Исследование структуры и свойств мембранных рецепторов

Будяк, Иван Леонидович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование структуры и свойств мембранных рецепторов
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование структуры и свойств мембранных рецепторов"

на правах рукописи УДК 577.3

ЕУДЯК ИВАН ЛЕОНИДОВИЧ

Исследование структуры и свойств мембранных рецепторов: рецептора фактора роста эпидермиса человека и галобактернального трансдьюсера

03.00.02 - биофизика

автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата физико-математических наук

Москва 2006

Работа выполнена в Московском физико-техническом институте (Государственном университете), Институте структурной биологии Исследовательского центра г. Юлнха (Германия) и Университете г. Питтсбурга (США).

Научный руководитель: Горделий Валентин Иванович, кандидат физико-математических наук

Официальные оппоненты: Киреев Виктор Борисович, кандидат физико-математических наук Чупии Владимир Викторович, доктор химических наук

Ведущая организация:

Институт физико-химической биологии (ИФХЕ) им. А.Н. Белозерского МГУ (г. Москва)

Зашита состоится 20 декабря 2006 г. в 10 час. 00 мин. на заседании диссертационного совета К 212.156.03 при Московском физико-техническом институте (141700, Московская обл., г. Долгопрудный, Институтский пер. 9, МФТИ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МФТИ. Автореферат разослан «15» ноября 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат физико-математических наук В.Е. Братин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Все живые организмы состоят из клеток. Жизнь каждой клетки происходит в тесном взаимодействии с другими клетками и окружающей средой. Это взаимодействие немыслимо без поступления сигналов извне, их передачи, обработки и соответствующей реакции. Таким образом, системы передачи и обработки сигналов в клетке являются одной из важнейших областей исследований современной биологии,

В данной работе были изучены два белка: галобактериальный трансдыосер 2 (Гтр2) из Natronobacterium pharaonis и рецептор фактора роста эпидермнса (РФРЭ) из Homo sapiens. Оба эти белка отвечают за трансмембранную передачу сигнала и выполняют важные функции в клетке. Нас интересовали характерные особенности устройства этих систем, возможность выделить некоторые черты и закономерности, присущие им обоим.

N.pharaonis относится к царству Архебактерий и является типичным экстремальным галофилом, предпочитая для обитания водоемы с высоким содержанием неорганических солей. При недостатке питательных веществ и кислорода N.pharaonis осуществляет фотозависимый синтез АТФ, при избытке — старается избегать освещбнных участков из-за риска фотоокисления ДНК ультрафиолетом. Для этого клеткой синтезируются сенсорный родопсин 2 (СР2) и Г1р2, образующие в мембране комплекс со стехиометрией 2:2 (Gordeliy et al., 2002). После возбуждения СР2 квантом света рецептор претерпевает конформационные изменения, которые затем передаются на Гтр2 (Moukhametzianov et al., 2006). Траисдьюсер модулирует активность цепи киназ, в конечном счёте определяющих частоту переключений флагеллярного мотора, что, в свою очередь, влияет на направление движения клетки таким образом, чтобы она оставалась преимущественно в затенённых областях.

Гтр2 представляет собой 2 трансмембранные спирали и относительно большой цитоплазматический домен (Гтр2-цит), Белок имеет высокую степень гомологии с эубактериальными хеморецепторами, что говорит об их функциональном и эволюционном родстве (Le Moual and Koshland, Jr., 1996). Структуры и механизм взаимодействия СР2 и Гтр2 в мембранной области уже известны, однако детали передачи сигнала цитоплазматическим доменом до конца не ясны. Таким образом, цитоплазматический домен Гтр2 является недостающим звеном в понимании работы системы отрицательного фототаксиса в N.pharaonis, Поэтому первая часть работы была посвящена структурной характеризациа Гтр2-цит и исследованию фолдинга этой части Гтр2.

РФРЭ человека играет важнейшую роль в жизни клетки и организма. Белок состоит из трех основных доменов: внеклеточного, ответственного за связывание с лигаидом, трансмембранного и внутриклеточного, имеющего в своем составе тирозин-кинаэу. Связывание лиганда с внеклеточным доменом РФРЭ активирует киназу, запускающую многочисленные сигнальные пути. Отклонения от нормального функционирования грозят глубокими нарушениями в работе клетки вплоть до её злокачественного перерождения (Jorissen et а]., 2003).

Структуры внеклеточного домена РФРЭ и тирозин-киназы известны (Ogiso et al., 2002; Garrett et al., 2002; Stamos et al., 2002). Тем не менее, роль трансмембранного домена остается непонятной: он может быть как пассивным мембранным «якорем», так и активно участвовать в передаче сигнала. Прилегающая к мембране (примембранная) и богатая основными аминокислотными остатками область, следующая непосредственно за трансмембранным доменом РФРЭ, как было недавно показано, имеет важное функциональное значение. Не ясно, однако, какую роль эта область играет в передаче сигнала. Вторая часть данной работы была посвящена исследованию трансмембранной и

прилегающей к мембране областям РФРЭ (тмп-РФРЭ). Также были частично изучены внеклеточный и внутриклеточный домены РФРЭ.

Цели и задачи

Целями части настоящей работы, посвященной Гтр2-цнт, были:

(1) создание экспресснонных плазмидных конструкций, разработка системы экспрессии и очистки Гтр2-цит;

(2) всестороннее исследование биофизических свойств, особенностей фолдинга и внутримолекулярной динамики белка, его способности к олигомеризации при разных условиях;

(3) определение структурных параметров Ггр2-цит. Задачи части работы, посвященной РФРЭ, заключались в:

(1) создании экспрессионных плазмидных конструкций, разработке систем экспрессии внеклеточного, внутриклеточного доменов РФРЭ и тмп-РФРЭ и очистки внутриклеточного и тмп-РФРЭ;

(2) конформационном и структурном анализе тмп-РФРЭ при разных физико-химических условиях.

Научная новизна

В ходе работы были исследованы Гтр2-цит из N.pharaonis и различные домены РФРЭ человека. Основные результаты с точки зрения научной новизны приведены ниже.

Впервые был получен, очищен и исследован при различных физико-химических условиях Гтр2-щп\ С помощью кругового дихроизма (КД), ядерного магнитного резонанса (ЯМР), инфракрасной (ИК) Фурье-спектроскопии детально изучена конформационная динамика в белке в зависимости от состава растворителя. В работе показано, что в разбавленных водных растворах Гтр2-цит имеет высокую конформационную подвижность; при этом некоторые соли и спирты способны стабилизировать и/или индуцировать заметные количества а-спиральных элементов вторичной структуры. С помощью мзлоуглового рассеяния нейтронов (МУРН) определены форма и размеры Гтр2-цнт. Вместе о аналитической гель-фильтрационной хроматографией (АГФХ) и кросс-лн нкингом это позволило также исследовать способность Гтр2-цит к олигомеризации и агрегации. На основании полученных данных по аналогии с системами хемотаксиса в Escherichia coli и Salmonella typhimurium предложена модель передачи сигнала в системе фототаксиса экстремальных галофилов, подразумевающая модуляцию рецептором конформационной динамики Гтр2-цит.

Осуществлена экспрессия внеклеточного домена РФРЭ человека в клетках линии COS-1 из Cercopithecus aethlops, а также экспрессия внутриклеточного домена этого белка в клетках линии COS-1 и E.coli.

Тмп-РФРЭ был впервые получен рекомбинантным путем. Для этой конструкции были подобраны оптимальные условия экспрессии в E.coli и последующей очистки. С помощью КД исследовано содержание элементов вторичной структуры в белке в зависимости от окружения. Методом ЯМР показаны переходы в третичной структуре тмп-РФРЭ в мицеллах детергентов разных типов. Также методом кросс-линкнига определено олигомерное состояние тмп-РФРЭ и его способность к агрегации в детергентах и липидиом окружении.

Значение работы

Результаты работы могут быть использованы в практике научных исследований по трансмембрашюй передаче сигнала и роли динамических свойств всего белка или его отдельных областей в этом процессе.

Апробация работы

Основные положения работы и её отдельные результаты были представлены на 2-й международной конференции по проблемам биологического языка (2nd Biological Language Conference, 18-19.11.2004, г. Питтсбург, США), 49-й международной ежегодной конференции биофизического общества (49m Annual Biophysical Society Meeting, 1216.02.2005, г. Лонг Бич, США), международном симпозиуме центра нейтронных исследований г. Юлиха и встрече европейских пользователей (Jülich Centre for Neutron Science (JCNS) Symposium and European User Meeting, 16-17.02.2006, г. Юлих, Германия), 50-й международной ежегодной конференции биофизического общества (50th Annual Biophysical Society Meeting, 18-22.02.2006, г. Солт Лейк Сити, США) и на 20-м международном ежегодном симпозиуме белкового общества (20th Annual Symposium of The Protein Society, 5-9.08.2006, г. Сан Диего, США), а также на семинарах факультета клеточной биологии исследовательского института Scripps (18.02.2005, г. Jla Хойя, США), кафедры молекулярной физики МФТИ (09.06.2006, г. Москва), лаборатории струюуры и функции мембран ИФХБ им. А.Н. Белозерского (13.06.2006, г. Москва), факультета биохимии и молекулярной биологии университета Массачусетса (10.08.2006, г. Амхерсх, США),

Публикации

За время работы над диссертацией опубликована одна статья в реферируемом журнале.

Объём и структура диссертации

Работа изложена на 120 страницах, иллюстрирована 45 рисунками и содержит 4 таблицы. Диссертация состоит из введения и четырёх глав, включая обзор литературы. Список цитированной литературы содержит 140 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Первая глава

Первая глава содержит критический обзор современной литературы, посвященный следующим темам:

классификация клепочных рецепторов, про- и эукариотические рецепторы класса I; система отрицательного фототаксиса в N.pharaonls-, СР2 и Гтр2; хемотаксис в Е.соИ и S.typhymurium: аспартатиый и сериновый рецепторы; современные представления о механизмах передачи сигнала в системах фото- и хемотаксиса;

физиология и структура РФРЭ человека;

современные представления о механизмах передачи сигнала РФРЭ человека.

Роль клеточных рецепторов обычно играют мембранные белки. Типичный рецептор имеет внеклеточный домен, связывающий лиганд(ы), трансмембранный домен и внутриклеточный (цитоплазматнческий) домен, служащий для передачи сигнала внутрь клетки. Как правило, в цитоплазматическом домене либо находятся сайты связывания киназ, либо он сам обладает киназной активностью. Было показано, что рецепторы подразделяются на 3 класса в зависимости от наличия или отсутствия двух пар т.н. «инделов» (англ. indel, от insertion/deletion-) размером 14 а.о, (4 оборота а-спирапи). Рецепторы класса I представляют собой мембранные белки с одной или двумя трансмембранными спиралями, функионнрующие в виде димеров (Heldin, 1995; Stock, 1996). У прокариот эти белки ответственны преимущественно за хемотаксис (Szurmant and Ordal, 2004). У эукариот рецепторы класса I выполняют куда более разнообразные

функции. Так, например, более 40% человеческих белков-рецепторов относятся к классу I, среди них иитегрины и рецепторы цитокинов, ннсулиповый рецептор, РФРЭ. Большинство названных белков имеет огромное медицинское значение, являясь ключевыми звеньями во многих заболеваниях, например, диабете, раке и иейродегеиеративных болезнях. Кроме того, многие рецепторы служат первичными мишеиями для вирусных инфекций человека и животных.

Отрицательный фототаксис в N.pftaraonis регулируется системой СР2-Гтр2 (HofF et al., 1997). СР2 состоит из 7 трансмембранных спиралей и несёт ковалентно присоединённый через основание Шиффа хромофор, ретиналь. После поглощения кванта света определённой частоты ретиналь изомеризуется, а СР2 претерпевает ряд последовательных и циклических конформацнонных изменений, называемый фотоциклом. Гтр2 относится к рецепторам класса I и имеет длину 534 а.о., состоит из 2 трансмембранных спиралей и относительно большого цитогщаэматического домена с участком связывания гастндин-кннэз и ограничивающими его сайтами метилирования. Трансдьюсер образует комплекс с СР2 со стехиометрией 2:2 в основном через взаимодействия Ван-дер-Ваальса в мембранной области (Gordeliy et al., 2002). В сигнальной конформации рецептор определённым образом взаимодействует с прилежащей областью трансдьюсера (Moukhametzianov et al., 2006), который затем активирует каскад книаз. Таким образом, система фототаксиса СР2-Гтр2 в N.pharaonis принципиально не отличается от эубактериальных систем хемотаксиса: роль лигаида выполняет свет, а роль внеклеточного домена — СР2, передающий конформационные изменения на трансдьюсер. Однако механизм передачи сигнала и характер конформацнонных изменений в цитоплазматической области Гтр2 до сих пор неизвестны.

