Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Прижизненное исследование действия рубомицина на делящиеся клетки печени методом контактной люминесцентной микроскопии

ВАК РФ 03.00.17, Цитология

Автореферат диссертации по теме "Прижизненное исследование действия рубомицина на делящиеся клетки печени методом контактной люминесцентной микроскопии"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М. В. ЛОМОНОСОВА Биологический факультет

На прааах рукописи УДК в1в-00в.04-085.332 Рубомации—07:616.36-018.1 -076.4

ХАРЛАМОВА Светлана Борисовна

ПРИЖИЗНЕННОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

ДЕЙСТВИЯ РУБОМИЦИНА НА ДЕЛЯЩИЕСЯ КЛЕТКИ ПЕЧЕНИ МЕТОДОМ КОНТАКТНОЙ ЛЮМИНЕСЦЕНТНОЙ МИКРОСКОПИИ

03.00.17 — цитология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1988

Работа выполнена в Научно-исследовательской институте технология и безопасности лекарственных средств

Работа выполнена без руководителя

Официальные оппоненты:

доктор биологически: наук З.Я.Бродский

кандидат биологических наук Г.Е.Онищенко

Ведущее учреждение - Институт морфологии человека АМН СССР

Защита диссертации состоится "/¿/"л-гг ^к /> ¿-1988 г. в

/

15.30 ч. на заседании специализированного совета Д.053.05.68

в Московской государственном университете по адресу:

119899, Москва, ГСП-3, 3-235, Ленинские горы, МГУ, Биологический

факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке факультета Автореферат разослан " 'У " е / 1988 г.

Ученый секретарь Совета кандидат биологических наук

А.А.Языков

К. r,.::k i>

!. . j. ¡s22ji ТДЗЛ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Противоопухолевый препарат рубошщин относится к группе антрациклиновых антибиотиков, которые широко применяются в клинике. Однако, до сих пор не сложилось единого мнения о том, чем обусловлены противоопухолевая активность и кардио-токсичность этих препаратов, а также возникновение резистентности к ним.

Актуальность решения этих задач определяется тем, что ананке механизмов действия этого класса антибиотиков позволит повысить эффективность антрацикдиновой терапии, поможет в поиске методов и средств снижения их побочного действия, а также в создании hóbhx более эффективных препаратов антрадиклинового ряда*

Изучение действия одного из антрадиклиновых антибиотиков -рубомицина - на делящиеся клетки печени проведено в данной работе в прижизненных условиях дня того, чтобы иметь возможность соотнести закономерности действия препарата на делящиеся клетки млекопитающих in vivo с известными для него молекулярными механизмами. Помимо теоретического интереса, эта проблема шеет и практическое значение. Во-первых, некоторые из антрадиклиновых антибиотиков применяются при лечении рака печени, во-вторых, конкретные представления о влиении этих препаратов на восстановительные процессы в печени и об отдаленных последствиях их воздействия важны для тех клинических случаев, когда антрадивлиновую терапию проводят пациентам с поврежденной печенью, так xas репаративные процессы в органе при этом проходят на фоне воздействия антибиотика.

Птп. » яяпячи исследования. Целью настоящей работы явыось прижизненное исследование методом контактной лшинесцеитной микроскопии дейотвия антрадиклинового антибиотика рубвмицина на

делящиеся клетки регенерирующей печени мышей после частичной ге-патэктомии.

Конкретные научные задачи, поставленные в работе, можно разделить на Методические и собственно исследовательские задачи.

К методически* задачам относятся:

- разработка метода прижизненного исследования клеток печени живого животного с помощью люминесцентного зонда Hoechst 3325В /Ы 33258/ на основе техники контактной люминесцентной микроскопии;

- определение информативности зонда Н 33258 при исследовании клеток печени в норме, при повреждении (cd4) и регенерации после частичной гепатэктомии;

- разработка критериев оценки повреждения популяции гепатоцж-тов регенерирующей печени при воздействии рубомицина.

При исследовании закономерностей воздействия рубомицина на индуцированную пролиферацию в печени в числе основных задач предполагалось:

- выявить различия в действии рубомицина на делящиеся клетки печени при однократном введении антибиотика в разные фазы клеточного цикла гепатоцитов;

- исследовать отдаленные последствия при действии рубомицина на регенерирупцую печень;

- вследствие того, что рубомяцин обладает собственной люминесценцией, предполагалось также выяснить, как происходит накопление антибиотика в нормальной и регенерирующей печени живого животного, и изучить влияние на транспорт рубомицина разобщения окислительного фосфорамровавня.

