Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие различных систем генетической нестабильности у Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие различных систем генетической нестабильности у Drosophila melanogaster"

PfS GO

\

российская академия наук

шстгот шолош развития ш. н„к.Кольцова

На правах рукописи

шщ евгеккй мшйювич. ъ^^рщ^з яшш гзажшяй ешйшйьноот

7 шобя&ш skïkâwmêftsssr. (10.00.15 - генетика)

АВТОРЕВЗРАТ

диссврхацгк та сонскзаие у^эно2 стэвдш кандидата бзах.огячэикнх наук

москва - i9s3

Работа выполнена в лаборатории генетики мобильных элементов Института биологии гена, РАН, г.Иосква. ; -

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Т.И.Герасимова

Официальный оппоненты: доктор медицинских наук, члэн-корр. РАН

Л.И.Корочкин

кандидат биологических наук Н.И.Иващенко

Ведущее учреждение: Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта, РАН

Защита состоится

сиу^еи^ 1993 г, в _ час. на

заседании специализированного совета (Д 002.85.01) при Институте биологии развития ш. Н-К.Кольцова ш адресу Москва, ул. Вавилова, 26.

Автореферат разослан

^Щ^Гя 1993

Ученый секретарь спзцаализированного совета кандидат биологических наук

\

Е.М.Цротопоноза

ВВЕДЕНИЕ. ■)

Мобильные генетические элементы составляет довольно значительную аоть геЕома эукариот. В случав дрозсфшг на них приходятся oico.no IOï еиома. Ух:е одно это позволяет говорить о мобнлкзшс элементах как о ашюй генетической состэалякш.зк. Кроме того давно показана роль обильных генетических элементов в мутагенезе, и их возможное значение ля процессов эволзции. Однако в стандартных условиях перемещения обильных элементов происходя'!' крайне р-эдко (на Солее I на Ю~"*-1СГ ), :то сильно затрудняет их исследований. В настоящее время ухе известны •енетическио системы с более высокой частотой транспозиций (вырезаний t встраиваний) - ~Ю~2-10-4. Наиболее подробно изучены системы ибрадного диагенеза, где источником нестабильности являйся отдельные ".обильные элементы - Р, hobo ила I. (Kidwell К. ее al. 1987, Bregliano Л al. 1981, Yannopoulos at al. 198?) Нестабильность в этих системах >бычно затухает к третьему поколению. 1Сроне зти систем, в настоящее зрэмя обнаружены и другие система генетической нестабильности, в соторет задействоваяч мобильные элементы других классов - ЦДГ-ыюквнты. Это, например, систома Кима (Ким и др. 1936, 1989), где терэмещазтея ЗДГ4 иле система продленной нестабильности (Герасимова и ф, ISSOr Georgia et al. 1950;. вызванная Сталкером. Ебретдезня лобжаннх глр^ентоз mopvt бчть также kîobshh и различными ¿пэщйгпйенюй® создеФс^Бииг». -- аньвкцаями зкгогеЕксй JEHK (Гаршензок, Сандала ISSS), иезлзъшл ¡гокок (.-Tunaicovio et al. 1936) елп митомэцином J (c-eorgiev si ai. 1930). Однако создашэ генетических систем стьбяявз бжя» подай-гп к вопросам мехавиаков нестабильность. Е аосдаднээ зрэмя зсэ больше появляется дазшгх с системах аестй/алькости, гда участвую' несколько мобильны? элементов. Например з нзс.(аоалыюй ио-хрокосог£ и ее производных перемещаются МДГ4 а ьоьо элементе (Ил '98а); ВДГ4 н copia переиздаются в производных очсР-^веяя (He7el-3iûlo st al., 1933). ДастабялазацЕЯ ЭДГ-элемектоа Щ-*неходзт и псе скрэззгваннз и ОуЬ/йа лвяй (Kaiiano*' et al.,i990). йокрзанн театга г глюзестБвшке ^рапепозицак кебяльвщ элементов, цринадлейгщех к разним классам, в системе тргнагаззцзонЕнх взрывов ct^-CTio-i-ûbii (Gera3iaî-ra eï а1.,19в1) и яроато з иабредннх шиях (Гвоздев, КлёДзШ?- j.SSS; Biemont et al. ,1986). Таким образом возникает вопрос о Еззгагосмзи ¿'азашодэйстЕйи разжис. мобильных гэпэтичзсккх элементов, о боямохност?! оушестконанЕЯ общего механизма их де йтабнлжзьцин.

В этой сгязн црэдстазллатся актуальны« создание к дзучение

системы генетической нестабильности с участием нескольких мобильа элементов, в которой мсгао было бы с помощью генетических молекулярных методов исследовать механизмы их перемещений взаимодействия, а такта роль каждого из них в мутагенезе.

ПЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЭДОЕАШЯ. Целью данной работы бнло создание исследование системы генетической нестабильности путем различно] сочетания Н-Е гибридного . дисгенеза к система продление нестабильности.

Первая часть работы посвящена анализу мутагенеза в пелученш системах и оценке взаимоотношений мобильных элементов hobo и Сталке] Были поставлены следуйте конкретные задачи:

1) определение частоты и характера мутагенеза в различи; скрещиваниях; ^

2) определение патогенетических характеристик полученных мутантов помощью метода гибридизации in situ. Выявление транспозиций hobo Сталкера;

3) молекулярный анализ мутантного локуса white у разлнчш

производных исходной ллши.