На данный момент предложено несколько моделей передачи сигнала в системах бактериального хемотаксиса, которые можно условно разделить на 2 группы. К первой группе относятся механистические модели (Mllburn et al., 1991; Lynch and Koshland, Jr., 1992; Chervitz and Falke, 1996; Yeh et al., 1996; Cochran and Kim, 1996; Liu et al., 1997). В этом случае связывание лигаида приводит к изменению взаимного расположения мономеров в составе димерного рецептора. Вторая группа — динамические модели, подразумевающие пребывание рецептора во множестве конформаций и его стабилизацию в сигнальном состоянии после связывания лигаида (Kim, 1994; Zhang and Kim, 2000). Важное различие между упомянутыми группами состоит также в том, что в механистических моделях до связывания лиганда рецептор имеет определённую конформацию, в то время как в динамических моделях она непостоянна. Для системы СР2-Гтр2 из N.pharaonis предложена модель, предполагающая вращение и параллельный сдвиг в мембранной части (Moukhametzianov et al., 2006), но сопровождающие их конформационные изменения в цитоплазматической области неизвестны. Характеризация Гтр2-цит призвана углубить понимание системы СР2-Гтр2,

РФРЭ регулирует внутриклеточные воздействия таких лнгандов, как фактор роста эпидермиса и трансформирующий фактор роста а. РФРЭ также взаимодействует с тремя своими известными гомологами, ЕтЬВ2 (также называемым Neu или HER2), ЕтЬВЗ (HER3) и ErbB4 (HER.4) лигаад-зависимым путём с образованием гетеродимеров (Yarden and Sliwkowski, 2001; Olayioye et al., 2000). В отсутствие лиганда РФРЭ существует на поверхности клетки преимущественно в виде мономеров с примесью димеров (Sako et al., 2000; Moriki et al,, 2001; Yu et al., 2002). Димеризация РФРЭ является необходимым, но не достаточным условием для активации внутриклеточной киназы. В отличие от механизма димеризацим и узнавания лиганда внеклеточным доменом, механизм димеризации и активации внутриклеточной кииазы понят ещё не до конца, но известно, что важную роль в этом процессе играет прилегающая к мембране область РФРЭ (Poppleton et al., 1999).

Предположительно, активация обеспечивается электростатическим и взаимодействиями между противоположно заряженными областями в примембранном и С-концевом доменах РФРЭ (Alfa et al., 2005). Дня понимания этих механизмов требуется знание структур трансмембранного и примембранного доменов РФРЭ, исследование их способности к самостоятельной димеризации. Такая информация должна пролить свет на роль этих областей в передаче сигнала в системе РФРЭ,

Вторая глава

Вторая глава состоит из 4-х частей. Первая часть содержит список всего использованного оборудования, реактивов и буферных растворов. Во вторую часть вошли описания методик и протоколов работы с клетками Е.соИ и млекопитающих (COS-1 из C.aethiops НЕК 293S из H.sapiens). В третьей части приведены протоколы по очистке и приготовлению образцов белка. Последняя, четвёртая, часть главы посвящена описанию биофизических и биохимических методов, использованных в работе: масс* спектрометрии, КД, ЯМР, ИК Фурье-спектроскопии, АГФХ, кросс-линкингу, МУРН.

Третья глава

В третьей главе описано исследование конформацнонной динамики и структуры Гтр2-цит. Основные результаты и выводы из них приведены ниже.

Клонирование, экспрессия и очистка Гтр2-иит. Фрагмент ДНК, соответствующий а.о. 234-504 Гтр2 (Гтр2-цит) был амшшфицнрован с клеток N.pharaonis (штамм 2160) с помощью полнмеразной цепной реакции (ПЦР). Праймеры содержали специальные фланкирующие нуклеотидные последовательности, включающие сайты узнавания ресгриктаз и/или кодировали дополнительный гистцдиновыЙ олигопешид, необходимый для очистки белкового продукта. Полученные продукты ПЦР очищали, затем ли пировал и в плазыидный вектор pCR Blunt ТОЮ и секвенировали. Определённая последовательность ДНК совпала с ранее опубликованной. После повторной рестрикции кодирующий участок ДНК вставляли в экспрессионный вектор рЕТ 27Ы-. Положительные клоны выявляли с помощью рестрикционного анализа. Клетки E.coli BL21(DE3) Codon Plus RJL трансформировали полученными плазмидными конструкциями. Гтр2-цит успешно экспрессировался как в среде 2xTY, так и в синтетической среде с выходом около 10 мг/л клеточной культуры. Была разработана система очистки, включающая высаливание белка сульфатом аммония, гидрофобную и гель-фильтрационную хроматографию. Используя данную схему очистки, Гтр2-цит очищали до состояния гомогенности. Поведение белка, соответствующего Гтр2-цит с б гистидинами на С-конце, не отличалось от поведения Гтр2-шгг.

Исследование вторичной структуры и кондюомааионных изменений Гмп2-гтт с помощью КД. Содержание различных элементов вторичной структуры в спектре КД Гтр2-цит в фосфатно-солевом буферном растворе (PBS) (рис. 1, сплошная линия) было оценено в -77% неструктурных элементов, -7% поворотов, -13% ß-листов и ~3% а-спиралей с помощью программного пакета CDPro (Sreerama and Woody, 2000). Полученные цифры могут неточно отражать реальный процентный состав из-за погрешностей определения различных типов вторичной структуры, поэтому приводимые значения не следует рассматривать как абсолютно точные. Скорее, они отражают тенденции изменений вторичной структуры белка. Кроме того, следует отметить, что степень неупорядоченности белка, получаемая на основании расшифровки спектров КД, может быть сильно завышена: гибкие а-спиралн в конформационно подвижных белках имеют спектры КД, схожие с таковыми для неупорядоченных белков (Hirst and Brooks, III, 1994). Учитывая высокую конформационную подвижность и гибкость Гтр2-цит (см. ниже), приводимые ниже предсказания содержания элементов вторичной структуры не

следует трактовать прямо. Изменение спектров КД в присутствии различных веществ может быть как следствием индуцирования новых элементов вторичной структуры, так и стабилизации уже существующих в смысле ограничения их конформационного пространства, т.е. уменьшения, их динамики. Полностью разделить оба эффекта экспериментально в рамках данной работы не представлялось возможным, но данные, полученные с помощью других методов (см. ниже), говорят о преимущественной стабилизации уже существующих, но сильно конформационно подвижных а-спиралей Гтр2-цит, т.е. изменении в динамике белка.

Форма спектра КД была неизменной при рН>5, при этом белок оставался почти полностью неупорядоченным. При более низких значениях рН, вплоть до рН 2, происходило постепенное упорядочивание Гтр2-цит (в смысле появления спиральных элементов вторичной структуры) Так, при рН 2 наблюдали -38% неструктурных элементов, при этом -18% поворотов, -24% р-л истов и -20% а-спиралей. Т.к. эти значения рН не являются физиологическими, то влияние рН на струклуру Гтр2-цит в дальнейшем не исследовали. Все последующие измерения спектров КД проводили при рН 7,2, соответствующему рН PBS, _

Глицерин стабилизировал и конформацто предположительно у порядочивания

-PBS

— 60% (об/об) глицерин

-----90% (об/об) глицерин

90% насыщ. сахароза

220 240

х, нм

260

сахароза а-спиральную Гтр2-цит за сч&г гидратационной оболочки вокруг белка, уменьшающей энтропию растворителя (ТтазЬеГГ, 1998). При низких концентрациях глицерин предпочтительней

стабилизирует р-структуры, с незначительным увеличением доли а-спиралей в белке. Напротив, при концентрации глицерина в растворе 60% (об/об) и выше количество предсказанных спиральных элементов вторичной структуры в белке увеличивается с —25% (при 60% (об/об) глицерина) (рис. 1, штриховая линия) до -70% (при 90% (об/об) глицерина) (рис. 1, штрих-пунктирная линия). Вместе с этим уменьшается содержание неструктурных элементов до -18% в 90% (об/об) глицерине. Вклады р-структур и поворотов при 90% (об/об) глицерине были равны -3% и -9%, соответственно. При добавлении сахарозы наблюдали схожие эффекты. Вплоть до 50% насыщенного раствора сахарозы Гтр2-цнт сохранял исходную конформацию. Затем наблюдаемое содержание а-спиралей росло с -5% до -43%, а вклад неструктурных элементов уменьшался с -82% до -31%. В 90% насыщенном растворе сахарозы содержание р-элементов и поворотов составляло —7% и —19%, соответственно (рис. 1, пунктирная линия).

Трифторэтанол (ТФЭ), обладающий способностью индуцировать в белке о-спирали, был использован для контрольного эксперимента. В присутствии ТФЭ спектр КД Гтр2-цит постепенно изменяется вплоть до соответствующего почти полностью а-спиральной конформации: от -4% при 10% (об!об) ТФЭ и до -77% при 98,5% (об!об)

Рис. 1 Спектры КД Гтр2-цит в PBS, 60% (об/об) глицерине, 90% (об!об) глицерине и сахарозе при 90% насыщения.

— PBS

- 98.5% (об/об) ТФЭ 40% насыщ. (NH^SO, 80% насыщ. (NH4)2SO„

ТФЭ (рис, 2, штриховая линия). Содержание неструктурных элементов уменьшается соответственно. Вклад остальных элементов вторичной структуры минимален.

Вплоть до 30% насыщения сульфата аммония, сильного высаливающего агента, Гтр2-цит имел спектр КД, соответствующий в основном неупорядоченной

конформации. Между 30% и 60% насыщения спектры

характеризовались предсказанным содержанием а-спиралей -60-64% (рис. 2, штрих-пунктирная линия). При концентрации более 60% насыщения сульфата аммония, наблюдали следующие изменения; содержание спиральных элементов уменьшалось, доля неструктурных элементов увеличивалась, так же как и вклад поворотов. Плато при достижении 80% насыщения сульфата аммония и выше характеризовалось -50% а-спиралей, —4% (^складчатых листов, ~19%

^ 200

1 31

220 240 X, нм

260

Рис. 2 Спектры КД Гтр2-цит в PBS, 98,5% (об/об) ТФЭ, сульфате аммония при 40% и 80% насыщения.

поворотов и -27% неструктурных элементов (рис. 2, пунктирная линия).

В присутствии хлоридов одновалентных металлов Гтр2-цит имел спектр КД, соответствующий неупорядоченному состоянию, вплоть до концентрации соли 3 М, С увеличением концентрации соли до 4 М быстро увеличивалась наблюдаемая доля а-спиралей и уменьшалось количество неструктурных элементов. Однако содержание а-спиралей различалось при одинаковой ионной силе разных солей (рис. 3 а): сильнее всего было выражено влияние хлорида натрия (содержание а-спиралей -41%), слабее всего — хлорида цезия (содержание а-спиралей ~7%). Хлориды щелочноземельных металлов (кальция и магния) при этом практически не влияли на форму спектра КД,

220 240 X, нм

-0.&

-1-

° ° С" о D а ** * Jf^

□ PBS

* LfCJ

И NaCl

А KCl

♦ RbCl

★ .. 1......... CsCl

260

40 60

t, вс

Рис. 3 Спектры КД Гтр2-цнг в PBS, 4 М растворах LiCl, NaCl, KCl, RbCl, CsCl (а) и кривые плавления а-спиральных элементов Гтр2-цит в этих растворах, наблюдаемые на 222 нм (6).

Известно, что химические вещества вызывают различные структурные изменения благодаря специфике их химической природы. В случае солей, исследованных в данной работе, эффект их влияния на коиформационные переходы белка не сопряжён с ионной силой раствора. Важнее заряд катиона и его размер: натрий, характерный для внеклеточной среды N.pharaonis, влиял на спектр КД сильнее, чем калий, основной внутриклеточный электролит экстремальных галофилов (Christian and Waltho, 1962). Это подтверждается зависимостью температур плавления а-спнральных элементов вторичной структуры Гтр2-штг от радиусов катионов (рис. 3 б). Температура плавления уменьшалась с +41,5°С в 4 М LiCl до +32,44°С в 4 М RbCl. В 4 М CsCl уже не наблюдали точки перегиба на кривой плавления. Из приведённых данных следует, что количество и/или конформационцая динамика a-спиралей в Гтр2-цит главным образом зависят от типа иона. Так, малые по размеру катионы, имеющие относительно большую плотность заряда, вызывают более сильные изменения на спектрах КД и увеличивают температуру плавления a-спиральных элементов вторичной структуры. Вероятно, они легче стабилизируют и делают жёстче довольно гибкую цитоплазматическую часть трансдьюсера как за счёт уменьшения энтропии растворителя и увеличения поверхностного натяжения воды (TimashefF, 1998), так и за счёт электростатических взаимодействий с заряженными группами (Madern et al., 2000). Исключением является LI4": в присутствии 4 М LÍC1 спектр КД Гтр2-цит соответствует конформацин с меньшим содержанием спиральных элементов, чем в присутствии 4 М NaCl. Это, по-видимому, объясняется наличием остаточной гидратационной оболочки вокруг иона лития, мешающей прямому взаимодействию с белком. Аналогичные отклонения описаны для влияния катионов щелочных металлов на ДНК (Zinchenko and Yoshikawa, 2005).

Исследование вторичной структуры и конформагтонных изменений ГМр2~иит с помощью ЯМР. Структура цитоплазматического домена серинового рецептора из Kcoli (Тср-цит), определенная методом рентгеноструктурного анализа, — tyro цилиндр диаметром около 25 Á и длиной около 200 Л (Kim et al., 1999). Было бы естественно предполагать, что высокогомологичный ему Гтр2-цит должен демонстрировать широкий разброс резоыансов на спектрах ЯМР и сильный TROSY (англ. Transverse-Relaxation Optimized 8рес1го5СорУ)-эффект. В частности, для остатков на поверхности суперспиралыюй структуры можно ожидать широкий разброс химических сдвигов. Напротив, спектры неупорядоченных белков имеют острые линии и слабый разброс химических сдвигов.