Натчная новизна результатов. На основе техники контактной люминесцентной микроскопии разработан новый метод, позволяющий исследовать непосредственно в живом животном морфологию гепатоци-

тов и изменение их состояния по проницаемости клеток доя люминесцентного зонда Hoechst 33258, уменьшении степени конденсации хроматина, изменению спектральных характеристик зонда. Определены характерные реакции клетки, обработанной флуорохромом, на неспецифическое повреждение, что позволяет фиксировать начальные стадии патологических процессов в живых клетках неповрежденного функционирующего органа.

Впервые подробно изучено действие противоопухолевого антибиотика рубомицина на делящиеся клетки регенерирующей печени. Выработаны критерии оценки повреждения рубомицином популяции гепато-цитов. На основе этих критериев выявлена различная эффективность антибиотика доя гепатоцитов, находящихся в разных стадиях клеточного цикла. Изучены отдаленные последствия воздействия антибиотика на делящиеся клетки печени.

Исследовано влияние веществ, снижавших токсичность рубомицина - фенобарбитала и экстракта элеутерококка, - на патологические процессы в печени, вызванные рубомщинои.

Впервые проведено изучение накопления и распределения антибиотика в клетках нормальной и регенерирующей печени живого животного, а также изменения этих параметров при разобщении окислительного фосфоршшроаания.

Практическое значение работы. Разработанный метод прижизненного исследования клеток органов и тканей живого организма можно использовать в медицине для срочных гисто- и цитологических анализов, а также непосредственно в процессе хирургической операции путем аппликации зонда на поверхность органа. Кроме того, данный метод полезно использовать в тех научных исследованиях, где необходимо соблюдение прижизненных условий эксперимента.

Критерии оценки эффективности противоопухолевого антибиоти-

ка рубомнцина могут применяться при исследовании действия других препаратов. Обнаруженные различия в эффективности рубомицина при введении его в различные периоды клеточного цикла гепатоцитов могут быть.полезны.для оптимизации применения препарата в клинике.

АпрпЛрптя работы. Результаты работы были доложены на У1 Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Пущино, 1984); на П Всесоюзной межуниверситетской конференции по биологии клетки (Тбилиси, 1965); на П Всесоюзном совещании "Люминесцентный анализ в медицине и биологии и его аппаратурное обеспечение (Рига, 1985); на 2-м рабочем совещании "Прикладная цитохимия хроматина" (Ленинград, 1986), на научных семинарах лаб.биофизических испытаний НИИ технологии и безопасности лекарственных средств, лаб.цитологии Института биологии развития им. Н.Н.Кольцова.

¡¡¡ЙШШ- По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ....

Мш В СТРУКТУРА таОРТН. Диссертация изложена на 172 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуждения подученных результатов, выводов, списка цитированной литературы. Текст иллюстрирован II таблицами и 38 рисунками. Список литературы включает 190 наименования источников.

ЙА.ТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Эксперименты проводились на мышах самцах линии Baib/o массой 15-18 г. Для прижизненного микроскопического исследования мышей наркотизировали уретаноы (I г/кг, внутримышечно), внутрибрю-шнио или внутривенно вводили Н 33258 (ФРГ). Затем вскрывали брюшную стенку и выводили наружу около 2/3 печени; поверхность обнаженного органа орошали подогретым физиологическим раствором (37°С). Ыикроскопирование осуществляли при контакте поверхности органа с

объективом микроскопа.

Работа проводилась на экспериментальном образце контактного люминесцентного микроскопа с телевизионной видеосистемой, который был разработан совместно с Ленинградским оптико-механическим объединением /ЛОМ0/ и ВНИИ телевидения /Ленинград/. Телевизионная видеосистема, сопряженная с микроскопом ЛШАМ-КФ, состоит из высокочувствительной камеры - супервидекона Л15-702, электронных блоков преобразования видеосигнала, черно-белого и цветного видеоконтрольных устройств /ВКУ/ и видеомагнитофона "Электроника".

Исследования проводили при максимуме возбуждения в области 365 нм и максимуме флуоресценции в области 435 нм.

Для внутрибршинного и внутривенного введения использовали следующие дозы флуорохрома Н 33258: 5, 10, 20, 40, 100 мг/кг.

После подбора оптимальной дозы зонда эксперименты проводили с использованием внутрибршинного введения флуорохрома в дозе 10 мг/кг.

Для исследования механизма развития паранекротической реакции клеток печени, выявляемой при окраске их Н 33258, в качестве термического воздействия применяли инкубации изолированной печени в течение 30 мин. при температуре +42°С. Контролем служила только что полированная печень. Для химического воздействия на клетки печени использовали фиксацию ткани раствором этанола /4С#/ путем аппликации его на поверхность органа наркотизированного животного в объеме 2 икл.

Для изучения патологических процессов в печени использовали стандартную модель токсического гепатита, вызванного введением четыре ххлористого углерода /СС14/ в вяде 20% масляного раствора подкожно по 0,2 ил на животное. Второй модельной системой пато-

логин печени служила регенерирующая печень животных с частичной гепатэктомией /ТГЭ/ с удалением 2/3 печени по методу Хиггинса-Андерсона. Операции и введение СС14 проводили с 8 до 10 часов утра.

