Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование внутриядерного разделения антигенов хроматина в клетках рака легкого человека

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование внутриядерного разделения антигенов хроматина в клетках рака легкого человека"

'I ^ АКАДЕМЫ НАУК УКРАНШ

ШСТИТУТ Б10Х1МН 1М. 0.В.ИАЛ1АДША

На правах рукошсу

КУЯШВСЪКШ ЬАСШЬ 1ВА1ЮВИЧ

дослщшда шутрхшньодЕшиго розподшння

АНТИГЕН 1В ХРШАТШУ В Ю11ТШАХ РАКУ ЖГЕНЬ

лвдш

03.00.04 - Б!ох1м1я

Автореферат

дисартацП' яа здобутгя парового ступени кандидата б ¡могЛ'атх наук

■Лшв - 1993

Робота вяконаяа у Bimlni глолекулярних основ сом lo тики 1нсгитуту tííoxfMií ím. О.В.Паллад!на АН УкраУни.

Науковий KepiBHHK

доктор б10Л0г!чних наук В.М.брмекова

OJiQiüHi опоненги

доктор 01олог1ч;гах наук професор Цудзевич Б.О.;

доктор медачних наук Ялкут СЛ.

Пров1дна установа:

1нститут xímíí високомолекулярних сполутс АН УкраУни

1993 року о

Захист в{дбудзться год. на оас}данн1 сгоц!ал1эоваио? ради Д 016.07.01 в Iнетитуtí tíioxlHíí 1м.0.В.Паллад1на АН УкраУни /252601, м. Ки гв-30, в ул. Леонтовича, 9/.

Автореферат розгеланий

року

Вчоний секрэтар

споц1ал1зовано1 Вчонсп ради м

кандидат ót олог íтгних наук /¿it^ta?»-^ O.B.IüipceiiKO

ЗАГАЛЪНА ХАРАКТЕРИСТИКА. РОБОТИ

АКТУАЛЫПСТЬ ПРОБЛЕМ. Hhhi ¡нтенсивно дослхдауготься пусков i механгзмн, hki порушують функщонування конкретних генхв, що супроводауються неопластичною трансформацхею кл1тини.

Ведомо, що включения i виключення р:зних генгв у цроцесг життед1Яльност1 шптши зд1йснюеться за рахунок сгоциф1чних ДНК-б1лкових взаемодш. Вивченюо б1ЛК1В - регулятор1в транскришШ reHiB присвячено значну кглыисть роб it /Бакаев, 1982; Разин и до., 1987; Clark, Kinura 1990; Bonifer et al., 1991; Сиво-лоб, Храпунов, 1991; Белевцева и др., 1992; Еркин, 1992/.

У велший cepii ексшриментхв було показано, що шреважно чутлив1 i гШерчутлив1 до ДНК-ази I Д1ляшш хроматину збагачен1 в!дпов1дно активно-транскрибованими i регуляторнши дШнкаш pi3H2X reHiB /V»eintraub et al., 1981; Gorz et al., 1989; Perry et al., 1989; Takada, Obinata 1991; Pfeifer, Hidds 1991/. Досл1дауван1 Д1лянки хроматину, гшерчутлив1 до ендо- i екзо-нуклеаз, утршдують б шеи, Miujio зв"язан1 з ДНК i характеризують-ся шдвищеною 1Шуногенистю / Ermekova et al., 1984/.

У зв"язку з цш велике значения мае пошук цухлиноасоц1Йо-ваних антигенгв, якi можуть бути локал1зован1 в г1перчутливих i шреважно чутливих до нуклеаз Д1лянках хроматину з juiiTm раку легень людини i, отасе, можуть вШгравахи ваяливу роль у трансфорглаци клтши за канцерогенезу.

ПЕТА I ЗАВДАННЯ ДОСЯШЕШМ.Метою ilis'i роботи було вивчен-ня внутршньоядерного розподхлення антигенхв хроматину в юити-нах раку легень людини. Для досягнення поставлено!' мети необхтдно було:

1. Виявити пухлиноасоц1йован1 антигени хроматину клхтип раку легень людини. .

2. Д0сл1дити локал1зац1Ю пухлиноасоц1йованих антигенiB у перевалено чутливих i гшерчутлшзих до ДНК-ази I дглянках хроматину.

3. Вивчиги антигени продукт!в ендонуклеазного г!дрол:зу.

4. Довести характеристику антиген iB нуклзосомних структур хроматину.

НАУКОВА НОВИЗНА РОБОТИ.Проведенi досл1дження дозволили виявити i вивчити цухлиноасоц1Йован1 антигени хроматину з хштин раку легень людини. Так, показано, що rinep4yximBi до ДНК-ази I

делянки хроматину збагачен! ¡адуногенними б1лками з молекулярной ыасов понад 60 кД, як1 локал!зован! головним чином у висо-комолекулярних фрагментах ДНК /понад 5-Ю6 Д/, У продуктах ендо-нуклеазного гОдролгзу цшшнких кл1тин виявлено високомолекуляр-Н1 бхлки /240 кД I 200 кД/, зосередаеН1 в комплексах ДНК-НГБ /в1Д I*Ю5 до 1*Ю7 Д/, якг не виявлшоться в аналогшоа препаратах легень у норгЛ.

Лркал1зац1я данях антигенхв у д!лянках хроматину, збагаче-них регуляторними поыидовностями, а також м1цн!сть }'х зв"язку • з ДНК, дозволила розглядати участь б:лк1в з молекулярной масоа 240 кД 1 200 кД в неопластичн!й траксформащ1 кл!тини.

Досл1даення 1цунореактивност1 нуклеосомних фракц!й хроматину показало, що антитени анал1зуемях структур становлять собою б!лгл середньо1 ыолэкулярно! маси, 1дентичн1 для вс!х препаратов ол1го-1-мононуклеосо!,1. Зб1льшения антигенност! високомолекуляр-них нуклеосомних структур /понад 1»Ю6 Д/ вШуваетъся за раху-нок взаемодП 1чуногенними б!лками.