'Н-спектр Гтр2-циг в 10 мМ NaP рН б и 10% D^O изображен на рис. 4 а. Резонаисы очень узкие и компактно располагаются вокруг 8,3 мл. Также не наблюдается силыюпольных резонансов за 0,8 м.д. Все эти свойства характерны для спектров ЯМР неупорядоченных белков (Dyson and Wright, 2001).

Дня исследования поведения 15№меченого Гтр2-цит при разных температурах записывали спектры ЯМР lH-lsN HSQC (англ. Heteronuclear Single Quantum Correlation) {рис. 4 б, в). При +4°С в 10 мМ NaP рН б и 10% D20 (рис. 4 б) наблюдали 254 из 271 ожидаемого резонанса NH-rpynn пептидных связей, в то время как при +41°С обнаружили лишь 216 пиков. Разброс резонансов был сильнее при низкой температуре, ио в целом сравнительно слабым. Для наблюдаемых пиков значения гетероатомного спектра NOE (англ. Nuclear Overhauser Effect) были типичны для нестабильного конформациоииого множества со средним значением -1,259 и стандартным отклонением 1,66, что также подтверждает высокую информационную подвижность Гтр2-цит. Один из сигналов,соответствующий, скорее всего, глицину ('Й-8,114 мл., 15N- 106,785 м.д.), использовали для калибровки интенсивиостей остальных пиков. Обнаружилось, что положение 44 резонансов не зависело от температуры, остальные сдвигались. В присутствии 4 М KCI (рис. 4 в) разброс резонансов слегка увеличивался, особенно при

+4°С. Тем не менее, Н5С>С спектры 15Ы-мечено го Гтр2-цит походили на таковые в

отсутствие соли. Приведённые результаты говорят о том, что наблюдаемые изменения в спектрах КД не соответствуют конформационному переходу типа клубок-спираль, но отражают изменения в динамике вторичной структуры белка. а

о:

2 б

1-Г Е Ей

ф Т

8 7 6 5 4 3 2

Н химический сдвиг, м.д.

100 ч

110 *

120 я

130 щ

140

* +4°С > *

9.5—&.<з 7.6-ко-6.6 7.6

+25°С

• % #

Л",

+4ГС »

■ * *

г-

9*5 53 7ЛГ

ЕС»

1_Г Е

£ О

а>

7 X

X 2

100 4* 4

110 *

■ 4

120 ■Й*

130 ■М

140 : *

+4°С

"Ш5 §!5 7!5"

, +25°С

л,

ЙЭ

'•У

ТГО8.0 7.0

.. +41 °С

• « * *

■Г • • «

ч *

у.и

•9

§15 Ш

1Н химический сдвиг, м.д.

Рис. 4 'Н спектр ЯМР Гтр2-щгг в10 мМ ЫаР рН 6 и 10% ЭгО (а), 'Н-"Ы га<ЗС спектры ЯМР '^-меченого Гтр2-цит при +4°С, +25°С и +4ГС в 10 мМ ЫаР рН б и 10% РгО (б), 10 мМ ЫаР рНби 10% Б20 + 4 М КС1 (в).

Исследование вторичной структуры и конформационных изменений Гтр2-нут. с помощью ПК Фурье-спектроскоп ии.

ИК спектры поглощения Ггр2-циг в растворе и в виде сухой плёнки в области амид I (1600-1700 см"1) представлены на рис, 5. Позиция белкового пика в растворе (1645 см'1) подтверждает предсказания из спектров КД и ЯМР и соответствует неупорядоченной конформации. С другой стороны, положение пика амид I в сухой плёнке Гтр2-цит (1654 см'1) лежит в области а-спирали. К сожалению, было невозможно разделить вклады

суперспиральной структуры и обычной а-спирали в ИК спектрах Ггр2-цит, поскольку достоверные предсказания вторичной структуры возможны лишь для простых и детально охарактеризованных, «модельных» белков. Кроме того, в сухой плёнке белок может принимать ненативиую коиформацию.

Исследование олигомеризаиии и агрегации Гтр2-иит с помощью АГФХ. Аналитический гель-фильтрационный анализ Гтр2-циг проводили, чтобы выяснить, как отражаются изменения во вторичной структуре белка и её динамике в различных растворах (см. выше) на объёме удержания. Результаты представлены на рис. 6, а 1000' 1б0" 10иДа 6 ЮЙО" 1Й6"" 110*Да

Рис. 6 Хроматограммы Гтр2-цнт в PBS (пик обозначен ш), в PBS + 10-40% насыщения сульфата аммония (пики обозначены 10-40) (а) и в PBS + 4М NaCl (пик обозначен Na) и PBS + 4 М KCl (□ик обозначен К) (б).

Наличие Гтр2-цит в соответствующих фракциях подтверждали с помощью гель-электрофореза в додецилсульфате натрия (ДСН). В PBS Гтр2-щтг имеет объём элюции, равный 11 мл, что грубо соответствует объёмам элюции глобулярных белков молекулярной массой 240-250 кДа. Подобное поведение проявляет мономерный цитоплазматический домен аспартатного рецептора (Тар-цит) из E.coli (мол. масса 31 кДа), элюциоиный объём которого соответствует таковому глобулярного белка массой около 110 кДа (Long and Weis, 1992). Предположительно, Гтр2-цит, будучи конформацнопно гибким, имеет палочковидную форму (см. ниже), что существенно уменьшает его элюционный объём. Дополнительным подтверждением этого Гтр2-цит

V, см"1

Рис. 5 ИК спектры поглощения Гтр2-цит в 10 мМ Tpuc-HCl pH 8 в DjO (сплошная линия) н в сухой плёнке (пунктирная линия).

служит тот факт, что позиция элюцнонного пика остается неизменной даже в присутствии 6 М гидрохлорида гуанидина. Увеличение концентрации сульфата аммония с 10% до 40% насыщения в элюцнонном буфере ведёт к сдвигу элюцнонного пика с 12 мл до 20 мл, т.е. в область меньших молекулярных масс (рис. 6 а). В присутствии более высоких концентраций сульфата аммония (50% насыщения и выше) Гтр2-цит не может быть смыт с колонки. Однако при последующем промывании колонки низкосолевым буфером исходное количество белка смывается точно в промежуточном градиенте. Это указывает на то, что Гтр2-цит в присутствии высоких концентраций сульфата аммония (от 50% насыщения и выше) спонтанно агрегирует с обнажением сильно гидрофобных участков, что в результате ведёт к наблюдаемому полному удержанию белка. Нельзя, однако, исключить, что сдвиг элюцнонного пика при низких концентрациях сульфата аммония (до 40% насыщения включительно) может быть частично обусловлен образованием более компактных «преагрегатов». В присутствии 4 М КС1 и 4 М NaCI элютюнные объёмы Гтр2-цит были равны 12 мл и 12,4 мл, соответственно (рис б б). Элюционные пики также значительно уширялись. Данные результаты подтверждают, что даже при одинаковой ионной силе различные ионы (в данном случае катионы К* и Na+) по-разному шщуцируют конформационные изменения и/или имеют различные потенциалы агрегации и/или стабилизации белка. Это полностью соответствует выводам, сделанным из спектров КД и ЯМР.

Исследование олигамеризаиии и агрегации Гтр2-ичт с помощью кгюсс-линкинга. Полученные в результате кросс-линкинга гидрохлоридом 1-этнл-3-[3-диметиламинопропил] карбомнда (EDC) и N-гндрокснсукцинидом (NHS) Ггр2-цит продукты анализировали с помощью АГФХ в PBS и гель-электрофореза в ДСН. Кросс-линкинг Гтр2-штт в PBS не выявил какой-либо значительной агрегации и/или олигомернзацин белка, Хроматограмма продуктов кросс-линкинга имела один основной пик около 113 мл (рис. 7 а). Этот пик был воспроизводимо шире, чем пики, полученные после кросс-линкинга при других условиях (см, ниже), что может быть объяснено множеством конформаций, принимаемых Гтр2-цит и захватываемых кросс-линкерами. Более поздний минорный пик повторялся во всех экспериментах, хотя его позиция незначительно менялась (от 14,8 мл до 15,2 мл). Соответствующая слабая полоса имелась и на гель-электрофореграмме (рис. 7 а, вставка). Добавление сульфата аммония до 10% насыщения не меняло позицию пика Гтр2-циг ни на хроматограмме, ни на гель-электрофореграмме. При этом элюционный пик становился относительно уже — это подтверждает гипотезу о том, что сульфат аммония при низких концентрациях делает Гтр2-циг более компактным. В присутствии 40% насыщенного сульфата аммония наблюдалась заметная агрегация Гтр2-циг. Гель-электрофорез в ДСН (рис. 7 б, вставка) выявил 3 основных полосы молекулярной массы: 41, 90 и 150 кДа, Эти продукты кросс-линкинга проявлялись на хроматограмме в виде двух пиков на 9,4 и 11,2 мл и плеча первого пика, бывшего за пределами разрешения колонки (рис, 7 б). При проведении кросс-линкинга в растворе 70% насыщенного сульфата аммония Гтр2- цит имеет сильную склонность к агрегации и почти полностью остаётся на колонке во время аналитической гель-фильтрации. Это служит дополнительным доказательством того, что при высоких концентрациях сульфата аммония гидрофобные поверхности Гтр2-цит обнажаются, способствуя агрегации белка.

В присутствии 4 М КО или 4 М NaCI Гтр2-цит ведёт себя практически одинаково. На хроматограмме обнаруживаются два основных пика с элюционными объёмами 10,5 мл и 12,4 мл (рис. 7 в). Левое плечо первого пика перекрывается по меньшей мере с двумя дополнительными пиками (около 7,8 мл и 9,0 мл), соответствующих высокомолекулярным олигомерам. Гель-электрофореграмма (рис. 7 в, вставка) подтверждает присутствие как минимум четырёх различных белковых продуктов после

реакции кросс-линкинга. Один ю них имеет электрофоретическую подвижность,

соответствующую молекулярным массам между 80 и 120 кДа. Можно предполагать, что в данном случае наблюдаются димеры Ггр2-цит. Видно, что элющюииые объёмы Гтр2-цит в солевых растворах отличаются от таковых образцов после кросс-линкинга при тех же условиях. Этот эффект объясняется сильной зависимостью удержания колонки от используемого раствора и свойств белка в этом буфере. Таким образом, прямое сравнение некорректно. Стандартные условия (PBS) для аналитической гель-фильтрации продуктов кросс-лин кинговой реакции были необходимы для однозначного анализа данных. При проведении гель-фильтрации в растворах, совпадающих с соответствующими растворами для кросс-лин кинга, хроматеграм м ы соответствовали таковым на рис. 7. Исключение составили образцы после кросс-линкинга в PBS + 4 M KCl: положение пика, предположительно соответствующего димерам Гтр2-цит, практически совпадало с положением пика свободного Гтр2-цит в PBS + 4 M KCl (12,2 мл), однако, имелись пики от олигомеров и мономеров. Вместе с наблюдаемым уширепием злюционных пиков свободного Ггр2-шгг при данных условиях это подтверждает то, что Гтр2-цит в присутствии 4 M KCl или 4 M NaCI находится преимущественно в димерном состоянии, но с примесью мономеров и олигомеров более высокого порядка.

0.0 5.0

б •№>

10.0 15.0 20.0 МЛ

0.0 5.0

«Да

10.0 15.0 20.0 МЛ

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 МЛ

Рис. 7 Хроматограммы и гель-электрофореграммы (вставки) Гтр2-цит после кросс-линкинга с помощью EDC и NHS в PBS

(а), PBS + 40% насыщения сульфата аммония

(б) и PBS + 4 М КС1 (в).

Структурный анализ Гтр2-иит с помощью МУРН. Для улучшения соотношения сигнал : шум буферный раствор PBS был заменён на такой же, но приготовленный на тяжёлой воде, dPBS (Timmins and Zaccai, 1988). Сравнение спектров КД в PBS и PBS + 4 М KCl со спектрами в dPBS и dPBS + 4 М KCl показало их полную идентичность. Гтр2-цит исследовали при концентрациях 2 и 7,5 мг/мл. Сравнение спектров, полученных при разных концентрациях белка, показало пропорциональную зависимость интенсивности сигнала I(Q) от концентрации. Из этого можно заключить, что при данных условиях между молекулами Гтр2-цит отсутствуют взаимодействия, зависящие от концентрации, ■по согласуется и с данными кросс-линкинга.

Экспериментальные кривые рассеяния, нормированные на концентрацию белка, представлены па рис. 8 а для Гтр2-циг в dPBS и dPBS + 4 М KCl. Видно, что в обоих случаях интенсивности следуют степенному закону ](Q)-Q"' (штриховая линия) в

широком диапазоне (от 0,03 до 0,07-0,1 А"1). Такой характер рассеяния типичен для сильно вытянутых объектов.

