Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика обмена кетоновых тел в тканях крыс при хронической алкогольной интоксикации

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Характеристика обмена кетоновых тел в тканях крыс при хронической алкогольной интоксикации"

Академия наук Беларуси ИНСТИТУТ БИОХИМИИ

На правах рукописи

ЛУКНВСКАЯ ОКСАНА ЯРОСЛАВОВНА

ХАРАКТЕРИСТИКА ОБМЕНА КЕТОНОВЫХ ТЕЛ В ТКАНЯХ КРЫС ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ АЛКОГОЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ

03.00.04 - БИОХИМИЯ

Автореферат диссертаций па соискание ученой степени кавдалата биологических наук

Смоленск - 1994

Работа выполнена в. лаборатории регуляции обмена веществ Института биохимии АН Беларуси

Научный руководитель - доктор биологических наук Ф.С.Ларин

\

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Кожемякин Л.А.

доктор биологических наук, профессор Чиркин A.A.

Ведущее учреждение - Институт питания АМН Российской Федерации

Защита состоится ", ." __1994 г. в " " час.

на заседании специализированного ученого совета (К 084.34.01) по присуждению, ученой степени кандидата биологических наук в Смоленском государственной медицинском институте по специальности биологическая химия С Российская Федерация. 214019, Смо-^енск^л.-—Крупской^_28 L:____;___________

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Сыоленс- , кого медицинского института.

Автореферат разослан *3Qn cz^Fjßfajj 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета, профессор

Н.Ф.Фаращук

ОБЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Хронический алкоголизм продолжает оставаться одной из важнейших биомедицинских проблем современности. Заболеваемость и смертность при регулярном потреблении алкогольных напитков связана с токсическим воздействием этанола на важнейшие органы человека и. в первую очередь, на так называемые оргада-мишени: печень, сердце и мозг. Метаболические последствия злоупотребления этанолом, приводящие к поражение внутренних органов, характеризуются изменениями, наблюдаемыми практически во всех основных звеньях обмена веществ.

• Метаболизм кетоновых тел (КТ), тесно сопряженный с обменом липидов и углеводов, также претерпевает существенные изменения в условиях алкогольной интоксикации. Важнейшим доказательством этого является развитие кетоацидоза у больных хроническим алкоголизмом. Алкогольный кетоацидоз является довольно распространенным синдромом, который характеризуется высокой концентрацией КТ в плазме крови (до 10-15 мМ). кетонурией и состоянием выраженного ацидоза крови, при котором значение рН может достигать 6,96 [Ьаггешоге» 19841.

Болызинство работ, посвященных взаимоотношениям алкогольной интоксикации с обменом КТ, выполнено преимущественно на клиническом материале, носят узкоспециальный характер и ограничиваются констатацией уровня КТ. На сегодняшний день остаются недостаточно освещенными особенности утилизации КТ как в периферических тканях, так и в печени, а такаге многие аспекты кетогенеза при продолжительной алкоголизации. Практически неизученными остаются вопросы наработки ацетона и взаимоотношения длительности голодания с хронической алкогольной интоксикацией в процессах кетогенеза. Проведение исследований по этим невыясненным проблемам необходимо не только для более полного понимания метаболических изменений, возникающих в печени, сердце и мозге при хронической алкогольной интоксикации, гаи для обоснования коррекции возникающих при этом патологических состояний.

Цель и задачи исследования. Основной целью работа явилось изучение особенностей биосинтеза и утилизации КТ при хронической алкогольной интоксикации у экспериментальных животных. В соответствии с эти» были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать динамику наработки КТ в печени крыс при хронической алкогольной интоксикации и влияние различных сроков

голодания на этот процесс.

2. Оценить роль этанола как предшественника в синтезе КТ.

3. Охарактеризовать использование КТ в процессах липогене-за в печени при хронической алкогольной интоксикации.

А. Исследовать характер утилизации КТ в сердце и гсшоеном ыозге при длительно« потреблении этанола.

Научная новизна работы. В. работеч впервые показано, что при хронической алкогольной, интоксикации у крыс этанол становится более предпочтительным субстратом в кетогенезе. чей длинноцепо-чечные аирные кислоты (ВДШ. Включение этанола в КТ осуществляется через стадию наработки ацетата с последующей его активацией б ацетил-КоА-синтетазной реакции, а непосредственная наработка КйА-производных из ацетальдегида, с образованием полумер-капталей в качестве промежуточных продуктов, практически не наблюдается. Биосинтез КТ в печени крыс усиливается при сочетании хронической алкогольной интоксикации с голоданием, при этом появление пика концентрации КТ замедляется.

Установлено, что КТ эффективно утилизируется печенью в реакциях липогенеза. Хроническая алкогольная интоксикация активирует этот процесс, усиливая липогенез как из З-оксимасляной кислоты (01,20. так и из ацетоацетата {АцАц), что связано с возрастанием роли АцАц в тргнснеабрадавд переносе ацетильных единиц.

__________Показано, что при хронической агесогсшьноЯ интоксикации

окисление КТ в сердц>Г1с01ггролируетаг_£Щ,и^

3-оксокислот и О'Ж-дегидрогеиазы, тогда каз7Т7;ог^шаГШзге~оп-:--

ределявщш фактором является концентрация КТ крови. Хроническая алкогольная интоксикация снизает утилизация КТ, как энергетических субстратов, в.сердце, '.

