Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование транспорта ионов кальция в изолированных ядрах из клеток печени мыши

ВАК РФ 03.00.05, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Исследование транспорта ионов кальция в изолированных ядрах из клеток печени мыши"

НАЦГОНАЛЬНА АКАДЕМЫ НАУК УКРАШИ 1НСГИТУТ Ф13ЮЛ0Г1? 1М.О.О.БОГОМОЛЬЦЯ 13ЮЛОГ1ЧНЕ В1ДД1ЛЕННЯ Л1ВЕРПУЛЬСЬКОГО УН1ВЕРСИТЕТУ

На правах рукопису

ГЕРАСИМЕНКО Юлш Володимир^виа

ДОСЛ1ДЖЕННЯ ТРАНСПОРТУ ЮН1В

КАЛЫД1Ю В 130ЛЬ0ВАНИХ ЯДРАХ 3 КЛ1ТИН ПЕЧ1НКИ МИШ1 03.00.05 - Бюф1зика

Автореферат дисертаци на здобутгя вченого ступеня кандидата бшлопчних наук

Кшв - 1996

Дисертащею е рукопис.

Роботу виконано у Ф1зюлопчному вщдшенн1 Л1верпульського ушверситету (Великобриташя), та у вцщш загально! ф1з1олол1 нервово! система 1нституту ф1зюлогй iM. О.О.Богомольця HAH Украши

Науковий кершник -- академш, директор 1нституту ф1зюлогй iM. О.О.Богомольця HAH Украши Платон Григорович Костюк. Офщшш опоненти:

1)член-коресповдент HAH Украши Кришталь Олег Олександрович ( 1нститут ф1зюлоги iM. О.О.Богомольця HAH Укра!яи)

2)каидидат бюлопчиих наук Гшмельрейх Нша Германовна ( 1нститут 6ioxiMii iM. O.B. Паллад1на HAH Украши)

Провщна установа: бюлопчний факультет Нащонального Ушверситету iM. Тараса Шевченка

на засщаиш Спещал1зовано1 ради Д-01.13.01 при Гнсгитуп ф1зюлоги ¡м.О.О.Богомольця HAH Украши за адресою м.Кшв, вул.Богомольця 4.

3 дисертащею можна ознайомитися в б!бл1отещ 1нституту ф1зюлоп! 1м.О.О.Богомольця HAH У

Захист вщбудеться «.

1996 р. 0

Автореферат роз1сланий «.

1996 р.

Вчений секретар Снещагизовано! ради доктор бюлопчних наук

3.0. COPOKIHA-MAPIHA

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальтсть проблема. Дегалька десятир1Ч вчеш звертаються до проблеми вивчення рол1 та транспорту ioniß кальцш в клтшах. Кальцш - найбшьш поширений катюн в opraHÎ3Mi хребетних, який контролюе внутршньоклтшт процеси. Також вщома важлива роль ioHiß кальцш у фундаментальних ядерних процесах. Недавно було показано, що злитгя ядерних везикул потребуе мобипзаци îohîb кальцйо (Sullivan, 1993), а також в ядрах знайдет кальщев1 АТФази сарконлазматичного типу (Lanini, 1992), шозитол трисфосфатш рецептори (I<P3)(Nicotera, 1990, Meszaros, 1993) та системи синтезу шозитол трисфосфата (Divecha, 1993). Ниш не кнуе загальноприйнятох модел1 транспорту кальщю у ядрах. Одне з основних питань -проникливкть ядер. Рашше вважалось, що ядерна оболонка прониклива для îohîb, а також речовин з молекулярною вагою до 10-20 кДа (Lang, 1986). Недавно було опублшовано деюлька po6iT, в яких доповщалось про кнування р1знищ Mim концентращями вшьного кальцш в иуклеоплазм! та цитозол!, особливо шсля стимуляцН (Himpens, 1992, Shankar, 1993). В шших роботах вважаеться, що тага данш е артефактами, а концентраци кальцш м1ж цитозолем та нуклеоплазмою швидко вщивнюються (Al-Mohanna, 1989, Brini, 1993, Gillot, 1993). На шдстав1 експерименпв з хзольованими ядрами знайдено АТФ-залежне захоилення кальцш у ядерний проепр та 1ФЗ-викликаний вихвд кальцш у цитоплазму (Nicotera, 1989, 1990). Безиосередш видпрюванпя концентраций вшьного кальцш в нуклеоплазм1 за допомогою специф1чно синтезованого всередиш ядер екворшу вказують на значну проникливкть ядерно! оболонхш для кальцш

(Brini 93). 3 наведеного внще важко зрозумгги, яким чином функцюнують ядерш мехашзми кальщевого гомеостазу.

