Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль мобильных генетических элементов в мутагенезе индуцированном химическими и физическими агентами

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Роль мобильных генетических элементов в мутагенезе индуцированном химическими и физическими агентами"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им. В.А. ЭНГЕЛЬГАРДТА

РОЛЬ МОБИЛЬНЫХ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ЭЛЕМЕНТОВ В МУТАГЕНЕЗЕ, ИНДУЦИРОВАННОМ ХИМИЧЕСКИМИ И ФИЗИЧЕСКИМИ АГЕНТАМИ

03.00.03-Молекулярная биология 03.00.15-Генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

на правах рукописи

ГЕОРГИЕВ ПАВЕЛ ГЕОРГИЕВИЧ

Москва-1991

Работа выполнена в Институте обпей генетики им. Н.И. Вавилова АН СССР и Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта АН СССР.

Научные руководители: доктор биологических наук кандидат биологических наук

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Л.И. КОРОЧКИН

доктор биологических наук, профессор О.Л. ПОЛЯНОВСКИЙ

Ведущее учреждение- МГУ им. М.В. Ломоносова

Т.И. ГЕРАСИМОВА Н.В. ЛЮБОМИРСКАЯ

Запита состоится "¿^ мая 1991г. в часов на заседании Специализированного совета Д 002.79.01 при Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта СССР по адресу: 117964 Москва, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться молекулярной биологии АН СССР.

в библиотеке Института

Автореферат разослан

- «

"¿¿I апреля 1991 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

. КР..ЦЫН)

Перемещение мобильных генетических элемента в геноме высших организмов, например, у ОгозорШ )д те1зподэ5(ег происходит весьма редко, с частотой не пыше, чем 10~5 на генерацию. Между тем, известно, что значительная часть всех спонтанных мутаций у о. melэnogэster зависит именно от внедрения мобильных генетических, элементов.

Позникает ' предположение, что в определенных условиях перемещения мобильных элементов могут' активироваться. Действительно, Сило установлено, что о результате скрещивании между определенными линиями О. теК^поаэ^^ег , происходит индукция транспозиция мобильных ойементоп. В этом отношении наиболее хорошо изучены системы Р-М и 1-й гибридных дисгенезов. Термин гибридный •дисгенез означает, что при скрещивании между особями соответствующих линия (М и Р, д и 11 п >исходит целый ряд генетических нарушении и, в частности, выраженная гонадная стерильность. Особняком стоят системы, п которых под влиянием каких-то, пока неизвестных генетич.ских факторов возникают одновременно множественные перемещения • мобильных ' э ^ментов, относящихся к разным классам. Такие транспозиционные взрывы были наиболее подробно изучены на примере гжеперементально полученного семеяства г чия-- с^^ и ряда ее производных (Герасимова и др.). Лругоп сходный случая - изменение локализации мобильных элементов при активации так называемой НА линии (Гвоздев и др.1. В обоих случаях механизм активации пока не выяснен.

Возникает вопрос, могут ли транспозиции •'обильных элементов индуцироваться Факторами, отличными от скрещивания между определенными линиями. Исследование на растениях показали, что заражение некоторыми пирусами иногда стимулируют транспозиции мобильных элементов. Мак Клинток развила представление о "геномном гтрргг.р" как индукторе транспозиция, хотя само понятие геномного стресса пока остается несколько расплывчатым'. ■

ЦЦЗ!1_11_аадаи!!_!!ССЗеа911аиИЗ- Перед нами стояла задача выяснить, какова роль мобильных элементов в мутациях, не связанных с различными типами гибридного дисгенеза. Если мобильные элементы депствительно вовлечены в такие мутации, то следовало выяснить природу происходящих с ними изменения. Наконец, выяснив основные закономерности происходящих "события, можно было подойти к

понимание механизмов участия мобильных элементов в мутагенезе. '' ' Для изучения вопроса о факторах, которые могут вызывать изменения в локализации мобильных элементов, были предприняты генетические исследования эффекта ряда химических и физических Факторов на стабильную линий О. me!anogaster, несущую ряд мутаций, индуцированных мобильными элементами.

Н22Эиаа_1И*аИ2иЭ..Ва!5а1Нд в результате проведенной работы установлено, что поя влиянием различных, мало специфичных воздействия, таких, как инъекции самцам митомицина С, микроинъекции в эмбрионы чужеродной вирусной ДНК и тепловой шок, происходит активация мутагенеза. Выявление мутагенного эффекта теплового шока явилось одним из первых сообщения на эту тему.

Ряд полученных реверсий и мутация был изучен с помощью блот-анализа и других методов. Показано, что практически все обнаруженные в работе мутационные события, вызванные перечисленными вьше агентами, были связаны лисо с удалением мобильчых элементов, либо с их встраиванием в соответствующие локусы. Таким образом, установлено, что транспозиции мобильных элементов являются важным фактором мутагенеза,вызванного разными химическими и физическими агентами.

Значительная часть наблюдавшихся явлений может быть объяснена усилением процессов гомологической рекомбинации, что, в частности может вести к вырезанию .МДГ элементов с сохранением одного длинного концевого повтора. Однако, в ряде случаев происходит и прямая активация "процессов транспозиции, внедрения мобильного элемента в новое место генома.

Наконец, в работе продемонстрировано, что специфичность мутагенеза, т.е. спектр наблюдаемых для определенной лчнии мутация в значительной степени зависит от исходного расположения мобильных элементов в геноме данной линии.

Цапвй:авак1иае££28-аизаеиие_вабй1Нй Работа посвяшна в основном р^иению фундаментальных проблем механизмов мутагенеза. •Однако полученные данные могут иметь определенное практическое знг-'ение,. поскольку установлено, что расположение в геноме мобильных элементов позволяет предсказывать специфичность мутагенезу в данной линии. Результаты настоящей работы могут быть также использовали в .исследованиях других групп, работающих с мобильными -енетическими элементами.

ЙПВаОацнЗ-ВаЙаИл Основные научные результаты диссертации докладывались на конференции "Проблемы молекулярной и гсопуляционноя генетики" (Москва, 1966), на б-м Всесоюзном :овещании по проблемам биологии и генетики (Одесса, 19091 и hl. конференции молодых ученых ИОГен им. Н.И. Вгздлова АН СССР (19871.