Вторая часть работы связана с оценкой участия других явлений нестабильности в изучаемых системах. В связи с эти» были поставлен задачи:

1) анализ распределения различных мобильных элементов i Х-хромосомах родительской н полученных мутантаых линиях методе гибридизации in eitu;

2) клонирование мутантного гена white из исходной линии y2so1waC Характеристика содержащейся в нем инсерции и анализ ее участия мутагенезе;

3) исследование структур хромосом некоторых полученных мутантов.

НАУЧНАЯ НОШЕНА РАБОТЫ. В результате проведенных эксперименте

проанализирована новая система генетической нестабильности, связана? со взаимодействием системы Н-Е гибридного дасгенеза и . спстех продленной нестабильности. Показано, что участие hobo элемент привносит дополнительный дестабилизирущий эффект в систем? продление нестабильности, что вырагается в усилении мутагенеза и изкэеоеие ei характера. Взанаодейсгвиэ этих двух, изученных ранее незавиеямс систем генетической нестабильности привело к активизации мобильи элементов различных классов. В третьем поколении от скрещиваний i многих случаях наОладалнсь сошэстнао перемещения нескольких мобильнь элементов. Напрвхзр, hobo и Стайера; hoi-о и ЫДП; hobo, Сталкэра

oot, ia. Транспозиции hobo и Сталкера s основном приводили к мутагенезу по локусу white. При анализе молекулярной структуры полученных мутация, впервые описан случай усиления мутантного биотипа при встраивания одного мобильного элемента (1юЪо) внутрь другой исходной вставга Doo (лута^л w1h).

Ошгсаиие в работе транспозиционные события отллчавтея от таковых з известных танее системах генетической нестабильности, в том числе л от сжтем Н-Е гибридного дкегенеза и продленной нестабильности, иаблвдавшиеся же случаи аномального кроссингор.ера, в частности случай появления y1so+w1h мутанта, описаны впервые и позеоляот сделать важное продаодожекио о мегандалэ нестабильности в дашшх скрэщаваниях.

Таким образом, з представленной работе выявлено несколько не известных ранее особенностей генетической нестабильности, связанной с многветвэнвыми первмещевкями различных, мобияышх элементов. Получен богатый материал для дальнейшего генетического к молекулярного анализа.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. Результаты проведенной генетической и мол0кулярЕо-гбнетЕЧбской работы представляет как теорэтический, так

и практачеекпй тштере-i. Получена каялетса^я различных мутантов, не известных рэкэ?.. позволяемая приступить в дальсэйюм к исследовании zx го-леку-вдаой природа- Подробно оштсанч мутации в локусе white, содержите bctoskm уззлачаой црярэяе в различнее регзмятэрннэ участки локуса. БроклонЕровяна неизвестная ранее вставка нз лскуса white родйтельскоч ¿ршш. r~so!v-3U. Полученные хлонн могут бить использованы для анализа других линий г рсуличЕнх системах нестабильности.

3 целом, голучеюте дгьяне позволяют по-новому подойти к исследовании обедах квхачнзнюв . гранспозжхй и вяквкя мобильна генетических элементов друг на друга к на уникальные жмсусы дрозефялы.

Апробация работа. Сспоззне пэучкнэ результату диссергацви докладовзлксь~зз"о-й съозле Общества Генетиков и Селекционеров ш. Н.И.ВавЕЛоза (&еск, i3s2), Итоговой научной конфэрэнции Института биология гена (фэвражь 1933).

Часть результатов была представлена на 12-й Европейской конфэренции по исследований} дрозофмы 'Mainz, FRG, 1991), кеь-яабораторном семинаре отдела молекулпрно-гезеткчесних проблем (1990).

Структура ь объем работы. Диссертация изложена па 125 страницах, включая 5 таСлп;7~Г5 рйсупков и фототрафгй и состоит из введения, обзора литэргтурн, экспериментальной части с обсуждением полученных

'результатов и выводов. Представлен список использованной литературы.

Представленные в работе результаты получены автора самостоятельно. Эксперименты по гибридизации in eitu проводялис совместно с аспиранткой ИВГ РАН Пэтрук С.Ф.

РЕЗУЛЬТАТЫ. .

I. Взаимодействие • мобильных, элементов hobo и сталкер.

I.I. Постановка скрещиваний и получение мутантов. На основание литературных данных о роли мобильного элемента hobo в нестабильности различных генетических систем (Yannopoulos et al., 1987; Ыш, 1988 было сделано предположение о его возможных сталирующих свойствах да активизации других мобильных генетических элементов. Для . проверю этого предположения были составлены скрещивания, вовлекающие активны« копии мобильного элемента hobo и ряд других мобильных элементов. 1 качестве источника активного hobo использовалась линия 23.5*/Су, полученная от ГЛнспоулвса . (Греция). Партнерами этой линии i скрещивания были взяти линии, несущие мутации, вызванные инсерцшав мобильных элементов - музейная линия get6 (мутации по локусам garnet j - out вызваны ВДГ4) и линия, использованная для получения. продленно! нестабильности з^ео1«3® (yellow и scute - ЭДГ4, white - не описанна) ранее шеерция). Скрещивания проводились по указанной па рисунке I. СХвМб •

5 X/FU4 X о"Х/У, 23.5*/Су

?0 9 Х*/Х* X 0*т/У, 2Э.5*/Су+ (Н)

F1 9 Х*/УИ4 (Н) X (fx*/У (Н)

Р2 гомозиготная линия: р Х*/Х*(Н), О*X*/Y (Н).