ТЕОРЕТИЧНЕ I ПРМТИЧНЕ ЗНАЧЕНИЯ РОБРГИ. Досл1даення цухшно-асоц1йованих антиген1в хроматину в р1знлх депаргментах ядра дозволила розглядати ноб1 шляхи иеопластягаох трансформацН кл!тани. Дан! щодо нагромадаевня цухлиноасотйованях б!лглв у цродуктах ендонуклеазного г!даол1зу сприяють бхльш повному розушнню пронесу мал1гн1зацП кл1тин раку легень людини.

АПРОБАШЯ РОБОТИ. Результата робота були представлен! на УП ЬНжнароднИ конференцН з пухшншсс маркерхв людини /Ки?в, 1990/, 71 Украхнсьному бЮхШчному э"'13д1 /йпв, 1992/, П Рос гйсько-} зраг льськоглу симдоз1ут.п з пептидтв 1 бш^в А'осква, 1992/. Анробавдя робота в!дбулася на зас1данн! в1дд!лу молеку-лярних основ сетотики 1нституту 61ох1мг1 О.В.Лаллад1на АН Укра'1'ни, протокол № 12 вхд 11.05.1993 року.

ПШИКАМ I. На тему дасертацг? опублпсовано С1М робгт.

ОБСЯГ I СТРУКТУРА ДИСЕРТАНП. ДисертаШя склада еться 31 всту-пу, огляду Л1тератури, опису матерхал1в 1 метод!в дослЩсення, результат:в дослхдаэнкя, ваклвчнох частини, висноиав, списку використано1 лхтератури. Робота викладена на 125 сторшсах ма-ппшопису. 1люстрована ода гею таблицею I 28 малинками. Список

л!таратури складаеться з 190 джарел, is них 150 шоземних.

МАТЕР1МИ I МЁТ0Щ1 Д0СЛ1ДШШЯ

В експариментах використовуваля п1сляодарац1йций цухлинний ыатар1ал в!д хворих з iuiini4HO й г1столог}чко п1дтвврдканим д!агнозом адонокарщшоми лежень /др1бнокл1тин1шй анашшстичшй -трое хворих; noMipiro дифврешийшгй шгоскогсл1тишшй - II; низь~ кодиферонцШшй плоскокл1тишшй - 6; залозистопашлярний з! слизо продукувашим - 2/. Мате pi ал дифШгшшх тканин легонь людини отримували з бюро судовсмледатао? експвртиз'и.

Ядра з тканини легвнь ввдгляли шляхом гомоген!зац( У в 10 об"емах 0,32 М сахарози, 0,01 U трис-IICI, ¡¿1=7,5, 3 мМ Mg,CL2 3 мМ СаС12, 0,25 мМ рте . Jbiit проф1льтрований матар1ал сус-пвндували в 1,75 М сахароз! цього ж середоввда, нановшш на 5 мл 1,75 М сахарози i центрифугували /90 хв, 120 OOOg/.

Дцарний ctK вид}ляли шляхом в!дмивки ядер де!ч1 в 0,01 М трИС-НСГ, рН=7,8, 100 мМ ¡iaCL , 3 глГЛ MgGL2 , 0,25 мМ PU3F. Надосадову pi дину об"едаували i вважали за ядарннй с!к. Сушр-натант i осадову фраки!» отрищували п1сля цзнтрифугування ядерного соку /100000 х g , 30 хв./.

Хроматин отршували п!сдя даоразовох екстракц!¥ ядер в 0,01 М трнс-IlCI, рН-7,8,100 Ml,I NaCL , 3 мМ b!gGL2 , 0,25 мМ PM3F , трич1 вгдаивали в розчшп 0,01 М трис-HCI, р№7,8,0,25 Ш pus? i один раз - в 0,001 М трис-HCI, р№=7,8, 0,25 Ш РМЗ?.

Д1ЛЯНКИ хроматину, г шарчутлив i до ДНК-ази I, вид{ляли шляхом обробкн хроматину ДНК-ааою I /30 од/мг, 0,5-2 хв, 37°С/. Реакц1ю зушшяли у льодовШ бан! протягом 10 хв з додаванпям ЕДТА до 3 мМ i noTiM центрифутували /5000 х g , 30 хв./.

Нуклеосоми отршлували nf сля обробки хроматину м!крококовою нуклеазою /Ю од/мг, 5-30 хв, 37°С/.

ФракцП моно- та олхгонуклоосом отримуваля шляхом розд1лан-кя в агарозному гол! з наступною елоктроэлвгд!ей в 0,089 М трис-борат, 0,089 М борна кислота, 0,002 М ЕДТА, рН=8,0 /ТВЕ/ при напру3t 100 В протягом 2 год з наступною зшкою напрячу сгруму на 2 хв.

Елоктрофороз 01л;ав за :,aa.»U /1970/ в 8,5-12£ ПААГ про-' ¿-SCSi

вадали niara обробки хроматину ДНК-азою I /30 мкг/мл/ в 0,01 М трис-HCI, рН=7,5, 3 М MgCL2 , 0,25 Ш PMSí при 37°С цротягом 30 хв.

Електрофорез ДНК цровадшш за Ман:ат1сом/1985/ в 0,8 % ага-розному гел1 щшготованоцу на буфер i THE за нацруги поля 5 В/см.

Гель-фхльтраЦ1Ю компонентхв ядерного соку провалили за Остер-маном /1985/ на колонках i3 сефарозою cl_4b, сь_бв в 0,02 м WaH2P0^ , рН=7,2, за швидкост1 елгаци 3 мл протягом 5 хв.

Кглькхсну реакцхю зв"язування комплементу в М1кропостанов-Ц1 /РСК/ провадшш за Levine et al. /1967/.