ClB3£KIiBa_H_QQMU.P3SQIHi Диссертация изложена на 112 стр.(> зклвчая б таблиц и 10 рисунков, и состоит из рмделов: введение, 5зор литературы, материал и методы, результаты, обсуждение и зыводы.

Основные результаты получены автором самостоятельно. Эксперименты по молекулярному анализу частично велись совместно с З.А. Могилой, опыты по гибридизации in situ соместно с Л.А. )боленковоя, инъекции выполнялись совместно'с С.Е. Корочкиноя и :.А. Набирочкиным.

2л-КзмьшюеслЕдовша

S^li-XaBaKrseHCiHKa-HCDca&'aQfiaiJuaii.a.raQcic.aHUBB-i?—

Основная часть экспериментов была проведена на' ст-чбильноя ]абораторноя линии, несупея три мутации в Х-хроиосоме, в локусах yellow, scute и white, полученной от И.Д. Голубовского. Она была ¡означена как линия y^sc'w^ waG- uhite-apricot Голубовского;. 'яд экспериментов был проведен на линии J1R19J1R!9ctf1RpN19^ юторая была пслучена в системе с транспозиционными взрывами. >днако, поскольку оказалось, что линь одна из трех мутация, :f.tlRpNI9( вызвана инсерциея мобильных элементов, ИДГ4 и ¡строенного в него жокея (Герасимова и др. 19651, то последняя 1иния использовалась только в начальноя фазе работы.

Был проведен анализ природы мутация в линии y^sc'w^. 1редполагалось, что у^ и sc1 -мутации вызваны мобильным элементом 1ДГ4 (gypsy). По данным гибридизации in .situ в Х-хромосоме ыявляется ливь один участок связывания с МДГ4, в зоне 1АВ, т.е. ам, где расположены гены yellow и scute. Однако эти гены аходятся очень близко друг от друга, так что разделить их по ибридизации in situ невозможно.

Поэтому был проведен другоя, генетический, эксперимент для роверки участия МДГ4 в индукции у? и sc' мутаций. Известно, что утации в гене supressor of Hairy wing. su(Hw), супресс.рувт

мутации, вызванные в"едрением ИДГ4. Были сконструированы' линии, содержащие Х-хромосому с у2 и se' -мутациями и Ill-хромосомы с мутацией su(Ни) в гомозиготном состоянии- В результате происходило полное восстановление дикого типа по обоим локусам, yellow и scute', подтверждая, что мутации / и se' вызваны инсерциея МДГ4.

К этому же выводу позволили прияти опыты по блот гибридизации геномной ДНК линии y^sc'w3 и ДНК линии Canton S (Контроль I с пробами генов yellowи scute (см. ниже).

Далее, были проведены опыты по установлению природы мутации, обозначенноя как waG (рис. 1). При проведении блот гибридизации с геномноя ДНК из мутантноя линии оказалось, что ^а зона локуса white, инсерция в которую вызывает мутации типа классических мутация'white-apricot ( J", wa41 (около позиции 0 на карте), практически не изменена у мутантноя линии.

Однако, при использовании другого зонда перестройку в локусе white удалось выявить. Вместо 2,5 тпн BamHI Фрагмс 1та появляется два новых v. размерами примерно 7,5 и 5 тпн. Далее было показано, что произошло встоаивание отрезка ДНК, размером не менее 10 тпн в районе около +3,5 тпн (рис. 1).

Рис.1. Природа waG мутации в линии

Рестриктная карта локуса white и место вставки, отвечающей за мутацию. Р-?трикгные сайты: s - Sacl. В - BamHI, Н - ЖгиШ1.

Таким образом, мутация в локусе white происходит не в тоя области, где локализуются истинные wa мутации (второй интрон), а в районе около 5'-конца гена (рис. 1I. Поэтому она по сути дела не является ь^-мутацией. Учитывая однако^ фенотипическое сходство с „' последней, мы оставили за ней название wa, добавив к индексу Q (waG). что означает white-apricot Голубовского. Полное название линии - или сокращенно uaG.

Дальнейшее изучение мобильного элемента, вызвавшего мутацию w3^, ведется в настоящее время другой группой.

Наконец, для характеристики линии был проведен анализ ее цитотипа с помощью теста на стерильность после скрещивания с линией п2, относящейся к Р-типу, и линией у1 snwry:/^e, имеющей И цитотип. Стерильность самцов, получившихся в результате скрещивания §waG х S л2, была даже выше, чем стерильность . самцов, полученных от скрещивания 9 y'sn'1' х S п2. Самцы от скреииваяия 9 y'snw х о u?G обладали нормальной фертильностью. Следовательно, линия waG относится к М-цитотипу или точнее к М'-цитотипу, поскольку ее геном содержит дефектные копии Р-элемента.

Аналогичные опыты были проведенн по выяснению IR цитотипа. Скрещивания ставились с линиями CS (I-линия) и Cha (R-линия 1. Оказалось, что линия waG относится к I-цитотипу: гонадная стерильнрсть возникает лииь при скрещивании самцов \fG с самками Cha. Таким образом* vaG - это линия с P'1-цитотипом.

2л2_05ыты_с_ннъакциямм_митоииц*на_с

Наибольшее число опытов было проведено с целью исследования действия митомицина С, антибиотика, который, как известно, является химическим мутагеном. Вместо обычной процедуры добавления мутагена в корм , м провели внутрибрюпинные инъекции митомицина С самцам, что позволило более точно дозировать антибиотик к выяснить, на каком этапе разпития гамет происходит его действие.

Полученных после инъекций митоиицигч С фертильных самцов (общее число-326) скрещивали с самками со сцепленными Х-хромосомами C(1)RM, yf (XX/ Yl. Далее изучали мутагенез у самцов в первое- поколении, причем потомство каждого самца исследовалось индивидуально. В :асти опытов самцов после инъекция -крепивали с самками той же линии (и анализировали мутагенез / самзк ь • первом поколении (в этом варианте терялись рецессивные кутании.

Таблица 1. Осногные генетические события, наблюдавшиеся в потомстве самцов ^sc^uaG, обработанных митомицином С.