Научно-практическое значение работы. Теоретическое значение выполненной работы заключается в той, что впервые осуществлена комплексная характеристика обмена КТ в печени, сердце и ■ головном иозге при хронической алкогольной интоксикации в экспериментальных условиях. Важным результатом работы является доказательство участия этанола в качестве субстрата в кетогенезе и возрастание этой роли при длительной алкоголизации. Выяснена метаболическая последовательность включения' углеродного скелета этанола в КТ. Наряду с этш установлено, что в условиях хронической алкогольной интоксикации КТ являются эффективными субстратами „ лишгенезе, что связано с усилекиеы роли АцАц, как транспортной формы ацетильных единиц. Продемонстрированы особен-

ности регуляции окисления КТ в периферических тканях. Нарушения утилизации КТ в сердце при длительном потреблении этанола свидетельствуют о снижении их роли, как энергетических субстратов.

Проведенные экспериментальные исследования позволили сформулировать и обосновать научные положения, способствующие пониманию биохимических механизмов, лежащих в основе нарушений синтеза и утилизации КТ при хронической алкогольной интоксикации. Полученные результаты могут иметь не только теоретическое, но и практическое значение в плане разработки новых подходов патогенетически обоснованной коррекции алкогольного поражения внутренних органов.

Положения, выносимые на зацнту.

1. Хроническая алкогольная интоксикация приводит к более предпочтительному использовании этанола, как предшественника в кетогенезе.

2. В условиях хронической алкогольной интоксикации активируется литогенез из КТ в печени и мозге экспериментальных еивот-

НЫХ. 5

3. При длительном потреблении этанола наруаается потребление КГ. как энергетических субстратов, в сердце за счет снижения активности ферментов утилизации КТ..

Апробация работы. Материалы работы были дологены на 1-м Международном конгрессе по витаминам и биофакторам (Кобе. Япония, 1991), на 10-м Гепатологическом симпозиуме (Белосток. Поль-па. 1991), на 27-м и 28-м конгрессах Европейской ассоциации по изученга печени (Бена. Австрия, 1992; Париз. Франция. 1993). а такае на научных конференциях - Института биохимии АН Беларуси (1992, 1993).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ.

Структура диссертант. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований. две главы результатов собственных исследований и их обсуждение. .заключение, выводы и список литературы. Текст диссер-;. тации изложен на 139 страницах, иллэстрирован 13 таблицами и 21 рисунком. Библиографический указатель содерзит 7 источников на русском языке и 169 иностранных источников.

ЙАТЕРЙАШ й ШЩ1 ИССЛЕДОВАНИЯ.

Опыта ln vivo проводились на белых беспородных крысах-саы

цах весом 150-180 г. Хроническую алкогольную интоксикацию вызывали внутриаелудочным введением 25% раствора этанола в дозе 3 г/кг веса в течение 40 дней. В опытах' с использованием ингибиторов альдегиддегидрогеназы (АдЦГ) половине крыс с хронической алкогольной интоксикацией и контрольных глвотныхза 4 часа до де-капитации вводили внутрибрюшнно раствор цианамида (60 иг/кг веса).

В отдельном эксперименте выяснялась зависимость концентрации КТ от времени последнего.введения этанола при хронической алкогольной интоксикации и влияние голодания на этот процесс. В опыте находишсь четыре группы животных. Основную опытную группу составляли животные с хронической алкогольной интоксикацией, вы-, зываеиой. как-описано вше. Остальные группы слузнли контролем. В первой контрольной группе находидйсь интакуньге по этанолу животные. ежедневно _папучавшш-та, протяженииДО дней через желудочный зонд дистиллированную,воду. Часть этих животных получала однократную дозу этанола (3 г/кг веса) бместо последнего внутри-желудочного введения воды для дифференцирования острого и хронического эффектов этанола,, составляя вторую' контрольную • группу. И. наконец, в качестве контроля на последнее введение этанола служили животные с хронической алкогольной;интоксикацией, получавшие вместо, последней доза этанола эквивалентный объем воды, _№n-epBan -ueafly-jrome,^4_BB^eHHe^ 3TaHC^ {или воды у контроль- • ных животных) и декапитадией составлялабпда.-т-ЗО-шн. и 12 часов. Каждая из четырех групп была в своя очередь разделена на три подгруппы, 'в первой из которых , крысы шели свободный доступ к корму вплоть до декалитации, а во. второй и третьей подгруппах голодали перед декапитацией на протяжении 12 и 24 часов соответственно.

Синтез КТ и триацилглицериков <Тг) In vitro из ДЦЖ, сред-нецепочечных жирных кислот (СЦЩ0 и этанола суспензией гепатоци-тов. изолированных из печени контрольных крыс и аивотных с хронической алкогольной интоксикацией методой закрытой перфузии печени с коллагеназой. проводили, используя 1-14С-изчеше пальш-тат, октаноат и этанол. , ' .

Исследование синтеза КГ гепатоцитаыи контрольных и апкого-лизированных крыс, получавших цианашд, проводили с использованием 2-иС-ацетил-КоА в качестве субстрата (1 iiM, 0,1 ыкКиДт)- с добавление« или1 в отсутствие эквишлярного количества немеченого этанола. 1 '.

Субклеточные фракции печени (митохондрии, цитозоль) получали методом дифференциального центрифугирования, используя среду, состоящую из 0.25 H сахарозы, 0,01 M Трис-буфера (рН 7,4) и • 0,001 U ЭДТА.

Для определения содержания КТ кусочки тканей быстро затрагивались менду алюминиевыми пластинами. После экстракции КТ хлорной кислотой определяли АцАц (Melanby, Williarason, 1962) и OMR ПШ liasison. Melanby, 1962) ферментативным методом, используя коммерческий препарат ОМК-дегидрогеназы.