Рисунок I. Схема скрещиваний, направленных на д&стэбилязацяо различию

линий путем введения активных копий hebo элемента.

Анализировались мухи третьего поколения, однако и в первых двуз поколениях от проведенных скрзщизаннй выявилось необычно большое количество случаев двойного и аномального кроссинговера (до 0.5 - 0.75 против 0.01 - 0.03S в норме). Особого интереса заслуживает тот факт, что в процессы рекомбинации оказалась вовлечена и хромосома РМ4. Е

третьем поколении частота кроссинговера с участиэн хромосомы тм доходила до 1х10-4-1СГ5. Так, например, был получен кроссовер FH4ct , ваоьма удобный для работа с различными, в том числе и летальншш, мутациями по локусу sut.

Всего з третьем поколении было проанализировано 24 65D к 25 420 хромосом для линий gct6 и j^soV35 соответственно. В случае линии gct с^эди них не было обнаружено ни одного мутанта, в то время как в линии y-so1;/^ наблюдался мутагенез с частотой 3.2x10-4. Были получена ;.!утгцш1 по локусам white, miniature и некоторым другим неидзнтифзцированнш лскусам х-хромосомы, а также две аутосокно-домянвЕТОДе мутации, вызывающие утончение петиьок. Tfpoi.se того, отлечия мавду взятыми в скрещивания линиями коснулись и поведения по отношению к активной Н-линии, каковой является линия 23.5*/Су. Для скрещивания с линией ^во1**0 не наблюдалось увеличения числа стерильных особей, характерное для явления Н-Е гибридного дисгенеза. Анализ же последующих поколений (до II-го) показал сохранение явления продленности мутагенеза для этой линии (см.табл.1).

Таблица I. Результаты апалязг потомства от скрещивания с дпни&Х y^scV«.

- Поколение скре-с^иваЕШ!, в кот. ттодучена мутзцкя. Количестве, просмотренное в поколении. | Локус Обозначение

F3 25 420 white лсу*

лсу3*1 y*scVh

miniature y^s^w^m1*1

y2301w£vh

р6 2 ТОО miniature y2soV°mSh

?8 3 700 white ? 1 ah ;.ecv

Р10 3 500 white joh у so w

1.2. Выявление hobo элемента в анализируемых линиях. Посколькз для индукции . описываемой нестабильности использовалась линия, содержащая *; активные копии мобильного ; элемента hobo, а характе] наблвдазмых калений сильно отличается у двух проанализированных линий, представляло интерес получить данные об исходном количестве этогс мобильного элемента во взятых в работу линиях.

Для блот-анализа го Саузерку была взята ДНК клона полноразмернс{ копии hobo (Blaoîanan et al., 1985). Данные гибридизации, представленные в диссертации, показывают, что большинство исгользуемш в работе линий могут быть отнесены к линиям Б типа, лишенным каких-либо копий hobo. Это линии FM4, got6, линия со сцвттленвнми X-хромосоиами. Однако в случае лшши y^sc1*30 m наблвдаем полосы, соответствующие как полноразмерным (Зтпн), так и делетироввннш. (1-5тпн) копиям hobo элемента. Т.е. в этом случае проведенное скрещивание на может быть отнесено к скрещиванию Н-Е гибридного дисгенеза и, следовательно, все наблюдаемые явления могут быть связана лишь со взаимодействием активного hobo со сталкером, как исто<шикоы продленной нестабильности.

В этой связи важно было оценить степень активности исходного höbe в линии y2Bo1waG. Дня этого было проведено контрольное скрещивание самцов этой линии с самками завэдомо Е-линии - линии со сцепленными Х-хромосоыами. Цроводимое скрешизаниэ является по сути скрещиваниек* Н-Е гибридного дисгенеза и должно приводить к увеличению в потомстве количества стерильных особей (Yannopoucls et al., 1987). Однако никакого увеличения процента стерильности по сравнению с контрольным еркещиванием самцов линии дикого типа QregcnR не наблюдалось. Это, г также получение ранее данные о поведении этой линии в офещиваниях, приводящих к продленной ностабильнстя, позволяет сделать предположение о неактивностн мобильного элемента hobo в самой линии у2во1?а('. Несомненно, что введение дополнительных, заведомо активных копий hobo, либо активизирует исходные копии, либо является сашстоятеяызгы дестабглизщзувдш фактором.

1.3. Различные картины мутагенеза в других скрэсдаваниях. В свете получэнннх дянгеге с еозноеюк участин в ыузаганазёГ исходно присутствовавши в родительской линии полноразмврных копка

hobo, а также для проверки приведенных вншэ рассувденпа о роли hobo из ленни 23.5*/Су, были поставлены дополнитэльно два скрещивания с различным сочетанием линий 23.5*/Су и ?И4. Схемы скречулвюпгй к полученные результаты представлены на рисунке 2.