Локус Мутационные Проанали-____Число_мутантов________ Частота

события зировано |сёгох__1_____Из.ци^!_____ событий

Х-яро МО- СОМ одиночные пучки*. мозаики <xio~V"

yellow у2—> У* 50030 4 4 - - 0,7 (0.7)

scute sc—> sc* << 9 7 1(2) - 1,6 (1 .4)

white ыаС—> wad << 5 5 - - 0,9 (0.9)

forked f*—•> f 48980 16 6 2(7,3) 1 3,3 <1.7)

gce^o 34 22 3 1 Л^ЪЛИЛХ

Контроль¡без инъкции 96220

white waG—> и _ВЫъекуии_ОхМВ_ИаСД 30170 1 1 - - 0,1 (0,1)

Всего 120390 1 0,08

В скобках приведено чцдло мутантных особей в пучке (*) или частота независимых событий ( 1.

В табл. 1 представлены мутационные изменения, происходящие в потомстве самцов, получавпих инъекции митомицина С. Всего было

А

обследовано око.ю 58x10 особей из F1 и обнаружены у* и sc*

реверсии к дикому типу -> у* и sc' ——•> sc+l; частичные

реверсии мутации4waG ( waG~.—> uaGci, цве,- глаз с-ановился более темным): и появляление мутаций с фенотипом "вильчатые щетинки", напоминающих классическую мутацию f в локусе forked. Общая частота регистрируемых в Х-хромосоме событий составила 6,2х10~4 или, если считать только заведомо независимые события, - 4,7x10-4.

Дело в том, что в трех случаях одинаковые мутационные изменения появлялись пучком в потомстве одного самца. Это либо может быть результата совпадения двух редких независимых событий в потомстве одного самца, либо, что более вероятно, объясняется вог икновением мутаций на предмейотичеркой стадии.

В течение того периода времени, когда велись выше описанные опыты, проводился анализ на стабильность исходной линии uaG. Было

з

проанализировано около.96x10 особея и среди них найден линь один

мутационный переход типа yaG -> у (частота - 0,1 хЮ~4). Ни

одного события, аналогичного .тем, которые наблюдались в' потомстве самцов, обработанных митомицином С, обнаружено че было.

Кроме того, были проведены прямые контрольные эксперименты, где самцам линии w3® вводили внутрибрююинно 0.14М NaCl в том же количестве, что при инъекциях митомицина С. В их потомстве, полученном от скрещивания с самками XX/Y, сре,- ; примерно 30xl9 ' проанализированных самцов эообие не было обнаружено ни одного мутационного события. Следовательно, под .влиянием митомицина С уровень мутагенеза поднимался, по крайней мере, в 60 раз, что является существенным его усилением.

Далее мы провели изучение природы мутационных событий, вызванных митомицином С.

Как отмечалось выше, у? и se1 мутации в линии ы3^ вызваны иксерциями МДГ 4. Для выяснения механизма у* и se* реверсий проводили сравнительную блот гибридизацию по Саузерну геномной ДНК, выделенной из контрольн я (Canton S), из исходной ( waG> и из линия с соответствующими реверсиями после обработки ДНК различными рестриктазами. Результаты исследования по локусу yellow суммированы- на рис 2. Там ж» приоедены результаты опытов по блот гибридизации по Саузерну. Геномную ДНК обрабатывали рестриктазами BamHi it SalOI, которые не разрезают МДГ4, а из нативного локуса yellow иырезаат отрезок размером около 3,2 тпн. При гибридизации с тем же самым .tj гц-ментом из интактного локуса yellow видно, что, размер гибридизующегося Фрагмента в ДНК линии wпримерно на 7

+ 1МГ

тпн больше, чем у контрольной линии Canton 5. ay р-'вертанта у "я-он уменьиается, но все же превышает размер фрагмента из контрольной линии примерно на 500 пн. Таким образом, часть вставки ИДГ4, по длине-соответсвуювая длинному концевому повтору (ДКП) МДГ4, сохраняется в локусе yellow. Известно, что вырезание МДГ с сохранением на месте инсерции одного ДКП является характерным для реверсии мутация, вызванных МДГ элементами.' •

ДКП МДГ4 содержит 'рестриктный сайт для эндонуклеаз xhol, которого нет ни внутри МДГ4, ни в исследуемом районе локуса yellowПоэтому для выяснения природы вставки, сохранивпейся при у*реверсии, ДНК обраоатывали рестриктазами Sa ЮГ. BamHI и , Xhol. После этого проводили блот-гибридизацио с Фрагментом SalGI-Pstl. В результате получена гибридизация с фрагментом

размером 2,5 тпн (рис.2). Осо"энно важно, что в обоих случаях размеры^/гибридизуююихся фрагментов оказываются совершенно одинаковыми в линиях y^sc^w9^ и y*J^scJwa9 что прямо подтверждает предположение о сохранении ДКП в месте инсерции МДГ4'- у у ревертанта. Естественно, размер гибрйдизующегося фрагмента в линии Canton S оказывается существенно большим. Итак, уреверсия является результатом вырезания МДГ4 с сохранением на месте инсерции его ДКП. Ревертанты у*змсц у+г*МС даот при блог гибридизации точно такие же фрагменты, что и у*^С <рИС. 2 1.

Отличная ситуация обнаружена в случае уревертанта. При проведении гибридизаций с ДНК, обработанной рестриктазами BamHl и SalGI, выявляются две полосы (рис.2). Их суммарный размер превышает размер BamHI - SalGI фрагмента со встроенным в него МДГ4 примерно на 5 тпн. Следовательно, эта реверсия связана со встраиванием новой последовательности размеромне не менее 5 тпн в МДГ4. Доказательством того, что новая инсерция находится внутри ИДГ4, является опыт, где проводилась дополнительная обработка геномной ДНК рестриктазой Xhol. В этом случае вставка вырезалась вместе с МДГ4 и гибридизуюииеся фрагменты по размерам не Отличались от- таковых для линий' ыаб и у*1Мс. Следовательно, реверсия является следствием но вырезания МДГ4, а

встраивания нового мобильного элемента в М.ДГ4.