Принцип определения радиоактивности КТ основан на образовании нерастворимой сот Денияе в результате взаимодействия АцАц и сульфата ртути (Bates et al., 196В). Определения суммарной радиоактивности КТ предпествозало ферментатизное превращение ОЖ в АцАц с последующей обработкой пробы сульфатом ртути. Радиоактивность GMK рассчитывали путем вычитания активности АцАц из общей радиоактивности КТ. Радиоактивность отмытого преципитата гцето-ртутного комплекса 'подсчитывали на кидкостно-сцинтилляц1!онном счетчике "Mark-IP (США).

Липиды из тканей экстрагировали по методу rolch at al. (1957). Разделение общих лнпидоз по фракция!.! осуществляли с по-мощыз одномерной хроматографии в тонко;.! слое силккагеля. Пятна липидоз обнаруживав в парах иода, соскабливали в отдельные про-' бирки и липиднке фракции элзировали смесьз Фолча,' используя полученный экстракт для определения содержания Л5гпидах фракций и их радиоактивности. Определение содержал?¡я Тг, фосфолипидоз, холестерина, свободных мирных кислот (СШ проводили с пилощьэ соответствую^]« наборов "Bio-La-Test" (СЬезаро!, Чехословакия). Радиоактивность -экстрактов липидных фракций, полученных метолом тонкослойной хроматографии либо целочны.! гидролизе:.! суммарных липидов измеряли в толуоловой сцинтиллягорз на а'дкостно-сцшти-ляционном счетчике.

Определение активности ферментов: С.ЧК-яегиярогенагы проводили по методу Каминского и Косенко (1987), АТФ-цитратлиазы и ацетил-КоА-синтетазы - Hoffaan et aî.. (1978). ацетоаце- ' тил-КоА-синтетазы - Bergstrou at al., (1985). З-скси-З-метилглу-тарил-КоА-синтетззы (ОМГ-КоА-амтетазы) - Quant et al., (1989). КоА-трансФеразы 3-оксокислот и ацётозцетил-КоА-тиолазы - Williamson et il. (1971). Определение содераадая белка проводили по методу Ьаш-у et al. (1953).

Результаты опытов подвергнуты статистической обработке по

общепринятому методу с применением Т-статистики и критерия Стыо-дента. В тексте диссертации приведены значения средней арифметической Ш), средней осибки Cm) и показателя достоверности (р).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ К ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. Влияние алкогольной интоксикации на кетогеназ в печени.

Уровень КТ в печени расценивается большинством авторов, как показатель кетогенеза (Zammit. 1981), поскольку процесс синтеза КТ в печени является доминирующим и не сопоставим с уровнем утилизации КТ. Нами сделана попытка сравнить динамику содержания КТ в печени и крови крыс с хронической алкогольной интоксикацией на фоне кормления или голодания в течение 12 и 24 часов.

Введние этанола кормленным контрольным животным снижает уровень ОМК в печени в короткие сроки, 15 и 30 минут с последую-' ним его повышением через 6 часов после введения алкоголя и нормализацией через 12 часов. Уровень ОМК в печени кормленных крыс с хронической алкогольной интоксикацией увеличивается через 1 чго после заключительного введения этанола (Рис. 1). Достоверное увеличение этого показателя сохраняется в 3-х часовой срок. Содержание АцАц в печен;; этих гивоткых существенно не различалось —сишт2олем.

ЭтанолГ^ведшшй^онтрольшм в течение

12 часов, снижает концентрацию АцАц впёчешГчерез~15—минут__В_

остальные сроки этот показатель не отличался от'контрольного. Содержание ОМК в печени животных достоверно повышалось через 1 час, достигая максимума через.6 часов и нормализуясь к 12-часовому сроку. У крыс с хронической алкогольной интоксикацией и 12-часовым голоданием уровень АцАц достоверно повышается через 1 и 3 часа, тогда как содержаие ОМК достоверно превышает контрольный уровень через 1,3 и 6 часов, причем максимум концентрации сдвигается на трехчасовой срок.

Однократное введение этанола крысам с 24-часовым голоданием не изменяет содержание АцАц в печени во все исследуемые сроки, однако повышает уровень ОМК начиная с 1-го часа эксперимента с максимумом через 6 часов и последующей нормализацией через 12 часов после алкоголизации. У животных с хронической алкогольной интоксикацией и 24-часовым голоданием наблюдается достоверное повышение концентрации АцАц в печени через 3 часа после введения

o-i---.---■-> о4-----■—-

0.25 0.Б0 1.00 3.00 6.00 12.0 0.26 0.60 1.00 3.00 6.00 12.0

Рис. 1. Динамика изменения концентрации кетоновых тел в печени кормленных (I) и голодавших 12 (II) и 24 (III) часа крыс после однократного' (А) и длительного (В) введения этанола. По оси X -время (часы), по оси Y - концентрация КТ (нмоль/г ткали). Обозначения: 1 - АцАц, контроль; 2 - АцАц, опыт; 3 - ОМК,контроль; i - ОМК. опыт. * - Р < 0,05 по сравнению с контролем.