Мета робота : з"ясувати транспорт ionia кальцйо в поодиноких ¡зольованих ядрах з клггин печшки мшт за допомогою кальцш-чутливих флуоресцентних фарбнигав, використовуючд флуоресцентну та

конфокальну мшроскошю. Задат роботт

1.Досл1Дити проникшсть ядер до ioHis кальцйо.

2.Виявити локал1защю мкць АТФ-залежного акумулювання кальцйо в ядрЬ

3. Визпачити роль та локал1зацйо 1ФЗ-рецептор[в у ядрь

4. Вивчити можливу участь р1анодинових penenropiB у регуляци транспорту кальцйо у ядр1.

Наукова новизна. Встановлено, що ядра мають систему кальщевих депо, розташованих в ядернш оболонщ, звщки кальцш вшотдаеться за допомогою шозитол трисфосфату та циюпчно! АДФ-р1бози через в!дпов1ДШ рецептори, збшьшуючи тимчасово локальний pieeHb ioHiB кальцйо в нуклеоплазм!. Змии цитоплазматичного кальцш можуть без перешкоди потрапляти у ядро та активувати кальцш-залежш ядерн1 процесл.

Практвчве значения. Отримаш результата - основа для дослщження транспорту юшзованого кальцш в 1зольованих ядрах кштин з печшки мини та можуть бути використоваш для вивчення кальцш-залежних ядерних процеав.

Алробацш робот. MaTepiann дисертаци доповщалися i обговорювалися на семинарах секцн Нейроф1зюлогИ 1нституту ф1зшлоги iM. О.ОЛЗогомольця HAH Украгаи (Ки!в 1994, 1995), конференци Ф1зюлопчного Товарнства Великобританй(Великобритан1я,Шверпуль 11-13кв1тня 1994),Гордон1вськ1й

конференцИ на тему кальвдево! сигнал1зацц (США, Хеннжер, 18-23 червня 1995).

Обсяг i структура дпсертаци. Дисертацм складаеться 3i вступу, огляду лггератури, характеристики методов та експериментально! частини, обговорення, 7 висповшв та списку лггератури з 141 назви. Робота викладена на 104 сторшках друкованого тексту, щлюстрована 17 малюнками. За материалами дисертаци опублшовано 3 робота.

Особистпй внесок. Дисертантом був зроблений значний внесок як в експериментальнш частит, так i в обробгй результата, а також у падготовщ матер1ал1в до публжацн.

МЕТОДИКА ДОСЛ1ДЖЕННЯ

Для отримання печшки брали двохмкячних мишей (самц1в л!нп СД1). Печшку одте! миип (0.3 грама) помщали в льодяний буфер А (125 мМ KCI, 2мМ К2НР04,50 мМ HEPES, 4 мМ MgCI2,0.1 мМ ЕГТА, 1 мМ АТФ, 1 мг/мл шпбпор Tpinciiiy, рН 7.0 доводили КОН), штм з допомогою ножиць рЬали на шматки розм1ром 2-3 мм додавали 4 мл льодяного буферу А та гомогешзували у гомогешзатор1 тефлон-скло ("Jencons Uniform") (10-15 pyxie гомогетзацшного поршню). Гомогенат центрифугували при 1000 g протягом 1 хвшшни, 4°С. Надосад зливали та ресуспендували осадок в 4 мл буферу А, гомогешзували у гомогенизатор! тефлон-скло ("Jencons Uniform") (6-8 pyxiB гомогетзацшного поршню) та фшьтрували через сито 0.25 мм (Sigma). ГБсля цього центрифугували вдруге у тих самих умовах. Осадок суспендували в 1 мл буферу А та зберкали протягом 2 годин при 4°С. Для дослвдження зм!н кальщю у ядернш оболонщ ¡зольоваш ядра витримували 30-45 хвплин при 4°С у буфер1 А в присутносп Фури2-АМ (20мкМ).

Для вивчення змш кальцдо у нуклеоплазлп ядра шкубували з декстран-зв"язаними флуоресцентними шдикаторами (Фура2 декстран (М.м.70 кДа), кальцш-Грш декстран (М.м.70 кДа) в концентрацй 20 мкМ протягом 10 хвилин при 4°С. Навантажеш ядра промивалися за допомогою центрифугування при 1000g протягом 1 хвилини, 4°С.