Q2, А2

Рис. 8 Экспериментальные кривые рассеяния, нормированные на концентрацию белка, для Гтр2-цнт в йРВЭ (о) и (1РВ8 + 4 М КС) (о). Сплошные линии соответствуют аппроксимации по приближению Веаис^е. Штриховая линия представляет зависимость —О*1- Пунктирная линия представляет теоретически рассчитанную кривую рассеяния для Тср-цит (а). Линейные аппроксимации кривых рассеяния в области Гинье для Гтр2-цит в <1РВ5 (о) и с1РВ8 + 4М КС! (□)(б>.

Из кристаллической структуры Тср-цит из E.coli известно, что этот белок имеет вытянутую форму длиной около 200 A (Kim et al., 1999). Для сравнения с полученными для Гтр2-цнг данными с помощью программы CRYSON (Svergun et al., 1995) была промоделирована кривая малоуглового рассеяния Тср-цит (рис. 8, пунктирная линия). Теоретически рассчитанная кривая для Тср-цит хорошо совпадает с эксперим и ггальным и кривыми для Гтр2-цит как в dPBS, так и в dPBS + 4 М КС1. Это говорит о том, что белки имеют схожие форму и размеры. Предсказанный для Тср-цит Rg«54,4 А также прекрасно согласуется со значениями Rg для Гтр2-цит, равных в обоих случаях 54±3 А, полученными из линейной аппроксимации кривых рассеяния в области Гинье (рис. 8 б).

Для получения структурной информации кривые рассеяния аппроксимировали по методу, предложенному Beaucage, который сочетает режим Гинье (при Q«l/Rg) и степенной закон при Q>l/Rs:

I(Q) = I(0)exp(- RgzQ3/3) + P[erj{i^Q/j6 )]3/Q" > (1)

где Rg — радиус инерции, Р - амплитудный множитель, 1(0) — рассеяние в нулевой угол, выражаемое как

1(0) = Ф(1-Ф)УДр2 (2)

где V - объём частицы, Ф — объёмная доля белка в растворе, рассчитанная для Гтр2-цнт как отношение массовой концентрации белка к его плотности, Ф=сЛЗр, Лр -разность между средними нейтронными плотностями рассеяния белка и растворителя. В случае вытянутых (цилиндрических) объектов (а=1) Р равно Р = Ф(1-Ф)л1г2Др2 (3)

где г — радиус поперечного сечения цилиндра. Длина цилиндра, таким образом, легко вычисляется из (2) и (3) L = л1(0)/Р (4)

Следует отметить, что величина L определяется по формуле (4) прямо из экспериментальных данных и не зависит от олигомериого состояния Гтр2-цит. Радиус г, зависящий от олигомериого состояния белка, в данном случае невозможно прямо определить из кривых рассеяния.

Поэтому для оценки радиуса молекулы г рассеяние в нулевой угол 1(0) представляли как функцию параметра N, отражающего степень олигомеризации Гтр2-цит (N=1 — мономер, N=2 - димер, N=3 - тример и т.д.). Для упрощения вычислений распределения по N не вводили, полагая систему монодисперсной в обоих случаях. При построении модели

учитывали образование вокруг белковой частицы оболочки из молекул растворителя толщиной около 3 А и плотностью, на 20% превышающей плотность раствора (Svergun et al., 1998). Параметры V^l (объём оболочки) и psheji (плотность рассеяния оболочки) фиксировали в соответствии с указанными выше величинами. Таким образом, в выражении (2) для 1(0) полагали: V=NVp+V,ilei|! Ф^р+Ф^! и P^PpVp+PsbdiVshdiViVp+Vshdi), где индекс «р» обозначает величины, относящиеся к белку, a «shell» - к оболочке. Зависимость плотности рассеяния белка от H-D-обмена учитывали с помощью параметра ц как рр=ррр°+( 1 -ц)ррн. Плотность рассеяния полностью протонированной формы Гтр2-цит (ц=0), ррН= 1,93*101 аст"г, рассчитывали на основании его химической брутто-формулы С11 щН тебС^ет^мгЗт и плотности dp"=l,4 г/см3; для полностью дейтерированной формы (ц.=1), ррс=7,80*10,0ст"2, по брутто-формуле СщгОтгбО^т^эгБт и платности dp=l,49 г/см1, соответственно. Параметр ц служил критерием отбора решений. Оценка даёт число обмениваемых протонов у Гтр2-цит равным 430-440 (Jacrot, 1976) при предположении, что все протоны пептидных связей обмениваемы, что верно для конформационно подвижных и неупорядоченных белков. Следовательно, ц<0,223-нЭ,228, и все решения, соответствующие ббльшим р., не имеют смысла. Теоретически рассчитанные зависимости 1(0)/с от N показаны на рис. 9. Сплошные и штриховые линии представляют зависимости 1(0)/с от N дня Гтр2-цит в dPBS и dPBS + 4 М КС1, соответственно. Горизонтальные линии отсекают экспериментально полученные значения 1(0)/с. Таким образом, абсцисса точки пересечения теоретической зависимости и экспериментального значения 1(0)/с даёт искомое N. В dPBS 1(0)/с соответствует мономерной форме белка (пересечение при N=1); при этом ц=0,21 (или около 400 обмениваемых протонов).

Решения с N>1 имеют слишком большие значения параметра ц: 0,37 для N=2 и 0,45 для N=3. Эти решения, очевидно, не удовлетворяют приведённому выше критерию отбора решений. Следовательно, Гтр2-цит в dPBS мономерен (N=1). Из тех же соображений N для Гтр2-цит в dPBS + 4 М КС1 равно 2,3, что говорит о полидисперсности системы. Ближайшее целое число — это 2. Значит, белок находится преимущественно в димерной форме при данных условиях. Имеется, однако, определённое количество олигомеров Гтр2-штг более высокого порядка и/или агрегировавшего белка. Точная оценка их количества представляется затруднительной в силу взаимного уравновешивания мономеров и олигомеров в смысле сдвига величины 1(0)/с,

Рве. 9 Теоретические зависимости рассеяния в нулевой угол 1(0), нормированного на концентрацию белка, от степени олигомеризации Гтр2-цит N. Сплошные и штриховые линии представляют зависимости 1(0)/с от N для Ггр2-цит в <1РВ8 и с1РВЗ + 4 М КС1, соответственно. Горизонтальные линии отсекают экспериментально полученные значения 1(0)/с.

При известном N можно вычислить радиус цилиндра, аппроксимирующего частицу Гтр2-цит, через объём белка Vp и длину цилиндра L

r= VNVp/TtL (5)

Таким образом, после обработки экспериментальных данных были определены структурные параметры Гтр2-цит: в dPBS белок имеет длину 202±5 А и радиус 7,2±0,3 А, а в dPBS + 4 М KCl длина и радуис цилиндра возрастают до 248±7 А и 9,1±0,4 А, соответственно. Эти значения прекрасно согласуются с аналогичными структурными параметрами Тср-цит: длина ~200 А, диаметр —18 Ä, Радиус инерции Гтр2-цит в растворе также соответствует Rt, рассчитанному для Тср-цит (см. выше). Поскольку такая форма белка подразумевает наличие у него стабильной третичной структуры, зафиксированная с помощью КД, ЯМР и ИК спектроскопии неупорядоченность Гтр2-цит является следствием его высокой конформационной подвижности и внутримолекулярной динамики. Этот вывод подтверждается увеличением наблюдаемого содержания а-спиральных элементов вторичной структуры в присутствии 4 М KCl, не сопровождаемым при этом значительными конформацнонными изменениями со стороны белка. Следовательно, соль скорее стабилизирует существующие элементы вторичной структуры, не индуцируя заметного количества дополнительных.

Модель передачи сигнала в системе СР2-Гтр2 в N.pharaonis. Очевидно, что наиболее близкими к условиям in vivo из исследованных в данной работе являются условия с высоким содержанием соли. В частности, известно, что внутриклеточная концентрация ионов К* у экстремальных галофилов —4 М, а внеклеточная среда представляет собой почти насыщенный раствор NaCl (Christian and Waltho, 1962). На основании приведённых выше данных можно утверждать, что внутри клетки Гтр2-цит является преимущественно димером вытянутой палочковидной формы длиной около 250 А и диаметром порядка 18 А с высоким содержанием а-спиральных элементов вторичной структуры (не менее 20%). Эта цифра может быть занижена (Hirst and Brooks, III, 1994), поскольку Гтр2-цит обладает высокой конформационной подвижностью. Последнее свойство, скорее всего, является ключевым для передачи сигнала с Гтр2 на кииазу CheA. Схематически предлагаемая динамическая модель передачи сигнала представлена на рис. 10.

Предположительно, в неактивном состоянии (рис. 10, справа) транедьюсер находится во множестве конформаций, при этом связывание киназы с ним затруднено. После возбуждения СР2 квантом света определённой частоты рецептор передаёт конформационные изменения на прилегающую к нему область Гтр2, Это, в свою очередь, сужает конформационное пространство трансдьюсера, он становится более упорядоченным и менее гибким (рис. 10 слева), и киназа CheA запускает каскад фосфорплирования. Такая модель лучше, чем р„с ,0 ^ модель

механистические модели, согласуется с ^фор«^^^ „мнений экспериментальными данными, полученными как для в р^-цит, сопряженных с комплекса СР2-Гтр2, так и для Гтр2 самого по себе. передачей сигнала.

Четвёртая глава

В четвёртой главе описана экспрессия внеклеточного домена РФРЭ человека в клетках линии COS-1 из C.aethiops, а также экспрессия внутриклеточного домена этого белка в клетках линии COS-1 и Rcoli. Особое внимание уделено конформационному и структурному анализу тмп-РФРЭ в мицеллах различных детергентов и в липидном окружении. Основные результаты и выводы из них приведены ниже.

Клонирование, экспрессия, очистка и характеуизааия внеклеточного домена РФРЭ человека. Фрагмент ДНК, соответствующий а,о. 1-644 РФРЭ человека был амплнфицирован с плазм идного вектора, содержащего полноразмерный ген РФРЭ человека, с помощью ПЦР. Праймеры содержали специальные фланкирующие нуклеотидные последовательности, включающие сайты узнавания рестриктаз. Прямой праймер кодировал также дополнительный гистидиновый олигопептид, предусмотренный для очистки белкового продукта. Полученные продукты ПЦР очищали, затем лигировали в плазмидный вектор pCR Blunt TOPO и секвенировали. Определённая последовательность ДНК совпала с ранее опубликованной. После повторной рестрикции кодирующий участок ДНК вставляли в требуемый экспрессионный вектор. Положительные клоны выявляли с помощью рестрикционного анализа.

Первой системой экспрессии была бактериальная система в клетках E.coli. Клетки штаммов BL21(DE3) Codon Plus RIL/RP и Star трансформировали полученными плазмидный и конструкциями. Экспрессии с вектора рЕТ 23 d+ не наблюдалось; во время экспрессии с вектора pGEX 4Т-1 химерный белок (с глутатион-трансферазой на N-конце) в клетке подвергался сильному протеолизу. Однако внеклеточный + трансмембранный домены РФРЭ успешно экспрессировались в культурах клеток млекопитающих, в частности COS-1. Клетки трансфицировали соответствующими плазмидными конструкциями и затем индуцировали экспрессию. В клетках COS-1 успешно экспрессировался полноразмерный и стабильный белковый продукт молекулярной массы ~70 кДа (рис. 11); в клетках НЕК 293S белок быстро деградировал. Оптимальными условиями экспрессии внеклеточного + трансмембранного доменов РФРЭ в клетках линии COS-1 из C.aethiops следует считать 55 час после индукции при +37°С, 5% С02. Косвенным подтверждением нативной конформацин белка служило то, что после экспрессии он находился в мембранной фракции и легко солюбилизировался в 0,05% (вес/off) растворе додецилмальтозида.

Клонирование, экспрессия, очистка и характеризаиия внутриклеточного домена РФРЭ человека. Фрагменты ДНК, соответствующие а.о. 687-1186 (цитоплазамтический домен) и 644-1186 (примембранный + цито плазматический домены) РФРЭ человека амплифицировали с плазмидного вектора, содержащего полноразмерный ген РФРЭ человека, с помощью ПЦР. Праймеры содержали специальные фланкирующие нуклеотидные последовательности, включающие сайты узнавания рестриктаз. Обратный праймер кодировал также дополнительный т.н. Ш4-олигопегггид (С-концевоЙ эпитоп родопсина), предусмотренный для очистки белкового продукта. Полученные продукты ПЦР очищали, затем лигировали в плазмидный вектор pCR Blunt TOPO и секвенировали. Определённые последовательности ДНК совпали с ранее опубликованными. После повторной рестрикции кодирующий участок ДНК вставляли в требуемый экспрессионный вектор. Положительные клоны выявляли с помощью рестрикционного анализа.

«Да Г1

52.3

Рис. 11 Иммуноблоттинг клеточных лнзатов до (1) и после (2) индукции экспрессии

внеклеточного +

трансмембранного доменов РФРЭ в клетках COS-1.