Подход к исследованию природы реверсии в гене scute был таким же. Вначале геномную ДНК для блот-гибридизации обрабатывали рестриктазой BamHI, которая вырезает из линий, дикого типа отрезок длиной 6,4 тпн. (рис. 31 При гибридизации с HindlII - EcoRI фрагментом выявляется лииь одна полоса гибридизации (рис. 3). У линии у8^ размер BamHI'Фрагмента увеличивается примерно на 7 тпн, что соответсвует размеру МДГ4. У всех четырех ревертьлтов его размер ■ существенно ниже, чем у родительской линии waG. но несколько выпе, чему контрольной линии (рис. 3). Важно, что разница одинакова; у всех реоертантов и составляет около 500 пн, что соответствует размеру ДКП МДГ4.

В следуюдей серии опытов геномную • ДНК обрабатывали рестриктазой Bglll. которая имеет сайт в ДКП МДГ4, и гибридизовали. с той же пробой. Belli вырезает из локуса scute в линии дикого типа отрезок длиной около 9 тпн.

+2МС

GX À,

yellow

75

MDG-4

GX -ML

У

*1,3,4MC

В

70

1 1

GX

1kb

LTR of MDG-4

10.2- ~

4.5 — J.7-3.J —

J.S —

2 1 t S в 1 И НИМ» «

Рис.2. Природа у* реверсий, вызванных v томицином С в линии

ai Рестриктиая карта локуса yellow, вставки, отвечающей за мутацию у?, и изменения, происходящие при реверсиях. Рестриктные сайты: S - SalGI, G - BglII, P - PstI, В - BamHI, X - Xhol. 61 Блот гибридизация геномной ДНК с рестриктными Фрагментами локуса yellow. 1 и 5 - геномная ДНК из линии y^sc'ivaG; 2. 6, 9 и 12 - y*mCsc'waG; 3 и 7 - y*2rlCsc'u3G: 4 и 6 - Canton S (дикий ТИП 1 ; 10 и 13 - y*5ncsc'uaG; 11 и 14 - у*4МСsc'waG. Рестрикцию вели SalGI-BamHI (1-4, 9-11), SalGI ♦ Xhol + BamHI (5-8, 12-14). В качестве пробы использовали SalGI-BamHI Фрагмент (1-4, 9-111 или SalGI-Pstl (5-в, 12-141 Фрагменты локуса yellow■ Блоты 1-3 и 9-14 получены в разных экспериментах.

а

gxr

iU-

HH GX

-Л-ill

G

BH H G H

j б

LTR of MDG-4

RB HR R GH

о scute -6 kb

1 kb

GX

»3.5 — 9ft-

Ifi?

ьу

.. Г

I 2 Э « S 6 7 9 8 10 11 12 13 U

Рис.3. Природа se* реверсия, вызванных митомицином С в линии

а) Г^стриктная карта локуса scute, вставки, отзечающея за мутацию se', и изуэнения.пр' входящие при реверсиях. Рестриктные.саяты: в

- BarnHI, H - HIndIII. G - Belli, X - Xhol, R - EcoRI.

б: Блот гибридизация геномноя ДНК с рестриктными фрагментами локуса scute. 1'и 5 - геномная ДНК из линии y^sc'w30; 2, 6, 9 и 12

- Лс*'^90.- 3 и 7 - y*sc*2ncuaG: 4 и 8 - Canton S <дикий тип); 10 и 13 - y^sc'**^. 11 и И - Рестрикцию вели ВэдЩ U-'i, 9-Ш , ВэШ 15-8, 12-Ш. В качестве пробы исполюора'!!' Hindi I I-EcoRI Фрагмент лгчуса scute. Блот 1-8 и 9-14 пелуч«1»'« в сч-чг^чяч ?ксп«-»римрнтал.

В линиях uaG и всех четырех производных $с+-ревертантах этот Фрагмент распадается на два размером 7,0 и 2,5 ,пн (рис. 31, что в сумме примерно на 500 пн больше, чем размер исходного ВоШ Фрагмента. Видно, что положение Фрагмента у sc'-мутанта и четыре.. 5с+-ревертантов совершенно одинаково.' Следовательно, во всех случаях sc^-реверсии произошло вырезание МДГ4 с сохранением на его месте инсерции ДКП.

Итак, у семи из ~осьми проанализированных молекулярно ревертант^в происходит вырезание ИДГ4 с сохранением ДКП, а у одного - внедрение в МДГ4 нового мобильного элемента.

.В опытах с инъекцией митомицина С возгчкли 16 сходных по Фенотипу мутация типа "вильчатые дстинки" в потомстве 7 разных самцов. Они были обозначены, как /^с-мутации. Гетероэиготы f^/f^, где f' - музеяиая мутация в локусе forked, имели мутантный ■генотип. Такой анализ на комплементации был проделан со всеми f-мутациями и результат был один и тот же. Следовательно, все полученные /^-мутации oti. лились к локусу forked (1-56,71. Высокая частота и специфичность мутагенеза позволяют предположить,' что мутация зависит от внедрения какого-то мобильного 5ле- энта.

Ответ был получен в генетических эксперементах. Каждая мутантная линия 3aVfcM выводилась для последующего анализа в гомозиготную по Х-хромосоме линию с помощью ряда скрещиваний, которые включали ^креиивание с линией F/14- При этом' было обнаружено, что скрещивание линии u3G и ее производных с линией Fff1 вызывает длительную геномную нестабильность, для которой было характерно резкое усиление мутагенеза в разных локусах Х-хромоссчы и аутосом, в частности по локусу forked. Мутагенез возникал во втором поколении после скрещивания, далее он достигал максимального уровня в 3-5 поколениях, и продолжался затем в течение нескольких десятков поколения с частотой примерно 0,5x10 . Как показали последующие исследования, причиной мутагенеза была индукция о результате / скрещивания нового мобильного элемента ИДГ типа, названного Сталкер. После выведения в гомозиготную по Х-хромосоме линию, мутация начала

ревертировать к дикому типу: f,ric—* f,fic\ В общей сложности на 6210 проанализированных хромосом было получено 3 ревертанта в двух ,

-4

независимых случаях (3,6x10 ). Поскольку после индукции нестабильности в системе перемещается только Сталкер, ш

ч^дположили, что мутации в ' локусе forked, возникавшие после обработки митомицином С, также вызваны внедрением мобильного элемента Сталкер.

Для дополнительной проверки были проведены эксперименты по гибридизации in situ политенных хромосом слюнных желез личинок дрогчофилы из линий waG. fWC, f3MC, f1MC+a и f1MC*b co сталкером-Оказалось, что в исходной линии uaG Сталкер в области 15F, где находится локус forked, отсутствует. У двух изученных /'-мутантов при том же распределении Сталкера по Х-хромосоме появляется * одно дополнительное место локализации Сталкера в районе 15F. У двух проверенных ревертантов Сталкер исчезает из этой области Х-уромосомы.. В совокупности с генетическими данными, эти результаты показывают, что мутации были связаны с внедрением Сталкера в локус forked-

Наконец, в пяти случаях были зарегистрированы изменения Фенотипа мутации waG, выразившиеся в появлении самцов с более темными глазами. Новые мутации были обозначены как uaGd. С помощью аналиаа на комплементации с мутацией u^G и музейной и1 все 5 новых мутаций были локализованы в локусе white. Таким образом, uaGd представляют частичную реверсию мутации uaG. Поскольку uaG мутация вызвана инсерцией мобильного, элемента, то ее частичная реверсия дЬлжна быть связана с изменениями происходящими в мобильном элементе.

Ранее было показано (Герасимова, 1984), что в некоторых, хотя и редких, случаях могут происходить транспозиционные взрывы. Поэтому мы провели прямые опыты по проверке, не происходят ли таковые под действием митомицина С. Лля этого проводили гибридизацию in situ различных мобильных элементов (ЧДГ1, МДГ2, МДГЗ, МДГ4 и copia> с политенными хромосомами слюнных желез личинок дрозофилы из разных мутантных линий y*zfic, sc*'^,

sc*ZMC. uaGd1, f,MC\, сравнивая их локализацию с таковой у исходной линии waG. Ни в одной из проанализированных линии ни разу не удалось зарегистрировать изменений в расположении того или инг-о МДГ-элемента. Следовательно, митомицин С не вызывает транспозиционных взрывов, и во всех случаях мы имеем дело с одиночнику событиями, связанными с вырезанием „ли внедрением единичных копий мобильных генетических элементов.

Анало-ччные опыти с инъекцией митомицина С внутрибрюиинно

самцам с последующим анализом потомства проводилось также на линии J1R19J1R19Сtt1RpN 19 ( С0Кращенн0 Эта линия в течение

примерно одного года после ее возникновения давала транспозиционные взрывы, но затем полностью стабилизировалась: примерно на 30x103 проанализированных Х-хромосом не было обнаружено ни одного мутационного события. В F1 было

проанализировано 9400 самцов, полученных в результате скрещивания проинъецированных самцов с самками Кх/ Y. В двух независимых случаях были получен1' изменения фенотипа мутации на Фенотип

близкий к ctm2. Эти последние были обозначены, как ctмутации. В гетерозиготе с/сдоминирует Фенотип мутации в

гетерозиготе ct2t1C/ct^2 доминирует Фенотип ct2tic- Мутация ct/1®2 связана с инсерциея в локус cut мобильного элемента МДГ4, а .при с^^^-мутации происходит дополнительная инсерция другого мобильного элемента, жокея, в область энхансера МДГ4, что приводит к частичной супрессии мутантного Фенотипа (Герасимова и др., 19881. Исходя из этого, можно с большой вероятностью считать, что мутация ct2t1C возникла в результате вырезания (вероятно, неточного) жокея из МДГ4.

с2222ЦНйЗ-£_М25йЗЬНУИИ_25еиентям1!

Ранее было показано, что при микроинъекции ДНК вирусов в полярную плазму эмбрионов у потомков в течение первых др-х поколений происходит актиьация мутагенеза. Специфичность мутагенеза при этом зависела от взятой для инъекции вирусной ДНК (Газарян и др., 1987).

Для работы с нашими линиями была выбрана ДНК аденовируса Sa7. Микроинъекция в полярную плазму ранних эмбрионов лйнии проводил.: по методике, описанной ранее (Набирочкин, 19841, Было проинъецировано 500 эмбрионо!.. Из них вылетело 29 мух: 13 самок и 16 самцов. Самцов Fo скрещивали с самками со сцепленными Х-хромосо"ами, а самокро скрещивали с самцами исходной линии реципиента. Мух с фенотип^ческими изменениями, найденными в F1 и F2. вновь скрещивали с самками со сцепленными Х-хромосомами или самцами исходной линии-реципиента (чтобы выяснить, не являются ли обнаруженные изменения морсозами). В результате было иолучеко б независимых мутационных событий в потомстве от пести различных

проинъецированных мух : две у+-реверсии, три sc^-ревереиии и одно событие в локусе yellow, приведвее . к. усилению у-фенотипа (у2->y1Sa^ частота мутагенеза составила около 6х10-4.

. Для выяснения природы полученных мутационных события

проведена блот гибридизация геномной ДНК с пробами клонированных

„ +

локусов yellow и scute• В случае двух у -реверсий и двух 5с+-реверсия размеры Фрагмента, содержащего в линии waG вставку МДГ4, уменьшались и приближались к размерам фрагмента дикого типа. Разница между ними составляла около 500 пн, т.е. соответствовала по размеру одному ДКП МДГ4. Таким образом, подобно тому, как это имело место в случае обработки митомицином С, реверсии в локусах yellow и scute явились результатом вырезания МДГ4 с сохранением одного ДКП на месте инсерции.

Далее была проанализирована у'^э-мутаиия. В этом опыте геномную ДНК, как и ранее, обрабатывали рестриктазами BamHI и SalGI. но в качестве пробы брали клон х sc 133, который захватывает фрагменты лежащие вправо и влево от BarnHl -SalGI Фрагмента, приведенного на рис.2. Таким образом, у дикого типа вместо одного Фрагмента на блоте, Фрагмента 3,2 тпн (центральный, сМ рис.2), выявляется еще два-' 5,5 тпн (левый) и 7 тпн (правый). В линии waG 3,2 тпн фрагмент увеличен до 10,2 тпн за счет вставки МДГ4 (рис.4, ср.с рис.21. В мутации у^а этот Фрагмент но изменяется по сравнению с у2, т.е. МДГ4 остается на месте. Однако, вместо 7 тпн BamHl-SalGt Фрагмента (правого! появляется 12,4 тпн Фрагмент.