Зразкн з ядрами, навантаженими Фурою або декстран-зв"язаними шдикаторами, помйцали в експериментальну камеру, з"еднану з системою перфузп та промивали стандартиим буфером 5-10 хвилин перед початком кожного експерименту. Експерименти проводили при шмнатнш температур! (21°С - 23°С) на поодиноких ¡зольованих ядрах. Налриюнщ експеримент1в зразки фарбувались етвд1ем бромщом для контролю.

Фарбування етвдем бромщом в концентрацИ 5мг/мл, або DiOC (3) в

6

концентрацй 2.5 мг/мл ввдбувалось додаванням цих фарбниив до суспензП ядер та шкубацИ протягом 5 хвилин з наступним промиванням стандартиим буфером А.

В стандартной розчин додавався CaCI^ до необхщно! концентрацй íohíb кальцЬо в зовн1шньому розчин1 ядер (100 - 200 нМ), яка перев1рялась за допомогою флуоресцентних вим1рювань Фурою2. Для кал1брування вим1рювально! системи використовували стандартт Са2+ - ЕГТА буфери (Molecular Probes).

Вим1рювання концентрацш вшьних íohíb кальцйо та розподш флуоресценци р1зних фарбнишв в 1зольованих поодиноких ядрах проведено за допомогою Imaging system (Applied Imaging). Розподш флуоресценци

Фури2, Фури2-декстрану, DiOC (3) та етщйо бромщу в 1зольованих ядрах

б

отримат за допомогою лазерного сканюючого конфокального мшроскоиу ODISSEY (Noran Instruments) з об"ективом Fluor 100Х, NA 1.3 oil (Nikon) та щшиною 2.5 мкм.

Зображення, отримаш за допомогою конфокального мшроскопа, оброблялися з використанням програми TwoD AnaIysis(Noran,CIHA).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛЩЖЕНЪ

Розподш флуоресдентих фарбшпав в ¡зольованпх ядрах

1зольоват ядра з клшга печшки мини в o6"eMi 100 мкл пом1щали в проточну камеру та залшпалп на 1-2 хвнлини, щоб датп можлив1сть ядрам ocicm на покривне скло. ГИсля цього камеру промивали приблизно 10 мл стандартного розчину та реестрували флуоресценщю за допомогою ССД-камери флуоресцентно! установки (Imaging system). 1нтенсивтсть флуоресценци Фури2 в навантажених Фурою 2-АМ (мембрано-проникливою формою) ¡зольованих ядрах, (пом1ряна при збудженш на хвил1 360 ни та eMicil бтьше 510 нм) була негомогепною: низькою в центральшй обласп проекци ядер та максимальною на периферп (п>100). Це наводить на думку про можливу пщсуппсть Фури2 в централыпй обласп ядер, а незначний р1вень флуоресценци, що спостерн-аеться, пояснюеться флуоресценщею В1пцих i нижчих mapie оболонки. Щоб перев1ритп це припущення було використано специф1ч1шй маркер ендоплазматнчпого ретнкулуму Д10С6(3), якнй повинен фарбувати тшьки ядерну оболонку, що е продовженням ендоплазматнчпого ретнкулуму клшш (п=7). Розподш флуоресценци Фурн2 сшвпадае з флуоресценщею ДЮСб(З). Така схож1сть у розподш1 пщтверджуе припущення, що Фура2 концентруегься не в нуклеоплазм1, а в обласп ендоплазматнчпого ретнкулуму ( та в ядернш оболонцО, який залишаеться з'едиалим з ядром шсля процедури видшення. Це припущення найкращим чином шдгверджено фотоз1Ймками, отриманими за допомогою конфокального мшроскопу, якнй мае

висок! показники латерально! (~ 0.1 мкм) та вертикально! роздшьш здатносп (~ 1мкм). Показано, що ш Фури2 (п=9), ш ДЮС (3) (п=8) немае нуклеонлазш: вони сконцентровашв ядернш оболонщ.