Ори изучении токсического действия рубомицина /гидрохлорид/ были использованы следующие дозы антибиотика для внутрибршинно-го введения - 2, 4, 6, 8 мг/кг.

В качестве антитоксических веществ применяли экстракт элеутерококка /завод "Санитас"/, который вводили по 0,1 ил на мышь внутрибршинно ежедневно в течение 10 суток, и фенобарбитал, вводимый внутрибршинно ежедневно в течение 3 суток в дозе 80 мг/кг. Контрольная группа животных получала по 0,1 ил физиологического раствора внутрибршинно. ЧГЭ проводили через 2 часа после внутрибро-шинной инъекции рубомицина в дозе 2 мг/кг. При этом животные получали антибиотик через 24 часа после последней инъекции антитоксического вещества. В каждой группе было по 15 животных.

При изучении действия разных доз рубомицина на делящиеся клетки печени антибиотик вводили внутрибршинно за 2 часа до ЧГЭ в дозах 2, 4, 6 к 8 иг/кг. Еечеаь иышей исследовали через 24, 48 часов, на 5, б, 7, 14, 20, 30, 60 и 175 сутки после ЧГЭ.

Подсчет клеток о патологическими ядрами проводили в 20 полях зрения, за поле зрения принимали экран черно-белого ВКУ с размером по диагонали 35 см. Подсчеты клеток проводили при использовании объектива х43 в окуляра х10. Число клеток с патологическши ядрами выражали в процентах к общему числу клеток. Соотношение клеток с разными типами патологии ядер выражали в процентах к общему числу клеток с патологическими ядрами. Все результаты обрабатывай статистически.

При исследовании действия рубомицина на делящиеся клетки пе-

чеки с введением его в разные периоды клеточного цикла использовали внутрибршинное введение антибиотика в дозе 2 мг/кг.

На рис.1 представлена схема эксперимента с однократным введением рубомицина в разные срокл до и после ЧГЭ: в о 0 - за 10 и 5 суток до ЧГЭ, а также за 24, 12 и 6 часов до операции. Действие рубомицина на стимулированные к делению клетки печени изучали при введении антибиотика в переходный период от в 0 к в I (°0—0}). в начале и в конце 0 2 (через 12 и 24 часа после ЧГЭ) и в з -периоде (через 30 часов после ЧГЭ). При определении длительности периодов клеточного цикла гепатоцитов после ЧГЭ руководствовались данными Урываевой и др. /1979/. Контролем в этих экспериментах служило введение рубомицина за 2 часа до ЧГЭ. Фоновый уровень патологии ядер гепатоцитов определяли в группах мышей, которым вместо рубомицина за 2 часа до операции вводили физиологический раствор. Кроме того, контроль патологии ядер гепатоцитов проводился в группах мышей, которым делали ложную операцию с предварительным (за 2 часа) введением рубомицина, а также у интактных животных с введением рубомицина и без него. Мишей исследовали через 48-50 часов после операции, на 4, 7, 14, 20 сутки после ЧГЭ.

ЧГЭ

а 5

Т-1 1 1 111 1 t I

10 сут. 5 сут. 24ч. 12ч.8ч.2ч. 2ч. 12ч. 24ч. Э0ч{

Рис.1. Схема экспериментов с однократным введением рубомицина в дозе 2 мг/кг в разные сроки до и после ЧГЭ.

При исследовании отдаленных последствий действия рубомицина на делящиеся клетки печени проводили вторую ЧГЭ через 100 суток

□осле первой операции. В группе опытных животных первое частичное удаление печени сопроводцалось предварительной инъекцией (за 2 часа) рубомицина в дозе 2 мг/кг. В табл.1 приведена схема этих экспериментов.

Таблица I.

Схема эксперимента со вторичной стимуляцией клеток печени к делению

! * группы! Начало эксперимента .100 суток после начала | эксперимента

I ЧГЭ I + рубомицин ЧГЭ П

П ЧГЭ I + физиологический ЧГЭ П

раствор

ш - ЧГЭ

1У ЧГЭ I + рубомицин -

У Ложная операция -

В каждой группе животных было со 8 мышей. Операции вторичной ЧГЭ проводилась с удалением каудальной доли печени.

Микроскопические исследования печени мышей проводились на 4, 7 и 14 сутки после ЧГЭ П в I-Ш группах и на 105 сутки после начала эксперимента в 17 и У группах животных.

