранах при однократном приеме этанола //Деп. в ВИНИТИ N4057-B90 от 18.07.90 (в соавт. с Н.Ф.Кушнеровой, А.Е.Булановым и др.

7. Эффект однократного приема этанола на жирнокислотный состав липидов мембран эритроцитов у представителей разных этнических групп // Деп.в ВИНИТИ N4101 - В90 от 20.07.90 ( в соавт. с Н.Ф.Кушнеровой, А.Е.Булановым.

8. Гепатопротективное действие растительного экстракта, выделенного из гребней винограда, при хронической алкогольной интоксикации // Антигипоксанты и актопротекторы. Росс. науч. конф. С.-Петербурга, 1-3 марта 1994года. Матер.конф. С-Пб,

1994. Вып.4. С.288 ! в соавт. с Н.Ф.Кушнеровой.

9. Эффект экстракта из гребней винограда на состояние этано-локисляющей системы // Там же. С.307 (в соавт.с Н.Ф.Кушнеровой.

10.К вопросу о биохимических механизмах биологического действия экстракта из гребней винограда при алкогольной интоксикации // Там же.Вып.3.С.239 (в соавт. с Н.Ф.Кушнеровой, Т.Н.Гордейчук.

11.Метаболические нарушения в печени крыс при хроническом воздействии этанола и их коррекция капримом // Валеология: Диагностика, средства и практика обеспечения здоровья. Владивосток: Дальнаука. 1995.- Вып.2.-С.150-156( в соавт. с Н.Ф.Кушнеровой, М. В. Палагиной и др.

12.Исследование метаболических реакций у представителей разных этнических групп при однократном приеме этанола, каприма и их сочетания // Там же. С.168-178.( в соавт. с Н.Ф.Кушнеровой, М. В. Палагиной и др.

13.Влияние каприма на состояние этанолокисляющей системы // Там же. С.162-168 ( в соавт. с Н.Ф.Кушнеровой, Т.Н.Гордейчук, Ю.Ф.Зуевым.

14.Влияние природных комплексов биологически активных веществ на процессы восстановления функций печени при алкогольной интоксикации // Вопр. мед. химии.- 1995, т.41.- N2. - С 20-23.( в соавт. с Н. <1>. Кушнеровой, М. И. Положенцевой , А.Е.Булановым.

15.Гепато- и мембранопротекторные свойства чайных катехинов при алкогольной интоксикации // Гигиена и санитария. 1996. - N1. (б соавт. с Ю.А.Рахманиным, Н.ф.Кушнеровой.

ВЛИЯНИЕ ЭТАНОЛА НА ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ И ЕГО КОРРЕКЦИЯ РАСТИТЕЛЬНЫМИ ПРЕПАРАТАМИ

Светлана Евгеньевна Фоменко

Автореферат

Подписано к печати 15.06.1995 г. Формат 60x84/16. Печать офсетная. Уч.- изд.л. 1.3. Тираж 100 экз.Заказь/2()2

Отпечатано в ОНТИ Тихоокеанского океанологического института ДВО РАН, 690041, Владивосток, ул.Балтийская,43.