В шших експериментах спостер1галося, що Фура2 (кашева ешь добавлена в камеру, швидко проникае в нуклеоплазму, а в хода промиванн за допомогою протоку вимиваеться з нуклеоплазми повтьшше шж камери, так що напротяз1 приблизно 30 секунд зменшуетьс флуоресценщя ядер. Таким чином, мембрано-непрониклива Фура2 бе иерешкод проходить через ядерш пори у нуклеоплазму та з не!. Також бул знайдено, що флуоресцентно м1чею декстрани (М.м.70 кДа) швидк проходять через ядерш пори, але шеля процедури промивання декстран дуже повшьно дифундують з ядра, мабуть, тому що адсорбувалися всередин даючи можлив1сть вишрювати концентращх вшьного кальщю безпосереднь внуклеоплазмь

В експериментах використовували флуоресцентш декстрани, м1чех флуоресцентними кальщевими 1ндикаторами (кальцш-грш 1 та Фура 2 Результата, отримаш за допомогою флуоресцентно! мжроскопц, показуют] що штенсившсть флуоресценци центрально! обласп ядер, навантажени Фурою2-декстраном, була бшьша, шж на иер1ферй (п>100). Подобний ти розподшення був знайдений 1 для кальцш-Грш 1-декстрана. Розпод1ленн штенсивности флуоресценци декстран-зв"язаних кальщевих 1ндикатор1в ядрах також дуже под1бне до розподшу флуоресценци етидаю бромщ; маркера ДНК та РНК (п>100), (п=8). Така дзвоноподдбна форм розподшення флуоресценци декстраюв пщтвержуе, що акумулящя ци молекул вщбуваеться у внутршшш обласп ядра (нуклеоплазмО. 3 допомогою конфокального мшроскопа був також зареестровани внутршшш розподш декстран-зв"язаних флуоресцентних 1ндикатор1в у ядра

(п=9), який засвщчуе бшьш гомогенну флуоресценщю, нЬк отриману за допомогою Imaging system, завдяки кращому вертикальному розршенню конфокального мшроскопа за рахунок вщшмання флуоресценцИ верхнк та нижчих uiapiB.

Вхщ та впхщ Са2+ в ¡зольоваяпх ядрах

Змши концентрацп зовншшього кальщю взд 10"8М до 1мМ не впливали на флуоресценщю ядер, навантажених Фурою2 в АМ-форм1 (п=7). Але додавання юномщину до зовншшього розчину з високою концентрац!ею кальщю (1мМ) призвело до насичення вщносного сигналу Фури2, а промивання розчином з хелатором кальцт ЕГТА у присутност ionoMiiiiiHy викликало вздновлення сигналу (мал.1) (п=10). В ¡ншш cepii експеримеипв ми показали АТФ-залежну акумулящю ioHiB кальц1ю в ядрах (мал.2) (п=12). Вихвд акумульованого кальцш стимулювався 1ФЗ, прицьому ефекти збшьшувались при вщсутносп АТФ. Шсля вилучення АТФ i3 зовн1шнього середовища, додавання 1ФЗ викликало помгене зниження концентраци вшьного кальщю в ядрах (мал.З) (п=7). Це пщтверджуе результати, отриман1 рашше (Hechtenberg, 1993, Nicotera, 89, 90) в експериментах з суслензшми Ьольованих ядер печшки, де було показано кнування АТФ-залежного акумулювання iome кальцш, а також вггад ioniB кальцш пщ впливом 1ФЗ та кальмщозол1ума. У наших експериментах ми контролювали розподш 1ндикатор1в кальцио, i з"ясували, що Bci щ ефекти вщбувалися в ¡зольованих ядрах з гальцевим розподшом Фури2.

Таким чином, ми можемо зробити висновок: кальщев1 депо в ядрах знаходяться в ядернш оболонщ, де вщбуваеться акумуляцш кальцио та його вих!д пщ впливом 1ФЗ, а не в нуклеоплазм1.

На цей час кнуе нимало доказ1в рол1 цикл1чпо! АДФ-

pi6o3H як посередника виходу íohíb кальцйо в деяких системах (Hua, 1994, Lee, 1989, Thorn, 1994), тому ми також дослщжували вилив цього реагенту. В робст показано, що 10 мкМ цАДФ-р1бози викликае значний вихщ íohíb кальщ1ю з ядерно! оболонки (мал.4) (п=6).