Таблица 1

Активность ферментов обмена кетоновых тел й ацетил-КоА (нмоль/мг белка за 1 мин.) в печени крыс с хронической алкогольной интоксикацией

Исследуемый показатель I Контроль I Опыт

Оксиметилглутарил-КоА-синтетаза 2,62 + 0,32 2,51 + 0,28

Ацетоацетил-КоА-синтетаза 0,88 0. 08 1,43 + 0,13*

Ацетил-КоА-синтетаза 2,41 + 0.14 1,68 + 0,14*

АТФ-цитратлиаза 2,38 + 0,11 1,48 + 0,23*

Оксибутиратдегидрогеназа 0.47. + 0,03 0,37 0.04*

(мкмоль/мг белка за 1 мин.)

* - Р<0,05 по отношению к контролю.

этанола. Уровень ОМК печени в этой группе достоверно увеличива- -ется уг:е через 30 минут. и достигает максимума к 6 часам. Через 6<ч 12 часов после заключительного введения этанола этот показатель у кивотных с' алкоголизацией существенно не отличался от контроля.

--алкогольной интоксикацией могут влиять разнообразшё~факт^^

ла в митохондриях, изменение гормонального спектра, наруеение ' окисления мирных кислот, колебания уровня различных метаболитов, оказывающих регуляторное влияние на обмен КТ и ряд других. Среди этих Федоров наиболее существенным представляется метаболизм самого этанола и вовлечение его или продуктов его метаболизма в кетогс-нез. Окисляясь до ацетата, этанол ыоает стать источником ацетил-КоА в результате-активации ацетата ацетпл-КоА-синтетазой.

Исследование активности ферментов, ответственных за наработку КТ б митохондриях печени показало отсутствие изменений активности ОМГ-КрА-синтетазы при хронической алкогольной интоксикации. В то же время активность ОМК-дегидрогеназа достоверно снижалась (Табл.' 1) . Можно, предположить, что в данном случае имеет место ингибирующий эффект НАДН, концентрация которого резко возрастает на фоне длительного потребления этанола ( Косенко. Каминский, 1988).- ■

Этанол, поступающий в , избыточных количествах в организм в

Таблица 2

Влияние палыягтата, октаноата к этанола ка наработку кетоновых тел и триацилглкцериноз гепатоцитами (нмоль/1 млн.клеток в час) и iía отношение 0!1К/АцАц в контроле и при хронической алкогольной интоксикации

Субстраты Юбшие кето-| ОМК Iновые тела !

АцАц

Тг

ОЖ/АцАц

Контроль

138 ^ 13

20

I1S 1 12 48 i 6 0,17 г 0.02

Октаноат 356 ± 32* 129 ± 21* 227 ± 28* 52 1 5 C.56 ¿ 0,07»

Пальмитат 306 ± 27* 144 ¿ 22* 162 ±19 79 ± 9» 0.89 1 0,09* Октаноат +

пальмитат 336 ± 35* 213 -- 24» 173 ¿ 22* 1C6 ± 12* 1.23 - 0.15*

Этанол

243 ± 28* 96 i 11* 147 i 23 92 ± 10» 0.65 ^ 0,07*

Хроническая алкогольная интоксикация

143 ± 12 42 ± 4

Октаноат 399 1 45* 172 1 28*

Палымтгт 385 ± 44* 201 ± 24*

Октаноат + 420 1 39* 242 i 27* пальмитат

101 i- 10 112 13 0,42 i 0,03

227 s 25* 123 i II 0,76 ^ 0.09®

í84 ^ 26* 173 - 23» 1,09 i 0. 15*

178 i 19* 1S3 i 20i i, 33 = 0, 21*

Этанол

253 ± 23* 124 i 11* 129 ¿ 17 202 * 23* 0, SS ± 0.11"

* - PC0.05 по сравнения с сзркей б-зз добавления субстрата в инкубационную среду.

процессе алкогольной интоксикации. когет быть достаточно элективным предгествекнином как в литогенезе, так и з кэтсгенезе. Исследования, проводнице на животных с острой алкогольной интоксикацией и на псрфузируе.мой печени (Gninnet et al., 2£85; Snde-иапп et al., 1987) свидетельствуют об активном включении двууг-лерсдного скелета этанола в КТ. В настог.цем разделе нала сделана попытка охарактеризовать биосинтез КТ з печени из этанола при хронической алкогольной интоксикации как на уровне целого органа в опытах ln vivo, так и в экспериментах ка гепатоцитах, изолированных из печени крыс.

Изучение наработки КТ и Тг из разных предшественников

Таблица 3

Влияние хронической алкогольной интоксикации на включение метки из 14 С- пальыитата и 14 С- этанола в кетоновые тела и тригцилглн-церина (импульсы/мкмоль продукта за 1 мин.) изолированном гепа-тецитами и на разведение метки немечеными субстратами.

Субстраты

ОЖ

АцАц

I

14 ¡4,

С-пальштат 3300 * 579

'С-папьмитат

+ этанол, 2 ы,

14

С-этанол С-этанол +

2913 ± 197* 5927 ± 274

Контроль 14373 ± llbi

10805 ± 933* 40218 i 2164

пальмитат. 2 мМ 4487 ± 391» 33142 ± 1027*

Тг

. 8624. 1 973

17332 ± 1547* 643 ± 92

' 97 ^ lb

14 14

С-пальмитат С-палъшгтат

+ эта'гол, 2 I.::.-! 14 С-ЗТЕК0Л

14

С-этанол *

Хроническая алкогольная интоксикация

2229 ± 196 10227 * 1480 17665 ± 1234

1725 £ 123* 6887 ± 822* 29623 * 2557* 7864 ± 899' 57142 ± 6614 729 * 95

__пальмитат. 2 6977 ± 735

48435 ± 5732

•116 ± 19*

* - РС0.05 по сравнению с cootsетствукцей серкой без добавления немеченого субстрата.