При исследовании накопления рубомицина в нормальной и реге-нерирупцей печени использовали внутрибршшшое и внутривенное введение антибиотика в дозе 10 иг/кг за 2 часа до или через 2 часа после ЧГЭ. 2-4-данитрофенол (ДНФ) наносили на поверхность печени в виде 0,5 мМ раствора в фосфатном буфере.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

При разработке методики прижизненного исследования печени мышей о использованием лшинесценткого ДНК-тропного зонда Hoechst 33258 (Н 33258) была подобрана оптимальная доза зонда для внутри-

брюшинного введения, которая не оказывала токсического влияния на восстановительные процессы в печени. При этом можно было видеть ядра гепатоцитов, лшинесцирувдие в синей области, и границы клеток, где наблвдалась дискретная желтая люминесценция, обусловленная, видимо, свечением желчных кислот, секретируемых гепатоцитами. Кроме того, применение Н 33258 позволяло регистрировать жировую дистрофию цитоплазмы гепатоцитов, некрозы и митозы гепатоцитов при повреждении печени после введения СС1^ или ЧГЭ. Дальнейшая работа показала, что в применении к исследованию клеток живого животного зонд Н 33258 нельзя рассматривать только как люминесцентный краситель для выявления морфологической структуры. Информативность зонда для живых клеток гораздо шире. Так, с его помощью можно фиксировать изменения проницаемости клеток. Вии выявлены также реакции гепатоцитов на неспецифическое повреждение при механическом, термическом и химическом воздействиях, которые заключались в увеличении скорости накопления Н 33258, уменьшении числа видимых хромоцеятров в ядре, связанном, видимо, с деконден-сацией хроматина, выявлении в ядре ядрышка и темно-зеленого свечения в цитоплазме, что обусловлено, скорее всего, дополнительным связыванием зонда с РНК, смещении спектра люминесценции Н 33258 в ядре в длинноволновую область.

Таким образом, применение метода контактной люминесцентной микроскопии с использованием лгминесцентного зонда Н 33258 позволяет прижизненно в короткие сроки исследовать морфологическую структуру печени, фиксировать изменения проницаемости клеток и начальные патологические процессы. Поэтому метод контактной лю->минесцентной микроскопии в данной модификации может быть чрезвычайно удобным и информативным при срочных гисто- и цитологических исследованиях в клинике.

Минимальная токсичность зонда в используемых концентрациях

позволяет применять исследования такого рода прямо в процессе хирургической операции путем аппликации зонда на поверхность органа или ткани, тем более, что хирургический вариант контактного микроскопа ухе разработан (Барский и др., 1979).

Для исследования патологических процессов, протекающих в регенерируицей печени мышей под действием рубомицина, первоначально были проведены эксперименты по влиянию разных доз рубомицина на продолжительность жизни мышей с частичной резекцией печени, данные которых показали, что постепенное увеличение дозы рубомицина (от 4 до 8 иг/кг) последовательно снижает продолжительность жизни животных. Максимально переносимая доза рубомицина, при которой кайладалась незначительная, сравнимая с контролем смертность животных после ЧГЭ, составляла 2 мг/кг. Эта доза была использована при проведении длительных экспериментов по исследованию динамики накопления в регенерируицей печени клеток с ядерными патологиями.

При однократном введении рубомицина в любой из используемых доз (от I до 8 мг/кг) за 2 часа до ЧГЭ наблюдали полное подавление митозов в печени через 48-50 часов после операции, тогда как в контроле в это время проходили деления.гепатоцитов.

Первые митозы во всех группах мышей, которым вводили рубо-мицин га 2 часа до ЧГЭ, наблвдади на 5-6 сутки после операции, причем митозы в основном были представлены патологическими формами: митозы с хромосомными мостами, отставанием хромосом, трехпо-люсные, многоподдсные и асимметрические митозы, сопровождающиеся отставанием хромосом и хроиосокными мостами. Б печени контрольных животных, которым ямеото рубомицина вводили физиологический раствор, патологических ыитовов практически не встречалось.

Аномалыше матовы приводили к появлению гепатоцитов с патологически измененными ядрами. Начиная с 7 суток после операции

в популяция гепатоцятов выявлялось большое количество клеток с ядерными нарушениями. В ооновном это были ядра с микроядрами, парные ядра с хромосомными мостами, неразошедшиеся в процессе деления удлиненные ядра, ядра неправильной формы и ядра, вытянутые на одном из полюсов, которые были названы "поляризованными1' ядрами. С увеличением дозы рубомицина возрастало число клеток с патологическими ядрами в среднем от 12-15% для дозы 2 кг/кг до 2530? для доз 4 и 6 мг/кг. Кроме того, увеличение дозы антибиотика сопровождалось появлением качественно иных патологий ядер. Так, если для дозы 2 мг/кг характерны патологии ядер, обусловленные фратаентацией хромосом /си. схему на ряс. 2/, в основном ядра с хромосомными мостами я микроядрамж, то для больших доз антибиотика /4 'и 6 мг/кг/ можно отметить появление более тяжелых ядерных аномалий, связанных с двумя патологическими процессами - фрагментацией хромосом и нарушениями мхтотического аппарата клетка: поляризованные ядра и ядра неправильной формы.