Схема скрещивания: Проанализировано Б 'v Получены мутанта:

[. 0 у2go1war z 0*23-5*/Су 1 Р0: OVboV0 (23.5*)

с

г g y^oV*3 (исх. ) IS 950 ySeoV3-5 • y2s0v3'5-1 (20") y2eo1waGpm 0 ayтос.доминант, (укороч. и утолщ.

2. Pn:Q y^acV^H) X о"?И4 (Е) i щетинки)

: 0 y2B01waG/PK4 I 1 I ^ J> 1 aG z и у se w 15 450 у2«»1««4 /soVWw*)

РисуЕок 2. Результаты, полученные при анализе скрещиваний с различным

сочетанием К- и Е-лилий.

1.4. Получение мут&кта у1Бс"%,-11г. При получении линии, [юмозиготяой~1го мутзнтной Х-хрсмоссмз y^scV1*1, во втором поколении з? скрещивания мутантного сп:.тца с самгмй ША, были получены независимо

« J- 1 h

îB8 сакца о феногапок у'яо w . Нутации по лиг/сам yellow и soute не 5ыли характерцы для исходной нестабильности. Кроме того, на разу до этого сдутая не наблюдались двойные мутационные события в нашей зистемс-. Таким образе«, данные мутанты представляют из себя особые озучай» B03MOSHO, зе связанная с собственной нестабильностью яшскваекой системы.

1.5. Анализ распре да лвння мобкльных злеметов hobo и сталкер в фото сом ах нсслэдуршх Ksrt Зало указано шшэТ большинство лутаций было получено при введена! активного hobo элемента в линию ;:icï5î.s продлэгпйой кэ с ï а Сильное ти. Таким образом, модно предположат Ь, ¡то наблюдаемая нестабильность связана с перемещениями двух мобильных элементов - hobo и Сталхерз.

Х-хромосомы мутантов и родительских линий были проанализированы

Таблица 2. Распределение сайтов гибридизации мобильных алементов hobo и Сталкер в Х-хромосомах линии j^eo1*®0 и ее мутантных производных.

линии сталкер hobo-

3 4 7 8 9 1011 12 131415 16 17 19 20 3 5 6 7 а 10111819

А CEP E|D E|D Е F А С F| А А A D Е Г Е 0 А В D А 0 Е FjB EJB С 0 D А В Е|А Е С|В A j В

y2eo1wa0 a в в в а в в и в в а

y2D0Vh в ■ Я в в в в а У в в т в в в

„1 + 1U у во я в г В В в Jf в я в в В г в в в в в

у во в » V в a ■ в в в а » в в в в в U a » в

y2So1wa0m1h в в и в в в в в в a в

y2eoVh T в в г а и ■ * ■ в в в в в m в "в

y2Bo1wred ▼ Q в в в в в в в в в в в » a

y2Bo1waGen(W°) r В т в в г т в в в в т в _ If т в в ВВП в У в в a

y2eo1w23-5 а в в в в В В В в » в V II я в в

y^o1«811 » в я ? в в в в ¥ В т т в в в » a т В в в в в в в

y2EOV0h т т в в в г в г в в в а * ■ т в а в в в в в в

«годом гибридизации in situ пслитанных хромосом слюнных жалез грозофиы с "Н-мечешюй ДНК bobo и Сталкзра (Streck el al., 1936; Сиселев и др., 1390). Результаты гибридизаций, представление в таблице !, показывают, что з проведенных скрещиваниях действительно габлюдаятся транспозиции как Сталкера, так и hobo. Прячем было гчявлено от I до 7 транспозиций на хромосому для Сталкера и от I до 3 [ранспозкций на хромосому - для hobo. Следует особо отметить случаи íOBMac'iiioi-o перемещения hobo и Сталкера, например у мутантов wiai\ rred и en('.ve). Причем два из этих мутанта получены з скрещивании, зтнесенном нами к Н-Е гибридному дасгенезу. То есть условия дисгзнеза, ю-видаыому, способствует совместной мобилизации . этих, мобильных элементов, ютя частота мутагенеза в скрещивании и не велика.

Как видно из локализации мобильных элементов hobo и Сталкера (табл. 2), ряд white мутантов моавт быть вызван непосредственно знсерцкями этих элементов в район локуса white - зс. Так например, в случае мутаций w1ah, woh и wro<1 в районе локуса *hite появляется пополнительный сайт гибридизации Сталкера, а в случае - hobo. Эдаако появление всех остальных мутаций не моасет быть объяснено азрзкзщэвЕямн только этих двух мобклышх элементов, активизированных в эпЕснгаэмой системе. Таким образом, еозмохпо, полученная нестабильность связав/*, не только с транспозициями Сталкера и (или) íiooo, а монет быть результатом ннсжествеэню: перемещений и других кабииызас элементов.

1.6. Молекулчграгй анализ структуры локуса white в ряда полученных мутаЩ?.. 3 сшгекБаембйНслстекэ нестабильности подззлящае большинство муТацЁм явдяьтса мутация® по локусу white. Кроме того в нестабильности по этому локусу очевидно задействованы оба изучаемых мобильных элемента - hobo и Сталкер, что достаточно убедительно показано зкспэр® таксами по гдбрвдвзацаа in situ. Поэтому для ггоязкуляр-зого анализа протэкагзщх явлений бил вгят именно этот локус -локус white.