(пальшпат, октгнеат, этанол) гепатецитагм контрольных крыс по-иазгпо,'-1 что котогенез из октачсатй насколько быго, чем-из паль-нитата, главным образом, га счет усиленной наработки АцАц (Табл. 2), однако отношение ОМК/АцАц было значительно вкс в присутствии пальштата. В пробах, инкубируемых с добавл&чием сноси пальмитата и октаноата, суммарная наработка КТ била близкой к результата!,1, полученным при добавлении одного октаноата, а отгга-пенне 0Ж/АцАц было салим высоки:.! среди * исследует групп. Повы-сение уровня КТ в присутствии этанола было не "столь вьгра'-генным; как при добавлении мирных кислот, а отношение 03.йС/АцАц было ни-¿::е, чем при использовании пальыитата. Октаноат но изменял наработку Тг " контрольных еивотных. тогда как остальные субстрата повыпали этот показатель примерно в одинаковой степени.

Таблица 4

Влияние цианамида на уровень кетоновых тел (ют-голь/г ткани) и включение 1-14С-зтанолз в кетоновые тела (импульсов/мюлоль за 1 мин.) в печени интактных кркс и животных с хронической алкогольной интоксикацией.

Исследуемый (Контроль [Контроль + (Опыт (Опыт +

параметр I (цианамид I |цкзкашд

Содержание АцАц 0.123±0,018 0. 142±0,028 0,199±0,035 0.207±0.026

Содержание ОН 1.28 ± 0,09 1.39 ± 0.11 1.65 £ 0.0S» 1.72 ¿ 0.10«

УА АцАц 7064 ± 948 4537 ± 352ít- 8835 * 739 5129 ¿ 6078

УА ОМК 345 ± 71 282 ¿ 35 577 * 53* 384 ± 40»

# - Р<0,05 по откованиэ к соответствующей группе, не получавсей

цианамид

* - Р<0.05 по откошен® к соответствующей контрольной .группе

Кегогекез в гепатоцетах, получскшх из тазотнкх с хронической алкогольной интоксикацией существенно ке отличался от наработки КТ у контрольных крыс, однако соотношение GMK/АцАц было выше контрольных показателей примерно в 2,5 раза. Изменения в гепатоцитах опытных и контрольное гя-эотных давали одинаковуэ направленность, однако сдвяга яжют GíK/АцАц и наработки Тг били выргксны более заметно.

Инкубация гепатсцптоз всатрошшзс крыс с 14 С-палькнтатои в присутствии- 2 ' ;£5 зтгнола , также как и добавление немеченого пальннтата в среду, инкубируемую с 54С-этанолом. приводит к снижению включения котки как в АцАц. так и п 0Ж (Табл. 3). Вкляче-ние метки из 14С-пзльмптата в Тг возрастало при добавлена этанола, тогда как удельная радиоактивность (УА) Тг при одновремен-'" ном использовании 14С-этачола и немеченого пальнитата резко скисалась.

Этанол практически не влияет на включение метки из 14С-ок-таноата в КГ гепатоцитоэ контрольных крыс и гизотных с хронической алкогольной интоксикацией, тогда как немеченый октаноат достоверно снижает включение 14С-этанола в АцАц и ОМК (Табл. 4).

Включение метки из 14 С-пальштата в КТ гепатоцитов с хронической алкогольной интоксикацией имело в присутствии немеченого этанола ту «е направленность, что и в клетках контрольных крыс (Табл. 2). Немеченый папьмитат не влияет на включение метки из 14С-этанола в КТ гепатоцитов крыс с хронической алкогольной интоксикацией, одновременно сникая УА Тг более, чем в 6 раз. Этанол. добавляемый к инкубируемым гепатоцитам, увеличивает отношение ОМК/АцАц в обеих группах. Это связано не с усилением суммарной наработки КТ, а с увеличением восстановления АцАц, что однозначно обьясняется -повышением уровня НАДН и отношения НАДН/НАД' в результате окисления этанола и ацетальдегида.

Приведенные данные свидетельствуют, что в условиях хронической алкогольной интоксикации возрастает роль этанола, как ке-тогенного субстрата, тогда как ДЦЯК более предпочтительно используются в реакциях этерификации, чем для биосинтеза КТ.

Как ухе упоминалось, .включение этанола как в КТ, так и а липида может осуществляться через свободный ацетат с последующей активацией до ацетил-КоА. Помимо традиционного пути, существует возможность наработки ацетил-КоА из этанола неферментативнкм путем. Опираясь на способность альдегидов легко образовывать полу-меркаптидные связи с БН-группировками, было показаноно, что аце-тальдегид шкет, непосредственно конденсироваться с КоА, образуя ---в дальиейаем. способны окисляться непосредственно ________

Блокирование альдегиддегидрогеназы (АлДГ) специфичискими ингибиторами (цианамид, паргилин) должно нарушать превращение ацетальдегида в ацетат в реакции, катализируемой АлДГ, и сникать таким образом уровень ацетата, нарабатываемого из экзогенного этанола' В то ке время, блокирование АлДГ такими ингибиторами не должно оказать существенного влияния на наработку ацетил-КоА из этанола.через промежуточное образование полумеркапталей.

