Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование транспозиций нового мобильного элемента сталкера у D. Melanogaster

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Исследование транспозиций нового мобильного элемента сталкера у D. Melanogaster"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ГЕНЕТИКИ им. Н. И. ВАВИЛОВА

На правах рукописи

СИМОНОВА ОЛЕГА БОРИСОВНА

УДК 575.24:595.77Х.4

ИССЛЕДОВАНИЕ ТРАНСПОЗИЦИЙ НОВОГО МОБИЛЬНОГО ЭЛЕМЕНТА СТАЖЕРА У В. ЫЕЫКСХЛБЕЕЯ (03.00.15 - генетика)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наух

МОСКВА - 1992

Работа выполнена в Институте общей генетики им. Н.И.Вавилова АН СССР, г.Москва-

Научный руководитель: доктор биологических наук

Т.И.Герасимова

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук

Л.И.Корочкин кандидат биологических наук . Н.И.Иващенко

Ведущее учреждение: Институт молекулярной биологии зш.В.А.Загэльгарда АН СССР, г.Москва

Защита диссертации состоится "_"_1992г.

в_час. на заседании Специализированного совета (Д 002.49.01) при

Институте общей генетики им.Н.Й.Вавилова АН СССР ш адресу: г.Москва, ул.Губкина, 3.

, С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИОГен АН СССР.

Автореферат разослан "_"_;_1992г.

Ученый секретарь Специализированного совета

кандидат биологических наук Г.Н.Полухина

ВВЕЛЕКМЕ

Мобильные элементы впервые били открыты в гс-коме кукурузы с мсщыз чисто генетических методов [HcCHntook, 1S48: 1950]. В геноме bslanogsster они Сели обнаружены укз посла того, как появились шо~нш:енврные методы [Ilyin st al., 1973]. Сущаствует несколько ¡зных типов строения мобильных элементов, что определяет разные ханкзкы Ja распространения по геному.

Расположение мооильных генетических элементов вдоль хромосомы D. lanogaster очень вариабельно, и между разными линиями различия часто звншают 2/3 всех мест локализации. Мезду индивидуальными особями ной лизгк эти различия могут составлять до 1/2 всех даст [Ilyin et .. 1973].

Основные закономерности генетической нестабильности, связанной с тквннм мутагенезом у дрозофилы изложены в рзботах Грина [Green, 67] я Голубонского ЕГодубсвский, 1977]. После открытия мобильных аментов Езгвньяв впервые показал связь нестабильности с зисдазициями [Еагоньзз н др., IS823.

Что касается 'вклада нобюгьнш: элементов в ¡«утагензз, то кожно ззать, что у разных видов и для разных локусов он различен, являясь миной от 10Ж до 90S всех мутаций [bsigh-Brosn et al., 1SS9) ■ этому транспозиции мобильных элементов являются ваанвйанн фактором хивидуалькой изменчивости организмов, нграя при этом сущзственнув а в процессах зеолюцие. В практическом отношении получение ;эрцйоннах мутаций в различных генах упрощает способ ах янрозания, используя в качестве зонда соотвэтствузянй мобильный >кзнт. Наиболее удобным для этих целей является F-элемепт £ Rubin, !31.

Огранкчивапцйм факторе« процесса получения ннсерцкокных мутаций у melas-cgaster является тот факт, что в норме транспозиции происходят звычайно редко, со скоростью ниле, чем 10"^ - Ю-6 на поколение аньев., 19813. Однако, существуют ситуации, когда частота еке^еннй кобкльвнх элементов резко возрастает. В первую очередь к относится гибридный дясгенез, возникающий при определенных типах ешивания, а такге системы нестабильности, обладание продленным эктсн, позволявшем исследовать процессы мутагенеза на протяжении

рада десятков поколений, представляющие в этом плане наибольший интерес. Известно несколько типов дасгенеза: Р-Ы [Kidwell, 1979; Engels, 1979], Н-Е [YaloppouICB et al., 1987], I-P. [Bucheton et al.,1934].

К системам с продленным эффектом- мутагенеза в первую очередь относится система "et1®2" [Geraaimova et al., 1984], где впервые наблюдались массовые одномоментные транспозиции разных классов мобильных элементов, а также ряд систем нестабильностей, в которых наблюдались перемещения МДГ4, [Lira et al., 1933; Hevel-Winio et al., 1939; Kim et al., 1990] и ряда других мобильных элементов [Гвоздев, Кайданов, 1936].