Иными словами, происходит внедрение в эту. область локуса yellow нового инсерта размером около 5,4 тпн. Поскольку в этом же Фрагменте находится оба экзона гена yellow, то. полная его инактивация легко объяснима. Мы не проводили дальнейшего анализа природы'внедрившейся в локус yellow последовательности. Скорее всег.о, она представлена каким-то мобильным генетическим элементом.

Итак, по крайней мере, пять из шести мутационных изменений, наблюдавшихся после инъекция аденовирусной ДНК в эмбрионы линии w30 D. melanogaster> связаны с мобильными генетическими элементами, их вырезанием или встраиванием.

f* f*- '-4.X

3 7- ^q»

•3,2

1 2 3

a.

—6,5

12 3 б

12,3» 10,2« •

I

3,2»

1 2 3

В

Рис.4. Природа у* и реверсий.. и y,Sa иутации, вызванных

инъекцией аденовирусной ДНК.

а) Геномные ДНК линия y*,Sasc'waG <11, y*2Sasc7waG (21 и Oregon RC <31, обработанные эндонуклеазами BamHl и SalGl: Гибридизации вели с меченой ДНК клона х sc 113 i yellow).

б) Геномное ДНК линий y?sc*1SawaG <П, y2sc*2SawaG <2) и Oregon RC 13),обработанные эндонуклеазой ВэтНЬ Гибридизацию вели с меченым

.BamHI Фрагментом локуса scute.

в) Геномные ДНК из линий y^sc'we(7<U, Oregon «Г <21 и y'^sc'w30 <3 1, обработанные эндонуклеазами BanHl и SalGl• Гибридизации вели с ДНК клона *sc 133 (yellow).

£_1В2Н£222УиН°1Шуми_сдбутияии Наконец, нами было изучено влияние на мутагенез такого мало специфичного фактора стресса, как тепловой шок. Для этого была использована линия y^sc^w90. Опы~ы ставились по той же схеме, что и опыты с митомицином С. Самцов подвергали тепловому шоку и через день скрещивали с самками XX/Y- Далее каждые б дней их скрещивали с новыми самками XX/Y- В целом было проанализировано 17640 самцов в потомстве от 140 Фертильных самцов, подвергнутых тепловому вок.,.

После теплового шока частота мутагенеза возросла примерно в той,же степени, как и после инъекций митомицина С (табл. 2). Было зарегистрировано в независимых мутаций: переходы у2 мутации в y'"s мутацис (полная инактивация гена yellowI; реверсия в локусе scute

(«тс'-мутационныо переходы uaG->J1S (усиление

мутаитного фенотипа); и мутации в локусе forked ( f*-

Возникает вопрос о природе полученных мутаций. Реверсия в локусе scute была проанализирована с помощью блот-гибридизации по той же схеме, что sc^-реверсии, ' возникшие при воздействии митомицина С и вирусной ДНК. Оказалось, что sc"'/7S реверсия явилась результатом вырезания ИДГ4 с сохранением на месте инсерции ДКП МДГ4 ■

Таблица 2. Мутационные события в потомстве от самцов у подвергнутых тепловыму шоку (37°С, 30 мин).

Название локуса Мутационное событий Число , проанлизи-рованных хромосом Число мутантов Частота мутирования , - ( XI 0 4 )

ye 1 low у* — > у' 17870 2 1.1

scute SC1—■> + SC ->>- 1 0.6

white У36— > W 3 1,7

forked f -, f ->>- - 2 1.1

Общая частота мутагенеза 17570 8 4,5

Проведен также блот-анализ двух у'^-мутаций (рис. 51. При рестрикции ге -омной ДНК дикой линии Oregon RC эндонуклеазой BamHI образуется два Фрагмента размером 12,6 и 9,2 тпн, гибридизуюииеся с ДНК плазмиды ^sc!33- В левый фрагмент размером 9,2 тпн встраиваится МДГ4, который индуцирует мутацию у?. В результате размеры его увеличиваются до 16,5 тпн. У обоих у '^-мутантов происходит утрата центрального BamHI сайта, и в ;. ззультате вырезается только один Фрагмент, размер которого составляет около 17,5 тпн у у"75' и около 16 тпн у y1hs? MyTatfTOB. Следовательно происходит делеция Фрагмента размером около 12 и 14 тпн, соответственно.

Опыты с использованием други.. рестриктаз показали, что эти крупные делеции затрагивают как часть МДГ4, так и часть локуса yellow, включая его кодирующие отрезки. Один из ДКП МДГ4 сохраняется.

Мутации в локусе forked были изучены с помощью ранее описанного генетического подхода. Их выводили в гомозиготные линии, которые одновременно дестабилизировались путем скрещивания с линией FM4. В потомстве наблюдались реверсии к дикому типу. В случае мутации на 6240 проанализированных хромосом было

обнаружено две независимых реверсии к дикому типу. Для мутации

было проанализировано 10300 хромосом и обнаружен один ревертант. Следовательно, ^-мутации после теплового шока связаны с внедрением мобильного элемента, по всей вероятности Сталкера. Таким образом, и для большинства мутационных .события, полученных после теплового' шока, выявляется связь с инрезанрем или встраиванием мобильных элементов.

Табл. 3 суммирует результаты по иутагегзу в линии y?scJwaG, вызванному различными воздействиями: митомицин С, вирусная ДНК, тепловой иок.

Большинство мутация сводится к вырезанию ИДГ4 из локусов yellowи scute с сохранением ДКП, к внедрению новых мобильных элементов в локус yellow и, наконец, к инсерции Сталкера в локус forked. Иными словами, они связаны с мобильными генетическими элементами. Кроме того, можно сделать вывод, что природа линии в значительной мере определяет спектр события, в нея происходящих.

in.