Длительное потребление зтатала увеличивает содераание суммарных КТ в печени, главным образом, за счет ОМК (Табл. 4). Введение цианамида существенно не влияет на урозень АцАц и ОМК, как у контрольных, так и у алкоголизированных крыс. У кивотных с хронической алкогольной интоксикацией . повивается вклвчение 14С-этанола в КТ печени, причем достоверно в ОМК. Цианамид сникает удельную радиоактивность АцАц у контрольных и опытных крыс, тогда .как включение метки в ОМК достоверно снизалось поу влиянием цианамида только в группе, получавшей этанол. В целом,

во всех группах, включение метки из 14 С-этанола было выле в АцАц, чем в ОМК.

Усиление кетогенеза из 14 С-этанола у крыс с хронической алкогольной интоксикацией еще раз подтверждает. что в условиях длительной алкоголизации этанол становится эффективным предшественником для синтеза КТ. Интермедиатом в этом процессе является ацетат, поскольку блокирование наработки его из ацетальдегида приводит к снижению наработки КТ из этанола. В то ае- время уровень КТ поддергивается за счет кетогенеза из других субстратов.

Утилизация кетоновых тел в тканях крыс прп хрскяческсй асшгшгь-1ШЙ ИНТОЯСйКаЦ!5Н.

В налих экспериментах было исследовано влияние хронической алкогольной интоксикации на утилизацию КТ в печени, сердце и головном мозге крыс. Хроническая алкогольная интоксикация снижает в печени активность ацетилгКоА-генерирущих ферментов, аце-тил-КоА-синтетазы и АТО-цитратлиазы, одновременно повышая активность АцАц-КоА-сштетазн (Табл. 1).

Вклад КТ в литогенез в печени предстазляется значительным, о чем можно судить по включению метки из 14С-?.:ечекых кетскосых тел в различные липидные фракции (Табл. 5 и 6). Г1аксимальныз абсолютные значения УА лкпидоз, синтезируе!зх из 14С-АцАц и 14 С-ацетона наблюдаются во фракции холестерина печени, тогда как метка из 14С-(Ш наиболее активно включалась во фракцию фосфоли-пидов. Хроническая алкогольная интоксикация усиливает включение метки из 14С-АцАц в холестерин, обцио и свободные яирнке кислсз-ты. эфира холестерина, причем наиболее выраженным было увеличение УА холестерина (в 2.6 раза).

Включение метки из 14 С-ОШ усиливалось- на фене длительного введения этанола по все исследуете .липидные Фракции, причем увеличение УА липидов убывало в следущем ряду: холестерин (в 7.7 раза) > фосфолипида (в 4.6 раза) > СЕК (в 3,4 раза) > обцие нирные кислоты (в 3.2 раза) > Тг (в 2,1 раза) > эф!1ры холестерина ( в 1,9 раза). Повышение УА Тг и фосфолшздоп осуществляется, главным образом, за счет гидрофобной части молекулы, включение метки в которую составляет соответственно для Тг и фосфолипидов, 8055 и 83% от общей радиоактивности.

- и -

Включение метки из З-1 i С-ацетсацетата

Таблица 5 (иыпульсы/мг липидов за

1мин.) в л»тидиые фракции тканей крыс с хронической интоксикацией.

алкогольной

■Лилидше I - Печень Фракции -----------

¡Контроль I Опыт

Мозг

(Контроль 1 Опыт

Холестерин 857 ± 51 .2253 1 180« 659 ± 87 938 ± 33*

СЕК 181 * 12 312 * 16** 262 ± 16 350 ± 16* 3{ифы холе- - .'

Стирияа ' 318 ± 22 480 ± Ш 163 ± 9 - 251 ± 16** Общие z>q-

ше~ кислота £0 t 5 76 i 6* 68 1 4 75 4 5

Tr Ш ± 14 174 t 10 290 ±25' 262 * 5

Фосфолипиды 265 * 1'Л 289 1 10 551 ± 23 568 * 20

* - P<0,05 no otkozeih-y ;; контроля;

«* - Р<0,001 по отношения к города.

нал процессом.

галяется внзпитохондриаль-■нараба-

использущкц ацетильный единица, тызаятся. главным образом, в митохондриях. Условной механизм переноса ацетильных групп реализуется через аэтратрасцеплящий путь, вклэтэщий штохондриальный синтез цитрата, перенос цитрата в цитоплазму и расщепление его АТФ-цитратлиазой (V'aston and Lonenstain, 1970). Еще один механизм перекоса ацетата связан с г.^ггохондр;1аЛЬ!1Щ1 синтезом АцАц, переносом его через ынтохондри-гльнуа ы£1лбрану в цитозоль и активации АцАц посредством '¿4.\ц-КаА-сиктетсзьг (Bergstrou efc al.,1982).

Позыаение активности Ац^ц-КоА-синтстазы в опытной группе в сочзтапш с падением активности здетшНСоА-генеркрующх ферментов, гцетил-КоА-аштетазы и АТФ-цктратляазв (Табл. 1), свидетельствует о возрастании роли транспортного потока ацетата для пут лгдогсчеза в пзчени при хронической алкогольной интоксикации через АцАц.

Сердце является шшиея аэробный органам, чей метаболизм

тесно связан с процесса;.::} кшсланил в интохондриях. Установлено,

Таблица 8

Включение метки из 3-14С~0-сксибутирата (импульсы/мг липидоз за 1 мин. ) в липидкш фракции тканей кркс с хронической алкогольной интоксикацией

Лппиднъ'-з Фракции

I

Печень

I

Мозг

¡Контроль ! Опыт

(Контроль ! Оя:гг

47 2916 ± 331?= 675 ± 59 7210 ± 721** 12 813 i 49** 285 4 le

Холестерин 361 ГШ 173 ЗОиры холестерина 443 i 47 911 ± 62« 52 - i Сбгу.з лирные кислоты 86 1 8 272 s 22« 113 £ 15 Тг 319 ± 47 677 î 67«« 684 ± 78 1371 ± 15Î** Фсс'.'слипиды 1184 * ш 5430 * 91« 612 ± 93 2439 * 269**

381 * 16** 68 4 5* 174 ± 8*

* - Р<0.05 по ояюгажэ к контроля; ** - ?<0,001 ПО ОТНСЗЭШ-ПЭ К контрою.