В дальнейшем при оценке степени повреждения популяции гепа-тоцитов были использованы 2 критерия - количественный /по содержанию клеток с патологическими ядрамд/ и качественный /по характеристика типов патологии ядер/.

В результате этих экспериментов было выяснено, что длительность периода задержки митозов не зависит от дозы рубомицина. Этот эффект антибиотика был назвав цитостатическим аффектом. Другой аспект действия препарата, связанный о патологическшн изменениями ядер гепатоцитов был назван эффектом ицдукца патологических ядер гепатоцитов. Увеличение дозы рубомицина оказывалось в возрастании этого аффекта антибяотика.

При использовании дозы рубомицина 2 мг/кг удалось проследить динамику патологии одер гепатоцитов на протяжении полугода после операции ЧГЭ. Было обнаружено, что через 1-2 месяца морфология

ядер возвращается к норме. Закономерно возникает вопрос, каким образом проходит этот процесс?

метафаза анаша

о

нормалшй митоз о

отставай® поноса* и а фрагментов в мета-, ми ана- и телофазе Л о ©

и0мзс0мшб ИХШ мм а

отставая« хромосом и и *раше№- тов Л оьразэванл: ..... хромосомшх мое-тов 2 8

»сшютгасмв митоз с отставай«! хромосом и хромо- сомкши юстами а с

два дллокпы ядра

ядер

ядра с воюсомшм мостом

¡ычзоешееся в адЖню^ядао1

"вшрюованное" ядро

тршаьосшя ил-

Кз О ОТСТАВАЯ*- I. Ш ПОЮС0М И

ишххшшш

постами

шяоашшЯ нл-

103 с отшванш!

хгсмхом и хрою- ^

сомшы постами .

л е>

и

ТРШООАСТЮЕ Я№0

ядро ншравшьной 40 рл

»-ОЬРАЗЬЯ

миюз

ядро непрлз.выюй «ш

Рис.2. Схема наблюдаемых патологических ядер и соответствующих им патологий митозов.

Для того, чтобы ответить на этот вопрос, был поставлен эксперимент с двойной стимуляцией пролиферации гепатоцитов с помощью двух операций ЧГЭ, разделенных значительным промежутком времени (100 сут.), о тем, чтобы в печени животных, подвергшихся воздействие рубомицнна перед первой операцией ЧГЭ, восстановилась нормальная морфологическая картина.

Результаты эксперимента показали, что в печени мышей, которым вводили рубомицин перед первой операцией ЧГЭ, после вторичной операции появлялось значительное количество клеток с ядерными нарушениями. Это указывает на то, что элиминации поврежденных клеток не происходит, и генетически дефектные клетки с нормальной морфологией в течение длительного времени сохраняются в популяции. Нормализация же морфологии ядер, ввдимо, может проходить двумя путями: объединением экстраядерного хромосомного материала с основным геномом при прохождении нового репродуктивного цикла, либо резорбцией экстраядерного хромосомного материала.

Введение рубомицина в разные сроки до операции ЧГЭ позволило выявить изменение эффективности антибиотика в зависимости от интервала между инъекцией препарата и ЧГЭ. Был найден интервал, в котором можно было разделить два эффекта антибиотика - цитостати-ческий эффект и эффект индукции патологических ядер гепатоцитов. Этот интервал составлял около 8 часов до операции. При увеличении его цитостатический эффект исчезал, при сокращении - вновь наблюдалось блокирование делений гепатоцитов. Исходя из этого было сделано предположение, что цитостатический эффект исчезает в результате выведения основной массы антибиотика из клеток. Для эффекта индукции патологических ядер гепатоцитов наблюдалась другая зависимость (рис.3).

Увеличение интервала меаду введением рубомицина и ЧГЭ от 2 до 8 и 12 часов вызывало возрастание этого эффекта. При дальнейшем увеличении интервала наблюдалось снижение эффекта индукции патологических ядер гепатоцитов, которое обусловлено, видимо, репаратив-ными процессами, проходящими в этот период.

Увеличение тяжести повреждения популяции гепатоцитов при увеличении срока экспозиции препарата от 2 до 8 и 12 часов до ЧГЭ свидетельствует, видимо, о той, что собственно операция резекции

печени приводит к остановке не только репаративных процессов, но и к прекращению развития повреждающего действия антибиотика.

гвпатошты с патмо-гпесхаи едраия X

10 S суток суток

гвпатоциты с патодо-гпасш! <црам1 i

Врвия до ЧГЭ

10 суток

Вршж до ЧГЭ

Рис.3. Содержание гепатоцитов с патологическими ядрами в регенерируицей печени мышей при введении рубомицшш в разные сроки до ЧГЭ; ае на 4-е сутки после ЧГЭ; б) на 7-е сутки (I), на 14-е сутки (2), на 20-е сутки (3) после ЧГЭ.

При исследовании действия рубомицина на стимулированные к делению гепатоциты были выбраны фазы цикла, оказавшиеся по литературным дянннм наиболее чувствительными к воздействию антибиотика - начало и конец G j и начало 2 периодов (Supino , 1977).

Результаты экспериментов показали, что при введении рубомицина в атих периодах клеточного цикла гепатоцитов эффективность антибиотика значительно ослабляется. Исчезал цитостатичаский эффект, число гепатоцитов с патологическими ядрами в опытных группах составляло на 7 сутки лишь 2-3Í по сравнению с 20-221 в контроле

/введение рубомицина за 2 часа до ЧГЭ/. На 14 сутки уровень патологии ядер гепатооитов практически не изменялся. Такое хе уменьшение эффективности рубомицина наблюдалось и при введении его через 2 часа после ЧГЭ.

Для объяснения полученных фактов мохно предположить, что в клетках печени, стимулированных к делению, проходят процессы, в результате которых ситуация в клетке изменяется настолько, что: I/ рубомицщ на проникает внутрь клетки; 2/ рубомицхн проникает в клетку| до бистро инактивируется и поэтому не влияет на те сис-текй, которые яащзтся мишенью его действия; 3/ в клетке в этот рвряод отсутствует условия, необходимые для проявления действия едтдаЗиота,

Для того, чтобы проверить первое предположение, было проведено исследование транспорта рубоыицина в клетках нормальной я регенерирующей печени. Было обнаружено, что в регенерирупцей печени происходит накопление антибиотика, однако, этот процесс проходит иначе, чем в норме. В нормальной печени наблюдалось мозаичное распределение препарата с концентрацией сначала в першортальннх, а затем в центролобулярных областях. В регенерирующей печени вскоре после инъекции рубошцин равномерно распределялся по всем отделам долек печени. Разобщение окислительного фосфоржлирования с помощью ДНФ в нормальной печени вызывало резкое увеличение накопления рубо-мхцина, что свидетельствует об энергетически ааввсшом транспорте рубомицина из клеток.. Кроме того, при этом проиоходвю изменение внутриклеточного распределения рубомицина - дв$фузная цхтошазыатх-ческая локализация рубомицина сменялась концентрацией его в цкгоола-зматическжх околоядерных везикулах, видвю, лжзосомального прою-хожденкн. В регенерирующей печева при деХотвш ДЕ№ таких аффектов не наблюдалось, что, очевидно, обусловлено удтраотрухтурнюи *з-ыенешгамх гепатоцитов, проходили« при стжмудяцжж же х делению.

Второй вариант предполагает большую по сравнению с нормой активацию системы детоксификации и выведения антибиотика из клетки. Однако, имеются данные клиницистов о возрастании токсичности антра-циклиновых антибиотиков у пациентов с заболеваниями печени, что является следствием замедления процессов биотрансформации антибиотиков ( chao et al. , 1980).

Наши эксперименты также указывают на то, что процессы инактивации рубомицина в регенерирующей печени замедляются. Из опытов с предварительным введением рубомицина можно сделать вывод о том, что реакция его инактивации в нормальной печени проходит достаточно быстро, так как цитостатический эффект рубомицина исчезает уже через 8 часов его присутствия в организме животного с неповрежденной печенью.

При сокращении этого интервала до 2 часов система детоксификации не успевает переработать рубомицин до момента операции ЧГЭ, и в этом случае наблюдаются оба эффекта препарата - и цитостатический аффект, и эффект индукции патологических ядер гопатоцитов.

Очевидно, уже в первые часы после ЧГЭ в клетках печени проходят такие изменения, которые не активируют, а наоборот, тормозят процессы биотрансформации рубомицина. Электронно-микроскопические исследования подтверадают это.предположение ( Jordan ( 1964; viragh, Bartok , 1966). Так, уже в первые часы после ЧГЭ в цитоплазме гепатоцитов наблюдаются ультра структурные изменения, среди которых важное место занимает фратентация эндоплазма отческого ре-тикулума. Имеются данные об уменьшении активности ферментных систем, локализованных в гладком эндоплазматическом ретикулуме, которые участвуют в биотраноформации ксенобиотиков (Арчаков, 1975).

Полученные результаты приводят к выводу о том, что нормально функционирующая система метаболизма необходима как для проявления действия рубомицина, так и для его инактивации. Это противоречие

можно разрешить исходя из данных по метаболизму рубомицинаV/tzO, в результате которого может происходить восстановление хиноновых груш хромофора антибиотика и образование высокоактивных суперок-сидншс анионов, которые действуют по свободно-радикальному механизму. Эта реакция катализируется НАДФН-цитохром-Р-450-редуктазой, которая локализуется в гладком зндоплазматическом ретикулуме, а также в ядерной и митохондриальной мембранах (Baohur et ai., 1982; Bachur, 1982; Trush et al., 1982).

Предполагают, что именно свободные радикалы вызывают разрыш в ДНК ( Baohur et ai„ 1977). Исходя из наших данных, можно также сделать вывод о зависимости эффекта индукции патологических ядер гепатоцитов от свободно-радикальных метаболитов антибиотика. Подтверждением этих предположений служат результаты, полученные в опытах с предварительным введением фенобарбитала.

При исследовании процесса индукции патологических ядер гепатоцитов под действием рубомицина при предварительном введении фенобарбитала было установлено уменьшение эффективности антибиотика по этому критерию. Цитостатический эффект препарата при этом не изменялся.

Результаты этих экспериментов находятся в полном. соответствии с данными экспериментов ill vitro ( Schwartz, Paul f 1984). Так, если фенобарбитал изменяет метаболизм в сторону уменьшения свободно-радикальных соединений рубомицина, как показано в этой работе, это должно сказаться на уменьшении числа разрывов в ДНК, а соответственно, ори делении клеток печени, - в появлении меньшего числа гепатоцитов с патологическими ядрами, что и наблвдалось при предварительном введении фенобарбитала.

Эксперименты с предварительной обработкой животных экстрактом элеутерококка, также снижающим токсичность рубомицина, пока-, зали, что в этом случае ситуация более сложная. Действие экстрак-

та зависит от его состава.

Таким образом, некоторые экспериментальные данные свидетельствует в пользу свободно-радикального механизма аффекта индукции патологических ядер гепатоцитов.

Что касается цитостагического эффекта рубомицина (эффекта блокирования деления гепатоцитов), то создается впечатление, что этот эффект действия рубомицина не связан с эффектом индукции патологических ядер гепатоцитов. В пользу этого предположения говорят следупцие факты: постоянство времени задержки делений гепатоцитов при увеличении эффекта индукции патологических ядер в опытах с использованием возрастающих доз антибиотика; исчезновение цитостатического эффекта и увеличение эффекта индукции патологических ядер гепатоцитов при увеличении интервала меяду введением рубомицина и ЧГЭ от 2 до 8 и 12 часов.

Отсутствие корреляции меаду двумя аспектами действия антибиотика привело к предположению о том, что они обусловлены разными механизмами действия. Наиболее вероятным объяснением цитостатического эффекта представляется подавление репликации и транскрипции при интеркаляции антибиотика в ДНК. В экспериментах in vitro показано блокирование ДНК-зависимых синтезов в присутствии рубомицина, которое прекращается при удалении его из среды (см.Гаузе, Дудник, 1987).

Исследования по изучению интеркаляции антрациклинов в ДНК свидетельствуют о том, что встраиваются неметаболизированные молекулы и C-I3 производные рубомицина, для которых не.характерна индукция свободно-радикальных реакций (Баранов и др., 1984). Поэтому этот процесс может быть независим от процессов действия на ДНК свободно-радикальных метаболитов антибиотиков либо индуцированных ими свободно-радикальных соединений.

Изучением процессов накопления рубомицина в интактной пече-

ни было установлено, что антибиотик постепенно исчезает из цитоплазмы гепатоцитов. Изходя из этого, можно думать, что исчезновение цитостатического эффекта через 8 часов после введения рубоми-цина в меньшей дозе /2 мг/кг/ животным с нормально функционирующей печенью обусловлено выведением рубомицина из органа.

Существует мнение, что интеркаляция антрациклинов - процесс обратимый, и может иметь место постепенное высвобождение встроенных молекул антибиотика (Schwartz, 19ВЗ). Возможно, это происходит при удалении основной массы рубомицина из цитоплазмы гепатоцитов, что приводит к включению процесса подготовки клетки к делению.

Сложнее объяснить отсутствие цитостатического эдаекта при введении рубомицина после ЧГа, так как при этом происходит накопление антибиотика в гепатоцитах. Хроме того, в этот период, как уже упоминалось, тормозятся и процессы инактивации антибиотика за счет снижения активности системы метаболизма рубомицина.

Можно предположить, что в регенерирующей печени нарушены процессы встраивания антибиотика в молекулу ДНд. Конкретные данные по этому вопросу неизвестны, поэтому эта проблема требует дальнейших исследований.

В заключение хотелось бы отметить, что прижизненные исследования методом контактной люминесцентной микроскопии позволили выявить не только последствия действия противоопухолевого антибиотика на делящиеся клетки, но и сравнить изменения его эффективности с изменением распределения в клетках печени. Развитже этого метода в техническом отношении, а также в плане расширения исследовательских задач может значительно обогатить наши представления о закономерностях многих физиологических процессов, проходящих & клетках живого организма.