Методом блот-гибргдиза'да по Сауззрну мной баян проанализированы все полрчэзнеэ white мутанты, В качестве зоэда использовались плагмида. содзряащго фрэгмэкты локуса white линиз дикого тша OregonR (Goldberg et al., 19S2)(lm. рис.4). Результаты анализа, щшзеденны« на' рисунке 3. показываю?, что вез Ероэнализнровашне white-мутантн. кроме г.утзцин помимо исходной вставки ссдв-риа? также дополнительные

кнебрцпк в reus white. Полученные данные, вместе с результатами гибридизаций in situ, позволили сделать еыбод о том, что причинами

большинства полученных white мутаций являются инсерции Сталкера ше hobo в различие участки гена white. Так в случае мутации w^®*1 Сталке] встроился в "области начала транскрипции, вызвав частичную реверсию w3' к нормальному фенотипу. Сходный результат наблюдается и в случа< мутанта woh, однако инсерция Сталкера, по-видимому, произошл; непосредственна внутрь исходной вставки waG (рис. 36). Т.о. аставк: Сталкера внутрь w^ привела к частичной супрессии фенотипа, что може: быть связано с влиянием инсерции Сталкера на энхансер исходной вставга и снижением уровня ее транскрипции (Чуриков и др., 1987).К третьем: варианту локализации Сталкера относится мутация w1ah. Инсерцш произошла примерно в области +1,3, возможно даже непосредственно i экзон гена white, и привела к проявлению полностью мутантного фенотип! "белые глаза".

Совершенно по другому обстоит дело в случае мутации w1h (рис 36). Причиной появления этой мутации является инсерция мобильно« элемента hobo внутрь исходной вставки w40, не далее 1тпн от ее 5 конца. Интересным является то, что появление этой дополнительной инсерции приводит к усилению мутантного фенотипа. Во всех ране( описанных случаях инсерций одного мобильного элемента внутрь другог* (O'Hare et al., 1991) это приводило к частичным реверсиям фенотипа Усиление мутантного фенотипа в нашем случае говорит о возможное^ взаимодействия энхансеров обоих вставок и локуса white, в результат! которого происходит усиление транскрипции вставки waG (Doo). Эт< также свидетельствует в пользу наличия в структуре hobo сильноп промотора. В любом случае, этот мутант связан с редко описываемы) явлением спещфгаеского hobo-индуцированного мутагенеза.

2. Молекулярный анализ chite мутации в родительской линии

2.1. Изучение, структуры неизвестной вставки методом блот-гибрид зации по Саузарну. Линия давно используется в различны

работах в навей" лаборатории. С ней связаны явления продаенно; нестабильности (Георгиев и др. 1938) и супернестабильности различных локусах (Георгиев, 1990). Однако большая часть ошеанны ранее явлений протекала, не затрагивая локус vfoite. В нашем же случа большое количество мутационных событий произошло именно в этом локус - локусе white. Был проведен подробный молекулярный анализ whit локуса в исследуемой системе. С помощью различных рестрицирущи эндонуклеаз были проанализированы геномные ДНК линии y2sc1waG н е мутантных пронзводаых. Гибридизацию на фяльтрах по Саузерну проводил

А.

12345678

Рис. 3: Молекулярный анализ локуса white у различных мутантов. А -гибридизация геномных ДНК различных мутантных линий, обработанных ферментами BanHl и EooRI с меченным фрагментом локуса white BaaHI(+l,7)~EooRl(+9,5). Анализируемые линии: Oregon R (1), y2eo1waG (2), ¡¿во1*011 (3), Ло1*111 (4), y2BcV1ah (5), у^о1«®1 (б'), ^во1»23'5 (7). y2eo1wred (8). Б - рестриктная карта исследуемой области лотоса white.

с двумя рекомбинантными плазмидами pw+(B-S) и pw+(B-R) (си. рисунок 4), содержащими фрагменты локуса white ,'шшк дикого тала QregonR. Било показано, что все изменения затрагивав район +1.5 - +5 по карте локуса white (Levis et ai., 1982). Оказалось, что мутация waß вызвана инсерцией размером около II тпн в первый интрон гена white. Следует отмэтить, что структура этой инсерции совершенно стабильна и не изменяется у большинства проанализированных мутантов.

-10 -5 о +5 +10

I_I_I . I_1_!_' I I I I I I I I I I I 1 I ■ I I

white Sa В X X R

-1-1-1-г1—I ' 1 ' I-n—I-1—h-

KSSSXb HGG НН

pw+(B-S)

I-1 pw+ (B-R)

Рисунок 4. Карта фрагмента локуса white линии дикого типа сь-egon R (Levis et al., 1982; Zachar, Biagsn, 1932) И использованных В работе шшзмид. Обозначены следующее сайты рзстракцзи: К - Kpnl, S - Sali, Sa - Saol, Xb - Xbal, В - BaaHI, Z - XhoX, G - Bglll, E - Hindlll, R - EooRI.

2.2. Получение рекомбинантных фагов. Анализ структуры цроклонированых фрагментов. Для более подробной характеристики изменений, произошедших в геке white у мутанта s^bo'w30 было проведет молекулярное клонирование участка данного локуса.