Таблица 7

Активность Ферментов обмена кетоновых тел Ояшоль/мг белка за 1 мин. ) и ацетил-КоА-гекерируэднк 5ер?,:онтсз (к:.-оль/иг ' белка за 1 жн.} о сердца' крас с хронической алкогольной ипдасякардаЯ

Исследуемый показатель-

КоА-тргнсфараза З-сксокпслот

Ацетоацетил-КоА-тиолгаа

0га:бутиратдепифсгеназа

Ацетил-КоА-синтетаза' . АТФ-цитратдиаза

! ■ Контроль . ! Crrj?

2,14 ± 0,138 Î3,8 ± 1,01 0,34 * 0,033 5,26 ± 0,71 6,25 4 0,61

1.12 ± 0.06* 13.6 ±.1.11 0,23 ± Q, 025* 2.71 * 0.26* 3,17 ± 0,39*

* - Р<0.05 по OTKOSGHK3 к контроле).

что яирные кислоты и КГ, являэтея предпочтительными субстратам! биологического окисления в сердце и более 80% его энергетической

потребности обеспечивается липидами.

Y Kptrc с хронической алкогольной интоксикацией значительно повышалась активность АцАц-КоА-синтетазы, тогда как активность ацетил-КоА-синтетазы и АТФ-цнтратлиазы снижались (Табл.7). Длительное потребление этанола приводило к снижению активности КоА-трансфераза 3-оксокислот как в прямой реакции (субстрат -АцАц), так и в обратной реакции (субстрат. - АцАц-КоА), а так;::е угнетало активность GMK-дегидрогеназы. Активность АцАц-КоА-тио-лазы в сердце крис,потреблявших этанол, была неизмененной.

Уровень АцАц в сердце ¡срыс с хронической алкогольной интоксикацией и 12-часовш голоданием не изменялся во все исследуемое сроки после заключительного введения этанола, тогда как со-ддргание ОЖ достоверно давшалось через 3 часа опыта, достигало ыакскиуыа через 6 часов' й нормализовалось к \2 часа,! после введши алкоголя (Рис. 2d). _

Существует мнение; что окислешз КТ периферическими тканями контролируется не активность» ферментов, ответственных за этот 'процесс, .а концентрацией КТ' б крови . (Williasson et al.. 1971). При хронической-алкогольной интоксикации увеличение кон-центрацгш КТ с .сердце осуществляется за счет повышения, уровня с;.:к и сопровождается снижением активности КоА-трансферазы 3- ок-сош'.слот и 013С-дзгидрогеказа. . V& предполагаем. что при длитель-

окисления КТ в сердце контролируется ке столько уровне:.; КТ крош£ сколько аятивностыН?зрУ2н=___

тов, утилизирующих ш соединения. Это предположение подтверзда- -стся сравнение:,; доаяии -изменений уровня КТ в крови и сердце, {.'зксинапьнзя концентрация КТ в крови (группа, получавпая этанол с 12-часовым голодание;,!) была обнаружена через 3 часа после введения последней дозы -этанола и по -созпадгла с пиком кетоновых тел в сердце, ' нгблздаздшм в""6-часовой срок (Рис. 2). Снижение акпшости ;КоА-трансфэразу ■ 8-оксокислот -и ОМК-дегидрогеназы сердца указшзазт -на -карушениэ утилизации КТ и на регуляторную роль -шавуказзниак ферментов .'б процессе утилизации КТ сердцем. К тоis/ se,' в- раде-ситуаций КоА-траксфераза 3-оксокислот рассматривается, 'тек- феррит;• ответственный- за утилизацию КТ в качестве субстратов {Ьилзгтизашго оккс/.ешш iV.'illiamson et al., 1971).

' И.Т шгут "исшльзозаться, .по дере доступности, в головном шзге как- для. энергетачекож -потребностей, так и .для липогенеза. Они явдяахея глаззшц источниссм энергии для цозга человека и животных при голодании (0«en end Schrana. 1981) и, наряду с глако-

Рис. 2. Динамика изменения концентрации кетоновых тел в сердце и мозге (нмоль/г ткани) крыс с хронической алкогольной интоксикацией, голодавпих 12 часов. По оси X - время (часы). По оси У - концентрация КТ. Обозначения: А - кровь; .В - сердце; С - мозг. 1 - АцАц, контроль; 2 - АцАц. опыт; 3 - 0?ЗС, контроль; 4 - ОМК, опыт; * - Р <.0,05 по сравнения с контролем.

Таблица

Активность ферментов обмена кетоновых тел (мкмоль/мг белка за мин.) и ацетил-КоА-генерирущих ферментов (нмоль/мг белка за мин.) в уозге крыс с хронической алкогольной интоксикацией.