3 и в о д ы

I. На основе техники контактной люминесцентной микроскопии разработан метод, позволяющий непосредственно в живом животном в едином эксперименте исследовать морфологию гепатоцитов и изменение их состояния по проницаемости клеток для люминесцентного зонда ноес!^ 33258, уменьшении степени конденсации хроматина, изменению спектральных характеристик зовда в комплексе с ДНК, выявлению РНК-с одержат их структур клетки. Характерные признали реакции клетки на неспецвдическое повреждение можно использовать для выявления данным методом начальных патологических процессов в клетках, находящихся в составе функционирующего органа. Минимальная токсичность зовда в используемых концентрациях позволяет применять метод в медицинской практике непосредственно в процессе хирургической операции.

2. При использовании данного метода было установлено, что рубомицин оказывает два различных эффекта на клетки регенерирующей печени - цитостатический эффект и эффект индукции патологических ядер гепатоцитов. Эффект индукции патологических ядер ге-патоцитов зависит, видимо, от системы биотрансформации антибиотика в клетке. Цитостатический эффект не связан с эффектом индукции патологических .ядер гепатоцитов.

3. Разработаны критерии оценки поВреждения популяции гепатоцитов регенерирующей печени под действием рубомицина по количеству клеток с патологическими ядрами и характеристике типов патологии ядер. При этом наиболее значительные патологические изменения в ядрах обусловлены двумя процессами - фрагментацией хромосом и нарушением функционирования ыитотического аппарата.

4. Морфология патологических ядер гепатоцитов, подвергшихся действию рубомицина, через 1-2 месяца после частичной гепатэкто-ыии возвращается к норме. Однако, прохождение нового репродуктивного цикла при повторной частичной резекции печени сопровождается появлением значительного количества клеток с патологическими ядрами, что свидетельствует о сохранении в популяции генетически дефектных клеток.

5. Воздействие на клетки регенерирующей печени наиболее выражено при введении антибиотика в интервале 2-8 часов до операции частичной гепатэктомии. При увеличении этого интервала происходит исчезновение цитостатического эффекта и постепенное уменьшение эффекта индукции патологических ядер гепатоцитов.

6. Действие рубомицина значительно ослабляется при введения его животным, клетки печени которых уже стимулированы к пролиферации. При этом исчезает цнтостатяческий эффект и резко уменьша-шается эффект индукции патологических ядер гепатоцитов, что связано, видимо, с процессами перестройки, происходящими в клетках при подготовке к делению.

7. Предварительная обработка животных фенобарбиталом, снижающим токсичность рубомицина, не оказывает действия на цнтостатяческий эффект, но в то же время снижает эффект индукции патологических ядер гепатоцитов. Изменения эффективности рубомицина могут быть обусловлены сдвигом метаболизма рубомицина в сторону образования производных антибиотика,не обладавших свободно-радикальными свойствами.

8. Обнаружена мозаичность в распределения рубомицина в нормальной печени живого животного, а также возрастание содержания антибиотика в клетках при разобщения окислительного фосфорклиро-

вания при действии ДНФ, что может свидетельствовать об энергетически зависимом процессе выведения рубомицина из клетки. Кроме этого, действие ДНФ вызывает изменение внутриклеточного распределения люминесценции антибиотика в клетках нормальной печени. В печени животных после частичной гепатэктомии этих эффектов не наблвдается.

СПЯЗОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Дмитревская Т.В., Харламова С.В., Иванов Л.С., Барен-бойм P.U. Контактная лшинесцентная микроскопия в прижизненных исследованиях репаративной способности печени животных. -Хим.-фарм.ж., 1984, * 3, с. 287-290.

2. Харламова C.B., Дмитревская Т.В. Прижизненное исследование ядер геоатощпов методом контактной флуоресцентной телевизионной микроскопии. Действие рубомицина С на индуцированную пролиферацию. - В кн.: Структура и функции клеточного ядра, Пущино, 1984, - с. 35.

3.Дмитревская Т.В., Харламова С.Б., Данилов В.А., Барен-бойм Г.М. Контактный телевизионный микроскоп для прижизненных исследований клеточных популяций на животных. - В кн.: Люминесцентный анализ в медицине и биологии и его аппаратурное обеспечение. - Рига, 1985, - с. 235-236.

4. Харламова С.Б. Появление и поддержание в популяции гепатоцнтов аномальных ядер после действия противоопухолевого антибиотика. Прижизненное исследование. - В кн.: Сборник тезисов II Всесоюзной межуниверситетской конференции по биологии клетки, - Тбилиси, 1985, - с. 723-724.