Открытие новых систем нестабильности, в которых наблюдается высокая частота мутагенеза, связанного с перемещениями одного или нескольких мобильных элементов, позволяет, во-первых, ■ подойти к решению проблемы, касавдейся механизмов и причин транспозиций, как феномена, свойственного определенной группе генов, существующей в генотипе практически любого организма; во-вторых, открывать и клонировать новые гены. В нашей лаборатории была получена система продленной нестабильности при скрещивании двух стабильных лабораторных линий [Георгиев и др., 1988]. В результате молекулярного исследования одного из мутантвых локусов, возникшего в этой системе, в его составе обнаружили инсерцшо, которая оказалась новым мобильным элементом мдг--»г.тигга, получившим название Сталкер [Киселев и др., 1990].

Двль и задачи исследования Целью данной работы было

выяснение роли нового мобильного элемента Сталкера в системе проданной нестабильности, а также изучение транспозиций этого мобильного элемента.

Были поставлены следующие задачи: Ппровести анализ ряда стабильных лабораторшх линий, а также двух исходных родительских линий (у^о1«^ и ?Н4) системы продленной нестабильности, методом in eitu гибридизации с ^Й-ДЖ Сталкера; 2)исследовать тем зга методом распределение Сталкера в мутантшх сублиших данной системы; 3Определить роль различных фрагментов Сталкера в процесса его транспозиций; 4)с помощью меченых проб Стажера провести цитологическое картирование новых транс-регуляторных мутаций, полученных в системе продленной настабильности, 5)выяснить причину продленности мутагенеза систеш, методом цитологического анализа

хромосом особей одной линии, ззятых из разных поколений, S)осуществить генетический синтез двух систем нестабильности (Р-М и продленной нестабильности), с дальнейшим исследованием спектра мутагенеза Р-элементе в нозых для нзго условиях системы продленной нестабильности.

Научная новизна работы. В данной работе бала исследоЕэна новая система продленной нестабильности. Было доказано, что причиной мутагенеза этой системы явились активные транспозиции нового мобильного элемента Сталкера, которые происходят на фоне стабильности ЩЧ, ВДГ2, ЩГЗ, ВДГ4, copia и I-элешнта. Установлено, что родительские ливши, скрещивание которых привело к созданию этой системы, на порядок отличается друг от друга по количеству копий Стажера вне хромоцентра (45 и 4). Обнаружено, что старые лабораторные линии являются малокопийннми по Сталкеру (I - в копий вне хромоцентра). Все исследуемые в данной работе линии шели чрезвычайно сильно мвтязцййся хромоцеЕтр, независимо от количества копий Сталкера пке его.

Било показано, что в процессе активных транспозиций участвуют лишь полноразиерные копии Сталкера, тогда как в геноме старых лабораторных линий присутствует; также и делетироЕанкые его кошт. Результат исследования 22 мутантннх сублиний данной системы показал гетерогенное распределение Сталкера не только от линии к линии, но и внутри самих линий, что объясняет причину продленностн ее мутагенеза, связанной с активными транспозициями Сталкера на протяжении ряда десятков поколений. В 75% случаев обнаружена корреляция между генетической локализации мутации и новыми копиями Сталкера. С помощьв меченых проб Сталкера проведено цитологическое картирование новых транс-регулято]рных локусов, контролирующих экспрессию как уникальных генов - е(у)1, е(у)2, е(у)3, eu(so), e(s?e) -, так и мобильных элементов œod(mdg4).

К вакнейяшм результатам работы относится открытие, описание, картирование новой, неизвестной ранее, регуляторной мутации, названной leg-arista-^ing-oomplex (lawo), имеющей вакное значение в раннем эмбриогенезе, одной из характеристик которой явилась трансформация аристы в элементы ТБрзуса. Установлено, что причиной возникновения этой мутации явилась кнсерция Р-элемента, что позволит в дальнейшем клонировать и изучить новый гомейозисннй ген на молекулярном уровне.