Клетки E.co/i BL21(DE3) Codon Plus RP трансформировали полученными плазмиднымн конструкциями. Экспрессия с вектора рЕТ 23 d+ наблюдалась для конструкции, содержащей только цитоплазматический домен РФРЭ (цит-РФРЭ). После экспрессии в клетках Kcoli цит-РФРЭ находился в нерастворимой форме, в составе т.п. тел включения. Тесты различных детергентов и денатурирующих веществ показали, что наибольшей экстрактивной силой по отношению к находящемуся в телах включения цит-РФРЭ обладает б М гидрохлорид гуанидина. Поэтому для получения цнт-РФРЭ в растворимой форме осадок после пропускалия через пресс Френча растворяли в б М гидрохлориде гуанидина. Первым шагом при очистке белка была ион обменная хроматография. Поскольку связывание белка с материалом колонки в растворе б М гидрохлорида гуанидина невозможно из-за его высокой ионной силы, белок переводили в раствор 8 М мочевины путём диализа и затем подвергали очистке с помощью ионобменной хроматографии. Для получения цит-РФРЭ в функциональной форме проводили при +4®С ступенчатый диализ лучших фракций, содержащих требуемый белок, против стократного избытка 100 мМ Трис-HCI рН 8. После диализа часть белка оставалась в растворимой форме, но значительная часть агрегировала, хотя раствор оставался визуально прозрачным. Однако полученный таким образом в растворимой форме цит-РФРЭ, к сожалению, не обладал тирозии-киназной активностью, т.е. рефолдинг не был успешным. Не удались и попытки рефолдинга цит-РФРЭ с помощью набора растворов для подбора условий рефолдинга, позволяющего провести подбор и оценку влияния на фолдинг белка более 10 параметров.

Цитоплазматический и примембранпый + цитоплазматический домены РФРЭ успешно экспрессировались в культурах клеток млекопитающих, в частности, COS-1 (рис. 12). Клетки трансфицировали соответствующими плазмиднымн конструкциями и индуцировали экспрессию. В клетках COS-) успешно экспрессировались полноразмерные, стабильные и функциональные белковые продукты. Оптимальными условиями экспрессии в клетках линии COS-1 из C.aethiops были 60 час после индукцин при +37°С, 5% СОг.

Клонирование, экспрессия и очистка тмп-РФРЭ, _ человека. Фрагмент ДНК, соответствующий а.о. 615-686 (трансмембранный + примембранпый домены) РФРЭ человека был амплифицирован с плазмидного вектора, содержащего полноразмерный ген РФРЭ человека, с помощью ПЦР. Праймеры содержали специальные фланкирующие нуклеотидные последовательности, включающие сайты узнавания рестриктаз. Было создано две плазмидных конструкции. Прямой праймер в обоих случаях кодировал дополнительный гисгидиновый олигопептид, предусмотренный для очистки белкового продукта. Обратный праймер в первом случае кодировал только стоп-кодон (His-тмп-РФРЭ), во втором - StrepII-олигопептид, предусмотренный для следующих ступеней очистки белкового проекта (Н15-тмп-РФРЭ-81гер). Полученные продукты ПЦР очищали, затем лигировали в экспрессионный вектор рЕТ 27Ы-, Положительные клоны выявляли с помощью рестрикционного анализа и секвенпровали. Определённые последовательности ДНК совпали с ранее опубликованными.

Клетки E.coli BL21(DE3) Codon Plus RP трансформировали полученными плазмиднымн конструкциями. His-тмп-РФРЭ и Н i s-TMn-POP3-Strep успешно - экспрессировались как в среде 2xTY, так и в синтетической среде.

Было обнаружено, что во время экспрессии тмп-РФРЭ подвергается протеолизу. Тщательный подбор условий очистки His-тмп-РФРЭ оказался безрезультатным:

кДа 1 2

Рис. 12 Иммуноблоттинг клеточных лизатов после индукции экспрессии примембралного + цитоплазматичсского (1)

и цнтоплазматического

(2) доменов РФРЭ в клетках СОЭ-!.

конечный продукт всегда содержал более или менее значительные количества укороченных фрагментов тмп-РФРЭ, что подтверждалось как гель-электрофоре граммами, так и масс-спектрами MALDI-TOF. На основании масс пептидных фрагментов удалось определить сайты протеолиза, оказавшиеся в С-концевой области His-тмп-РФРЭ (номера

а.о, соответствуют нумерации в полноразмерном РФРЭ): между L638 и G639, между Н648 и 1649, между R653 и Т654, между R657 и L658.

В силу изложенных выше причин работу продолжили с другой конструкцией, НЬ-тмп-РФРЭ-Strep. Сначала оптимизировали параметры экспрессии, выбрав в качестве переменных параметров время роста клеток и температуру среды после индукции экспрессии. После иммунологического анализа за оптимальные параметры экспрессии были приняты 24 час и +28°С, соответственно. Экспрессия при найденных условиях позволила существенно (более чем в два раза) увеличить выход меченого белка по сравнению со стандартными условиями (4 час, +37°С). Была разработана система очистки, включающая 2 шага аффинной (на гистидиновый и StrepII-ол нгопептиды) и последующую обратнофазную хроматографию. За счёт введения дополнительного олигопептнда StrepII в результате очистки получали гомогенный препарат полноразмерного Hts-тмп-РФРЭ-Strep без примесей продуктов протеолиза (рис. 13), что было также подтверждено с помощью масс-спектрометрии.

Олигомеризаиия и агрегация тмп-РФРЭ человека. Кросс-линкинг His-тмп-РФРЭ-Strep в 50 мМ NaP рН 6, 100 мМ детергента (октил P-D-глюкопиранозида (ОГ), ДСН и додецилфосфохолина (ДФХ)) не выявил сколь либо значительной агрегации и/или слигомеризации белка. Имму ноблоттинг продуктов кросс-линкинга с антителами против His- и StrepI I-олнгопептидов показал наличие единственной мажорной полосы, соответствующей мономерному His-тмп-РФРЭ-Strep (рис. 14). Гидрофильные (EDC и NHS) н гидрофобные (суберат днсукцинимиднла (DSS)) кросс-линкеры давали аналогичные результаты. В липидном окружении (например, в липосомах 1 -пальмитоил-2-олеоил-яи-глвцеро-3-фосфохолина (ПОФХ)) His-TMn-POP3-Strep, в отличие от мицелл детергентов, образовывал олигомеры высших порядков, что описано ранее для трансмембранных доменов РФРЭ (Mendrola et al„ 2002; Sharpe et al., 2002). Этот факт подтверждает, что различия в окружении трансмембранного белка могут играть значительную роль в его поведении.

Структура и конфор.иаиионные изменения тмп-РФРЭ человека. Вторичные структуры очищенных His-тмп-РФРЭ и Ни-тмп-РФРЭ-БПер сравнивали в 50 мМ NaP рН

б, 0,88% ОГ и 50 мМ NaP рН б, 0,88% ДСН, используя КД-спектроскопию. Спектры обоих белков при одинаковых условиях были идентичны, следовательно, присутствие олигопептнда Strepll не влияло на вторичную структуру белка. Кроме того, это показало, что продукты протеолиза His-тмп-РФРЭ принимают в мицеллах детергента конформацию, неотличимую на спектрах КД от их конформацни в составе полноразмерного тмп-РФРЭ.

кДа 1 23

Рис. 13 Гель-эле юрофореграмма (1) и иммуноблоттинг с антителами против His-(2) н StrepII- (3) олигопептидов очищенного His-тмп-РФРЭ-Strep.

кДа 1 2

I J ri^v |. '.-г .

■ Ш'-'УШ)

Рнс. 14 Иммуноблоттинг после кросс-лин кинга Hi а-тмп-РФРЭ-S trep в мицеллах ДФХ (1) и липосомах ПОФХ (2),

Для изучения влияния типа детергента на вторичную структуру Н15-тмп-РФРЭ-Б^р записывали спектры КД в 50 мМ ЫаР рН 6, 100 мМ соответствующего детергента, а также в воде и 95% (о6!о6) ТФЭ (рис. 15). По результатам обработки экспериментальных данных содержание элементов вторичной структуры следующее:

а-спираль р-лист поворот нестр.

эл-ты

вода 18% 29.5% 22.5% 30% ТФЭ 40% 13% 18.5% 28.5% ДФХ 36% 16% 20% 28% ПОФХ 4% 42% 21% 33%

----95% (об/об) ТФЭ

-------100 мМ ДФХ

ПОФХ

Полученные цифры неточно отражают реальный процентный состав из-за погрешностей определения различных типов вторичной стру туры, поэтому приводимые значения не следует рассматривать как абсолютно точные. Скорее, они отражают качественное соотношение между различными элементами вторичной структуры.

В 95% (об/об) ТФЭ (рис. 15, штриховая линия) Ню-тмп-РФРЭ-ЗЦер преимущественно а-спирален, при этом

260

X, нм

<х>

Рис, 15 Спектры КД Гтр2-цит в воде, 95% [об/об) ТФЭ, 50 мМ NaP pH 6, 100 мМ ДФХ и лапосомах ПОФХ,

вклад неструктурных элементов также значителен, В воде (рис. 15, сплошная линия) преобладают ß-структура и неструктурные элементы, что может свидетельствовать в пользу агрегации (Stork et al., 2005; Estrada and Soto, 2006). Спектры КД (рис. 15, штрих-пунктирная линия) и предсказания вторичной структуры His-тмп-РФРЭ-Strep в 100 мМ растворах детергентов разпых типов (ОГ — нейтральный, ДСН - анионный, ДФХ - цвиттерионный) в пределах погрешности почти не отличались друг от друга. Этот факт даёт основания утверждать, что вторичная структура тмп-РФРЭ слабо зависит от типа детергента, используемого для его солюбилизации. Относительно высокое содержание элементов ß-структуры в мицеллах детергента не является следствием агрегации, поскольку это противоречило бы недавно опубликованным данным о том, что трансмембранный домен РФРЭ преимущественно мономерен в мицеллах ДСН (Stanley and Fleming, 2005), и результатам кросолинкинга (см. выше). Интересно, что спектры КД в ДСН и ДФХ отличаются от таковых трансмембранного домена гомолога РФРЭ человека из крысы (Houtiston et а!., 2004), что говорит о влиянии мицелл детергента на вторичную структуру при мембранного домена в составе Н ¡ s-TMii-POP3-Strep. Ранее подобный эффект был показан для изолированного прнмембранного домена РФРЭ (Choowongkomon et al., 2004; Choowongkomon et al., 2005).

Чтобы получить представление о вторичной структуре тмп-РФРЭ в окружении, близком к нативному, записывали спектры КД His-тмп-РФРЭ-Strep в липидных мембранах, состоящих из ПОФХ, ПОФХ + холестерина (2:1 в молярном отношении) и ПОФХ + холестерина + сфингомнелнна (2:1:1 в молярном отношении) (Jones et al., 1997; Jones et al., 1998; Pike and Casey, 2002; Pike et al., 2005). Оказалось, что спектры КД His-тмп-РФРЭ-Strep в ПОФХ практически не зависели от присутствия холестерина и сфингомнелнна в диапазоне температур от +4°С до +60°С, но значительно отличались от спектров КД того же белка в мицеллах детергента (рис. 15, пунктирная линия). Во все трёх случаях предсказания вторичной структуры показали 3-4% а-спиралей, 42-43% ß-складчатых листов, 21% поворотов и 33% неструктурных элемешов. Существенное

увеличение содержания элементов Р-структуры подтверждает агрегацию трансмембранных доменов в составе Шз-тмп-РФРЭ-Зйгер в липидном окружении. Кроме того, независимость спектров КД НЬ-тмп-РФРЭ^гер от температуры свидетельствует об отсутствии влияния фазового состояния липидного окружения на степень олигомернзации этого белка.

Важно отметить, что по результатам расшифровки спектров КД Шя-тмп-РФРЭ-81гер в мицеллах детергентов и в липидном о>фужении содержание неструктурных элементов было оценено практически одинаково (около 30%), несмотря на существенные различия в самих спектрах. Данный факт, скорее всего, свидетельствует о высокой подвижности петель примембранного домена РФРЭ при разных условиях.

Ранее с помощью ЯМР была определена структура примембранного домена РФРЭ в мицеллах ДФХ (СЬоошогщкотоп & а]., 2005). Кроме того, имеются убедительные доказательства того, что трансмембранный домен РФРЭ преимущественно а-спирален как в мицеллах детергента, так и в липидных мембранах (Нои11$гоп « а1., 2004; Е^Ьу е( а1., 1998). До сих пор неизвестно, каковы конформация и структура обоих доменов в составе единой полипептидной цепи, поэтому Шз-тип-РФРЭ-Бйтер исследовали с помощью ЯМР в растворах различных детергентов.

При сравнении спектров ЯМР Нк-тмп-РФРЭ-Зц-ер в 10% Б20, 50 мМ ЫаР рН б, 100 мМ ОГ, в 10% 020, 50 мМ N3? рНб, 100 мМ ДСН и в 10% БА 50 мМ ЫаР рН б, 100 мМ ДФХ обнаружились значительные различия (рис. 16). а: а б в

Рис. 16 1H-ISN HSQC спектры ЯМР "М-меченого НЬ-тмл-РФРЭ-БИер в 50 мМ NaP pH б, 10% D20 + 100 мМ ОГ (а), + 100 мМ ДСН (б) и +- 100 мМ ДФХ (в).