Iадуноензимолог iчний аналхз /ДОТ/ здгйснювали за steraberg et al /1974/. Концентращя антигену 20-0,01 мкг на пробу, анипромати-нових igG -300 мкг/мл, антикролячих xsC- б ioniHOBoro кон"югату-1:1000, ав1дш-пероксидазного кон"югату - 1:2000. TícToxiMiiHa Bi3yani3aniH: ДАБ - 0,03 %, Н^ - 0,015 %.

1муноензимолог1чнжй анал13 /ELISA / цровадили за Burkhard, et al /1984/. Концонтравдя антигену - I мест на пробу, антихрома-тинових IgG - 10 мкг/мл, антикролячих IgG , М1чених пероксида-зою, - 1:500. ricroxiMi4Ha в1зуал1зац1я: ОРД - 0,04 %, Н202 -0,015 %.

1муноблотний анал1з:

а/ Б1лкя на нхтроцелюлозний фгльтр переносили за Тот/bin et al/1979/. Електроелюцгю зд1Йснювали в буферх /0,025 М трис-HCI, рН=8,3, 0,15 М гл1цкн, 20 % етанол/ протягом 2 год за над-руги 100 В i температури 4°С.

б/ Нуклеосоми на н^роцелюлозний фШ>тр переносили шшгхом кашлярно! дифузП в вертикальному напрям1 в I х ssc /0,015 М -HaOL , 0,05 М Cglí^HaOy, рН=7,0/ з метою зберекенкя нативностг ДНК-б 1Лкових комллексгв, протягом 16-24 год за 4°С.

в/ 1мунопероксидазне фарбування нхтроцелюлозних ф^льгрхв: концентраШя антихроматинових isg - 300 мкг/мл, антикролячих ig& , м1чених пероксидазою, - 1:500. rictoximi4ha в1зуал1зац1я: ДАБ - 0,03 %, Н202 - 0,015 %.

РЕЗУЛЬТАТИ í IX 0БГ0В0РЕНШ

Пухлиноасоцгйовар! антигени хроматину клхтин паку легень лидини

В експериментах були отриманх пол1клональн! антиттла в!д

чотирьох крол1в. У зв"язку з тим, що результата досл1даень ана-лог1ЧН1 для вс1х тварин, у робот1 показаний 1люстративний матер1ал, отриманий з антит1лами, вид1леними 13 сироватки кроля, 1му1пзова-ного хроматином хворого аденокарциноми легень з г1столог1ЧНИм Д1агнозом "пом1рно-диференщйний плоскокл1Тинний рак легень".

Перед 1мун!зац1ею в ус1Х крол!в брали сироватку, для оц1нки наявност1 природных антиг1л до хроматину.

Взаемод1ю алтигхл 13 хроматином аналтзували методами РСК, ДОГ I еыза , в яких антиген використовувався в нативному станг, без данатуруючих агент¡в. В табл. I /вар!ант А/ показано, що препарата: хроматинов, видгленг з пухлинних клгтин р1зних хворих, з високою ефектив;истю реагунть з отриманими антитхлаг.и, Аналог1Ч-ним чином пол1клональн1 антитгла, напрацьованх проти хроматину раку легень, волод1ють високою ефективнхстю зв"язування I 31 зраз-ками хроматину, видхленними з нормальних тканин легень людини.

У настугапй серII експеримент1В анал1зували взаемод!ю хроматин! в гз нормаль них г ракових клгтж легень з антитхлами, висна-жешпш препаратами хрома тин {в гз нормальних тканин легень людани /табл. I, вариант Б/. Видно, що тспажвнг анткт1ла практично не реагуить з хроматинами з нормальних тканин, але продовжуить зв"я-зуватися з антигенами хрома тан: в }з цдапшяих кл!тин.

Проте СЛ1Д В1дзначити, що не всг хроматини з пухлинних тканин збер!гають эдатнхсть взаемод1яти з антитглами, виснажешми хроматином нормальних легень. 20-25 % всгх дослхджених хрома тин! в 13 кл1тин раку легень людани втрачають здатн:гсть зв"язуватися з 1муноглобулЭ;нами, з яких вилучен: антит1ла до антиген 1в хроматину сшльних дай раяових 1 нормальних тканин.

Для виачення в!дл1нностей в 1МУНореактивност1 з р!зною доступы 1стю пухлиноа сощ йованих антиген1в хроматини шлдавали оброб-Ц1 ДНК-азою I. Ц1 досл1дженкя показали, що вфэктзшпсть взаемоди оброблених хроматинIв з антит1лами збгльшуеться 1 стае практично однаковою дая вс!х хворих /табл. I, вар1ант В/.

Уугжгаии делянок хроматину штетэджндтппуртттат I гшаочутливих до ДНК-ази I.

В Д1Й сер1г эксперимент1в вивчали локал!зац1Ю антиген1в у дЬлянках хроматину переважночутливях 1 Пперчутливих до

Таблица I.

Взаемод1я антихроматинових /прота хроматину 15 ¡з кл!тин раку легень/ ¡8 хроматинами з пухлинних 1 нормальних кл1-ган: А - до виснаження; Б - П1сля виснаження антит!л хроматином нормальних тканин; В - п1сля виснаження 1 обробки ДНК-азою I /50 мкг/мл, 30 хв/. '

й 56, 58, 62, 63 - хроматин !з кл1мн раку легень; № 70, 74, 78, 79 - хроматин !з кл!тин нормальних легень.

ELISA

Номери препарат!в хроматину Умовн! одиниц! ефективност! взаемодП антит!л i антигену /в одиницях екстинк-ц! ï зразк!в за 492 нм »1000 /

А • Б В

56 960 30 ' 460

58 965 35 430

62 1510 215 465

63 1695 230 470

70 980 5 95

74 1030 10 105 .