ПК -16,5 12.8

9.2

12 3 4

Рис. 5. Природа мутационных события, вызванных в локусе yellow тепловым иоком.

Геномные ДНК линий ythstsc'uaG (1); y'hs2sc'waG (2 1; uaG (3); Oregon RC (41, обработанные рестриктадой BamHI. Гибридизацию вели с ДНК клона >*sc 133.

Таблица &. Мутации, наблодаввнеся в линии у2sс 'waG при различных воздействиях.

Нутационное ____Чдйтета_1^^ен§за_1х10_^_при_воэаейст§ии1__

событие Контроль Митомицин С Инъекции ДНК Тепловой еок

у2--> * У - 0,7 2,0

• У> • - - 1,0 1.1

sc1—> + SC V) 1.6 зд 0,6

- 0,9 - -

W 0,1 - - 1 ,7

f+ -> f - 3,3 - 1,1

Всего 0,1 6,5 . &„8 4,5

3^_0БСУМШЕ_РЕЗУЛЬТАТдВ

Основной результат, полученный в настоящей работе, состоит в том, что почти асе мутации, возникшие в генетически стабильной линии п. те1апо9а$Ьег под влиянием разнообразных воздействий (митомицина С, вирусной ДНК, теплового шока1 были связаны с генетическими перестройками, а эти последние вовлекали мобильные генетические элементы. Происходило как вырезание, так и встраивание мобильных элементов. Кроме того, была показана выраженная локусная специфичность этих событий, что, очевидно, определяется струтурой генома каждой линии дрозофилы, а именно, количеством копий и распределением в геноме разных семейств мобильных элементов. Таким образом, 'ыла установлена роль мобильных элементов в мутагенезе, вызванном различными факторами

В работе показано, что химический мутаген митомицин С индуцирует вырезание и встраивание мобильных элементов. Каков возможный механизм этой индукции? Митомицин С является алкилирующим агентом. Под его воздействием возникают разрывы в ДНК, т.е. происходит образование свободных концов ДНК, что, в свою очередь может вести к активации процессов рекомбинации и генной конверсии. Можно предположить, что их активация и лежит в основе индукции транспозиционных события митомицином С.

По лраяней мере, некрторые геномные перестройки, имевшие место в наших опытах и связанные с мобильными элементами, могут иметь в своей основе процессы рекомбинации и генноя конверси . Наиболее ясно это проявляется в случае трех ' .у+-реверсия й всех четырех $с+-реверсий, когда происходило удаление МДГ4 с сохранением одного ДКП. Объяснение такого процесса - это внутрихромос иная рекомбинация между двумя ДКП.

Сложнее обстоит вопрос о возможной роли гомологичной рекомбинации или конверсии при других событиях. В случае у* реверсии, вызванной внедрением жокея в МДГ4 можно предложить два объяснения. Одно - чисто транспозиционное событие - внедрение ДНК-копии ретротранспозона жокея в МДГ4. Другое - встрояка зкжея происходит за счет генноя конверсии с другой копией ИДГ4 содержащей встроенный в нее жокея. Сходным может быть и механизм перехода мутации в мутацию. Здесь имеет место обратный

процесс - вырезание жокея. В этом случае можно предположить или -вырезание через гомологичную рекомбинацию по участкам дупликации

мишени, возникшей при внедрении жокея: или вырезание путем генной конверсии через взаимодействие с копией МДГ4, лишенной жокея, которых в геноме большинство. Как бы то ни было, в обоих случаях участие гомологичной рекомбинации выглядит вп< - не вероятным.

Что касается мутаций в локусе forked, то они. наиболее полно отвечают критериям истинных транспозиций•• происходит внедрение МДГ Сталкера в место генома, где он до этого отсутствовал-. Возникает, однако, вопрос о причинах неоднакратного возникновения f-мутаций в линии причем это происходит при воздействии как митомицина С, так и теплового шока (настоящая работа), и при активации Сталкера в результате скрещивания с линией FM4- Возможно опять-таки дело в гомологичной рекомбинации, если в районе локуса forked у данной линии существует последовательность, имеющая гомологию со Сталкером

Все это не исключает роли таких процессов, как обратная транскрипция или транспозазная реакция. Однако, вероятнее всего, они деяст.уют согласованно с ферментативной системой клетки хозяина, участвующей в процессах рекомбинации и сопряженной с ней ; генной конверсией. j

Мутагенное влияние чужеродной ДНК на дрозофиле было показано ! рядом исслдователей, начиная.с Герюензона (1971). Линия y^sc'w96 оказалась чувствительной к микроинъекциям аденовирусной ДНК, в ней с высокой частотой 16х 10-it)• происходили реверсии у2 и sc' мутаций. Молекулярный анализ показал, что все реверсии являются следствием вырезания МДГ4, вероятно в результате рекомбинации между ДКП. ДНК Sa7 непосредственно в изменение локуса не вовлечена. Таким образом, ее действие является опосредованным.

Вероятно, микроинъекция вирусной ДНК, приводя к появлению в клетке большого исла свободных концов ДНК, индуцирует активацию тех же ферментативных систем клетки, что и митомицин С. Тысим образом, можно предположить, чтб в основе мутагенного действия митомицина С и микро«нъекции вирусной ДНК лежат сходные процессы: вызванная появлением свободных концов в ДНК активация Ферментативных систем репарации и рекомбинации, в результате чего усиливаются гомологическая рекомбинация и генная конверсия.

Тепл<звоя шок был выбран как классический тип н специфического стрессового воздействия. Как, известно, при тепловом шоке происходит выхлю ,ение большинства генов и включается сравнительно

небольшая группа генов, так называемые гены теплового шока. 8 настоящей работе было исследовано влияние теплового шока.на линио y^sc'u3^. Оказалось, что тепловой шок обладает существенным мутагенным эффектом, по крайней мере, на данной линии. Интересно, что по спектру события, индуцированные тепловым шоком, напоминают таковые при действии митомицина С и вирусной ДНК, хотя часто й отличается по механизму. Например, выявленные при тепловом вокэ делеции, захватывающие как локус yellow,' так и часть МДГ4, не встречались при других воздействиях. Как бы то ни было, мутационные события опять оказались связанными с мобильными элементами.

Одновременно с нашими опытами появились и другие сообщения о влиянии теплового шока на транспозиции. мобильных элементов. (Junakovlc et al, 1986. Ратнер и др., 19871.

Одной из причин активации транспозиция при тепловом иоке может быть увеличение транскрипции мобильных элементов. Так было показано, что тепловой шок активирует транскрипцию МДГ copla (Strand and McDonald, 19851, При компьютерном анализе нуклеотидной последовательности ряда МДГ в них были найдены регуляторные элементы, гомологичные таковым в генах теплового шока (Капитонов и др., 19871.

В целом вопрос. о том, каким путем реализуется действие теплового шока на генетические перестройки, включающие мобильные элементы, остается открытым. Он несомненно представляет болыюя интерес и заслуживает самостоятельного • изучения.

Мобильным генетическим элементам принадлежит важное место в мутагенезе и, как следствие этого, в изменчивости организмов. При исследовании мутация, возникших у D. melanogaster в природных условиях, очень часто оказывается, что мутация связана с инсерциея мобильнс.-о элемента. В настоящей работе показано, что и при индуцированном разными химическими и физическими агентами мутагенезе мобильным элементам принадлежит весьма больиая роль.

Как следует из приведенного в Обсуждении- материала, мутационные события во многих случаях являются следствием гомологической рекомбинации или генной конверсии. . Это не удивительно, так как мобильные элементы представлены а геноме многими копиями, а кроме того, обычно содержат гомологичные. последовательности на своих концах. Теи сзши они являются

идеальным объектом для инициации рекомбинационных событий.

Таким образом, мобильные элементы являются горячими точками для индуцированного мутагенеза. Именно там, где они встроены в геном, особенно часты генетические изменения при воздействии разных мутагенов. Локализация мобильных элементов в разных линиях и даже у разных индивидуумов различна. Поэтому именно распределение в геноме мобильных элементов или их частей (например, ДКП1 в значительной мере определяет локуснуо специфичность мутагенеза у разных линия или особея.

В заключение следует подчеркнуть, что, как видно из приведенного материала, мобильные элементы играют больиую роль не только в спонтанном, но и в индуцированном мутагенезе. Очевидно, действие целого ряда мутагенов реализуется через перемещения мрбильных элементов. Интересно, что такие разные факторы, как повреждение ДНК (митомицин С1, имитация ее повреждения (введение экзогенной ДНК с больиим числом свободных концов) и неспецифический стресс (тепловой яок), - все они активируют транспозиционные процессы в клетке, которые, в свою очередь, стимулируют изменчивость.

Возможно, это - один из механизмов, с помощью которого в неблагоприятных для организма условиях происходит стимуляция генетической изменчивости, ведущей к появлению в популяции некоторого числа особей с более высокой приспособленностью к измениввеяся среде обитания.

1. Изучен механизм мутаций, возникающих под -влиянием различных химических и Физических агентов в генетически стабильной линии y^sc'waG Drosophlla melanoeaster, несущей мутации, вызванные мобильными' элементами, в локусах yellob, scute (инсерции МДГ-4I и white (инсерция не идентифицированного мобильного элемента».

2. Помимо известных мутагенных агентов • (митамицин С, инъекции ДНК), мутагенным действием обладает также тепловой иок. Во всех случаях индуцированный мутагенез превышал спонтанный примерно в 60 раз.

3. Большинство мутаций в Х-хрймосомё возникало в .локусах, где присутствовали мобильные элементы, "ни включали у* и sc* реверсии, и изменения у2 и uaG мутаций. Кроме того, было получе; :> много мутаций в локусе forked-

4. Реверсии в большинстве случаев зависят от вырезания МДГ-4 с сохранением одного ДКП (длинного концевого повтора). В одном случае реверсия вызвана внедрением нового мобильного элемента в МДГ-4, вероятно, в его регуляторную ^ону.

5. Изменения мутантного фенотипа связаны с изменениями в структуре инсерций мобильных элементов. Мутации в локусе forked вызваны внедрением НДГ элемента Сталкера.

6. Таким образом, псе мутации, полученные под действием исследованных агентов, связаны, с перестройками, вовлекающим мобильные генетические элементы. Расположение в геноме мобилън.х элементов определяет специфичность мутагенеза. Существенную роль в вырезании и встраивании мобильных элементов играют, по-видимому, гомологическая рекомбинация и генная конверсия.

. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ. !. Георгиев П.Г., Могила В.А., Корочкина С.Е., Герасимова Т.И. Получение устойчиво нестабильных линии Orosophila melanoeaster. Докл. АН СССР, 1966, 291, 1492-1495. ■ 2- Georg!ev P.G., Korochkina S.E., Moglla V.A., Geraslmova T.I. Mitomycin С Induces transpositions of mobile elements 1n Orosophila melanogaster genome. DIS, 1987, 66, 61. 3. Георгиев П.Г., Корочкина C.E., Могила В.А., Герасимова Т.И. Индукция одиночных транспозиций мобильных генетически.с элементов у Drosophila melanogaster с помощью митомицина С. Генетика, 1966, 24, 461-467. 4- Георгиев П.Г., Могила В.А. Различные способы дестабилизации стабильной линии Drosophila melanogaster• В кн. "Проблемы молекулярной и популяционной генетики (ред.- Богданов Ю.Ф-1. Наука, Москва, 1988, 7-13.

5. Набирочкин С.Д., Георгиева С.Г.', Георгиев П.Г., Герасимова

Т.И., Газарян К.Г. Инсерционные мутации, индуцированные в г<;не yellow Drosophila melanogaster микроинъекцией ДНК онкогенных вирусов в полярную плазму ранних эмбрионов. Докл. АН СССР, 1989, 306, 1473-1475.

6. Georglev P.G., Korochkina S.E., Georgieva S.G., Geraslmova T.I.

Mitomycin С Induces genomic rearrangements involving transposable elements 1n Drosophila melanogaster. Molec. Gen. Genetics. 1990, 220, 229-233.

Подпясаа'6 в печать /f/и -f/: Заказ. *

-fflfl TivBX/fp Уч. 16

Офсетно-изоаател.на4 лаборатория ИЭУСС АН СССР

2U