Нагромадження декстрашв, м1чених кальцш-чутливими шдикаторами, у BiiyrpimHix областях ядер створило уншальну можливкгть слщкувати за змшами концентраци íohíb кальцш в нуклеоилазм1. 3míhh концентраци кальцш в зовн1шньому розчин1 призводили до швидких змш флуоресденци кальщевих шдикатор1в, зв"язаних з декстранами. Пщвищення концентраци зовншшього кальцйо до 1 мМ викликало насичення шдикатор1в в нуклеоплазм1, в той час як додавания ЕГТА (2мМ) призвело до вщновлення сигналу, обумовленого виходом íohíb кальцш з нуклеоплазми (мал.5) (n=10). Таи швидш змши флуоресценцИ декстран-зв"язаних шдикатор1в засвщчують, що ядерна оболонка легко прониклива для íohíb кальцш. Але стимулящя ядер при вщсутносп АТФ за допомогою 1ФЗ (мал.6)(п=9) та цАДФ-р1бози (мал.7)(п=7) викликала швидке tpah3íchth6 пщвищення концентраци íohíb кальцйо всередиш ядер, зам1ряне за допомогою флуоресцентних декстран-зв"язаних кальщевих шдикатор1в. Ефект, отриманий при додаванш цАДФ-р1бози, свщчить про npiicyTHicTb функцюнальних р1анодинових редептор!в (Meszaros, 1993), i тому ми провели шлька експеримента щодо впливу р1анодину. Додавання останього викликало невелике, але цшсом достов1рне пщвищення концентраци кальцш в нуклеоплазм1 (мал.8)(п=15), яке було транз1ентним та повшьшшнм нор1вняно з ефектами 1ФЗ та цАДФ-р1бози. Декстран-зв"язан1 флуоресцентш кальщев1 шдикатори, hkí нагромаджуються всередиш ядра, зареестрували вихщ íohíb кальцш з ядерно! оболонки i дей

Малюнок 1. Вшхив змш концентрацщ зовшшього кальцш на концентраций вшьного кальцш в ядернш оболонщ поодинокого ¡зольованого ядра. Послщовш ашпкацп високо! концентрацн кальцш (1мМ СаС12) та ЕГТА (2мМ) до поодинокого 1зольованого ядра в присутносп 20мкМ юномщшу. Ядра навантажеш Фурою 2-АМ.

[Са ], (пМ)

Малюнок 2. Внлив ашпкацЦ АТФ (1мМ) на концентраций вшьного кальцш в ядернш оболонщ {зошъовяаого ядра в стандартному розчиш, який м1стить 100 нМ вшьного кальцш. Ядра навантажеш Фурою 2-АМ.

Малюнок 3. Вплив ашикаци 1ФЗ (10 мкМ) на концентрацш вшьного кальцш в ядернш оболонщ 1зольованого ядра. Ядра шкубувалн в стандартному розчиш з 200 нМ вшьного кальцш в присутноеп 1 мМ АТФ протягом 2 хвилин, поим промивали стандартним розчином без кальцш та АТФ, теля чого додавала 10 мкМ 1ФЗ. Ядра навантажеш Фурою 2-АМ.

[Са ^, (яМ)

Малюнок 4. Вплив ашикацп цАДФ-р1бози (10 мкМ) на концентрацш вшьного кальщю в ядернш оболонщ ¡зольованого ядра. Ядра шкуб1ровали в стандартному розчиш з 200 нМ вшьного кальцш в присутносп 1 мМ АТФ протягом 2 хвилин, потом промивали стандартним розчином без кальщю та АТФ, теля чого додавали 10 мкМ цАДФ-р1бози. Ядра навантажен1 кальцш-Грш 1-АМ.

Малюнок 5. Вплив змш концентрацш зовннпього кальцио на концентрацш вшьного кальцио в нуклеоплазьп поодинокого 1зольованого ядра. Послвдовна аплнсацш високих концентрацш кальццо (1мМ) та ЕГТА (2 мМ) до поодинокого 1зольованого ядра. Ядра навантажеш Фурою 2-декстраном.

Малюнок 6. Виклнканий 1ФЗ вихщ юн1в кальцио в нуклеоплазму. Ядра навантажували кальщем в нрисутност1 АТФ, промнвали стандартним розчнном без кальцио та АТФ та додавали 10 мкМ 1ФЗ. Ядра навантажет Фурою 2-декстраном.

Малюнок 7. Викликаний дАДФ-р1бозою вихщ юн1в кальцда в нуклеоплазму. Ядра навантажували кальщем в присутносп АТФ, промивали стандартним розчином без кальцио та АТФ та додавали 10 мкМ цАДФ-р1бози. Ядра наваитажеш Фурою 2-декстраном.

Малюнок 8. Викликаний р1анодином вихад юн!в кальцда в нуклеоплазму. Ядра навантажували кальщем в присутносп АТФ, промивали стандартним розчином без калыцю та АТФ та додавали 1 мкМ р1анодину. Ядра навантажеш кальцш-Грш 1-декстраном.