78 840 25 НО

79 845 20 100

Конценграц1я антигену - I мкг на пробу.

ДНК-ази I, як! за даними л!тературл належать в|дповхдно до активнотранскрибованих i регуляторних Д1Лянок хроматину.

• 11а мал. I подан! результати взаемодГ/ антшЧл з тотальним хроматином i кислоторозчшшими. фракц!ями за р!зного ступени г!д-рол!за хроматину ДЩ-азою I. Видно, цо зг!дно з методом РСК, г!шрчутлив1 до ДНК-ази I д!лянки хроматину злачно збагачен! антигенами /крива I/, н!;к норова;,шо чу тлив! до нуклеази облает i /крив! 2,3,4/ в1дносно тотального хроматину /крива 5/.

Для випчешш комплекс îb ДНК-11ГБ Г1шрчутливих до ДНК-ази I д!лянок хроматину, були проведен! досл1дашшя у двох вар ¡антах.

У порлому nnpiaiiTl досл!досиь було показано, що при змеи-

шенн! высотку % Г1дрол1зу препаратов хроматину ДНК-азою I у цих фракциях в1зуал13уиться б i леи з молекулярной масою понад 60 кД /мал. 2а/. В одночас було виявлено, що 3i зменшенням в:д-сотку виходу в кислоторозчинну фракд1Ю комплексов ДНК-НГБ, спо-стертгаеться пгдвицення ¡мунореактлвност! досл1нуваних препара-

РСК

&

м

<D

Е

О К

СП

I

СО &

я

со

100 80 -60 40 . 20 •

—i—

I 25 50 100 мест

Концентрация антигену- по ДНК/мл.

мал. I. Взаемод1я антихроматинових igG /проти хроматину й 15

i3 кл1тин ракових легень/ з гйерчутливими до ДНК-ази I дглянками хроматину /I/, шреважно чутливими д1лянками хроматину /2, 3, 4/ i тоталънш хроматином /5/ i3 кл1-тин ракових легень.

1,2,3,4 - KimcicTb ДНК, яка розпалася до кислоторозчин-них продумав, складае: 2 %, 5 %, 10 %, 15 % при оброб-itf тотального хроматину ДНК-азою I /30 мкг/мл/ В1ДП0В1Д-но 2 хв, 5 хв, 15 хв, 30 хв.

tíb. Анал!з ДНК гшерчу тливих Д1Лянок показав, що ni фракцП" утримують головннм чином високомолекулярнi фрагмента з молекулярного масою понад 5*Ю6 Д i невелику к1лыпсть низькомолекулярних комплекс íb ДНК-НГБ /мал. 26/.

У другому BapiaHTi досл!даень анал1зувалася роль компакти-зацИ в 1мунореактивностi Г1перчутливих д!лянок. Виявилось, що niara обробки г {перчу тливих д!лянок м!крококовою нуклеазою i

3 - 5052.

180 кД-

85 вД-75 кД-60 кД-

а 4

ю. Ю6 Д 5-ю6 Д

2,1-Ю6 Д

'Г'4*

1.1Ч0° Д

..•и

- " 4

0.5«10° Д __

0.25-Ю6 Д -

12 3

4 3 2 1

Концзнтрац1я антигену-50 мкг на пробу /А/, 20 ыкг на пробу /Б/, Мал.2. Електрофореграма бглк1В в 10$ ПААГ /А/ 1 комплекс1в ДНК-НГБ в 0,8$ агароз! /Б/ гшерчутливих до ДНК-ази I дхлянок хроматину з кл1тин раку легень,при зменшенн1 вхдсотку виходу фрагмент1в у кислотсрозчинну фракхдю. 1,2,3 - глльк1сть ДНК, яка розпалася до кислоторозчин-них продукт1в: I %, 1,5 %, 2 %, при оборобц! хроматину ДНК-азою I /30 мкг/мл/ вхдповхдно 30 сек, I хв, 2 хв.

ДНК-азою I ефективн1сть ix взаемоды з антит1лами не зм1нюеться. Щ результата вказують на В1дсутн1сть р1зко комиактизованих структур У цих препаратах х повну Д0ступн1сть антиген!в хроматину для реагуванвя з антит!лами.

Антигени ядещого соку

Ранхше в ядерному сощ з кл1тин 1ндук0ваних I перещеплених пухлин тварин було виявлено цухлиноасоц!йован1 антигени хроматину / Егтекоуа еъ а1., 1984/. ДаН1 досл1даенкя показали, що ядерний с!к утримуе фрагмента! ДНК з мхвдо зв"язаними бхлками, як1, як можна прицускати, е продуктами екдонуклеазного гхдролхзу.

На мал.За показано, що продукта ендонуклеазного Г1Дрол1зу з клхтин раку легень людини значно збагаченх антигенами /крива I/ в1дносно тотального хроматину /крива 4/. Результата досл1джень взаемод11 компонент ядерного соку з ангит!лами продемонструвалл /мал.Зб/, що його супернатант найбхльше збагачений антигенами /крива 2/, в той час як осадова щракщя /крива 3/ - утрите неве-

РСК

IT

50

100 мкг

I 25 50 100 I

Концентрация антигену - по ДНК/мл

Мал. 3. Взаемод1я антихроматинових /цроти хроматину № 15 югётин раку легень/ 1з ядерним соком та його шио-кентами з кл!тин раку легень людини: I - сумарний ядер-ний сге; 2 - сулврнатант ядерного соку; 3 - осадова фракцгя ядерного соку; 4 - тотальний хроматин.

Ядерний cik

2500,

ELISA Супернатант

Осадова фракц!я

OJ СП

-Г

200С

1500

ЮОС

12 12 12 Кожну експериментальну точку отрицували в результат! 3-х

зам1р1В.Похибка не перевищувала Ь%. _ ____

Мал. 4. Взаемод1Я антихроматинових /прост хроматину В 15 гз кл1тин раку легень/ з ядерним соком 1 його компонентами з пухлинних /I/ { нормальних /2/ кл!тин.