Исследуемый показатель I Контроль I Опыт

КоА-трансфераза 3-оксокислот 0,36 ¿ 0,03 0,35 ± 0,03

Ацетоацетил-КоА-тиалаза 2,12 ± 0,129 2,06 * 0,280

Оксибутиратдегвдрогеназа 0,27 1 0,021 0,25 ± 0,018

Ацетил-КоА-синтетаза 4,20 ± 0,39 3,28 ± 0,53

АТФ-цитратлиаза 4.59 ± 0,39 4,64 1 0,55

Ацетоацетил-КоА-синтетаза 0,46 ± 0,015. 0.65 1 0,016*

* - Р<0,05 по отноиению к контролю.

зой, в развивавшемся мозге (Patel and Owen, 1977; Robinson ai Williamson, 1980).

Длительное введение этанола кивотным не влияло на актш кость ацетил-КоА-генерирущих ферментов, ацетил-КоА-синтетазы АТС»-цитратлиази в цитоплазме мозга, тогда как активное АцАцЧйТРсгШ^ 8). Активное

ферментов утилизации КТ в мозге, КоА-трачсферазы—З^жшщсл (прямая и обратная реакции), 3-ОМК-дегидрогеназы и АцАц-КоА-ти лазы не изменялась под влиянием хронической алкогольной интокс кафщ. Тагаш образом, в условиях хронической алкогольной инто сикации роль КТ. как энергетических субстратов для мозга вряд существенно возрастает, о чем свидетельствует отсутствие измен ний активности ферментов их утилизации.

Интенсивность включения меченых АцАц и ОМК в липида •фракции мозга вполне сопоставила с аналогичным процессом в пе^ ни (Табл. 5 и 6). Хроническая алкогольная интоксикация усиливг включение метки из 14С-АцАц в холестерин, эфиры холестерина свободные жирные кислоты, тогда как включение метки из 5 4 С-( увеличивается во все исследуемые липидные фракции.

Непосредственная утилизация АцАц-КоА ОМГ-синтетазой. а с участием ацетил-КоЛ-карбокснлазы обусловливает предпочтите кое использование КТ для синтеза стеринов по сравнению с син-sou сирных кислот. Приведенные рассуждения применимы и для xj нической алкогольной интоксикации, когда в мозге активируе

Д ч/

АцАц-КоА-синтетаза. а УА холестерина, синтезируемого из 14С-КТ повышается более значительно, чем УА'аирных кислот.

ВЫВОДЫ.

1. Хроническая алкогольная интоксикация повышает содержание кетоновых тел и отнесение ОМК/АцАц в печени кормленных крыс с максимумом через 1 час после заключительного введения этанола. Голодание в течение 12 и 24 часов повышает уровень кетоновых тел и одновременно смещает максимум их концентрации у шгоотных, длительно получаваих этанол.

2. В условиях хронической алкогольной интоксикации этанол используется для синтеза кетоновых тел более эффективно, чем пальмитат, но менее активно Ло сравнения с октаноатом. В свою очередь, пальмитат в этих условиях становится более предпочтительным субстратом в реакции этерификации.

3. При длительной алкоголизации животных усиливается использование экзогенного этанола, как предшественника з процессе кетогенеза. Кетогенез из этанола включает этап наработки ацетата из ацетальдегида.

4. Хроническая алкогольная интоксикация усиливает вклад кетоновых тел в биосинтез липидов в печени, что обусловливается возрастанием роли АцАц в трансмембранном переносе ацетильных единиц,

5. Длительное потребление этанола экспериментальными- животными приводит к снижению утилизации кетоновых тел, как энергетических субстратов, в ткани сердца, сникая активность Ферментов, ответственных за этот процесс. Окисление кетоновых тел в сердце контролируется активностью ферментов, утилизирующих кетоновые тела, в отличие от мозга, где этот параметр регулируется концентрацией кетоновых тел в крови.

6. В условиях хронической алкогольной интоксикации мозг более активно использует кетоновые тела для синтеза липидов, тогда как роль кетоновых тел, как энергетических субстратов в мозге сохраняется на уровне контроля.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Лукивская О.Я.. Буко В.У;. Горензтейн Б.И., Ларин Ф.С. Липогенез из кетоновых тел в тканях крыс при хронической апко-

гольной интоксикации. Вопросы наркологии, 1989, Но 2. с. 5-13.

2. Lukivskaya 0. Ketogenesls and llpogenesls froa ketone bodies In the liver of rats with chronic alcohol intoxication. Abstracts, of the 10th Hepatological Syaposiua "Biaiystok Liver Day", Biaiystok, 1991, p. 31-32.

3. Buko V., Lukivskaya 0., Neakevich V., i.ialtsev A. Metabolic alterations in the liver after chronic alcohol intoxication . Abstracts of the 1st International Congress on Vitanins and Biofactors in Life Science, Kobe, 1991, p. 71.

4.Lukivskaya 0. Effect of chronic alcohol intoxication on hepatic lipogenesis froa ketone bodies. Journal of Hepatology,

1992, v. 16. Suppl. J, p. 99-100.

5. Lukivskaya 0. Ketogenesls'froa ethanol in isolated hepa-tocytss. of rats with alcoholic steatosis. Journal of Hepatology.

1993. v. 18, Suppl. 1. p. 142.

■6.Lukivskaya 0.. Buko V. Utilisation of ketone bodies by the rat liver, brain and heart in chronic alcohol intoxication. •Alcohol and Alccholisn, 1933, v.28, n.4, p.431-436.

7. Лукнзскгя О.Я. Влияние хронической алкогольной штокси-кацш на утилизации кетоновых тел периферическими тканями крыс. Известия АН Беларуси. Сэр. биол. наук., 1993, Но 4, с. 48- 50.