I_I

1тпн

В качестве вектора для клонирования был выбран фаг \GH£11 (фирма •Promega'). В результате нескольких последовательных скринингов из созданной геномной библиотеки был выделен фаг, содеркащий вставку раау.ером около 12 тпн и обозначен - (см. рисунок 5). Последующий анализ выделенного рекомбинантного фага показал, что он несет большую часть вставки wa0 (около 9 тпн) и фрагмент локуса white благодаря гибридизации зонда с которым данный фаг и был получен. Гибридизация полученного фага с згР-ыечзншши ДИК различных мобильных элементов показала, что фаг Дда0 содержит фрагмент мобильного генетического элемента Ыпе-типа - Doc.

white

-10 \

11 ' 1 i'in

В X н

W"V

I

X

В X н

_1_I_U.

х а

_j_l_

х

I

7 /

/

/

/+5

В R 1

5

X R Н В

.aG

pSK1 w'

aG

pSK2w"

aG

X

Ы

I ТПН

Рисунок 5. Рестряктпая карта фрагмента мутантного waG локуса white и структура проклочированого участка. (Обозначения см рис.4)

Таким образом оказалось, что мутация является, по-видилому,. аналогом алялэля я11. Проявление мутатц?ного фенотипа "темно-абрикосовые глаза" в этих случаях сзязапо с инсерцией в близкие районы носильного элемента Doo. Как п в случае у?1, в нашем мутанте мы имеем дело не непосредственно с Воо-элементом, а со вставкой, содержащей большую

часть этого мобильного элемента штос к небольшому фрагменту ДНК неизвестной природа. Сходство в молекулярной структуре и генетических свойствах мутаций иа0 к w*1 видно и при появлении в полученной нестабильности мутации en(we). Именно наличие видоизмененного мобильного элемента Вое является условием проявления полностью мутантного фенотипа "белые глаза" при совмещении мутации en(we) с мутациями по гену white.

Для удобства дальнейшего анализа проклонированного фрагмента были получены две плазмиды на остове плазыиды pBluesoriptSK(-/+), содераащие только участок гена white (pSKiwaG) и только фрагмент Doo-элемента (pSK2waG) соответственно. Полученные плазмиды (см.

4 рисунок 5) были использованы в дальнейшем для экспериментов по гибридизации in situ с политенными хромосомами полученнкх мутантных линий, а также могут использоваться в дальнейшем в качества зондов для клонирования аллелей w1h и woh.

2.3. Анализ распределения мобильного элемента Doo при мутагене зе .в изучаемой системе. Для анализа распределения мобильного элемента Еое в родительской линии j^sc^w30 и ряде ее мутантных производных были проведены эксперименты по гибридизации in situ политенных хромосом исследуемых линий с "^Н-меченной ДНК мобильного элемента Doo (O'Hare et al., 1991) и полученных при клонировании зондов. Данные проведенных гибридизаций показали, что расположение мобильного элемента Doo на X-хромосоме всех проанализированных линий остается неизменном. С другой стороны следует обратить внимание на тот факт, что родительская для всех проведенных скрещиваний линия у^ео1«32 является необычно многокошгйной по этому мобильному элементу. Линия y2eo1wfUj содержит более 40 копай Doe-элемента на геном. Возможно, ч-то сильная разница в копийности Doo между линиями, участвовавшими в дестабилизирующих скрещиваниях, может служить еще одним фактором индукции, нестабильности нашей системы.

3. Другие участники дестабилизации генома в описываемой система.

3.1. Анализ распределения различных ЦЦГ на Х-хромосомах мутантных линий. Как видно при анализе распределения "с7ак:ера и hobo на хромосомах мутантов, далеко не все мутации могут быть объяснены их инсерциями или эксцвзияш*. Так оставтся неясными все случаи появления мутаций по локусу minia turs, мутация en(we). Это позволило предположить, что нестабильность в системе может захватывать и другие мобильные элемента.

Таблица 3. Раекрэделвние сгйтов гибридизации некоторых ЦЦГ элементов в Х-хромосомзх изученных линий.

Линии КО.ШЧ9СТВО мди МДГ2 МДГЗ МДМ оор!а Общее числ

чтанспозицдй транснози

Стажера ЬоЪо I 3 4 5 111920 I 2 3 4 12181920 2 7 I 5 7 9 111920 ций

В А В Е Б А А А В В I" 0 Е Е А А В Р В А Б А В 7 »

у2зо1«аи _ - а в а □ В в а а а в я п В а я и _

у2Во1*11г - 2 в а г 3 В а в в а в я в 93 а в а а а 3

у1во+«Ш 2 I 5 а □ В а т т а в у а ■ а г ■ г а Т Я я * В я а ц я а II

у2во\1аи 3 I а в 0 ■ в ■ я в ■ я я а и а я я 4

у2в<Л0[1 3 - о □ а в а я а я 0 я и я а я а я 3

у2во1«геа т. I а а 0 н я я я в с я ы а я я я я 2

у2во1иа3еп(*' I т я(в)а г (и)а а » в 5 ■ а я и □ а а я У я а 13

у2ао1*23-5 - 3 а 0 3 и в в а а и а а в я я я в 3

у2аоУ81г 7 И □ в □ а а а а а я в я а я я я 7

у2воУ10и Й - к и а ¡3 в в я я а н м и я и я а в

Было проанализировано распределение на Х-хромосомах мутантов мобильных генетических элементов ЦДГ1, МДГ2, мдгз, ВДГ4 и oopia. Данные гибридизации in situ политенных хромосом слшных желез мутантных мух с "^Н-меченными пробами этих 1ЩГ показаны в таблице 3. По таблице видно, что практически для всех проанализированных МДГ показаны случаи транспозиций. Таким образом, действительно, в полученной нами системе генетической нестабильности происходят перемещения большого числа различных мобильных элементов. Следует отметить, что ни для системы продленной нестабильности, ни для системы К-Е гибридного дасгвнвза подобные явления кэ характерны. То есть, именно взаимодействие указанных систем генетической нестабильности является причиной активизации всех этих МГЭ.