вих1д був спрямований з оболонки в нуклеоплазму. Такий висновок був зроблений тому, що експерименти проводилися при постшнш перфузй ядер стандартним розчином, який мав в своему склад1 100 мкМ ЕГТА. Природа транз1ент1в таких ефект1В, ймов1рно, обумовлена виходом ioniB кальщю з нуклеоплазми через комплекс ядерних пор в цитоплазму.

ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТШ

Об"еднуючи попередш данш (Nicotera, 1989, 1990, 1992) та головш результата нашо! роботи вщносно транспорту кальщю в 1зольованих ядрах ми подтвердили принципов! висновки, асаме:

1) АТФ-залежне захоплення кальцпо в 1зольоваш ядра

2) Вихщ акумульованого кальщю, викликаний д1ею 1ФЗ .

Нам також вдалося з"ясувати, що цей транспорт кальцйо ввдбуваеться не в нуклеоплазму або з нуклеоплазми, а вядерну оболонку або з не!.

Ядерна оболонка е високодинам1чною та складною структурою (Simon, 1991, Smith, 1986, Taylor, 1991). Зовншгая мембрана мае характеристики ендоплазматичного регикулуму та вщр1зняеться за cboIm бшковим складом в1д внутршгаьо! мембрани. ripocTip мЪк зовтшньою та внутрнпньою мембранами (люмен ядерно! оболонки) е продовженням ендоплазматичного люмену (Alberts, 1989). Hanii дослщження не дозволили зробити певний висновок щодо Ч1тко! локал1зацц Са2+- АТФаз. Вони можуть посщати на внупншнш або зовшшнш мембранах ядра (або на обох одночасово), або на продовженш ендоплазматичного ретикулуму ядерно! оболонки, який залишаеться зв"язавим з ядром теля процедури ¡золяцп. Ми показали присутшсть двох тип1в кальщевих канал1в на

внутршшш ядернш мембран!, демонструючи викликаш

концентраци кальццо в штрануклеоплазм1, що пщтверджуе спрямовашсть виходу кальцш у внутршшш ядерний проепр. Ми не можемо виключити можливосп виходу калыцю з ендоплазматично! мембрани в перифершний просир, я кий розташований близько бшя ядерних пор 1 е продовженням простору середини ядра. Але не можна не вщзначити, що висош локальш концентраци кальцш, яш зустр1чаються в мисродоменах близько до входу в 1ФЗ-чутлнв1 канали Штактних клшга (Шггий), 1993) залежать ввд вщносно низько! мобшьности кальцш в цитозол! (Каваь 1994). Яшцо б кнували функщональш рецептори 1ФЗ на зовшшньому бощ ^зольованих ядер, яш знаходяться в ф1зюлопчному розчиш, тод! ми не повинш були б спод!ватись на попршення дифузц кальцш в цитозол1 1, таким чином, висока локальна концентрацш кальцш е малоймов1рною. У наших експериментах присутшсть 100 мкМ високоафшного кальщевого хелатора ЕГТА у зовншньому розчиш водночас з швидкою перфузкю ядер робило дуже малоймов1рним те, що досить висои локальш концентраци кальцш на зовншньому бощ ядра могли б призводити до змш р1вшв нуклеоплазматичного кальцш, навиъ у присутносп 1ФЗ-чутливих кальцш-визволяючих канал1в на зовншнш поверхш. Лашш та шш. (1992) ранние було запропоновано, що молекули Са2+-АТФази присутш як на зовншнш так 1 на внутршшш мембранах ядра. Мальв1я та шш. (1995) показали за допомогою моноклональних м1чених антитш, що 1ФЗ-рецептори р1зних тишв розташоваш на зовншнш 1 внутршнш мембранах ядерно! оболонки, причому на внутршнш мембраш розташовано приблизно втрич1 бшыпе 1ФЗ-рецептор1в, що пщтверджуе наил висновки щодо виходу кальцш, спрямованого в нуклеоплазму. Нанй результат« ч1тко засвщчуюгь кнування кальщевих насоов, зд1бних транспортувати кальцш з середовища ядер в люмен ядерно!

оболонки та пов"язаний з ним ретикулум.

Наявшсть рецептор1в на внутршнш мембрат ядерно! оболонки дозволяв запропонувати кнування специф1чно! системи транспорту кальщю, яка може використовуватпся для активаци ядерних процеав в клптшах.

Флуоресцентт дослщження на штактних клтшах показали ¡снування в окремих випадках дуже специф1чного субклггинного розподшу кальщй-визволяючих каналов (Burgoyne, 1989, Kasai, 1993, Petersen, 1994, Thorn, 1993). Детальне вивчення мкць знаходження спещал1зованих субклтшних кальщевих каналов потребуе подальшого вивчення транспорту калыцю у ¡зольованих клггинних органелах. Дослщження Ншотери та шш., (1990) та Мальвхя та iinn., (1994) показали, що йольоваш ядра печшки мають 1ФЗ-чутлив1 кальцш-визволяюч1 канали, а ендоплазматичшш ретикулум з клгаш печппш iuypin мае високоафшш м!сця зв"язування р^анодину. Нещодавно дуже зросла защкавленшсть вченлх до можливосп функцп цАДФ-р1бози (Lee, 1989) як внутр1шньоклшпшого посередника, який виклнкае впхщ кальщю. Показано, що цАДФ-р1боза безпосередньо регулюе поодинога канали р1анодинових рецептор1в нескелетного типу (Meszaros, 1993). Також нещодавш результата на панкреатичних ацинарних клтшах та нейронах продемонстрували, що цАДФ-р1боза е ф13юлопчно важливим модулятором р1анодинових рецептор1в (Ниа, 1994, Thorn, 1994). Результата, представлен! в Haniifi робота вказують на присутшсть цАДФ-pi6o3Hiix та р1анодинових рецептор1в в ядернш оболонщ. Як цАДФ-pi6o3Hi так i 1ФЗ-рецептори в ядр1 можуть робита внесок в формування регулярних кальщевих хвиль, яш розповсюджуються в гепатоцптах у вщповщь на стимулящю агошспв (Thomas, 1991).

16

висновки

1. В результат! екслериментш на лоодиноких ¡зольованих ядрах з клтш печшки мишей було встановлено, що флуоресцентний кальщевий шдикатор Фура2 розподшяеться в ядрах не гомогенно, як вважалось рашше, а зконцентровашш в ядернш оболонщ. Таке розподшешш ствпадае з розподшенням флуоресцентного ендоплазматичного маркера ДЮСб(3).

2. Декстран-зв"язаш флуоресцентш шдикатори кальцш-Грш1-декстран

та Фура2-декстран легко проходять через комплекс ядерних пор та накопичуються у нуклеоплазми

3. В результат! експермменлв з поодинокими ¡зольованими ядрами, навантаженими декстран-зв"язашши флуоресцентними фарбниками, показано, що ядро проникливе для юн1в кальщю. При змшах концентрацн вшьного цитоплазматичного кальщю вщповщно змшюегься концентращя вшьного кальцио в пуклеоплазмь

4. Разом з там ядра накопичують значну кшыасть юшв кальщю. Показано, що АТФ-залежне захоплення зовшшнього кальщю в поодиноких ¡зольованнх ядрах, направлений не в нуклеоплазму, а в ядерну оболонку.

5.Ашнкащя шозитол трисфосфата до поодиноких 1зольованих ядер викликае зниження концентрацц вшьного кальцио в ядернш оболонщ. Ашйкащя цикл1чно1 АДФ-р1бози до поодиноких iзoльoвaниx ядер також викликае зниження концентраци вшьного кальщю в ядернш оболонщ. Таким чином, в ядернш оболонщ ядер з клтш печшки розташоваш функщоналып депо кальщю.

6. Показано, що функцюналышй вихщ юшв кальщю з ядерно! оболошш через 1ФЗ-рецептори спрямовашш в нуклеоплазму. Також

було показано, що функцюнальний вихщ ioHiB кальцпо з ядерно! оболонки через р1анодинов! рецептори при стимулюванш циюпчною АДФ-р1бозою та р1анодином спрямований в нуклеоплазму.

7. Таким чином, ядра мають локальну систему сигнал1заци, яка складаеться з функцюнальних кальщевих депо, розташованих в ядернш оболонц], звадки кальцш викидаеться за допомогою шозитол трисфосфату та цигийчно! АДФ-р1бози через вщповщш рецептори, збшьшуючи тиичасово локальний ргвень юшв кальцда в яд pi, що може мати важливе значения для активаци кальцш-залежних процеив в ядрь

Перелш po6iT, опублжованих за тематикою дисертаци. Gerasimenko O.V., Gerasimenko J.V., Tepikin A.V., and Petersen O.H. ATP-dependent accumulation and inositol triphosphate- or cyclic ADP-ribose-mediated release of Ca2+ from the nuclear envelope. //Cell, 1995, vol. 80, pp 439-444

Gerasimenko O.V., Gerasimenko J.V., Tepikin A.V., and Petersen O.H. Preferential localization of fura-2 fluorescence in isolated liver nuclei in the perinuclear space // Proceedings of the Physiological society, Liverpool Meeting, 1994, p 76P.