Так, в мицеллах нейтрального детергента ОГ разброс резонансов довольно мал (рис. 16 а), что свидетельствует о значительной неупорядоченности His-тмп-РФРЭ-Strep. Однако в мицеллах заряженного (ДСН, рис. 16 б) или цвитгерионного детергента (ДФХ, рис. 16 в) спектр His-тмп-РФРЭ-Strep выглядит иначе: разброс резонансов существенно увеличивается, следовательно, белок становится более упорядоченным. Исходя из данных КД, можно предположить, что наличие отрицательно заряженной группы у молекул детергента необходимо для взаимной укладки элементов вторичной структуры в стабильную третичную структуру: например, путём взаимодействия многочисленных положительно заряженных боковых групп аргининов и лизинов в примембранной области с противоположно заряженными головными группами детергента. При этом петлевые участки сохраняют высокую подвижность; резонансы, относимые к ним, узкие и находятся в районе 8,3 м.д. по оси химических сдвигов протонов. Таким образом, спиральные элементы в составе Н is-TMn-P®P3-Strep, скорее всего, соединены гибкими петлями, обеспечивающими большую подвижность спиралей относительно друг друга,

как было показано ранее для прнмембранного домена (Choowongkomon et al., 2004; Choowongkomon et al., 2005). На основании вышесказанного можно, заключить, ;гго трансмембранный домен РФРЭ не влияет на структуру гибких петель в прилегающей к нему цитоплазматической области.

ВЫВОДЫ

1. Создана плазмидная конструкция, соответствующая цитоплазм этическому домену галобаюериального трансдьюсера 2 (Гтр2-цит, аминокислотные остатки 234-504 Гтр2) из Natronobacterium pharaonis, осуществлена успешная экспрессия мутантного гена в Escherichia colt, разработана система очистки рекомбинанпюго Гтр2-цит с выходом около 10 мг/л клеточной культуры.

2. В разбавленных водных растворах Гтр2-цит обладает высокой конформациопной подвижностью. Спирты, сахара, соли и свободные протоны индуцируют и/или стабилизируют вторичную структуру Гтр2-шгп в случае солей количество а-спиралыюй вторичной структуры и её устойчивость к тепловой денатурации, а также склонность Гф2-цит к агрегации зависят от природы соли. В частности, в растворах 4 M хлоридов щелочных металлов наблюдаемое количество a-спиральных элементов вторичной структуры убывает в ряду Na+ > Li4" > К+ > Rb* > Cs+, а температура денатурации - в ряда Li* > Na* > К+ > Rb+.

3. В разбавленных водных растворах Гтр2-шгг мономерен и имеет цилиндрическую форму с характерными размерами 202±5 А в длину и 14,4±0,б Â в диаметре. При условиях, близким к физиологическим (4 M KCl), Гтр2-цит преимущественно димерен, характерные размеры при сохранении общей формы увеличиваются до 248±7 А и 18,2±0,8 А, соответственно.

4. Создана плазмидная конструкция, соответствующая трансмембраиному + примембранному доменам рецептора фактора роста эпидермиса (тмп-РФРЭ, аминокислотные остатки 615-686 РФРЭ) из Homo sapiens, осуществлена успешная экспрессия мутантного гена в Escherichia coli, разработана система очистки рекомбинантного тмп-РФРЭ с выходом около 5 мг/л клеточной культуры.

5. Тмп-РФРЭ имеет схожее содержание элементов вторичной структуры в мицеллах различных детергентов, существенно отличное от такового в липидном окружении. Третичная структура тмп-РФРЭ различна в разных детергентах даже при количественном совпадении элементов вторичной структуры.

6. Данные настоящей работы указывают на то, что конформационная динамика является общим свойством отдельных областей белков, осуществляющих трансмембранную передачу сигнала,

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ivan Bud va k. Olga Mironova, Vijayalaxmi Manoharan, Georg Büldt, Judith Klein-Seetharaman, Valentín Gordeliy, Ramona Schlesinger

"Studies of Folding Pathways of Halobacterial Transducer from N.pharaonis" y abstracts of the 2nd Biological Language Conference (Carnegie Mellon University, Pittsburgh, PA, USA), November 18-19,2004, p. 84.

2. Ivan Bud yak. Olga Mironova, Vijayalaxmi Manoharan, Georg Billdt, Judith Klein-Seetharaman, Valentin Gordeliy, Ramona Schlesinger

"Biophysical and biochemical characterization of a missing link in the archaeal signaling cascade", abstracts of the 49й1 Annual Biophysical Society Meeting (Long Beach, CA, USA), February 12-16,2005, BiophysJ. (2005): 88 (1). suppl. 2S, p. 361,

3. Ivan Budvak. Vitally Pipich, Olga Mironova, Ramona Schlesinger, Georg BUIdt, Judith Klein-Seetharaman

"Conformational changes and oligomerization state of photophobic transducer, Htrll, from archaeon Natronobacterium pharaonis"% Jülich Centre for Neutron Science (JCNS) Symposium and European User Meeting (Jülich, Germany), February 16-17, 2006, Neutron Scattering at FRJ-2 Experimental Reports 2005/6 (editors: Th. Bröckel, D. Richter, R. Zorn), pp. 381-382.

4. Iva it Bud yak. Naveena Yanamala, Judith Klein-Seetharaman

"Conformational studies of the transmembrane-] uxtamembrane region of the epidermal growth factor reoeptor", abstracts of the 20lh Annual Symposium of The Protein Society (San Diego, CA, USA), August 5-9,2006, Protein Sei. (2006): 15 (1), pp. 160-161.

5. Ivan L. Budvak. Vitally Pipich, Olga S. Mironova, Ramona Schlesinger, Giuseppe Zaccai, and Judith Klein-Seetharaman

"Shape and oligomerization state of the cytoplasmic domain of the phototaxis transducer II from Natronobacterium pharaonis"

Proc. Natl. Acad ScL U.S.A. (2006): 103 (42), pp. 15428-15433.

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Будяк, Иван Леонидович

Оглавление

Список сокращений

Введение

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование структуры и свойств мембранных рецепторов"

Актуальность проблемыВсе живые организмы состоят из клеток. Жизнь каждой клеткинроисходит в тесном взаимодействии с другими клетками и окружающейсредой. Это взаимодействие немыслимо без поступления сигналов извне, ихпередачи, обработки и соответствующей реакции. Таким образом, системыпередачи и обработки сигналов в клетке являются одной из важнейшихобластей исследований современной биологии.В данной работе были изучены два белка: галобактериальныйтрансдьюсер 2 (Гтр2) из Natronobacterium pharaonis и рецептор фактора ростаэпидермиса (РФРЭ) из Homo sapiens. Оба эти белка отвечают затрансмембранную передачу сигнала и выполняют важные функции в клетке.Нас интересовали характерные особенности устройства этих систем,возможность выделить некоторые черты и закономерности, присущие имобоим.Natronobacterium pharaonis относится к царству Архебактерий иявляется типичным экстремальным галофилом, предпочитая для обитанияводоемы с высоким содержанием неорганических солей. При недостаткепитательных веществ и кислорода N.pharaonis осуществляет фотозависимыйсинтез АТФ, при избытке - старается избегать освещенных участков из-зариска фотоокисления ДНК ультрафиолетом. Для этого клеткой синтезируютсясенсорный родопсин 2 (СР2) и Гтр2, образующие в мембране комплекс состехиометрией 2:2 [1]. Носле возбуждения СР2 квантом света рецепторпретерпевает конформационные изменения, которые затем передаются наГтр2 [2]. Трансдьюсер модулирует активность цепи киназ, в конечном счётеопределяющих частоту переключений флагеллярного мотора, что, в своюочередь, влияет на направление движения клетки таким образом, чтобы онаоставалась преимущественно в затенённых областях.10Гтр2 представляет собой 2 трансмембранные спирали и относительнобольшой цитоплазматический домен (Гтр2-цит). Белок имеет высокуюстепень гомологии с эубактериальными хеморецепторами, что говорит об ихфункциональном и эволюционном родстве [3]. Структуры и механизмвзаимодействия СР2 и Гтр2 в мембранной области уже известны, однакодетали передачи сигнала цитоплазматическим доменом до конца не ясны.Таким образом, цитоплазматический домен Гтр2 является недостающимзвеном в понимании работы системы отрицательного фототаксиса вN.pharaonis. Поэтому первая часть работы была посвящена структурнойхарактеризации Гтр2-цит и исследованию фолдинга этой части Гтр2.РФРЭ человека играет важнейшую роль в жизни клетки и организма.Белок состоит из трех основных доменов: внеклеточного, ответственного засвязывание с лигандом, трансмембранного и внутриклеточного, имеющего всвоем составе тирозин-киназу. Связывание лиганда с внеклеточным доменомРФРЭ активирует киназу, запускающую многочисленные сигнальные пути.Отклонения от нормального функционирования грозят глубокиминарушениями в работе клетки вплоть до её злокачественного перерождения[4].Структуры внеклеточного домена РФРЭ и тирозин-киназы известны [57]. Тем не менее, роль трансмембранного домена остается непонятной: онможет быть как пассивным мембранным «якорем», так и активно участвоватьв передаче сигнала. Прилегающая к мембране (примембранная) и богатаяосновными аминокислотными остатками область, следующаянепосредственно за трансмембранным доменом РФРЭ, как было недавнопоказано, тоже имеет важное функциональное значение. Не ясно, однако,какую роль эта область играет в передаче сигнала. Вторая часть даннойработы была посвящена исследованию трансмембранной и прилегающей кмембране областям РФРЭ (тмп-РФРЭ). Также были частично изученывнеклеточный и внутриклеточный домены РФРЭ.

11Цели и задачиЦелями части настоящей работы, посвященной Гтр2-цит, были:- создание экспрессионных плазмидных конструкций, разработка системыэкспрессии и очистки Гтр2-цит;- всестороннее исследование биофизических свойств, особенностей фолдингаи внутримолекулярной динамики белка, его способности к олигомеризациипри разных условиях;- определение структурных параметров Гтр2-цит.Задачи части работы, посвященной РФРЭ, заключались в:- создании экспрессионных плазмидных конструкций, разработке системэкспрессии внеклеточного, внутриклеточного доменов РФРЭ и тмп-РФРЭ иочистки внутриклеточного и тмп-РФРЭ;- конформационном и структурном анализе тмп-РФРЭ при разных физикохимических условиях.Научная новизиаВ ходе работы были исследованы Гтр2-цит из N.pharaonis и различныедомены РФРЭ человека. Основные результаты с точки зрения научнойновизны приведены ниже.Впервые был получен, очищен и исследован при различных физикохимических условиях Гтр2-цит. С помощью КД, ЯМР, ИК Фурьеспектроскопии детально изучена конформационная динамика в белке взависимости от состава растворителя. В работе показано, что в разбавленныхводных растворах Гтр2-цит имеет высокую конформационную подвижность;при этом некоторые соли и спирты способны стабилизировать и/илииндуцировать заметные количества а-спиральных элементов вторичнойструктуры. С помощью МУРН определены форма и размеры Гтр2-цит. Вместес АГФХ и кросс-линкингом это позволило также исследовать способностьГтр2-цит к олигомеризации и агрегации. На основании полученных данных поаналогии с системами хемотаксиса в Escherichia coli и Salmonella typhimurium12предложена модель передачи сигнала в системе фототаксиса экстремальныхгалофилов.Осуществлена экспрессия внеклеточного домена РФРЭ человека вклетках линии C0S-1 из Cercopithecus aethiops, а также экспрессиявнутриклеточного домена этого белка в клетках линии C0S-1 и Escherichiacoli.Тмп-РФРЭ был впервые получен рекомбинантным путем. Для этойконструкции были подобраны оптимальные условия экспрессии в Escherichiacoli и последующей очистки. С помощью КД исследовано содержаниеэлементов вторичной структуры в белке в зависимости от окружения.Методом ЯМР показаны переходы в третичной структуре тмп-РФРЭ вмицеллах детергентов разных типов. Также методом кросс-линкингаопределено олигомерное состояние тмп-РФРЭ и его способность к агрегациив детергентах и липидном окружении.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Будяк, Иван Леонидович

ВЫВОДЫ

1. Создана плазмидная конструкция, соответствующая цитоплазматическому домену галобактериального трансдьюсера 2 (Гтр2-цит, аминокислотные остатки 234-504 Гтр2) из Natronobacterium pharaonis, осуществлена успешная экспрессия мутантного гена в Escherichia coli, разработана система очистки рекомбинантного Гтр2-цит с выходом около 10 мг/л клеточной культуры.

2. В разбавленных водных растворах Гтр2-цит обладает высокой конформационной подвижностью. Спирты, сахара, соли и свободные протоны индуцируют и/или стабилизируют вторичную структуру Гтр2-цит; в случае солей количество а-спиральной вторичной структуры и её устойчивость к тепловой денатурации, а также склонность Гтр2-цит к агрегации зависят от природы соли. В частности, в растворах 4 М хлоридов щелочных металлов наблюдаемое количество а-спиральных элементов вторичной структуры убывает в ряду Na+ > Li+ > К+ > Rb+ > Cs+, а температура денатурации - в ряду Li+ > Na+ > К+ > Rb+.