Практическая ценность работы. Результаты патогенетического

анализа причин продленной нестабильности, проведенного в данной работе, представляет как црактический, так и теоретический интерес. Картирование ряда новых транс-регуляторных мутаций ляжет в основу дальнейшего их молекулярного исследования, ухе начатого в нашей лаборатории.Открытие новой регуляторной гомейозисной мутации позволит продвинуться в вопросе о генетическом контроле сегментации и диффзренцировки в процессе эмбриогенеза дрозофилы. Таким образом, поиск причин нестабильности позволяет исследовать не только механизмы транспозиций, но и процессы регуляции экспрессии уникальных генов и мобильных элементов.

Аппробация работы. Основные научные результаты работы докладывались на YI Всесоюзном совещании по проблемам биологии и генетики дрозофилы (Одесса, 1939), на XI Европейской конференции по исследованию дрозофилы (Марсель, 1989), на YII Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1990), на межлабораторном научном семинаре "Молекулярные и клеточные основы генетических процессов" ИОГен им. Н.И.Вавилова (1991).

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 121 стр., включая 9 таблиц и II рисунков и фотографий, и состоит из введения, обзора литературы, изложения результатов и их обсуждения, заключения и выводов.

Результаты.

I. Распределение мобильных элементов в Х-хромосомах линий, полученных в система продленной нестабильности. Для того, чтобы ответить на вопрос:, индуцируется ли мутагенез системы цродлэнной нестабильности одним мобильным элементом или несколькими,мы провели анализ распределения мобильных элементов в Х-хромосомах полученных линий. В анализ были взяты шесть мобильных элементов - пять мдг (МДР1, МДГ2, ВДГЗ, 1ЩЧ, copla) и I-элемент. Для локализации использовали метод in situ гибридизации, с ^К-ДКК вышеуказанных мобильных элементов. Анализировали Х-хромосомы исходной родительской j^so1*83 и семи ее мутвнтшх производных (Табл. I). Поскольку обнаруженных мутантных самцов вели в скрещиваниях с самками со сцепленными X-хромосомами, т.е. анализируемые Х-хромосомы не были затронуты кроссинговером, мы могли сравнивать распределение мобильных элементов у этих мутантов с их распределением в родительской линии waG. В каждой линии анализировали 3-5 особей, взятых из разных поколений.

Таблица I. Одинаковое расположение сайтов мобильных элементов а Х-хрсмосомэ линии у2во1??а0 и ее мутантных производных, полученных посла дестабилизирующих скрещиваний.

ЛИНИЯ

Расшшжннв кобильта элементов

1ДДГХ | МДГ2 1МДГЗ (ВДГ4 | сор1а | 1-эленант

1В, 4В, 19А, 20А |40| 12Р, 19А, 20Й| 4У | 1В |5А, 7Р, 9А, 11В, 200|15С, 19В, 20А

угво+1*аа i сз а а И а я и а а а ¡а а и а а а и в

I а а и и и а а а и а а а и и а а И и

у2во+1«аС53и1 I а а ы а а а я (3 я к а а и а а а л а

Э +1 а0„ еи.1 ро т Вх ' I а а а а о а а а а га а а я а а и в И

У2Во+1тг1и1 I а а и и ЕЗ а я ¡3 и а а а га а а а я

у2Во+1*2и1 I а а а а И 13 н Я а а а ¡3 а ¡3 а а щ а

у2Во+1Аг1и1 I о а и & а а а И я в а и Н ш а а а а

у2во+1иаС}1еи1 I а а в а а а а я и я а а в И а а ¡2 а

Оказалось, что в Х-хрэмосомах всех тестируемых линий, как исходной, так и ее производит, расположение мобильных элементов остается неизменным. Следовательно, в системе продленной нестабильности не наблюдается множественных одномоментных транспозиций. Мы предположили, что активный мутагенез является результатом перемещения другого мобильного элемента. Так как оба исходные линии имели Ми I вдиотип, этот элемент заведомо не мог быть ни Р-, ни I-элементом, а также остальными, тестируеьшш в данном эксперименте.

Результат поставленной С.Л.Киселевым блот-гибридизации по Саузерну ДНК мутантного аллэля yIuI с фрагментами локуса yellow дикого типа, показал, что во втором вкзоне кодирующей части локуса находится вставка, размером 7,6 т.п.н. Ей оказался не тестированный ранее мобильный элемент, относящийся к классу мдг-элемзнтов. Он получил название Сталкера [Киселев и др., 1990].

2. _Анали§__SS§лкера_в стабильных лабораторных__ли-

■р 1 я g ' """ — — — ——

ниях и в исходной уео w линии. Далее мы исследовали распределение Сталкера в стабильных лабораторных линиях. В анализ были взяты девять таких линий, часто используемых Havni в различных экспериментах (Табл. 2). Все эти линии шелл сильно метящийся хромоцентр и по I - 8 сайтов гибридизации вне его. В числе этих исследуемых линий была одаа' из родительских - им,. содержа®,ая 4 свободных копии Стажера. Вторая родительская линия waG подверглась подобному анализу, в результате которого выясналось, что она также имеет сильно матягзйся хроь-оцэнтр, ко по количеству копий Сталкера, локализованных вне его не порядок (45 копей) отличается от всзх предадудах ксследуэшх лзва£, включая линия РК4. ¿ззлпз Х-зрокосон 22 особей миогокоеейеой родительской лшне, взятых с ингерваламя в 4 месяца три раза, показал стабильность распределения Сталкера, то есть отсутствие его транспозиций внутри самой линии.

3. Анализ_распределения Стажера__в_Х-хромосс-.мах полученных

мутентньа: лилий. Далее в роботе со Сгаякерон бъ-ш проанализированы X-хро;.;осоьа новых мутантякх линий, получанных в системе продленной нестабильности. Исследовали 5-7 особей, взятых из разинх поколений. Анализировали 22 линия, содержащих 23 новых нутаций в разннх локусах Х-хромоссмн. Новые мутантнне линии всегда нг-дзли марнзры у2 ,ас1, waG. Это слукило надехшой гарантией того, что в анализ брались не случайные X-xpoMocoi2i, а Х-хромосош, мутнровавзшэ в системе продленной

Таблица 2. Число свободных копий Сталкера в геноме стабильных лабораторных линий.

ЛИНИЯ число копий

окесон к 8

санош г 5

к? 6

шыг/су 1

23.5/Су 3

И14 4

КГ7а 5

С (1 )ВХ, п 8

5

45

нэстабильности. Результаты этого исследования показали,, что во всех тестируемых Х-хромосомых обнаруживаются активные транспозиции Сталкера (Табл. 3). Под транспозициями мы рассматриваем появление новых и исчезновение старых родительских сайтов локализации Сталкера по отношения к стабильным сайтам Х-хромосомы родительской линии waG. Примечательно, что часть линий характеризовалась гетерогенный распределением Сталкера не только по отношению к исходной родительской линии, но и внутри самих линий тестировались его транспозиции. А так как каждая линия была создана из одной Х-хромосомы, то изменения локализации Стажера в пределах индивидуальных линий свидетельствует о его транспозициях внутри самих линий уже после их создания. Таким образом, мы получали цитологическую интерпритацшо причины продленности мутагенеза системы, связанной с необыкновенной активностью мдг Сталкера.

Анализируя полученные в данном эксперименте результаты можно сказать, что Сталкер способен как появляться в новых сайтах, так и вырезаться из прежних, родительских. Однако, его инсерции наблюдались намного чаще эксцизий. Интересно и то, что Сталкер был зафикшгрован и в местах локализации ряда новых мутаций. В целом, 75% мутаций, возникших в процессе мутагенеза данной системы, явились результатом транспозиции в данный локус копии Сталкера.'

Таким образом, в линиях, полученных в системе продленкой нестабильности, выявляется активные транспозиции Сталкера. На основе полученных результатов ма сделали вывод, что транспозиции Сталкера, активированные пока неизвестным для нас механизмом, и явились причиной дестабилизации генома.

4. Анализ распределения различных фрагментов_Сталкера в_X-

хромосомэ. Дашй эксперимент был поставлен с цэльы выявить делетированные районы Сталкера. Для этого весь элемент был рестрицкрован на ряд фрагментов, %-ДНК которых подверглась in Bitu гибридизации с полит еншши хромосомами четырех линий, одна из которых предтБвляет собой исходную родительскую линию системы продленной нестабильности з^во1*810, две других - y1u1sc1waG и y2Eo1waGvu1 -являются ее мутантными производными, а четвертая - дикая линия из природной популяции - Oregon R.

В результате последовательной рестрикции был получен следующий

Таблица 3. Локализация Сталкера в Х-хромосомах,' мутабильных линий, которые велись в скрещиваниях с самками со сцошенными

Х-хромосомаш.

Примечание:

п - инсерции Сталкера, м— зксцизки Сталкера кз родительских т

сайтов, Ц - инсерции Стедкера в район локализации мутации соответствующей мутантной линии.

ЛИНИЯ

Количество

хромосом

Сайты гибридизации Сталкера

Коли-

1 2 34 67 8 9 10111213151617181920 чество ABPABCADEDCPABAGACAB DDSABBP А ВВЕ В

событий

y2S0VG 20 s п я з в а в Г?3 а 0

1 a i гд а а я в в ея □ 2

1 в я в ▼ ■ а а & а в ея в 1

^so+V« 7 и а а п а а а кз в 0

1 а т и а в а а в а е53 а 1

16 а а а а а т 13 а сэ el 2

y1u3eoVG 15 а а я es а в и ея а 0

Ao+V03 10 и и ¡3 г _ее» в г а в г в 3

21 а а □ * а я m т т □ в я £23 в 2

-2„„1„aG 1u2 jr во v7 v 15 а Т ЕЭ а в а а г а в еэ я 2

у2во1яа0е(у)1 18 т г елл В ч ез в а а г С а ££3 в 4

З^зо^^еСу)2 15 Г ся а в V и еЗз я т га еэ в 4

y2so1waße(y)3 12 я и в а в в а Г Ъз в 1

y^BO+VW) 20 я а я е=Дз и т в в ЕЗ а 5

s^sc'w^suibo) 10 а г т ея сп т a а а к а т а в вэ в 4

^boV^o®1 14 Л 13 0 Ь..... i _ т г а а я ея а 9

к

с

набор фрагментов Сталкера (рис. X): Ват Я - Ват н, фрагмент длиной 4,1 т.п.н(а); Bam Е - Pst 1, фрагмент, длиной 4,3 т.п.н.(б); Hind III -Hind III, фрагмент, длиной 2,7 т.п.н.(в); Soo R1 - Еоо R1, фрагмент, длиной 2,1 т.п.н.(г) и внутренний Bam Н - Еоо R1, фрагмент, длиной 7 -9 т.п.н. (д), включающий в себя Ban Н -Pst1 и Hind III - Hind III фрагменты и часто используемый в качестве меченного зонда в экспериментах по гибридизации in eitu на голитенных хромосомах. Два концевых фрагмента Ваш Н - Bam Н И Еоо R1 - Еоо R1 содержали по 100 н.п. локуса yellow, из которого был клонирован Сталкер.

Все линии, с хромосомами которых гибридизовались фрагменты, были получены из одного самца и отселектированны на протяжении S - 10 поколений, что исключило вероятность наличия гетерогенности по Сталкеру, которая могла бы помешать достоверно интерпретировать результаты.

Первыми тестировались две линии - исходная родительская waG и ее производная уи1."Как видно из Таблицы 4, у этих двух линий фрагмент "а" не тестировался в.районе IB, тогда как другие, фрагменты в етом районе тестировались. Это говорит о том, что в данном районе находится делегированный Сталкер по концевому фрагменту Еоо R1 - Еоо R1 (2.1 т.п.н.). Что касается линии y1u1so1waG, то там присутствовал весь набор фрагментов с одинаковым распределением сайтов гибридизации, включая IB район. Вероятно, это объясняется тем, что именно из локуса yellow (1В) данной линии и был клонирован Сталкер.

Далее анализировали Oregon R. Эта линия является малокопийной по Сталкеру. Лишь центральная часть Сталкера, фрагменты: '-"б", "в" и объединяющий их фрагмент "д" дали одинаковую гибридизацию в X-хромосоме в районах IB, I2D, 20В, а в аутосомах в районе 75С, 86?, 87Е. Два других концевых фрагмента отсутствовали в районе 20В -фрагмент "а" и в районах IB и 20В - фрагмент "г", относительно X-хромосомы, и почта во всех сайтах аутосом. Кроме того наблюдались внутренние делевди по фрагменту "в" (Табл. 4).

Таким образом, в старой лабораторной линии, какой является Oregon R, присутствуют как полноразмерные, тая и делегированные, включая делевди как концевых, так и внутренних районов, копии Сталкера. Однако, в новых мутантных линиях в транспозициях участвуют лишь полноразмерныэ копии этого мдг.

Рис. I Рестриктная карта Сталкера.

Ника показаны фрагменты Сталкера, меченные 3Н пробы которых использовали в in situ гибридизации.

Pst I Bam HI Eoo RV Pat I Hind III Eoo RY Hind III Eoo RI

_L_I________L_J_____

a

б

1 kb

Ta&mma 4. PacnpessJieime (JparMeHTOB Ciajmepa b X-xpoMocoMe

SPAIWHTH(kb) CAfoU rK6PH2H3AI®K

y2so1waG 1B 2B 42 10A 12D 1TA 19B 1SE 20B

4.1 S3 s c E3 B a Q ' n El

4.6 B £3 a B a a B H a

2.7 B H H B B m B E a

9 a a h E B B B B B

2.1 B D B B B a a a

AoVV11 1B 2B 4E 10A 11A 12D 15S 16C 1TA 19B 20B

4.1 m B a B B B a a B B B

4.6 H B B B S3 a a B B B B

2.7 a a a IS B B a a B B m

9 a Ks a a S3 m B a B B B

2.1 B B B H B B a B B • B

y1u1Bo1waG 1B 2B 2C 3C 4B 4E TA 10A 20B

4.1 b B B h B a B B B

4.6 a b b b B B e B a

2.7 e B b a B B a B B

9 b B B b B B B B B

2.1 B B B B es B (x B B

OREGON R IB 12D 20B 29A 47A 75C 86P 87E

4.1 B B J< * * > B

4.6 B B . R □ B B E B

2.7 ■ B B B ■ B

9 B B B B a B B B

2.1 B n H

5■ Картирование новых_транс-регуляторкнх__генов,__полученных в

системе продленной нестабильности. Несмотря на ' определенную локусную специфичность, спектр мутаций, вызванных Сталкером является довольно широким. Поэтому система продленной нестабильности может использоваться для скрининга различных новых генов, особенно тех, которые представляют большую научную ценность. К такому разряду можно отнести гены, участвующие в транс-регуляции различных локусов. В настоящее время проклонировано и исследуется целый ряд транс-рэгуляторных генов, а такхе ведутся работы по изучению регуляции экспрессии индивидуальных генов на разных этапах развития и в определенных тканях [Miohael, 1937]. Ряд таких уникальных генов удалось оотфыть, благодаря мутациям, возникшим в них з системе продлеиной нестабильности [Georgiev, Gerasimova, 1989].

Используя у2 мутацию для тестирования, удалось обнаружить несколько мутаций в разных локусах, которые влияет на у2 фенотип. Первый был назван "модификатор МДГ4", так как мутация mod(mdg4)u1 изменяет-фенотшиче скую экспрессию различных мутаций, вызванных МДГ4 в других локусах.' Три другие были обозначены "эяхансеры yellow" -enhanoer о£ yellow 1, 2, 3. Мутации в этих локусах, е(у) , е(у)2, е(у)3, усиливают фенотипическую экспрессию некоторых мутантов по локусу yellow, вызванных различными инсерциями. Иными словами, они влияют на экспрессию гена yellow. Кроме того независимо были получены 4 мутации, влияЕщив на фенотипическую экспрессию гена soute. Все они принадлежали к одному локусу, который был назван "супрессор Boute"(eu(so)). И, наконец, была получена одна мутация, влияющая на фэнотипичэскую экспрессию мутации гена white - Она была названа "энхавсэр - enhanoer ot whitee(e(vr)). В назей лаборатории

П.Г.ГеоргиеЕЫм была проаедена примерная локализация этих шести локусов при помощи рекомбшационного анализа. Однако, для дальнейшего молекулярного изучения этих генов и их продуктов возникла необходимость более точного их картирования.

Картирование производили методом in situ гибридизации с ^-ДНК центральной части Сталкера (рис. 1д). В анализ включили слвдузэдие линии: y1ot6v; mod(mdg4)u1/ nod(mdg4)u1, у^о^^еЫ1, T^oVW)»2, ЛЛ^е!?)3, /soWisc), /soV^).

Результаты исследования, представление в Таблице 5, обнаружили

Таблица 5. Результаты картирования новых, транс-регуляторшх

генов.

Название Генетическая Са2т

яокуса локализация гибридизации

Сталкера

энхансер whitee 1-32 90

энхансер yellow2 1-36.2 100

супрэссор eoute 1-50.0 13В

энхансер yellow1 1-57-9 1бв

знхавсер yellow3 1-62.2 18CD

модификатор ВДГ4 3-70.7 93D

аолиос совпадение локализации копий Сталкера с данными рекомбинациопного анализа.

Таким обрязом, используя уннхальнуа способность Сталкера внедряться в новые неизвестные гены, вызывая з них мутации, можно картировать эти гены, клонировать, изучать тонкие процессы регуляции на молекулярном уровне.

6. Генетический и молэкулярно-цитологический__анализ_новой

Ввща^н^^ц^^ьмятаейна^ - 1а_ща. на

основе генетического анализа сформулирован ряд гипотез о том, как действуют гены, контролирующие процесс индивидуального развития дрозофилы. Однако, в основе этих исследований леют скрининг и эписаниэ новых мутаций, затрагивающих геш, экспрессия которых зеобходима для правильной поэтапной клеточной дайеренцировки и зегыентации тела насекомого в процессе эмбриогенеза.

Одна из таких мутаций была получена в нашей лаборатории. Она возникла в результате инсерционного мутагенеза в системе продленной ^стабильности, усиленного Р-М габрздным дисгенезом. фенотипическн, мутация проявляется как комплекс изменений нескольких частей тела с зарьзрущей пепетрантнос'тьз. При сильной пэнетрантностз это особи, давядаэ I) сильно расст£влзяяне} приподнятые, обрезанные крылья; 2) зягалнлтельные еэжннкз на гоясеэ, груди л щитке; 3) грубые глаза; 4) юкрявленнне дистэдьннэ части ноги и 5) арасту, тргнсфор^гировззнуп в сарзус. При слабой гэпэтргятности изменения ограничиваются лннь :ршлЕктелы&ши щетонхемя. Стесзяь экспрессивности дгнг-а признаков з эсЕоансм зависят от услонкЗ содер^зия особей: сильное фэнотшшчаское грояэлешв ауганая происходив в экстремальных условиях - па старом Тегшэрэтурнсй завцсггюстя на проявление степени экспрессивности ранкой иутациа зегтеео нз было, ш назвали мутеязз 1з§-аг1з ¡окрХегЦатс).

Новый гэн обладает рецессивны?.! щлулегальннн действием. Он неположен в А-хрсжсэуэ, что дзет гозмозность поддергивать эту диниа ! сзфзщаваниях с ссд&чз со ецэпленжелг Х~хрскоссмг:,а.

Как угэ агшчаюсь, данная мугацпя возникла з условиях иеврцконного мутагенеза двух разных систем нестсбаяьностн - Р-•лэмонта и Стажера, что дает возможность сделать предположение об

инсерционной природе мутации lavrc?1. На это указывает и тот факт, что в ка&дом потомстве на протяжении ухе нескольких десятков поколений мутация lawoP1 с высокой частотой (примерно 30%) ревэртировала к дикому типу. Реверсия затрагивала целиком все измененные признаки. Ревертанты lawo+ имеют нормальный фенотип и в дальнейшем проявляют стабильность. Это указывает на то, что весь комплекс ыутантных изменений вызван именно мутацией lawcP1. Ревертирование часто сопровоздалось возникновением дополнительных мутаций в локусах yeiiow, milite, einged, loriced, в одаом неидентифйцнрованном локусе Х-хромосомы с крыловой мутацией, что говорит о сильной активности Р-элемента в атой линии. В настоязщй момент частота ревертирования упала до Ю-2 -Ю-3.

Используя линию анализатор otn оо ras х, методом рзкомбинационного анализа удалось установить, что ген lawo расположен между генами out(l-20.0) и ooelliless(1-23.1) в районе 1-23.0 единиц карты Х-хрошсош.

Даннно рекомбинационного анализа были проверены и подтверждены данными цитологического и молекулярного анализа, методом гибридизации in Bitu с ^-меченной пробами Р-элемента и Сталкера. Сайт гибридизации Р-элемента в мутантной лиши находился в районе 7г, который • как раз совпадает с областью 23.1 Х-хроьюсомы. Он исчезал из данного района у lav?o+ ревертантов. Всего было проанализировано три iswo+.. ревертанта. Это дало полное основание утверждать, что именно этот район является местом локализации нового гена. Копии Сталкара не было обнаружено в дашом районе.

Новая мутация представляет собой некую уникальнооть в -связи с там, что за небольшим исключением, линию, несущую мутацию в гене, контролирующем ранние процессы эмбриогенеза, почти невозможно получить по причине полной летальности данных мутаций, затрагивавших жизненно ваяныэ функции организма, что затрудняет исследование этих интересных локусов. Открытие и локализация нового гена явились основой для дальнейшего его к-олекулярно-генетического исследования, уже начатого в нашей лаборатории.

выводы

1. Показана мобильность Сталкера с помощью in situ гибридизации зго меченных проб с различными лабораторными линиями. Все линии зодеряат сильно метящийся хромоцентр. Большинство лабораторных линий содержат от I до 8 копий Сталкера вне хромоцентра.

2. Родительские линии, скрещивание которых привело к созданию гистемы продленной нестабильности,'отличаются на порядок (4 и 45) по количеству копий Сталкера вне хромоцеятра.

3. Исследование Х-хромосом 22 мутантных сублиний выявило изменение сайтов локализации Сталкера (появление новых и исчезновение старых родительских сайтов). Показано, что его транспозиции идут на £оне полной стабильности mdgl, mdg2, mdg3, mdg4, copia и I-элемента.

4. Анализ . лабораторных линий с помощью различных фрагментов Сталкера показал, что транспозируются в новых сублиниях только полноразмерные копии, хотя в старых лабораторных линиях имеются копии Сталкера с делециями внутренних и концевых его районов.

5. В подавляющем большинстве случаев обнаружена корреляция между генетической локализацией мутации и новыми сайтами Сталкера. С помощью Сталкера проведено цитологическое картирование новых транс-регуляторных мутаций: е(у)1, е(у)2, е(у)3, su(so), e(we), iaod(iaclg4).

S. Совмещение систем продленной нестабильности и Р-М гибридного днегенеза позволило изменить спектр мутагенеза и выявить новую регуляторную мутацию, имеющую важное значение в раннем эмбриогенезе leg-arista-wing-complex, приводящую к - трансформации аристн в сегменты тарзуса.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Георгиев Г.П., Симонова О.Б., Герасимова Т.И. Новый тип нестабильности генома у D. melanogaBter // Генетика, 1983. Т.24. 1:5. С.867-876.

2. Георгиев П.Г., Симонова О.Б., Киселев С.Л., Герасимова Т.И. Система генетической нестабильности у дрозофилы // 6-е Всесоюзное совещание по проблемам биологии и генетики дрозофилы. Тезисы докл. Одесса. 1989.

3. Киселев С.Л., Георгиев П.Г., Симонова О.Б., Герасимова Т.И. Мобильный элемент Сталкер и его роль в нестабильности генома // 6-е Всесоюзное совещание по проблемам биологии и генетики дрозофилы. Тезисы докл. Одесса. 1989.

4. Gerasimova T.I., Georgiev P.G., Kiselev S.L., Simonova O.B. Genetic system oí prolong instability induced Ъу a novel traasposable element Stalker // 11th European Drosophila conlerenoe. Marseille. 1989. P.104.

5. Герасимова Т.И., Симонова О.Б., Георгиев П.Г., Киселев С.Л. Транспозиции нового элемента Сталкера в системе продленной нестабильности у D. melanogaster // Докл. АН СССР. 1990. Т.310. tëiv. C.I474-I479.

6. Георгиев П.Г., Симонова О.Б., Киселев С.Л., Герасимова Т.И. Новая система генетической нестабильности у дрозофилы связана с транспозициями мобильного элемента Сталкера // Y11 Всесоюзный симпозиум "Молекулярные механизмы генетических -процессов". Тезисы докл. Москва. 1990. С.14.

7. Georgiev P.G., Kiselev S.L., Simonova О.В., Gerasimova T.I. A novel transposition Byetem in Drosophila melanogaster depending"on the Stalker mobile genetio element // ЕЬШО J. 1990.Y.9. N.7. P.2037-2034.

8. Кузин Б.A-, Досжанов K.T., Симонова О.Б., Герасимова Т.И., Гуляев Д.В. Новый аллельный вариант вва и его участие в регуляции пролиферации стволовых элементов ножных и антенных дисков Drosophila melanogaster // Онтогенез. 1991. J62. Т.22. С.212-216.

9. Симонова О.Б., Кузин Б.А., Георгиев П.Г., Герасимова Т.И. Новая рвгуляторная мутация DroBophAla melanodaster // Генетика. 1992. М2. Т.28. С.164-167.