з*

лику 1'х к1льк1сть.

За досл!даення препаратхв нормальних х пухлинних тканин /мал. 4/ було выявлено, що ядерний о1к 13 шптин нормальних легень менш ефективно взасмодге з антителами, Н1Ж в1даов1Дна фракция 13 кл1тин раку легень. Вивчення 1ЭДУН0Л0Г1ЧН01 активнос-т! компонент ядерного соку з юитин нормальних тканин показало зншсення 1цунореактивност1 як супернатанту, так I осадовог фракц1I В1дносно аналог¡чних препарат!в ракових шптин.

У наступиШ серп ексшрямент1в характеризували антигени хроматину сумзрного ядерного соку та його компонент !з кл!тин раку легень людини.

Було шдраховано, що стввгдаошення б!лок:ДНК в тотальному хроматинх складае 2,25, тод! як в осадовхй фракдхГ ядерного соку - 3,55,-суыарному ядерному совд - 5,5 I супернатантг - 6,2.

Дан! бхлкового електрофорэзу продемонстрували принципову схо&хсть складу б1ЛК1в сумарного ядерного соку х його суперна-таноу, тод1 як в осадовхй фракЦ11 ядерного соку не В1зуал1зушть-ся деягл високомолекулярн1 бшш /мал. 5/. Кр!м цього, в ус!х досл!дауваних црепаратах не виявлено г1стон1в, що дозволяе при-пускати в1дсутн1сть регулярних нуклеосомних структур в ядерного сод! та його кошонентах.

180 кД__

85 кД

65 кД 43 кД . 36 кД

12 3

Концантращя антигену - 50 мкг на пробу Мал. 5. Електрофореграма б!лк1В ядерного соку /I/, осадово! фракцп /2/ 1 супернатанту /3/ з пухлинних кл!тин.

Для вивчення комплекс ¡в ДПС-НГБ анал!зували розподхл анти-ген1в тотального хроматину по фрагментах супернатанту ! осадовоГ фракци ядерного соку. Препарата хроматографували в!дпов!дно на колонках сь _бв I оь _4в з наступним визначенням ¡адунореактив-ност! отриманих шк1в кожноУ проби методом еыбд /мал. 6а/. Виянилось, що антигенн!сть супернатанту ядерного соку не зв"я-зана з молекуляршши розмхрами фрагмент 1В г практично !дентична в д!апазон! молекулярно? маси 1*10 - 1»Ю5 Д.

Зове1нша картина отримана за аналхзу осадово? фракц11. Основна маса фрагмен^в ДНК-Н1Б осаду виходить у в!льновду об".еы! колонки, що ор!ентовно в!дповхдас молекулярн1й мае г понад РЮ'д. Однак несхШдно вхдзначити, що гмунореактившеть не зб1гаеться з основним П1КОМ елюата, а зв"язана з фрагментами меншоТ моле-кулярно! маси в д1апазон! 2*Ю6 - 1*10 Д. Водночас дан! досл1д-яеняя показали, що найб!льш !ыунореактивн! антигена хроматину як супернатанту, так ! осадовог фракцН асоц!йован! з фрагментами ДНК одн!е'1 й ттет" ж ыолакулярнох маси. Для визначення розм!цу ДНК, що в!дпов!дае метальному Iмунореактивному фрагменту, супернатант I осадову фракщю ядерного соку п!дцавали оброб-ц! м!крококовою нуклеазою, за умов, що викликають г!дрол1з фраг-мент!в до розм1ру з молекулярного па сою цриблизно 1'Ю - 1-Ю5 д /мал. 66/. Анал!з ¡мунореактивност! виявив, що отриман! фрагмента повн1СТЮ збер!гашь свои антигенн!сть. Отже м!н!мальний розм!р"антигенно1 оданиц!" мае молекулярну масу б!ля 1-Ю5 д.

Проведен! досд!даення показали, що антигени хроматину част-коволокал!зован! в високомолвкулярних фрагментах супернатанту ! осадовоТ фракц!! ядерного соку.

У зз"язку з цим вивчали вшшв компактизац!I на ефективн!сть взаемодИ компонент ядерного соку !з кл!тин раку легень ! нормаль-них легень з антит!лами. Було встановлено, що за р!зного ступени г!дрол1зу препаратIв ДНК-азою I спостерхгасться зменшення р!зни-ц! в !мунорвактпвност! сумарних ядертис сок!в г особливо осадових фракц!й.

Для виявлення пухлиноасоцхйованих антиген!в були проведен: дослхда, в яких використовували полIклональн1 антит!ла, виснаже-н! хроматином ¡з кл!тин нормаль них легень. Выявилось, що так! антит!ла найефективн!ше взаемодШть з ядерним соком ! суперна-

Супернатант Осадова фракц!Я

Мал. 6. Гель-ф1лътрац1я фрагмент!в супернатанту I осадово?

фракцП ядерного соку 1 5с'х взаемод!я з антит!лаш до обробки /А/, п!сля об робки мйсрококовою нуклеазою /5 од/мл/ в1дпов1дао 30 хв 1 2 хв /Б/.* •-^492»° °~А280*

тантом хз кл1тин пухлинних тканин. Прлчому зберггаеться сп!в-в гдношення в гмунореактивност 1 дои хроматин!в, адерних сок!в 1 IX компонент1в, отримане при взаемод!? 8 пол!кловальними анти-т1лвми.

Декомлактизащя, доел 1дауваних црапараПв з допомагсо ДНК-ази I сприяе кращому-шявленню вдхганоасовдйованжх антигек!в в ядерному сой 1 йаго компонентах кл!тин раку легекь лвдини.

Портвняльна характеристика хмуногенних б!лктв у хроматин!. ядерному coni i г аерчутливих до ШЩ-ази I д1лянках тгоепараттв i3 нормальних i пухлинних imi-nm.

На мал. 7а вм1щено данг электрофорезу 6}Ж1В хроматину з клхтин нормальних i ракових легень. Видно, що хроматин духшн-HOi тканини збагачений бглками з молекулярною масою 180 кД, 150 кД, 65 кД, 32 кД i 30 кД вгдносно препарату нормальних легень. KpiM цього, в хроматин! ракових легень В1зуал1зуються 61л-ки з молекулярною масон 100 кД, 60 кД'1 43 кД.

Результати ¡муноблотного аналхзу щх зразк!в i3 пол!клональ-ниш антитглами показуить /мал. 7б/, що основна маса антигенfв хроматину s сп1льнивд, серед яких частина хмукогенких б!лк1в вщизняеться кхльк1стю. Так, хроматин i3 шитин пухлиннох тканини утримуе значно бхльше бхлкгв з молекулярной масою 220 кЦ, 180 кД, 150 кД, 130 кД, 90 кД, 65 кД, 34 кД, 32 кД ! 30 кД, а хроматин нормальних легень - 40 кД. Водночас гмуногенн! бхлки 100 кД, 60 кД i 43 кД виявляються т1льки в пухлинних препаратах, а б1лок 85 кд - у препаратах клхтин за норми.

Дослхдження взаемод11 дих зразкгв з виснаженими антитхлаш /мал. 7в/ показало, що в хроматтп з кл1тин раку легень в!зуал1-зуються б!лки з молекулярною масою 130 кД, 100 кД, 60 кД i 43 кД.

' п

120 КД

94 кД

67 КД 60 КД

43 КД 36 КД 30 КД

14.4 кД

i 1 г I ^ Концентрация антигену - 40 мкг на пробу Мал. 7. Електрофореграма б ijnciB /А/, 1муноблотний анал!з з антихроматиновими igG /Б/ i антит хлами, виснаженими хроматином нормально'1 тканини В/: I - хроматин i3 ракових кл!тин; 2 - хроматин хз нормальних югётин.

АналогÍ4H8 порхвняння хмуногенних dirnciB провадили для препаратхв сумарного ядерного соку з нормальных i пухлинних кл1тин. Результата электрофорезу óíjikíb цих фракцхй свхдчать /мал. 8а/. то в ядерному coyi ракових клхтин утримуеться б хлыяе dimÍB з молекулярного масою 85 кД, 82 кД, 75 73 кД,- 70 цД, 60 кД i 32 кД, а в зразках iuiítuh за норми - б1ЛК1в з молекулярной масою 85 кД, 43 кД, 40 кД, 38 кД i 36 кД. KpiM 1ц,ого, тхльки в дослхдауванхй фракцП з клхтин ракових легень 1денти-фпсуються бглки з молекулярной масою 220 кД, 82 кД, 42 кД i 34 кД.

Данi 1муноблотного аналхзу цих препарат в з невиснаженими антитпшми продемонстрували принципову схогЛсть ochobhoí маси виявлених антигенíb хроматину /мал. 86/.Разом з тим спостер!гаетьс i к1лькхсна pi3hh4h. Так, в ядерному соц1 пухлинних клхтин míc-титься б{льше ¡муногенних óíjikíb 200 кД, 180 кД, 75 кД, 73 кД, 60 кД, 34 кД i 32 кД, а в зразках норми - бхлкхв 85 кД, 43 кД, 36 кД. KpiM цього, iMyHoreHHi б1лки 220 кД, 82 кД i 42 кД в!зу-ал1зуються Т1лыш в пухлинних црепаратах.

Результаты дослгдаень з виснаженими антитхлаш показали

/мал. 8в/, що ядерний cík i3 ракових клхтин легень людини утри-

А Б В

¡

Т - г

р — 220 кД

* — 94 кД - 67 кД

60 «д

- 43 КД

- 36 кД

- 30 КД

12 12 12 КонцентраЩя антигену - 40 мкг на пробу Мал. 8. Електрофореграма бхлкхв /А/, хцуноблотний аналхз з анти-хроматиновими 1в& /Б/ I антит}лами, виснаженими хроматином нормально! тканини /в/: I - ядерного соку хз нормальних клхтин, 2 - ядерного соку 1з ракових клхтин.

¡ують б!лки з молекулярном масою 240 кД, 200 кД, 82 кД, 60 кД, 2 кД, 34 кД 1 32 кД, як! не вдаеться виявити в препаратах дерного соку з нормалышх кл!тян лвгепь.

Таким чином, визначона трупа антиген!в, яка в!зуал1зуеться . а допомогою внтит!л, виснажених хроматином нормальноI тканини, чевидно, наложить до пухлиноасоцШованих б!лк!в. Звичайно цей акт може бути пояснений як як!сциш зм!нами в ракових кл!тинах,

0 супроводауються появою нових 61лк1в, так !, ц!лком матишво, 1Льк1с!Ш!Ж в1лм1нностягли, через як1 не вдаеться виявити м!нор- '

1 компоненти в склад} ядорннх 61Ж1В нормалышх кл!тин.Кр!м ього, на препаратах !э клггин нормально! I пухли нно! тканини . оказано, що ядорний с1к значно в!др!зняеться за складом б!ж!в !д хроматину. У продуктах евдонуклеазного г1дрол1зуз ракових л1тин легень людши виявлено р!зко збШшену к!лыс1сть високо-ол8кулярго1Х б1лк!в /240 кД ! 200 кД/. Ран1ше нами було показа-е рхзко збагачення антигенами, хроматину ядерного соку з ормальних 1 особливо ракових юл тин. На основ! цих данлх ми моемо припускати, що сама б!лки з молекулярной масою 240 кД 1

00 кД вШюв!дають за п!двищену 1мунореактивн1сть ядерного соку пухлинних клхтин.

Антигени нуклеосоших структур хроматину. -

Су!ларнх фракцП' нуклэосом Шсля электрофорезу в нативних мовах 1 переносу на н!троцелгалозний ф!льтр п!дцавали !муно-нзимолог1чн!й обробц! антит1лаш /мал. 9/. На електрофорез! !тко видно безшрервгай розподхл фрагмент !в хроматину за роз-!рами в!д ол!гонуклеосом до мононуклеосом в д!апазон! мшгвку-ярно I* маси в!д 10,6« ю6 д до 0,25-Ю6 Д. За 1Мунопероксидаз-ого фарбуваши препарат!в було показано, що !мунореактивними иявлшоться фракцИ нуклеосш з молекулярной масою в!д 10,6«ЮЬД о рЮ6 Д, тобто ол1го-тотрануклеосоми.

Кр!м цього, окрам! фракц!: нуклеосш, отриман! як описано "Матер!олах I методах", анал!зували методами ДОТ ! еыба мал. 10/, крива I/. Видно, що !нтенсивн!сть взаемод!I фракц!й анипМламп спадае у м!ру зменшення розм!ру нуклеосомного фраг-онту, тобто найб!лыл активно працшгь ол!гонуклеосош, одаок Цщосно неволика робота в1дм!чаеться ! доя мононуклеосом.

5-я фракдтя

4-а фракдтя

3-я фракция

2-а фракдтя

1-а фракдтя

2 I

|1 - 10,6. ю6 д

Г| — 4,7* 10® Д

4 - 3,3-10| д

| -2,2-Ю6 Д ( 6

! _0,5'Ю6 Д

_ 0,25-10й Д

Мал.9. Електрофорез фрагмент 1в в 0,8$ агароз! /А/ I тмуноблотний анал!з /Б/ нуклеосомних фракцИ хроматину з пухлинних клг

дот

■<! г*4 С-2

I фр.2фр. Зфр. 4фр. 5фр.

Концентрад1Я антигену - I мкг на пробу

Мал. 10. Бзаемод!я антихроматинових 1в® /проти хроматину № 15 13 ракавих кл!тин легень/ з фракд1ями нуклеосом хроматину ракових кл!тин: до обробки /I/, п1сля обробки ы}крококовою нуклеазою /10 од/мг, 30 хв/ /2/, п!сля обробки ДНК-азою I /30 мкг/мл, 30 хв/ /3/.

Таким чином, представленI дан1 однозначно вказують на залех н!сть !мунореактивност! хроматину в!д розм!ру нуклеосомного фрагменту.

В зв"язку з цим ц1каво було досл1дити ыШмальний розм!р

А

антигенно: одиниц1 хроматину. Для цього описан! фракцп шдца-вали iHTSHCHBHiiö обробц! ДЯКазога I i м!крококовою нуклеазою, досягаючи однакового ступiню г1дрол!зу у Bcix препаратах нуклео-сом. HoTiM отриман1 зразки аналгзували методами ДОТ i elisa /мал. 10, крив: 2,3/. Виявилося, що п!сля виснаженого ггдрол1зу повнiстю збер1гаеться як !нтенсивн1сть фарбування, так i cniB-В1дн0шенкя в ефективност1 взаемоди з антит1лами Mis фракц1ями ОЛ1ГО- i мононуклеосом.

Таким чином, було встановлено, що антигенн1сть noBHic-тю пов"язана з вихгдншл розм1ром фракцИ' нуклеосом у склад! хроматину i не залезкить В1Д наступного П г!дрол!зу нуклеазамл до субнуклеосоглних структур.

Для характеристики антигенких комплексib отриманих фракщй ол1го- i мононуклеосом, було проведено два типи експеримент1в.

У mprnifi cepii експеримеш^в анал1зували б1лковий склад р!з-них препаратхв нуклеосом у денатурованих умовах з наступним Вес-терн-блотом, На мал. II видно, що б Шеи в склад1 ол£го- i мононуклеосом 1дентичн1 як за електрофоретичного, так i ¡муноблотно-го анал1зу. 1муногенними в складг фракцМ е бхлки з молекулярной масою 62 кД, 54 кД, 50 кД, 46 кД i 32 кД.

А F

60 кД 50 кД 43 кД

32 кД

Icpp. 2фр.йфр.4фр. 5.^р. 1фр.^фр.3фр.4фр.5фр.

Концентрац1Я антигену - 50 мкг на пробу Мал. II. Електрофореграмма б1ЛК1в /А/ та 1муноблотний анал1з /Б/ фракщй нуклеосом хроматину ракових юйтин

У друг Iii cepli ексшримвнт1в препарата нуклеосом шддава-ли. обробц! 2 U HaOL i 2 М HaCL , 5 М сечовиною. В табл. 2 наведано дан!, як! демонструють, що обидва типм обробки шдви-щуыгь ефоктивн!сть зв"яаування фракШй з антит!лами, але t в цьому випадку збер!гаеться сп!вв!дношоння 1нтенсивност1 взаемо-д!i' ол1го- i мононуклеосом з антгПлаш.

Таблиця 2.

ВзасмоД1Я актихроматиновюс igG/проти хроматину В 15 i3 ракових кл!тин легонь/ з фракдЬши нуклеосом хроматину цухлин-них кл1тин п!сля обробки ДНК-азою Т f сольово!' екстракц!Ё.

ELISA

Вид обробки I-а фракШя 5-а фракиля

Контроль 0,200 0,600

.ЩК-аза I /30 мкг/мл, 30 хв/ 0,200 0,600

ДНК-аза I /30 мкг/мл, 30 хвА

4M liaOL 0,310 0,800

4M HaOL+lO М сечовина 0,350 0,300

КонцеитраЩя антигену-! мкг на пробу.