3. В разбавленных водных растворах Гтр2-цит мономерен и имеет цилиндрическую форму с характерными размерами 202±5 А в длину и 14,4±0,6 А в диаметре. При условиях, близким к физиологическим (4 М КС1), Гтр2-цит преимущественно димерен, характерные размеры при сохранении общей формы увеличиваются до 248±7 А и 18,2±0,8 А, соответственно.

4. Создана плазмидная конструкция, соответствующая трансмембранному + примембранному доменам рецептора фактора роста эпидермиса (тмп-РФРЭ, аминокислотные остатки 615-686 РФРЭ) из Homo sapiens, осуществлена успешная экспрессия мутантного гена в Escherichia coli, разработана система очистки рекомбинантного тмп-РФРЭ с выходом около 5 мг/л клеточной культуры.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Будяк, Иван Леонидович, Москва

1. Gordeliy VI, Labahn J, Moukhametzianov R, Efremov R, Granzin J, Schlesinger R, Buldt G, Savopol T, Scheidig AJ, Klare JP, & Engelhard M2002) Molecular basis of transmembrane signalling by sensory rhodopsin Il-transducer complex. Nature, 419,484-487.

2. Moukhametzianov R, Klare JP, Efremov R, Baeken C, Goppner A, Labahn J, Engelhard M, Buldt G, & Gordeliy VI (2006) Development of the signal in sensory rhodopsin and its transfer to the cognate transducer. Nature, 440, 115-119.

3. Le Moual H & Koshland DE, Jr. (1996) Molecular evolution of the C-terminal cytoplasmic domain of a superfamily of bacterial receptors involved in taxis. J. Mol Biol, 261,568-585.

4. Jorissen RN, Walker F, Pouliot N, Garrett TP, Ward CW, & Burgess AW2003) Epidermal growth factor receptor: mechanisms of activation and signalling. Exp. Cell Res., 284,31-53.

5. Ogiso H, Ishitani R, Nureki O, Fukai S, Yamanaka M, Kim JH, Saito K, Sakamoto A, Inoue M, Shirouzu M, & Yokoyama S (2002) Crystal structure of the complex of human epidermal growth factor and receptor extracellular domains. Cell, 110, 775-787.

6. Stamos J, Sliwkowski MX, & Eigenbrot С (2002) Structure of the epidermal growth factor receptor kinase domain alone and in complex with a 4-anilinoquinazoline inhibitor. J Biol Chem, 277,46265-46272.

7. Heldin CH (1995) Dimerization of cell surface receptors in signal transduction. Cell, 80,213-223.

8. Stock J (1996) Receptor signaling: dimerization and beyond. Curr. Biol., 6, 825-827.

9. Szurmant H & Ordal GW (2004) Diversity in chemotaxis mechanisms among the bacteria and archaea. Microbiol Mol Biol Rev., 68,301-319.

10. Hoff WD, Jung KH, & Spudich JL (1997) Molecular mechanism of photosignaling by archaeal sensory rhodopsins. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 26,223-258.

11. Luecke H, Schobert B, Richter HT, Cartailler JP, & Lanyi JK (1999) Structure of bacteriorhodopsin at 1.55 A resolution. J. Mol. Biol., 291, 899911.

12. Kolbe M, Besir H, Essen LO, & Oesterhelt D (2000) Structure of the light-driven chloride pump halorhodopsin at 1.8 A resolution. Science, 288, 1390-1396.

13. Royant A, Nollert P, Edman K, Neutze R, Landau EM, Pebay-Peyroula E, & Navarro J (2001) X-ray structure of sensory rhodopsin II at 2.1-A resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 98, 10131-10136.

14. Kamo N, Shimono K, Iwamoto M, & Sudo Y (2001) Photochemistry and photoinduced proton-transfer by pharaonis phoborhodopsin. Biochemistry (.Mosc.), 66, 1277-1282.

15. Hirayama J, Imamoto Y, Shichida Y, Kamo N, Tomioka H, & Yoshizawa T (1992) Photocycle of phoborhodopsin from haloalkaliphilic bacterium (Natronobacterium pharaonis) studied by low-temperature spectrophotometry. Biochemistry, 31,2093-2098.

16. Yang CS, Sineshchekov O, Spudich EN, & Spudich JL (2004) The cytoplasmic membrane-proximal domain of the Htrll transducer interacts with the E-F loop of photoactivated Natronomonas pharaonis sensory rhodopsin II. J. Biol. Chem., 279,42970-42976.

17. Bergo VB, Spudich EN, Rothschild KJ, & Spudich JL (2005) Photoactivation perturbs the membrane-embedded contacts between sensory rhodopsin II and its transducer. J. Biol. Chem., 280,28365-28369.

18. Falke JJ & Hazelbauer GL (2001) Transmembrane signaling in bacterial chemoreceptors. Trends Biochem. Sci., 26,257-265.

19. Kim KK, Yokota H, & Kim SH (1999) Four-helical-bundle structure of the cytoplasmic domain of a serine chemotaxis receptor. Nature, 400, 787-792.

20. Chi YI, Yokota H, & Kim SH (1997) Apo structure of the ligand-binding domain of aspartate receptor from Escherichia coli and its comparison with ligand-bound or pseudoligand-bound structures. FEBSLett., 414,327-332.

21. Kim SH, Wang W, & Kim KK (2002) Dynamic and clustering model of bacterial chemotaxis receptors: structural basis for signaling and high sensitivity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 99,11611-11615.

22. Lybarger SR & Maddock JR (1999) Clustering of the ehemoreeeptor complex in Escherichia coli is independent of the methyltransferase CheR and the methylesterase CheB. J. Bacteriol., 181, 5527-5529.

23. Homma M, Shiomi D, Homma M, & Kawagishi I (2004) Attractant binding alters arrangement of ehemoreeeptor dimers within its cluster at a cell pole. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 101,3462-3467.

24. Ames P, Studdert CA, Reiser RH, & Parkinson JS (2002) Collaborative signaling by mixed ehemoreeeptor teams in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 99,7060-7065.

25. Gardina PJ & Manson MD (1996) Attractant signaling by an aspartate ehemoreeeptor dimer with a single cytoplasmic domain. Science, 274,425426.

26. Tatsuno I, Homma M, Oosawa K, & Kawagishi I (1996) Signaling by the Escherichia coli aspartate ehemoreeeptor Tar with a single cytoplasmic domain per dimer. Science, 274,423-425.

27. Francis NR, Wolanin PM, Stock JB, Derosier DJ, & Thomas DR (2004) Three-dimensional structure and organization of a receptor/signaling complex. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S A, 101, 17480-17485.

28. Milburn MV, Prive GG, Milligan DL, Scott WG, Yeh J, Jancarik J, Koshland DE, Jr., & Kim SH (1991) Three-dimensional structures of the ligand-binding domain of the bacterial aspartate receptor with and without a ligand. Science, 254,1342-1347.

29. Jung KH, Spudich EN, Trivedi VD, & Spudich JL (2001) An archaeal photosignal-transducing module mediates phototaxis in Escherichia coli. J. Bacteriol., 183,6365-6371.

30. Trivedi VD & Spudich JL (2003) Photostimulation of a sensory rhodopsin II/HtrII/Tsr fusion chimera activates CheA-autophosphorylation and CheY-phosphotransfer in vitro. Biochemistry, 42, 13887-13892.

31. Ottemann KM, Xiao W, Shin YK, & Koshland DE, Jr. (1999) A piston model for transmembrane signaling of the aspartate receptor. Science, 285, 1751-1754.

32. Kim SH (1994) "Frozen" dynamic dimer model for transmembrane signaling in bacterial chemotaxis receptors. Protein Sci., 3,159-165.

33. Lynch BA & Koshland DE, Jr. (1992) The fifth Datta Lecture. Structural similarities between the aspartate receptor of bacterial chemotaxis and the trp repressor of E. coli. Implications for transmembrane signaling. FEBS Lett., 307,3-9.

34. Chervitz SA & Falke JJ (1996) Molecular mechanism of transmembrane signaling by the aspartate receptor: a model. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 93,2545-2550.

35. Yeh JI, Biemann HP, Prive GG, Pandit J, Koshland DE, Jr., & Kim SH (1996) High-resolution structures of the ligand binding domain of the wild-type bacterial aspartate receptor. J. Mol. Biol, 262,186-201.

36. Cochran AG & Kim PS (1996) Imitation of Escherichia coli aspartate receptor signaling in engineered dimers of the cytoplasmic domain. Science, 271,1113-1116.

37. Liu Y, Levit M, Lurz R, Surette MG, & Stock JB (1997) Receptor-mediated protein kinase activation and the mechanism of transmembrane signaling in bacterial chemotaxis. EMBOJ, 16, 7231-7240.

38. Zhang С & Kim SH (2000) The effect of dynamic receptor clustering on the sensitivity of biochemical signaling. Рас. Symp. Biocomput., 353-364.

39. Oprian DD (2003) Phototaxis, chemotaxis and the missing link. Trends Biochem. Sci., 28, 167-169.

40. Falke JJ, Dernburg AF, Sternberg DA, Zalkin N, Milligan DL, & Koshland DE, Jr. (1988) Structure of a bacterial sensory receptor. A site-directed sulfhydryl study. J. Biol. Chem., 263,14850-14858.

41. Hughson AG & Hazelbauer GL (1996) Detecting the conformational change of transmembrane signaling in a bacterial chemoreceptor by measuring effects on disulfide cross-linking in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A, 93,11546-11551.

42. Chervitz SA & Falke JJ (1995) Lock on/off disulfides identify the transmembrane signaling helix of the aspartate receptor. J. Biol. Chem., 270,24043-24053.

43. Bass RB & Falke JJ (1998) Detection of a conserved alpha-helix in the kinase-docking region of the aspartate receptor by cysteine and disulfide scanning. J Biol Chem, 273,25006-25014.

44. Bass RB, Coleman MD, & Falke JJ (1999) Signaling domain of the aspartate receptor is a helical hairpin with a localized kinase docking surface: cysteine and disulfide scanning studies. Biochemistry, 38,93179327.

45. Danielson MA, Bass RB, & Falke JJ (1997) Cysteine and disulfide scanning reveals a regulatory alpha-helix in the cytoplasmic domain of the aspartate receptor. J. Biol. Chem., 272,32878-32888.

46. Trammell MA & Falke JJ (1999) Identification of a site critical for kinase regulation on the central processing unit (CPU) helix of the aspartate receptor. Biochemistry, 38,329-336.

47. Seeley SK, Wittrock GK, Thompson LK, & Weis RM (1996) Oligomers of the cytoplasmic fragment from the Escherichia coli aspartate receptor dissociate through an unfolded transition state. Biochemistry, 35,1633616345.

48. Wu J, Long DG, & Weis RM (1995) Reversible dissociation and unfolding of the Escherichia coli aspartate receptor cytoplasmic fragment. Biochemistry, 34,3056-3065.

49. Seeley SK, Weis RM, & Thompson LK (1996) The cytoplasmic fragment of the aspartate receptor displays globally dynamic behavior. Biochemistry, 35,5199-5206.

50. Klare JP, Gordeliy VI, Labahn J, Buldt G, Steinhoff HJ, & Engelhard M (2004) The archaeal sensory rhodopsin II/transducer complex: a model for transmembrane signal transfer. FEBSLett., 564,219-224.

51. Bordignon E, Klare JP, Doebber M, Wegener AA, Martell S, Engelhard M, & Steinhoff HJ (2005) Structural analysis of a hamp domain: The linker region of the phototransducer in complex with sensory Rhodopsin II. J Biol. Chem.

52. Yarden Y & Sliwkowski MX (2001) Untangling the ErbB signalling network. Nat. Rev Mol Cell Biol, 2,127-137.

53. Olayioye MA, Neve RM, Lane HA, & Hynes NE (2000) The ErbB signaling network: receptor heterodimerization in development and cancer. EMBOJ, 19,3159-3167.

54. Burgess AW, Cho HS, Eigenbrot C, Ferguson KM, Garrett TP, Leahy DJ, Lemmon MA, Sliwkowski MX, Ward CW, & Yokoyama S (2003) An open-and-shut case? Recent insights into the activation of EGF/ErbB receptors. Mol Cell, 12, 541-552.

55. Choowongkomon К, Carlin CR, & Sonnichsen FD (2005) A structural model for the membrane-bound form of the juxtamembrane domain of the epidermal growth factor receptor. J Biol. Chem, 280,24043-24052.

56. Gerber D, Sal-Man N, & Shai Y (2004) Two motifs within a transmembrane domain, one for homodimerization and the other for heterodimerization. J. Biol. Chem., 279, 21177-21182.

57. Sharpe S, Barber KR, & Grant CW (2002) Interaction between ErbB-1 and ErbB-2 transmembrane domains in bilayer membranes. FEBSLett., 519, 103-107.

58. Mendrola JM, Berger MB, King MC, & Lemmon MA (2002) The single transmembrane domains of ErbB receptors self-associate in cell membranes. J. Biol. Chem., 277,4704-4712.

59. Sharpe S, Barber KR, & Grant CW (2002) Evidence of a tendency to self-association of the transmembrane domain of ErbB-2 in fluid phospholipid bilayers. Biochemistry, 41,2341-2352.