Особый интерес в этой связи представляет мутация en(we). При появлении этого мутанта наблюдаются транспозиции наибольшего числа мобильных элементов. Помимо перемещений Стажера и появления нового сайта hobo,'в данном случае активизируются и ЩГ? ж copia элементы. Кроме того явно меняется локализация ЦДЛ на Х-хромосоме мутанта. Новый сайт гибридизации SfflTI появляется в 4А районе, но только на одной из хроматвд- (см. табл.3) Сходная ситуация наблюдалась на одно;.! из проанализированных препаратов а в другом участке хромосомы - IIB. По-видимому, в процессе мутирования на Х-хромосоме линии у^о^^егЦ«®) произошел ряд локальных перестроек, связанных каким-то образом с транспозициями актквизщювакпихся мобильных элементов. Кроме того, разница в расположении сайтов гибридизации для мобильного элемента ЦДЛ может объясняться и явлениями соматических транспозщай в данной линии, как уже описано для некоторых других систем генетической нестабильности (М.Б.Евгеньев и др., 1982; Kiia, Belyaeva, 1991).

Однако как в случае en(we) мутанта, так и для мутаций по локусу miniature, не показано встраивание ни одного из проанализированных мобильных элементов в непосредственный район локализации этих генов. Ке получено таких результатов и лля мутации w101*. Следовательно, список возможных участников нестабильности в данной системе может быть расширен при дальнейших исследованиях.

4. Мутации, не связанные с перемещениями мобильных генетических элементов.

4.1. Мутация w23"5 - результат делеции б районе локализации гена white. Появление мутанта у^во'я23*5 связано с возникновением нехватки

в области начала транскрипции гена white. Представлялось наиболее вероятным, что это вызвано неточным вырезанием исходной waG вставки с захватом части гена. Однако оказалось, что родительская яа<3 вставка -Doc - совершенно стабильна в проводимых скрещиваниях. Тем не менее структура участка Х-хромосомы - ЗС - соответствующего району локуса white, явно нарушена. Для анализа характера происшедших изменений были получены самки, гетерозиготные по исследуемой Х-хромосоме. Были приготовлены препарата политенвнх хромосом слюнных желез этих гетерозиготных самок. Полученные результаты подтверждают, что в области ЗС Х-хромосомы линии .y2so1w23*5 произошла делания, которая, видимо, и явилась причиной проявления в этом случае полностью мутантного фенотипа "белые глаза".

Появление такого рода хромосомных перестроек характерно для hobo-индуцированной нестабильности, однако в нашем случае район происшедшей делоции не связан с локализацией копий hobo, как это описыватся в литературе (Ыт, 1988). С другой стороны, активные перемещения hobo при возникновении этой мутации (см. таблицу 2) не вызывают других хромосомных перестроек в местах своей локализации. Это позволяет предположить, что изучаемая нестабильность каким-то образом связана непосредственно с локусом ^hite. Большое разнообразие происходящих в этом локусе изменений (дополнительные ¡шсерции разных мобильных элементов в разные районы, в том числе и внутрь Doc, деления) говорит о том, что ген white является "горячей точкой" а созданной системе нестабильности. Возможно все это обусловлено влияниями недостаточно еще изученого мобильного элемента Всо.

Таким образом, помимо активизации мобильных генетических элементов, их инсерций и эксцизий, мутагенез в описываемой системе мокет быть связан и с возникновением различных хромосомных перестроек, что полностью соответствует нашему исходному предположению о роли hobo, как источнике нестабильности.

4.2. Появление мутантов у1 eo+w1h, еозмояно, указывает на один из важных механизмов нестабильности исследуемой системы. Как уже было указано ранее, при получении линии, гомозиготной по одной из полученных мутантннх Х-хромосом w1h были получены два самца с фенотипом y1so+w1h. Оказалось, что в данной линии имеют место транспозиции как hobo так и Сталкера при сохранении всех родительских сайтов» Кроме того, данные мутанты полученн в скрещивании Н-Е гибридного дисгензза. И здесь, как л в двух других случаях дисгенатического мутирования (vrred и en(we)} наблюдаются совместные

транспозиции Сталкера и hobo.

Исследование же распределения на Х-хрошсоме линии y1so+w1h различных МДГ элементов показало, что практически все из них, за исключением ВДГ copia, резко меняют сайты локализации (см. таблицу 3, рис. 6). Большая часть изменений затрагивает самое начало хромосомы - 1-2 секции, причем в пределах этого участка полностью изменяется картина распределения всех мобильных элементов.

Т ИТ ? t Т Т TY ТУ 7 ? т ? ? У J. A A 1 'Ai

ЗС 5В 7В

| il

Тт?т?т ïïîtî Т ТY 7? ? f??f У

ia i ' • « i"

2В

о2В

9А

1АВ 5D

h ^ i

ШОШзи'

ÀJ

1В 23 1В

I i

18В

I Я

т ? Т т ? ? ?