ЙмоЫрно, що п!сля сольовог обробки 1 Biipiisy нем1цно зв"язаних б tлес 1в антигени нуклеосомних структур хроматину б|льш широко експонуються для взаемод!'/ з антит!лнми.

висновки

У хроматин! з ракових кл!ткн легонь людини виявлено пухлино-асоц!йован1 антигени, як! е ¡муногенниш б!лками з молекуляр-ною масою 240 кД, 200 кД, 82 кД, 60 кД, 42 кД, 34 кД t 32 вД. Осиовна маса пухлиноасоцИ'юваних б!лгс1в локал!зована в регуля-торних областях активиих ген!в хроматину Пперчутливих до ендо-i екзонуклэаз, як1 характеризуются в!дсутн!стю або нэрогуляр-Hicno нуклэосом.

У г!перчутливих до ДИК-ази I д!лягасах хроматину !з пухли»мх кл!тин антигени зосеродлон! в основное в фрагментах з молоку-лярною масою понад 5»ю Д, шо характеризуются в1дсутн!стю компакта зова них структур, як1 бускладапвали i'x взасмод!ю з пнтит!-ламя.

1.

2.

3.

У продуктах евдонуклеазного г!дролгзу !з кл!тин раку легень спостер!гасться нагромадження високомолекулярних б!ж!в /240 кД i 200 кД/. Дан! б!лки зосэреджен! в фрагментах з молекулярною масою менше 1*10 Д, що гакож не мають компактизованпх структур, як! б ускладнювали íx реагування з антит!лами.

В той же час низькомолекулярн! !муногенн! б!лки ядерного соку переважно локалгзован! в фрагментах з молекулярною масою пснад 1°10 Д, як! значно ускладнюють i'x зв"язування: з антит!лами. Прячо-.у ядерний cík i3 пухлинних кл!тин м!стить менш компактизован! структу-ри по в!дношенню до аналог!чних препарат!в !з нормальных кл!тин. Шдвшцення антигенност! продукт!в ендо- i екзонуклеазного Г1Дро-л!зу хроматину з пухлинних кл!тин вШосно аналог!чних црепара-tíb нормальних тканин вШуваеться за рахунок шсоксмолекулярних б!лк!в /понад 60 кД/.

Серед цаних антиген!в ввд!ляються 6íjikh з молекулярною масою 240 кД i 200 кД, для яких характерна висока ефектЕвн!сть зв"язування пол!клональних антит!л.

Ол!го- i мононуклеосомн! фракщ1 хроматину з кл1тин раку легень складаються з !дентнчтах 1муногеннлх 6imiB з молекулярною г,и сою 62 кД, 54 кД, 50 кД, 46 кД ! 32 кД, як! мають м!цний зв"язок з ДНК. ЗбЬтыпення антигенност! шсоксмолекулярних нуклеосомних структур /понад 1*10 Д/ в!дбуваеться за рахунок взаемод!! м!я !му-ногенними б!лками.

СПИСОК ПРАЦЬ, 0ПУБЛ1К0ВАНИХ ЗА ТЕМСЮ ДИСЕРТАЦП"

1. bitko в.н., Терновий К.с., Д!брова т.Д., Кулак!всышй b.i., Салабай П.В., брмекова В.М. Досл!даення пухлиноасоцИова-них ¡муногенних б!лк1в хроматину // Тез.докл. У1 Украшсько-го 6ioxiM. з"!зду. - Khí'b у 1992,- ч. I.- С. 6.

2. Кулак!вський B.I., Терновий К.С., Eítko В.Н., Д!брова Т.Д., Салабай П.В., брмекова В.М. Зв"язок антиген!в хроматину з нуклеосомною структурою // Тез. докл. У1 Укра'1'нського 6io-xím. з"1'зду. - Iüiib , 1992.- ч. 111.- С. 101.

3. Салабай П.В., Терновий К.С., Eítko В.Н., Д!брова Т.Д., Кулак1всъкий B.I., брмекова В.М. ПухлиноасоцШован! 61ЛКИ нуклеазонадчутливих д!лянок // Тез. докл. У1 Укра'йського 6íoxím. з'Чзду. - ffiii'B f 1992,- ч. Ш.- С. 108.

4. Терновий К.С., Bítko В.Н., Д1брова Т.Д., Кулак1вський В.I., Салабай П.В., брмекова В.М. Дослгдаення антиген!в хроматину

в нуклёосомах та i'x ол1гомерах. //ДАН УкраУни. - 1991 -№ 12,- С. 106-109.

5. Терновой К.С., Битко В.Н., Диброва T.JI., Галахин К.А., Кулаковский В.И., Ермакова В.М. йдмунологический анализ антигенных детерминант хроматина клеток paica легкого и прямой кшпки человека // Эксгариментальная онколога;. - 1992 -& 5. - С. 60-67.

6. Ternovoi S.S., Bitko V.N., Galahin K.A., Dibrova T.L., Kulakovsky V.I., Salabai P.V., Ermekova V.M. Chromatin antigens of human colon and lung tumors // Journal of tumor oncology. - 1990.- v. 5 N? 3,- P. 270.

7. Tcrnovoi K.S., Bitko V.N., Kulakovsky V.I., Salabai P.V., Eimekova У.Ы. Immunological proteins.of nuclease - sensitive region of tumor cell chromatin". // II Russian - Israel Symposium on peptids and proteins. - 1992. - P. 60.

ГКдп. до друку С/, «>/. 93 . Формат 60x84'/iS.

Пашр друк. J6 J . CnociS друку офсетний. Умовн. друк. арк. .

Умовн. фарбо-вщб.-/,39 . Обл.-вид. арк. /О Тираж -¡£>0 . Зам. i&i~t>SS. . Безплатно.

Ф1рма «В1ПОЛ» 252151, Ки1в, вул. Волинська, 60.