Gerasimenko O.V., Gerasimenko J.V., Belan P.V., and Petersen O.H. Inositol trisphosphate and cyclic ADP-ribose-mediated release of Ca2+ from single isolated pancreatic zymogen granules.// Cell, in press

Gerasimenko J.V. Investigation of the Ca2+ transport in isolated liver nuclei.

The dissertation is present in accordance with requirements for the degree of candidate of bioliglcal sciences in the spatiality 03.00.05 -biophysics. A.A.BogomoIetz Institute of Physiology, National Academy of Sciences of Ukraine, Kiev, 1996.

Uptake and release of Ca2+ from isolated liver nuclei were studied with fluorescent probes. We shown with the help of digital imaging and confocal microscopy that the Ca2+-sensitive fluorescence is similar to that of an endoplasmic reticulum marker. The previously demonstrated ATP-dependent uptake of Ca2+ into isolated nuclei and release of the accumulated Ca2+ by inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3) are therefore due to transport of Ca2+ into and out of the nuclear envelope and not the nucleoplasm. Dextrans labeled with fluorescent Ca2+ indicators ( calcium-Green 1 and Fura 2) are distributed uniformly in the nucleoplasm and can be used to show that changes in the external Ca2+ concentration produce rapid changes in the nucleoplasms Ca2+ concentration. Nevertheless, IP3 and cyclic ADP-ribose evoke transient intranuclear Ca2+ elevations. The releas« from the Ca2+ stores in or around the nuclear envelope appears to b< directed into the nucleoplasm from where it can diffuse out through th< permeable nuclear pore complexes.

Герасименко Ю.В. Исследование транспорта ионов кальция i изолированных ядрах из клеток печени мыши.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологически: наук по специальности 03.00.05 -биофизика. Институт физиологии им АА.Богомольца НАН Украины, Киев, 1996 год.

Целью представленной работы было исследовать транспорт ново: кальция в одиночных изолированных ядрах из клеток печеш

мыши с помощью кальций-чувствительных флуоресцентных красителей, используя флуоресцентную и конфокальную микроскопию. Было установлено, что флуоресцентный кальциевый индикатор Фура 2 распределяется в ядрах не гомогенно, а сконцентрирован в ядерной оболочке. Декстран-связанные флуоресцентные индикаторы кальцин-Грин-1декстран и Фура2-декстран легко проходят через ядерные поры и накапливаются в нуклеоплазме. В результате экспериментов с одиночными изолированными ядрами, нагруженными декстран-связанными флуоресцентными красителями, показано, что ядро проницаемо для ионов кальция. При изменениях концентрации свободного цитоплазматического кальция соответственно изменяется концентрация свободного кальция в нуклеоплазме. Вместе с тем ядра накапливают значительное количество ионов кальция. Показано, что АТФ-зависимый захват внешнего кальция в одиночных изолированных ядрах, направлен не в нуклеоплазму, а в ядерную оболочку. Ашгакация инозитол трисфосфата к одиночным изолированным ядрам вызывает снижение концентрации свободного кальция в ядерной оболочке. Апликация циклической АДФ-рибозы к одиночным изолированным ядрам также вызывает снижение концентрации свободного кальция в ядерной оболочке. Таким образом, в ядерной оболочке ядер из клеток печени расположены функциональные депо кальция. Показано, что функциональный выход ионов кальция из ядерной оболочки через 1ФЗ-рецепторы направлен в нуклеоплазму. Также было показано, что функциональный выход ионов кальция из ядерной оболочки через рианодиновые рецепторы при стимуляции циклической АДФ-рибозой и рианодином направлен в нуклеоплазму. Таким образом, ядра имеют

локальную систему сигнализации, состоящей из функциональных кальциевых депо, расположенных в ядерной оболочке, откуда кальций выбрасывается с помощью инозитол трисфосфата и циклической АДФ-рибозы через соответственные рецепторы, увеличивая временно локальный уровень ионов кальция в ядре, что может иметь важное значения для активации кальций-зависимых процессов в ядре.

Ключов1 слова: транспорт кальщю, ядро, Фура 2, шозитол 1,4,5-трисфосфат, цикл1чна АДФ-р1боза.