J

121)

J

19А

y2eoVG

/Ww1*

Г |.

_1_,.+„1h Г во s

Рисунок 6. Распрздэлоше сгйтов гаЗркдезацьи in Bitu pasja^anx мобильных элементов е ряда пемедоватзльннх мутантов j^bo'w3" -j^boV11 - y1Eo+w1h. (а - Сталкер, о - hobo, v - вдт I, О - здг 2, к - мдг 3, ® - вдт 4, * - oopis.)

Происхождение данных мутаитов из лет зг2во1*?11г на вызывает Еикаких сомнений. Дополнительным подтверждением этого монет, служить сохранение большинства родительских' сайтов гнбрздизации мобкльнкх зломеетов, а такке полностью идентичная картина распредаяавия

многокопийного элемента copia в ряду последовательных мутантов от исходной литот y2sc1waG - y2so1w1h - y1sc+w1h (см. рис. 6). Однако анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов в районе локуса Boute показал, что в случае появления so+ аллеля структура локуса сильно отличается от таковой в родительской линии, и сходна со структурой этого локусз з использованной при ведении мутантннх самцов линии со сцепленными Х-хромосомами. Проведенные независимо в нашей лаборатории исследования распределения МДГ элементов на Х-хромосомах линии C(I)dz,yi показали полную идентичность локализации всех МДГ в районе О - 2В с полученной мною картиной для y1so+w1h (О.Б.Симонова, личное сообщение). Таким образом,появление мутаций у' и во+ может быть вызнано заменой участка Х-хромоссда родительской линии фрагментом одной из сцзплэнннх Х-зродасом линии С(1 )DX,yi. До-видамону, здесь мы жжем дело со сложннм случаем аномальной рекомоинации.

Однако даже признание такой рекомбинации не объясняет всех случаев изменения локализации мобильных элементов на хромосоме y1so+w1h. Эти процессы - рекомбинация в одном участке хромосомы и транспозиции в других участках - скорее всего являются результатами действия одного общего механизма, дестабилизирующего нашу систему. По-видимому осноео® для такой рекомбинации могли послужить вызываемые hobo одноцепочечные разрывы ДНК, с последующей их застройкой с участием мобильных алекэнтов или фрагментов других хромосом. С другой стороны hobo сам по себе никогда ранее не внзывал такие масштабные перестройки генома и, возможно, решающим здесь оказалось наложение активности hobo на систему продленной нестабильности. Тем более, что роль Сталкера в конкретном мутагоназе остается и в нашем случае более заметной, чем роль hobo.

выводы.

1. Охарактеризована система генетической нестабильности, полученная при введении в скрещивания, индуцирущиэ продленную нестабильность, активных копий мобильного элемента hobo. Мутагенез наблюдается в третьем поколении с частотой 3.2 х Ю-4.

2. С помощью метода гибридизации in situ показано, что в данной системе активно перемещается целый ряд различных мобильных элементов разик структурных классов, как например hobo, Сталкер, МДГ1, ВДГ2,

oof>ia.

3. Получена коллекции различных мутаций по локусу white. С помощью молекулярно-генетического анализа изучена структура произошедших изменений.

Показано, что возникновение мутаций woh, wred и связано с дополнительными инсерцяями мобильных элементов сталкер и hobo в район локуса white, причем инсерцая сталкера в случае ж ЕЕсзрцая hobo в случае w1h произошли внутрь исходной вставки. Описано новое явление усиления мутзнтнсго фенотипа при встраивании мобильного элемента hobo в состав исходной вставки (мутация w1h ).

4. Проклоноровак мутантвый локус vrhltc из родительской jeeke y2so1waG. Показано, что причиной мутации waG является шсерция кидоззмененного мобильного элемента Еоо в первый нитрон гена white.

5. Показаны случаи различиях' хромосомных перестроек, связанные с мутагенезом в описываемой система и травспозшшхж мобильных аавцентоз (мутацаи y2Bo1waGen(we) и з^ве1^3"5).

Получены данныэ о eosmgseocte аномального кроссакгоезра мзаяу хромосомами ланий, участаовавшх в скрещиваниях данной системы (щчшх r1Do"S1il). Сделано предпологениа с существовании общего де с та билизирующего механизма,' затрагивающего и рэксмбиаациоашэ и транспозиционные процессы.

Список работ, опубликованных по теме- диссертации:

I- Буфф Е.Ы., Сшлонова О.Б., Петрук С.Ф., Герасимова Т.И. Участие мобильного злешнта hobo в трансдозицкопных событиях в системе линий ^продленной нестабильности у Drosophlla melanogaster.// Генетика, 1992, т.28, >512, стр. 73-79. - " . :

2. Буфф E.U., Петрук С.Ф., Герасимова , Т.Н. Мнокественная из стабильность в системе взаимодействия мобильных элементов hobo и сталкер у Droeophila melanogaater.// Генетика, 1993, в печати.

3. Gsrasimova T.I., Hogila V.A., Xhatypova M.A., . Buif Е.И.

(

Different eye terns Of genetio instability in Drosophlla melanogaster. bate abstracts book of 12th European Vroeophlla Conferenoe, Mainz (PUG). 2-6 Sept. 1991., P.6.