60. Stanley AM & Fleming KG (2005) The transmembrane domains of ErbB receptors do not dimerize strongly in micelles. J. Mol. Biol., 347, 759-772.

61. Rigby AC, Grant CW, & Shaw GS (1998) Solution and solid state conformation of the human EGF receptor transmembrane region. Biochim Biophys Acta, 1371,241-253.

62. Aifa S, Aydin J, Nordvall G, Lundstrom I, Svensson SP, & Hermanson О (2005) A basic peptide within the juxtamembrane region is required for EGF receptor dimerization. Exp. Cell Res., 302,108-114.

63. Kil SJ & Carlin С (2000) EGF receptor residues leu(679), leu(680) mediate selective sorting of ligand-receptor complexes in early endosomal compartments. J. Cell Physiol, 185,47-60.

64. Martin-Nieto J & Villalobo A (1998) The human epidermal growth factor receptor contains a juxtamembrane calmodulin-binding site. Biochemistry, 37, 227-236.

65. Hubbard SR (1997) Crystal structure of the activated insulin receptor tyrosine kinase in complex with peptide substrate and ATP analog. EMBO J., 16,5572-5581.

66. Ge G, Wu J, Wang Y, & Lin Q (2002) Activation mechanism of solubilized epidermal growth factor receptor tyrosine kinase. Biochem. Biophys. Res. Commun., 290,914-920.

67. Sako Y, Minoghchi S, & Yanagida T (2000) Single-molecule imaging of EGFR signalling on the surface of living cells. Nat. Cell Biol., 2,168-172.

68. Moriki T, Maruyama H, & Maruyama IN (2001) Activation of preformed EGF receptor dimers by ligand-induced rotation of the transmembrane domain. J. Mol. Biol., 311, 1011-1026.

69. Yu X, Sharma KD, Takahashi T, Iwamoto R, & Mekada E (2002) Ligand-independent dimer formation of epidermal growth factor receptor (EGFR) is a step separable from ligand-induced EGFR signaling. Mol. Biol. Cell, 13, 2547-2557.

70. Schlessinger J (2000) Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell, 103, 211-225.

71. Honegger AM, Schmidt A, Ullrich A, & Schlessinger J (1990) Evidence for epidermal growth factor (EGF)-induced intermolecular autophosphorylation of the EGF receptors in living cells. Mol. Cell Biol., 10,4035-4044.

72. Zelic B, Vasic-Racki D, Wandrey C, & Takors R (2004) Modeling of the pyruvate production with Escherichia coli in a fed-batch bioreactor. Bioprocess Biosyst. Eng, 26,249-258.

73. Oprian DD, Molday RS, Kaufman RJ, & Khorana HG (1987) Expression of a synthetic bovine rhodopsin gene in monkey kidney cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 84, 8874-8878.

74. Reeves PJ, Kim JM, & Khorana HG (2002) Structure and function in rhodopsin: a tetracycline-inducible system in stable mammalian cell lines for high-level expression of opsin mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 99, 13413-13418.

75. Chen С & Okayama H (1987) High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Mol. Cell Biol., 7,2745-2752.

76. O'Mahoney JV & Adams ТЕ (1994) Optimization of experimental variables influencing reporter gene expression in hepatoma cells following calcium phosphate transfection. DNA Cell Biol., 13,1227-1232.

77. Laemmli UK (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227,680-685.

78. Sreerama N & Woody RW (2000) Estimation of protein secondary structure from circular dichroism spectra: comparison of CONTIN, SELCON, and CDSSTR methods with an expanded reference set. Anal Biochem., 287, 252-260.

79. Sreerama N, Venyaminov SY, & Woody RW (2000) Estimation of protein secondary structure from circular dichroism spectra: inclusion of denatured proteins with native proteins in the analysis. Anal Biochem., 287, 243-251.

80. Chataway TK & Barritt GJ (1995) Detection of a 65 kDa ras binding protein in rat and sheep brain cytosol using a chemical cross linking agent. Mol Cell Biochem., 145, 111-120.

81. Mattson G, Conklin E, Desai S, Nielander G, Savage MD, & Morgensen S (1993) A practical approach to crosslinking. Mol Biol Rep., 17,167-183.

82. Rudolph J & Oesterhelt D (1996) Deletion analysis of the che operon in the archaeon Halobacterium salinarium. J. Mol. Biol., 258, 548-554.

83. Spudich EN, Hasselbacher С A, & Spudich JL (1988) Methyl-accepting protein associated with bacterial sensory rhodopsin I. J. Bacterid., 170, 4280-4285.

84. Sundberg SA, Bogomolni RA, & Spudich JL (1985) Selection and properties of phototaxis-deficient mutants of Halobacterium halobium. J. Bacteriol., 164,282-287.

85. Terwilliger TC, Wang JY, & Koshland DE, Jr. (1986) Surface structure recognized for covalent modification of the aspartate receptor in chemotaxis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 83,6707-6710.

86. Perazzona В & Spudich JL (1999) Identification of methylation sites and effects of phototaxis stimuli on transducer methylation in Halobacterium salinarum. J. Bacteriol., 181, 5676-5683.

87. Wilkins MR, Lindskog I, Gasteiger E, Bairoch A, Sanchez JC, Hochstrasser DF, & Appel RD (1997) Detailed peptide characterization using PEPTIDEMASS-a World-Wide-Web-accessible tool. Electrophoresis, 18, 403-408.

88. Hirst JD & Brooks CL, III (1994) Helicity, circular dichroism and molecular dynamics of proteins. J. Mol. Biol., 243, 173-178.

89. Timasheff SN (1993) The control of protein stability and association by weak interactions with water: how do solvents affect these processes? Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 22,67-97.

90. Timasheff SN (1998) Control of protein stability and reactions by weakly interacting cosolvents: the simplicity of the complicated. Adv. Protein Chem., 51, 355-432.

91. Christian JH & Waltho J A (1962) Solute concentrations within cells of halophilic and non-halophilic bacteria. Biochim Biophys Acta, 65, 506-508.

92. Lai MC & Gunsalus RP (1992) Glycine betaine and potassium ion are the major compatible solutes in the extremely halophilic methanogen Methanohalophilus strain Z7302. JBacteriol., 174, 7474-7477.

93. Madern D, Ebel C, & Zaccai G (2000) Halophilic adaptation of enzymes. Extremophiles., 4,91-98.

94. Zinchenko AA & Yoshikawa К (2005) Na+ shows a markedly higher potential than K+ in DNA compaction in a crowded environment. Biophys. J., 88,4118-4123.

95. Consonni R, Zetta L, Longhi R, Toma L, Zanaboni G, & Tenni R (2000) Conformational analysis and stability of collagen peptides by CD and by 1H- and 13C-NMR spectroscopies. Biopolymers, 53,99-111.

96. Dyson HJ & Wright PE (2001) Nuclear magnetic resonance methods for elucidation of structure and dynamics in disordered states. Methods Enzymol., 339,258-270.

97. Arrondo JL, Muga A, Castresana J, & Goni FM (1993) Quantitative studies of the structure of proteins in solution by Fourier-transform infrared spectroscopy. Prog. Biophys Mol. Biol., 59,23-56.

98. Jackson M & Mantsch HH (1995) The use and misuse of FTIR spectroscopy in the determination of protein structure. Crit Rev. Biochem Mol. Biol., 30,95-120.

99. Pribic R, van Stokkum IH, Chapman D, Haris PI, & Bloemendal M (1993) Protein secondary structure from Fourier transform infrared and/or circular dichroism spectra. Anal. Biochem, 214,366-378.

100. Heimburg T, Schuenemann J, Weber K, & Geisler N (1996) Specific recognition of coiled coils by infrared spectroscopy: analysis of the three structural domains of type III intermediate filament proteins. Biochemistry, 35, 1375-1382.

101. Reisdorf WC, Jr. & Krimm S (1996) Infrared amide Г band of the coiled coil. Biochemistry, 35,1383-1386.

102. Long DG & Weis RM (1992) Oligomerization of the cytoplasmic fragment from the aspartate receptor of Escherichia coli. Biochemistry, 31,99049911.

103. Timmins PA & Zaccai G (1988) Low resolution structures of biological complexes studied by neutron scattering. Eur. Biophys. J., 15,257-268.

104. Svergun D, Barberato C, & Koch MHJ (1995) CRYSOL A program to evaluate x-ray solution scattering of biological macromolecules from atomic coordinates. Journal of Applied Crystallography, 28, 768-773.

105. Beaucage G (1996) Small-angle scattering from polymeric mass fractals of arbitrary mass-fractal dimension. Journal of Applied Crystallography, 29, 134-146.

106. Guinier A & Fournet G (1955) Small Angle Scattering of X-rays. Wiley, New York.

107. Svergun DI, Richard S, Koch MH, Sayers Z, Kuprin S, & Zaccai G (1998) Protein hydration in solution: experimental observation by x-ray and neutron scattering. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 95,2267-2272.

108. Jacrot В (1976) Study of Biological Structures by Neutron-Scattering from Solution. Reports on Progress in Physics, 39,911-953.

109. Deleage G & Roux В (1987) An algorithm for protein secondary structure prediction based on class prediction. Protein Eng, 1,289-294.

110. Geourjon С & Deleage G (1995) SOPMA: significant improvements in protein secondary structure prediction by consensus prediction from multiple alignments. Comput. Appl. Biosci., 11, 681-684.

111. Combet C, Blanchet C, Geourjon C, & Deleage G (2000) NPS@: network protein sequence analysis. Trends Biochem Sci., 25, 147-150.

112. Lupas A, Van Dyke M, & Stock J (1991) Predicting coiled coils from protein sequences. Science, 252, 1162-1164.

113. Romero P, Obradovic Z, Li X, Garner EC, Brown CJ, & Dunker AK (2001) Sequence complexity of disordered protein. Proteins, 42,38-48.

114. Thomson R, Hodgman TC, Yang ZR, & Doyle AK (2003) Characterizing proteolytic cleavage site activity using bio-basis function neural networks. Bioinformatics, 19, 1741-1747.

115. Thomson R & Esnouf R (2004) Prediction of natively disordered regions in proteins using a bio-basis function neural network. Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg.

116. Bateman A, Coin L, Durbin R, Finn RD, Hollich V, Griffiths-Jones S, Khanna A, Marshall M, Moxon S, Sonnhammer EL, Studholme DJ, Yeats C, & Eddy SR (2004) The Pfam protein families database. Nucleic Acids Res., 32, D138-D141.

117. Greenfield NJ & Hitchcock-DeGregori SE (1993) Conformational intermediates in the folding of a coiled-coil model peptide of the N-terminus of tropomyosin and alpha alpha-tropomyosin. Protein Sci., 2, 1263-1273.

118. Maruyama IN, Mikawa YG, & Maruyama HI (1995) A model for transmembrane signalling by the aspartate receptor based on random-cassette mutagenesis and site-directed disulfide cross-linking. J. Mol. Biol., 253,530-546.

119. Jones DH, Rigby AC, Barber KR, & Grant CW (1997) Oligomerization of the EGF receptor transmembrane domain: a 2H NMR study in lipid bilayers. Biochemistry, 36, 12616-12624.

120. Jones DH, Barber KR, VanDerLoo EW, & Grant CW (1998) Epidermal growth factor receptor transmembrane domain: 2H NMR implications for orientation and motion in a bilayer environment. Biochemistry, 37, 1678016787.

121. Pike LJ & Casey L (2002) Cholesterol levels modulate EGF receptor-mediated signaling by altering receptor function and trafficking. Biochemistry, 41, 10315-10322.

122. Pike LJ, Han X, & Gross RW (2005) Epidermal growth factor receptors are localized to lipid rafts that contain a balance of inner and outer leaflet lipids: a shotgun lipidomics study. J. Biol. Chem., 280,26796-26804.

123. Stork M, Giese A, Kretzschmar HA, & Tavan P (2005) Molecular dynamics simulations indicate a possible role of parallel beta-helices in seeded aggregation ofpoly-Gln. Biophys. J., 88,2442-2451.

124. Estrada LD & Soto С (2006) Inhibition of protein misfolding and aggregation by small rationally-designed peptides. Curr. Pharm. Des, 12, 2557-2567.

125. Houliston RS, Hodges RS, Sharom FJ, & Davis JH (2004) Characterization of the proto-oncogenic and mutant forms of the transmembrane region of Neu in micelles. J. Biol. Chem., 279,24073-24080.1. БЛАГОДАРНОСТИ

126. Техническую поддержку работы осуществляли Илона Риттер (Ilona Ritter), Кристиан Бакен (Christian Baeken) и Саша Лееман (Sascha Lehmann).

127. Эффективное решение многочисленных административных проблем является заслугой Биргит Герман (Birgit Gehrmann) и Анны Паулюс (Anna Paulus).

128. Наконец, я говорю спасибо своей жене и коллеге, к.ф.-м.н. Ольге Сергеевне Мироновой, поддерживавшей меня и помогавшей мне на всех этапах подготовки и написания диссертационной работы. Любовь и забота, постоянно окружавшие меня, воистину творили чудеса.

Информация о работе

Будяк, Иван Леонидович
кандидата физико-математических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.02

Диссертация

Исследование структуры и свойств мембранных рецепторов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы