Исследование структурных основ субстратной специфичности карбоксипептидазы T Thermoactinomyces vulgaris

Гришин, Андрей Михайлович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование структурных основ субстратной специфичности карбоксипептидазы T Thermoactinomyces vulgaris
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование структурных основ субстратной специфичности карбоксипептидазы T Thermoactinomyces vulgaris"

На правах рукописи

0034524TY Гришин Андрей Михайлович

Исследование структурных основ субстратной специфичности карбоксипептидазы Т Thermoactinomyces

vulgaris

03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 з "л^ 20Q3

Москва - 2008

003452477

Работа выполнена в лаборатории химии белка им. В.М. Степанова в Федеральном государственном унитарном предприятии «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» (ФГУП «ГосНИИгенетика»).

Научный руководитель

кандидат химических наук Акпаров Валерий Халильбекович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Вейко Владимир Петрович

профессор

ФГУП «ГосНИИгенетика»

доктор химических наук, Румш Лев Давыдович

профессор

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. • Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Ведущая организация Кафедра химии природных

соединений химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Защита состоится <<Л^Г» ^'НзА^ 2008 года в 14 ч 00 мин на заседании диссертационного совета Д.21^.013.01 при Федеральном государственном унитарном предприятии «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545, Москва, 1-й Дорожный пр., д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИгенетика».

Автореферат разослан «В » 2008 г.

Ученый секретарь ^р Заиграева Г.Г.

диссертационного совета,

кандидат биологических наук —

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. В течение последних 20 лет происходило становление и развитие науки о конструировании ферментов с желаемыми характеристиками - энзиматической инженерии. Своему развитию эта область знания обязана революционным переменам в генной инженерии, позволяющей теперь производить любые изменения первичной структуры белка, секвенированию геномов, проекту «функциональная геномика» и развитию структурных методов исследования, благодаря которым необыкновенно расширилась база данных первичных и третичных структур ферментов. Огромные возможности для визуализации и анализа структурной информации дает развитие компьютерной техники.

Получение ферментов с промышленно важными свойствами и, в частности, с измененной субстратной специфичностью стало одной из целей коммерческой энзимологии вследствие таких отличительных черт ферментативного катализа, как специфичность, работа в мягких условиях, способность катализировать реакции, которые невозможно осуществить методами классической химии, совместимость с окружающей средой. Однако успех создания таких ферментов напрямую зависит от глубины нашего понимания ферментативного катализа и, в частности, от адекватности теории, объясняющей субстратную специфичность.

На сегодняшний день существует большое число примеров успешного получения ферментов с измененной селективностью действия. Однако примеров неудач также много. Вследствие этого исследование ферментов, чью селективность сложно объяснить на основе имеющейся теории, представляет особый интерес, поскольку это способствует углублению наших знаний о взаимосвязи их структуры и специфичности. Такие фундаментальные исследования, в конечном счете, приведут к созданию эффективной технологии получения новых биокатализаторов. Настоящая работа относится к их числу.

Метаплокарбоксипептидаза Т Thermoactinomyces vulgaris (КПТ), открытая в нашей лаборатории, отличается от других охарактеризованных метаплокарбоксипептидаз (МКП), таких как карбоксипептидаза А (КПА), карбоксипептидаза В (КПВ) и карбоксипептидаза О (КПО), тем, что на основании имеющейся трехмерной структуры фермента ее субстратную

селективность сложно объяснить с позиций теории специфичности МКП. Карманы первичной специфичности КПТ и КПВ устроены сходно: оба обладают отрицательно заряженным остатком Asp и достаточно полярны. Тем не менее, если КПВ обладает узкой селективностью к субстратам с С-концевыми положительно заряженными остатками, то КПТ наиболее активна по субстратам с С-концевыми гидрофобными остатками. Активность по положительно заряженным субстратам у КПТ на два порядка хуже, чем у КПВ. Несмотря на присутствие отрицательного заряда в S1'-субсайте, КПТ отщепляет С-концевую Glu лучше, чем С-концевой Arg. Наличие трехмерных структур для обоих ферментов делает возможным выявление структурных детерминант, ответственных за те или иные особенности субстратной селективности КПТ, что может открыть путь для направленного изменения КПТ и получения на ее основе микробного фермента со специфичностью промышленно важной карбоксипептидазы В. В связи с этим исследование структурных основ субстратной специфичности КПТ является актуальным.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось изучение роли аминокислотных остатков S1'-субсайта КПТ в определении субстратной специфичности фермента и поиск новых, не известных до настоящего момента, детерминант субстратной специфичности КПТ.

В соответствии с этой целью решались следующие задачи: конструирование мутантов КПТ с предполагаемой измененной селективностью действия на основе компьютерного анализа структур КПТ, КПА и КПВ; получение мутантных генов КПТ; экспрессия, ренатурация, активация и очистка мутантных белков; сравнительный анализ энзиматических и структурных свойств вариантов КПТ.

Научная новизна и практическая значимость работы. В ходе работы было получено и исследовано 12 вариантов КПТ, несущих замены в активном центре фермента и непосредственной близости от него. Впервые получен вариант КПТ, состав сорбционного центра которого полностью воспроизводит сорбционный центр КПВ, и изучены его кинетические и другие физико-химические характеристики. Показано, что имплантация сорбционного центра КПВ в КПТ не изменяет селективности действия

последней. В то же время имплантация в КПТ основных структурных детерминант субстратной специфичности КПА и КПО (варианты КПТ D253G/T255I, а также КПТ D253G/T255K и КПТ D253G/T255R) позволила приблизить кинетические характеристики КПТ к КПА и заставила КПТ D253G/T255R гидролизовать преимущественно субстраты с отрицательно заряженной С-концевой аминокислотой (специфичность КПО).

Впервые показана роль остатка Leu247 и структурного кальция как детерминант субстратной специфичности КПТ.

Практическая значимость работы. Данная работа закладывает основы для получения микробных металлокарбоксипептидаз с уникальными свойствами, важными для использования этих ферментов в биотехнологических процессах.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на 31-м Конгрессе Федерации европейских биохимических обществ (Стамбул, Турция, 2006), Международной школе-конференции для молодых ученых «Системная биология и биоинженерия» (Москва, Россия, 2005), XVIII Зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, Россия, 2006), 10-й Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, Московская обл., Россия, 2006), Третьей международной научно-практической школе-конференции МЕДБИОТЕК-2006 «Актуальные вопросы инновационной деятельности в биологии и медицине» (Москва, Россия, 2006), VI Симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, Россия, 2007), III Симпозиуме «Белки и пептиды» (Пущино, Московская обл., Россия, 2007), 11-й Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, Московская обл., Россия, 2007).

Диссертационная работа была апробирована на заседании секции молекулярной биологии Ученого совета ФГУП «ГосНИИгенетика» 03 июня 2008 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе две статьи.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, список сокращений, обзор литературы, материалы и

методы, результаты, обсуждение результатов, выводы, список публикаций по теме диссертации и список использованной литературы. Работа изложена на 224 страницах машинописного текста, включая 29 рисунков и девять таблиц. Список цитируемой литературы содержит 298 источников, в том числе девять на русском языке.

Основное содержание работы 1. Получение, очистка и определение кинетических характеристик КПТ дикого типа и ее мутантов

В работе исследуются кинетические характеристики 12 вариантов КПТ. Ген срТ, кодирующий прокарбоксипептидазу Т дикого типа, был выделен из Thermoactinomyces vulgaris ранее (Smulevitch et al, 1991). Для получения мутантов гена срТ был использован метод ПЦР-мутагенеза с удлинением перекрывающихся фрагментов. Мутантные гены КПТ, кодирующие желаемые замены аминокислотных остатков, были клонированы в вектор pet23a и поставлены под контроль Т7-промотора. Экспрессию генов осуществляли в штамме E.coli BL21(pLysS)DE3 в виде телец включения в количестве около 50% от общего белка. Тела включения растворяли в 8М мочевине и ренатурировали 10-кратным разбавлением в буфере состава 50 мМ Трис-HCl рН 8,0,30%-ный глицерин (V/V), 0,5 М NaCI, 10 мМ СаС12. Проферменты активировали субтилизином 72, который по окончании реакции ингибировали диизопропилфторфосфатом. Активированные ферменты очищали аффинной хроматографией на CABS-сефарозе (табл. 1).

Таблица 1

Выход и чистота КПТ на различных стадиях процесса ренатурации,

активации и очистки

Стадия Общий выход, %

Растворение в 8М мочевине 100

Ренатурация КПТ в буфере и 14

Первое концентрирование

Обработка субтилизином 7,5

Второе концентрирование 4,5

Аффинная хроматография 3

Выход ренатурированного, активированного и очищенного фермента составил около 3% от суммарного белка тел включения и около 9 мг на литр культуральной жидкости как для КПТ дикого типа, так и для всех ее мутантов. Конечная чистота вариантов была не менее 95% по данным

ДС№-ПААГ-электрофореза. Полученные таким образом препараты ферментов не содержали примеси субтилизина.

— КПТМ

— КПТ5

— КПТ6

— КПТ 02530

— КПТ 02536/Т2551 —КПТ 0253С/Т255К

КПТ 0253С/Т255Р

длина волны (нм)

Рис. 1. Спектры кругового дихроизма КПТ дикого типа и ее вариантов. Молярная эллиптичность [9] выражена в град см2 децимоль"1

Для определения кинетических характеристик КПТ использовали трипептидные субстраты 2ААЬ (активность фермента по А-типу), БпрААЯ - (активность фермента по В-типу) и Последний

позволяет детектировать активность глутамат-специфичных карбоксипептидаз. Кинетика гидролиза этих субстратов вариантами КПТ подчинялась уравнению Михаэлиса-Ментен за исключением гидролиза гААЕ мутантом КПТ Ь247Ы.

Все исследованные в работе варианты КПТ были ренатурированы с выходами, сравнимыми с выходом ренатурации фермента дикого типа, обладали устойчивостью к действию субтилизина, способностью связываться с аффинным сорбентом и характеризовались наличием высокой удельной энзиматической активности. Кроме того, спектры кругового дихроизма вариантов были весьма схожи с таковым КПТ дикого типа (рис. 1). Состав вторичной структуры, рассчитанный для КПТМ: 3536% аминокислотных остатков в а-конформации и 14-19% остатков в р-конформации, хорошо согласовался с данными рентгеноструктурного

анализа: 37 и 14% соответственно. Все эти данные предполагают правильный фодцинг вариантов.

2. Изучение роли аминокислотных остатков Sl'-субсайта на субстратную специфичность КПТ

2.1. Роль Asp253

При связывании с метаплокарбоксипептидазой боковой радикал С-концевого остатка субстрата погружается в полость, называемую S1'-субсайтом зоны связывания, или «карманом» первичной специфичности фермента. Взаимодействие семи остатков, выстилающих поверхность кармана первичной специфичности, с боковым радикалом С-концевого остатка субстрата определяет субстратную специфичность МКП: остатки 203, 207, 243, 250, 253, 255 и 268 (нумерация КПА). При этом остаток в положении 255, как полагают, является ключевым для дискриминации гидрофобных и заряженных субстратов (табл. 2).

Исследования КПВ, включающие рентгеноструктурный анализ и сайт-направленный мутагенез остатков кармана первичной специфичности, выявили ведущую роль Asp255 в связывании гуанидиновой группы С-концевого аргинина субстрата.

КПТ также способна связывать субстраты с С-концевым Arg, и в ее S1'-субсайте присутствует остаток Asp, хотя он расположен в отличном от 255 положении 253. Несмотря на различие в положении этих остатков у КПТ и КПВ предполагалось, что оба они функционируют одинаково.

Удаление отрицательного заряда из зоны связывания КПТ путем замены Asp253 на Gly (КПТ D253G) привело к ожидаемым изменениям кинетических параметров КПТ D253G (табл. 3 и табл. 4). Так, активность этого варианта на субстрате с С-концевым Arg упала примерно в 10 раз. В противоположность этому эффективность гидролиза отрицательно заряженного субстрата увеличилась в 6,5 раз. Это доказывает роль остатка Asp253 в связывании положительного и отталкивании отрицательного заряда аргининового и глутаматного субстратов соответственно.

Таблица 2

Аминокислотные остатки, определяющие субстратную специфичность МКП. Аминокислотные замены, внесенные в 81 '-субсайт

КПТ

Аминокислотный остаток (нумерация КПА)

Фермент 203 207 243 250 253 255 268

КПА Ьеи ау Не А1а ау Не ТЬг

КПВ Ьеи Бег ау А 1а Ыу Азр ТЬг

КПО Ьеи А1а ТЬг ау Агё ТЬг

КПТ Ьеи Оу А1а ТЬг Азр ТЬг ТЬг

КПТ Б253С ау

КПТ Б253С/Т2551 ау Не

КПТ 0253в/Т255К в1у Ьув

КПТ 02530/Т255Я в1у А^

КПТ1 ау

КПТ2 Оу А^р

КПТЗ ау й1у Авр

КПТ4 Бег Оу ау Аяр

КПТ5 8ег Оу А1а ау А$р

Примечание. Жирным шрифтом показаны аминокислотные остатки, которым приписывается ключевая роль в определении субстратной специфичности. Для мутантов КПТ показаны лишь замененные аминокислотные остатки.

Таким образом, Авр253 действительно функционирует и как позитивная, и как негативная детерминанта субстратной специфичности КПТ.

Таблица 3

Кинетические параметры КПТ и ее вариантов8

DnpAAR ZAAL ZAAE

Фермент кш, kcat> ^са/Кш» кш, kcat, кса/Кщ» кт, kcat» kcat/Km,

мМ с"1 М-'с1 мМ с"1 М-'с"1 мМ с"1 М-'с"1

КПА8 с С С 0,012 35 2900000 с с С

КПВг 0,07 35 500000 С С С с с С

KllTwt 4,4±1,3 14,6 ±3 3600±600 0,046±0,003 10,3±2,1 230000±65000 b Ь 6100±2600

KIIT1 3,6 2 550 0,02 6,7 335000 с с С

КПТ2 3,6 4,3 1200 0,04 28 700000 с с с

КПТЗ ь ь 840 0,03 11,1 370000 с с с

KI1T4 Ь ь 150 0,09 6,8 76000 с с с

КПТ5 ь ь 1300±280° 0,15±0,01 22,8±3,6 152000±21000 b I) 880±110

КПТ6 ь ь 142Í12" 0,75±0,26 7,1±2,1 9700±730" ь Ь 37,5±11,4"

КПТ D253G ___ь ь 346±36d 0,016±0,004 4,1±0,1 282000±80000 0,18±0,015 7,2±0,1 40000±2400d

КПТ D253G/T255I 1, ь 132±8d 0,03±0,006 5,2±0,3 184000±31000 0,3±0,03 8,5±0,5 28000±1500"

КПТ D253G/T255K 2,8±0,9 0,04±0,01 16,8±3,8a 0,03 3±0,007 1,6±0,2 55000±19000е 0,65±0,05 11,5±1,0 17800±1800"

КПТ D253G/T255R С С <5' 0,45±0,08 5,6±1,0 12500±600" 0,8±0,07 23,6±1,7 29600±1400d

КПТ H68N 5,9±0,1 17,5±1,1 2940±210 0,02±0,002 8,4±0,8 422000±39000 ___Ь ___b 2300±200

КПТ L247N 4±0,3 14,4±0,9 3600±130 0,063±0,003 5,6±0,5 87400±3700 ь ___b <213±50

Примечание.

а Процедуру экспрессии, ренатурации, активации, очистки и определения кинетических параметров проводили по три раза для вариантов с представленными значениями стандартной ошибки среднего и по одному разу - для остальных вариантов КПТ.

ь Не было замечено насыщения субстратом в условиях эксперимента. с Нет данных.

й р < 0,05 согласно Т-тесту Стьюдента. Параметр [кса,/Кт] КПТ5 сравнивался с таковым КИТЧ*!. Параметр КПТ6 сравнивался с таковым КПТ5. Параметр КПТ 02530 сравнивался с таковым КПТуЛ. Параметры КПТ 02530/Т2551, КПТ 0253С/Т255К, КПТ 0253СЛ,255Я сравнивались с таковым КПТ 02530.

е р = 0,051 при сравнении параметра [кса,/Кт] КПТ Э2530/Т255К с таковым КПТ 0253в.

г Активность варианта КПТ Э253С/Т255Я была ниже предела детекции, равного 5, М 'с"1.

8 Данные согласно статье (Трачук и др., 2002).

Таблица 4

Субстратная специфичность КПТ и ее вариантов

Специфичность8

Фермент Положение Заряд" Субстрат с С-концевым(ои

253 255 Ьеи 01и Аг§

КПТУЛ АБр ТЬг -1 64 1,7 1

КПТ 5 Аэр -1 172 1 1,5

КПТ 6 &у АБР -1 259 1 3,8

КПТ 02530 ТЬг 0 815 115 1

КПТ Б253С/Т2551 С1у Не 0 1390 212 1

КПТ 0253в/Т255К в1у ЬуБ +1 3270 1060 1

КПТ 0253б/Т255Я в1у Ащ +1 1 2,4 0

КПТ Н68Ы 183 1 1,3

КПТ L254N 24 <0,06 1

Примечание.

а Специфичность - [ксМ/Кт] 1.т/[кси/ АГт] а Л ¿са/^т] аг8. ь Заряд кармана первичной специфичности.

Активность КПТ D253G по обоим заряженным субстратам свидетельствует о наличии в кармане первичной специфичности достаточно полярных участков, с которыми взаимодействуют гуанидиновая и карбоксильная группы бокового радикала С-концевого остатка субстратов. Анализ компьютерных моделей КПТ D253G с тетрапептидами FFVR и FFVE показал, что данные зоны образованы ОН-группой Thr250 и двумя молекулами структурно связанной воды для субстрата с С-концевым Arg, а также Thr250, Argl45, Asnl44 и молекулой воды для субстрата с С-концевой Glu.

2.2. Роль аминокислотного остатка в положении 255

2.2.1. Влияние гидрофобного остатка в 255 положении на селективность карбоксипептидазы Т

КПА, обладающая гидрофобным SI'- субсайтом, в состав которого входят Leu203, Пе243, А1а250 и 11е255 (см. табл. 2), отщепляет преимущественно гидрофобные С-концевые аминокислотные остатки. КПТ также обладает наибольшей активностью на гидрофобных субстратах, которые она гидролизует на два порядка активней, нежели заряженные, однако на порядок хуже, чем КПА. Несмотря на выраженную гидрофобную специфичность в состав S1'-субсайта КПТ в качестве гидрофобных остатков входят лишь А1а243 и консервативный для КПА, КПВ и КПТ Leu203 (см. табл. 2). Мы предположили, что постановка Ие в ключевое 255 положение в КПТ приведет к увеличению активности фермента по гидрофобным субстратам и падению эффективности гидролиза заряженных субстратов.

Замена Thr255 на Ile по аналогии с КПА (КПТ D253G/T255I), как и ожидалось, привела к ухудшению гидролиза заряженных субстратов, однако всего в 2,6 и 1,4 раза для DnpAAR и ZAAE соответственно. Скорость гидролиза гидрофобных субстратов осталась на прежнем уровне: lwKro *10"3 = 282, MV для КПТ D253G и 184, MV для КПТ D253G/T255I, что на порядок ниже, чем у КПА, значение kcat/Km *10'3

которой равно 2900. Отметим, что КПА практически не гидролизует заряженные субстраты.

Анализ компьютерных моделей КПТ D253G/T255I с субстратами FFVR и FFVE показал, что гидрофобный Пе255 в одной из его конформаций вытесняет молекулу структурно связанной воды из контакта с заряженными группами субстратов и, тем самым, несколько ухудшает их связывание. Ввиду малого влияния на специфичность Ие255 в КПТ сам по себе не является ключевым остатком для дискриминации гидрофобных и заряженных субстратов. Это свидетельствует о том, что и в КПА остаток 11е255 не является главной детерминантой субстратной специфичности. На роль такого остатка претендует 11е243 в КПА в связи с тем, что КПТ D253G/T255I, несущий А1а243, в отличие от КПА может гидролизовать заряженные субстраты.

2.2.2. Влияние положительно заряженного остатка в 255 положении на селективность карбоксипептидазы Т

КПО, специфичная к субстратам с С-концевыми Glu и Asp, несет в ключевом 255 положении S1'-субсайта положительно заряженный остаток Arg. Кроме того, возможность обращения специфичности КПВ в сторону субстратов с С-концевыми остатками дикарбоновых аминокислот была показана заменой Asp255 на Arg или Lys. В случае общности механизмов субстратной специфичности МКП такой же эффект должен наблюдаться и для КПТ.

Действительно, постановка остатка Lys или Arg в 255 положение (КПТ D253G/T255K и КПТ D253G/T255R) привела к ожидаемому результату. Было отмечено значительное падение эффективности гидролиза положительно заряженного субстрата: в 21 раз для КПТ D253G/T255K и более чем в 70 раз для КПТ D253G/T255R. Эффективность гидролиза гидрофобного субстрата также упала для КПТ D253G/T255K и КПТ D253G/T255R в 5 и 23 раза соответственно. Сродство вариантов к отрицательно заряженному субстрату не улучшилось.

При удалении отрицательного заряда из кармана первичной специфичности (КПТ D253G) значение [kca/Km]Giu/[kcat/Km]Arg увеличилось

в 68 раз, а при постановке туда положительно заряженного остатка (КПТ D253G/T255K и КПТ D253G/T255R) различие скоростей гидролиза отрицательно и положительно заряженных субстратов изменилось в 620 и более 3000 раз для КПТ D253G/T255K и КПТ D253G/T255R соответственно по сравнению с ферментом дикого типа. Это согласуется с данными исследований роли электростатических взаимодействий в определении субстратной специфичности других протеаз. Профиль селективности КПТ D253G/T255R стал 1/2,4/0 для субстратов с С-концевыми Leu, Glu и Arg соответственно (см. табл. 4). Таким образом, на качественном уровне нам удалось воспроизвести аналогичный эксперимент по превращению КПВ в глутамат-специфичную карбоксипептидазу.

Кинетические параметры КПТ D253G/T255K и КПТ D253G/T255R могут быть объяснены на основании моделей этих вариантов с FFVF, FFVR и FFVE. Драматическое ухудшение гидролиза аргининового субстрата, по всей видимости, вызвано как отталкиванием одноименных зарядов, так и стерическими ограничениями карманов первичной специфичности вариантов. Ухудшение гидролиза гидрофобного субстрата также может быть объяснено отсутствием свободного пространства в S1'-субсайте для того, чтобы вместить объемные боковые радикалы Lys или Arg вариантов фермента и Phe субстрата. Вариант КПТ D253G/T255R лучше гидролизовал отрицательно заряженный субстрат, чем КПТ D253G/T255K, что, возможно, связано со способностью гуанидиновой группы образовывать большее количество водородных связей с субстратом, чем аминогруппа.

2.3. Реконструкция кармана первичной специфичности КПТ по аналогии с КПВ

Несмотря на структурное сходство зон связывания КПТ и КПВ субстратная специфичность этих ферментов существенно различается.

Среди семи остатков S1 '-субсайта, которым приписывается роль детерминант субстратной специфичности, КПТ и КПВ отличаются пятью (см. табл. 2). В ходе работы шаг за шагом все эти пять остатков были

заменены по аналогии с КПВ (варианты КПТ1-КПТ5) (см. табл. 2). Таким образом, было осуществлено воссоздание кармана первичной специфичности КПВ в КПТ. Несмотря на то, что кинетические характеристики вариантов КПТ1-КПТ5 обладали некоторыми отличиями от таковых фермента дикого типа, ни один из мутантов не приблизился по своим свойствам к КПВ. КПТ1-КПТ5, как и KnTwt, гидролизовали гидрофобные субстраты на два-три порядка активней, чем положительно заряженные (см. табл. 3).

Замена остатков Asp на Gly в 253 положении и Thr на Asp в ключевом 255 положении (КПТ2) не привела к увеличению активности варианта на субстрате с С-концевым Arg. Перенос отрицательного заряда в новое положение в противоположность ожидаемому не ухудшил, а даже улучшил гидролиз гидрофобных субстратов. По всей видимости, причиной этому является отдаление карбоксильной группы от входа в карман специфичности вследствие того, что остаток 255 располагается ближе ко дну Sl'-субсайта на 1 Â.

Расширение кармана первичной специфичности при замене А1а243 на Gly (варианты КПТ1 и КПТЗ) привело к ослаблению связывания аргинина субстрата, в то время как скорость гидролиза гидрофобного субстрата изменилась незначительно.

Введение полярной ОН-группы Ser207 (вариант КПТ4) привело к прогнозируемому ослаблению связывания субстрата с С-концевым Leu. Неожиданным оказалось ухудшение сродства варианта к субстрату с С-концевым Arg. Это можно объяснить тем, что при связывании боковой радикал субстрата вынужден вытеснять воду из контакта с Ser207 без компенсаторного формирования с ним водородной связи, как это наблюдалось в случае комплекса КПВ с аналогом аргининового субстрата.

Активность мутанта КПТ5, наиболее близкого по первичной структуре к КПВ, по субстрату DnpAAR была в 380 раз ниже, чем таковая КПВ и в 2,8 раза ниже по сравнению с KnTwt. Введение пяти мутаций практически не изменило k^/Km гидролиза гидрофобного субстрата. Эти наблюдения идут в разрез с данными для КПВ, у которой возможность отщеплять гидрофобные С-концевые остатки была найдена лишь на качественном уровне. В то же время приближение к структуре КПВ

привело к ожидаемому уменьшению эффективности гидролиза субстрата с С-концевой Glu в 7 раз.

Изучение селективности КПТ выявило противоречия с классической теорией субстратной специфичности МКП. Несмотря на наличие отрицательного заряда в S1'-субсайте KnTwt и ряда ее вариантов, как у КПВ, скорость гидролиза положительно заряженного субстрата обоими ферментами существенно различается. При этом КПТ в отличие от КПВ обладает способностью отщеплять С-концевой Glu субстрата. Необъясненной остается и высокая скорость гидролиза КПТ гидрофобных субстратов при общей полярности кармана первичной специфичности.

Отсутствие серьезных изменений кинетических параметров КПТ при воссоздании зоны связывания КПВ наводит на мысль о существовании других, помимо общепризнанных семи остатков S1 '-субсайта, детерминант субстратной специфичности.

Другая возможность объяснения наблюдаемых фактов состоит в том, что введение этих замен приводит к искажению структуры Sl'-субсайта КПТ. Подобные эффекты наблюдались в работах по имплантации зоны связывания химотрипсина в трипсин.

3. Поиск новых детерминант субстратной специфичности КПТ

3.1. Сравнение структуры КПВ и модели КПТ5

Модель КПТ5 была получена посредством введения в известную структуру КПТ соответствующих мутаций in silico и выбора конформаций боковых радикалов, наиболее близких к таковым в КПВ. Различия в составе и расположении зарядов в молекулах ферментов и строении их активных центров были проанализированы.

КПТ5 и КПВ отличались расположением и зарядами 30 заряженных остатков. Однако большинство из них локализовано на поверхности молекул, где в присутствии воды и противоионов их электростатическое поле значительно ослаблено. Тем не менее, ферменты отличались и остатками, расположенными в сердцевине белка. КПТ обладает His68, расположенном во втором слое остатков вокруг бокового радикала С-

концевого остатка субстрата. В случае если Жз68 заряжен, взаимодействие с ним заряженных групп субстратов способно уменьшить энергию связывания ОпрААЯ КПТ в 7 раз и увеличить энергию связывания гААЕ в 6,5 раза.

Кроме того, КПТ, в отличие от КПВ, обладает четырьмя центрами связывания ионов Са2\ Несмотря на удаленное расположение (ЗОА от активного центра фермента) суммарный заряд этих ионов велик (+8), что также позволяет предполагать их участие в определении специфичности КПТ. Расчет силы взаимодействия показывает, что улучшение связывания субстрата с С-концевым глутаматом и ухудшение связывания субстрата с С-концевым аргинином благодаря наличию ионов Са2+ может быть 10-кратным.

\1 I

Рис. 2. Петли активных центров КПТ и КПВ

Сравнение строения активных центров выявило отличия в организации петли с Туг248, распределении молекул структурно связанной воды, природе и положении остатков, образующих второй слой остатков вокруг субстрата. В фокус исследования попало лишь первое отличие. Это связано со сложностью манипулирования сайтами гидратации и отсутствием информации о роли остатков второго слоя в определении субстратной специфичности МКП.

Петля активного центра с Туг248, участвующая в индуцированном соответствии, укорочена у КПТ на один остаток по сравнению с КПВ и с КПА (рис. 2).

На рис. 2 полипептидный хребет КПТ и КПВ показаны серой и синей лентами соответственно. Остатки КПТ изображены в проволочном виде и подписаны красным шрифтом. Остатки КПВ показаны в виде линий и подписаны синим шрифтом. Ингибитор, имитирующий С-концевой Phe субстрата в КПА, окрашен фиолетовым цветом. Предположенное для КПТ положение С-концевого Phe, в котором его боковой радикал обращен в гидрофобную зону кармана первичной специфичности, показано в виде линии, окрашенной по типу атомов. Водородная связь между Туг248 и СОО' группой субстрата показана пунктирной линией.

Вследствие этого боковой радикал Leu247 удален на 1-1.8Â от алифатической части заряженных субстратов по сравнению с гомологичным 11е247 КПВ. Расчет Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий с помощью потенциала Леннарда-Джонса показывает, что это приведет к падению энергии связывания субстратов с С-концевыми Arg и Glu в 5 и 15 раз соответственно.

Другое влияние данного отличия состоит в том, что гидрофобная зона кармана первичной специфичности пространственно объемнее в КПТ, чем в КПВ, что было доказано как визуальным анализом структур, так и методами молекулярной механики. Минимизацией энергии структур КПТ и КПВ с субстратом FFVF было показано, что объемный боковой радикал С-концевого Phe может быть расположен у входа в карман первичной специфичности КПТ рядом с Leu247 и Туг248. Подобная конформация не может быть достигнута в КПВ вследствие того, что боковой радикал 11е247 смещает бензольное кольцо субстрата на 1,5Â ко дну S1 '-субсайта. Таким образом, данное различие объемов S1'-субсайтов КПТ и КПВ может объяснить высокую гидрофобную специфичность КПТ. В этом случае Leu247 должен быть одной из главных детерминант гидрофобной селективности КПТ.

3.2. Вариант КПТ H68N

Для проверки возможной роли Шб68 в качестве детерминанты субстратной специфичности КПТ этот остаток был заменен на незаряженный Азп (вариант КПТ Н68Ы). Эффективность гидролиза КПТ Н68Ы всех трех субстратов осталась на таком же уровне, как и у фермента дикого типа (см. табл. 3). Профиль субстратной специфичности КПТ H68N 183/1/1,3 остался таким же, как и у КПТ\у1 64/1,7/1 (табл. 4), демонстрируя наибольшее сродство к гидрофобным субстратам. Отсутствие влияния замены ШэбВАвп на селективность КПТ по отношению к положительно и отрицательно заряженным субстратам означает, что Шэбв не заряжен.

3.3. Влияние ионов кальция

[Са{2+(]

Рис. 3. Зависимость активности КПТ по субстрату ОпрААЛ от концентрации Са2+. Значения стандартных отклонений менее 10%

Для уменьшения концентрации ионов кальция в реакционную смесь был добавлен хелатирующий агент ЭГТА. В этом случае концентрация кальция была на порядок меньше, чем концентрация фермента. Свидетельством удаления Са2' из структуры фермента явилось падение термостабильности КПТ. Так, после предварительной инкубации в течение 15 мин при 70°С фермент с Са2+ теряет около 30% активности, в то время как фермент без Са2+ полностью инактивируется.

Зависимость активности фермента по субстрату ЭпрААЯ от концентрации Са2+ (рис. 3) имела сигмоидальный вид с перегибом в диапазоне концентраций СаС12 10-100 мкМ. Зависимость подобного вида принято интерпретировать как доказательство роли структурно связанного кальция в селективности ферментов.

Изменение активности фермента при удалении из структуры КПТ ионов Са2+ было существенным (табл. 5). Активность фермента без Са2+ уменьшилась в 1,7 и 2,2 раза для заряженных субстратов ОпрААИ. и ZAAE соответственно. Напротив, активность фермента на гидрофобном субстрате гААЬ возросла в 1,5 раза. Таким образом, специфичность к гидрофобным субстратам у фермента без Са2+ увеличилась в 3 раза. Эффект Са2+ был полностью обратим.

Увеличение эффективности гидролиза гидрофобных субстратов и уменьшение эффективности гидролиза положительно заряженных субстратов заставляет предполагать, что влияние ионов кальция сводится к конформационным изменениям в районе сайтов связывания Са2+, которые передаются в район активного центра фермента. Таким образом, нами впервые обнаружено влияние структурно связанного кальция на субстратную специфичность КПТ. Этот эффект, описанный ранее для аминопептидазы 81герютусе.ч griseus, для МКП ранее не описан.

Таблица 5

Активность КПТ в буфере с 1 мМ и 3 нМ Са2+ а.

Субстрат Активность, %

1 мМ Са2+. 3 нМ Са2+.

ОпрААЯ 100 ± 19 58 ± 11 "

гАА1 100 ±6 147 ± 3ь

гААЕ 100 ±4 45 ± 6"

Примечание.

а Активность КПТ в буфере с 1 мМ СаС12 принята за 100%. Приведены средние значения и стандартные отклонения среднего. ь р < 0,05 согласно Т-тесту Стьюдента.

3.4. Влияние длины петли активного центра с Туг248

Вставка одного аминокислотного остатка (Thr 246) в петлю активного центра КПТ5 по аналогии с КПА и КПВ (вариант КПТ6) привела к падению каталитической эффективности варианта. Так, значения кса/Кга для субстратов с С-концевыми Arg, Leu и Glu упали соответственно в 9, 16 и 24 раза. Таким образом, эффективность гидролиза всех трех использованных в работе субстратов вариантом КПТ6 приблизительно на порядок меньше, чем КПТ5. Ухудшение катализа в нашем случае может быть результатом менее выгодного расположения Туг248 в «закрытом» комплексе или увеличения энергии, которую необходимо затратить для осуществления индуцированного соответствия.

Профили субстратной специфичности КПТ5 и КПТ6 остались схожими с таковыми КПТ дикого типа: 172/1/1,5; 259/1/3,8; 64/1,7/1; для субстратов с С-концевыми Leu, Glu и Arg для КПТ5, КПТ6 и KnTwt соответственно (см. табл. 4). Все три фермента гидролизовали гидрофобные субстраты с эффективностью на два порядка большей, нежели заряженные.

Таким образом, отличия в строении петли активного центра с Туг248 у КПТ и КПВ не являются причинами различной специфичности этих ферментов.

3.5. Вариант КПТ L247N

Для выяснения роли Leu247 КПТ в связывании гидрофобных субстратов мы заменили его изостеричным полярным Asn. При этом ожидалось уменьшение активности варианта по гидрофобным субстратам. Тем не менее, эффективность гидролиза субстрата с С-концевым Leu мутантом L247N осталась на прежнем уровне, как и в случае субстрата с С-концевым Arg. В то же время существенно изменились кинетические характеристики гидролиза отрицательно заряженного субстрата. Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата не подчинялась уравнению Михаэлиса-Ментен из-за активации субстратом в использованном нами диапазоне концентраций ZAAE. В этом случае нам

удалось определить лишь верхнюю границу параметра кса1/Кт при минимальной использованной концентрации ZAAE. В этих условиях каталитическая активность варианта упала более чем в 28 раз. Таким образом, профиль специфичности фермента для субстратов с С-концевыми Leu, Glu и Arg изменился с 64/1,7/1 для КПТ дикого типа до 24/<0,06/1 для КПТ L247N.

Скорее всего, падение активности в отношении отрицательно заряженного субстрата объясняется тем, что при замене гидрофобного Leu на полярный Asn был удален гидрофобный контакт между Leu247 и алифатической частью Glu субстрата, доля которого в связывании этого субстрата велика по сравнению с взаимодействиями алифатических частей Leu и Arg. Боковые радикалы С-концевых Arg и Leu, в отличие от такового С-концевой Glu, обладают дополнительными одной CH2S- и двумя СН/ -группами соответственно, которые могут образовывать гидрофобные контакты еще и с Leu203.

Таким образом, нами обнаружена структурная детерминанта селективности КПТ к отрицательно заряженным субстратам - Leu247.

Выводы

1. Методом сайт-направленного мутагенеза показано, что природа остатка в 255 положении не играет ключевой роли в определении преимущественно гидрофобной специфичности карбоксипептидазы Т, что находится в противоречии с классической теорией субстратной специфичности пищеварительных металлокарбоксипептидаз.

2. Подтверждена роль заряда в 253 или 255 положениях кармана первичной специфичности как детерминанты сродства карбоксипептидазы Т к заряженным субстратам.

3. Показано, что воссоздание зоны связывания карбоксипептидазы В в карбоксипептидазе Т не приводит к изменению гидрофобной специфичности последней, что говорит о недостаточности классической теории. Высказано предположение о существовании дополнительных детерминант субстратной специфичности карбоксипептидазы Т.

4. Найдены новые детерминанты селективности карбоксипептидазы Т: остаток Ьеи247, принадлежащий карману первичной специфичности, и структурные ионы кальция, удаленные от активного центра.

Список сокращений

САВБ-сефароза- [Ы-(е-аминокапроил)-/)-аминобензил]сукцинил-Сефароза 4В

ОпрААЯ - 2,4-динитрофенил-аланил-аланил-аргинин

2ААЕ - бензилоксикарбонил-аланил-аланил-глутаминовая кислота

2ААЬ - бензилоксикарбонил-аланил-аланил-лейцин

ДСЫа - додецилсульфат натрия

КП - карбоксипептидаза

КПТ и КПТ-М - карбоксипептидаза Т дикого типа. МКП - металлокарбоксипептидаза(ы) ПААГ - полиакриламидный гель

Список публикаций по теме диссертации

1. Акпаров, В.Х. Структурные основы широкой субстратной специфичности карбоксипептидазы Т Thermoactinomyces vulgaris. Воссоздание кармана первичной специфичности карбоксипептидазы В / Акпаров, В.Х., Гришин A.M., Юсупова М.П., Иванова Н.М., Честухина Г.Г. // Биохимия, -2007, -Т. 72, - №4. - С. 515-524.

2. Grishin A.M. Structural principles of the broad substrate specificity of Thermoactinomyces vulgaris carboxypeptidase T - role of amino acid residues at positions 260 and 262 / Grishin A.M., Akparov V.Kh., Chestukhina G.G // Protein Engineering, Design and Selection. - 2008. - Vol. 21. -№9. -P.545-551.

3. Гришин A.M. Дизайн карбоксипептидазы T Thermoactinomyces vulgaris со специфичностью карбоксипептидазы В // Системная биология и биоинженерия: Материалы Международной школы-конференции для молодых ученых. Москва, 28 ноября - 02 декабря 2005 г. - М.: Изд-во Макс Пресс, 2005. - С. 21.

4. Гришин A.M. Исследование субстратной специфичности карбоксипептидазы Т Thermoactinomyces vulgaris / A.M. Гришин, В.Х. Акпаров, Г.Г. Честухина // Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии: Материалы XVIII Зимней молодежной научной школы. Москва, 7-10 февраля 2006 г. - М.: Изд-во Учебно-научного центра института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 2006. - С. 33.

5. Гришин А.М. Исследование влияния отдельных аминокислотных замен в кармане первичной специфичности карбоксипептидазы Т Thermoactinomyces vulgaris на субстратную специфичность этого фермента / A.M. Гришин, В.Х. Акпаров, Г.Г. Честухина // Биология - наука XXI века: Материалы 10-й Пущинской школы-конференции молодых ученых. Пущино, 17-21 апреля 2006 г. - М.: Изд-во Пущинского научного центра РАН, 2006. - С. 71.

6. Grishin А.М. Carboxypeptidase Т with the reconstructed primary specificity pocket of carboxypeptidase В / A.M. Grishin, V.Kh. Akparov, G.G.

Chestukhina // Molecules in Health and Disease: 31st FEBS Congress. Istanbul, 24-29 june 2006. FEBS Journal. - 2006. - Vol.273, - №sl - P. 309.

7. Гришин A.M. Гипотеза о двух зонах связывания в кармане первичной специфичности карбоксипептидазы Т Thermoactinomyces vulgaris / A.M. Гришин, В.Х. Акпаров, Г.Г. Честухина // МЕДБИОТЕК. Актуальные вопросы инновационной деятельности в биологии и медицине: Материалы Третьей международной научно-практической школы-конференции. Москва, 4-5 декабря 2006 г. - М.: Изд-во ОАО «Авиаиздат», 2006. - С. 28

8. Гришин А.М. Исследование взаимосвязи между структурой и функцией в молекулах ферментов на примере карбоксипептидазы Т / A.M. Гришин, В.Х. Акпаров, Г.Г. Честухина // Химия протеолитических ферментов: Материалы VI Симпозиума. Москва, 23-25 апреля 2007 г. - М.: Изд-во Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 2007. - С. 20.

9. Гришин A.M. Роль Asp253 в определении субстратной специфичности карбоксипептидазы Т Thermoactinomyces vulgaris / A.M. Гришин, В.Х. Акпаров, Г.Г. Честухина // Белки и пептиды: Материалы III Симпозиума (16-21 сентября 2007 г., г. Пущино, Московская обл.), - М.: Изд-во Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 2007. - С. 44.

10. Гришин A.M. Влияет ли длина петли активного центра металлокарбоксипептидазы Т Thermoactinomyces vulgaris на субстратную специфичность этого фермента? / A.M. Гришин, В.Х. Акпаров, Г.Г. Честухина // Биология - наука XXI века: Материалы 11-й Пущинской школы-конференции молодых ученых. Пущино, 29 октября - 2 ноября 2007 г. - М.: Изд-во Пущинского научного центра РАН, 2007. - С. 58.

Подписано в печать Усл. печ. л. 0,9 Тираж 100 экз.

29.09.2008

127994, Москва, ул Образцова, 15, МИИТ

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гришин, Андрей Михайлович

Список использованных сокращений

Введение

Обзор литературы. Рациональное конструирование ферментов с измененной субстратной специфичностью

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование структурных основ субстратной специфичности карбоксипептидазы T Thermoactinomyces vulgaris"

Методы рациональной белковой инженерии 15

Выбор КПТ в качестве модельного объекта для белковой инженерии обусловлен достаточно простыми обстоятельствами.

Семейство металлокарбоксипептидаз (МКП) является на сегодняшний день одним из самых хорошо изученных семейств пептидаз. Некоторые объекты семейства, такие как карбоксипептидаза А (КПА) и карбоксипептидаза В (КПВ), приводятся даже в учебниках. За последние 20 лет количество структурной информации о данных объектах выросло в разы. КПТ, открытая в нашей лаборатории (Остерман и др., 1984), и которая, на начало данных исследований, считалась ферментом, имеющимдвойную субстратную специфичность, т.е. подобную, как КПА, так и КПВ, или промежуточную между ними, представлялась удобным объектом для изменения субстратной специфичности в сторону таковой обоих классических ферментов. Для всех этих трех ферментов известны трехмерные структуры (Lipscomb и др., 1968; Schmid и Herriott, 1976; Teplyakov и др., 1992; Adler и др., 2005), причем для КПА изучены структуры как свободного фермента (Kilshtain-Vardi и др., 2003), так и фермента в комплексе Михаэлиса (Christianson и др., 1985) и в переходном состоянии (Kim и Lipscomb, 1991; Christianson и Lipscomb, 1989). Есть и многочисленные кинетические данные, что позволяет вести исследования с открытыми глазами.

Данная работа — еще один шаг к созданию работоспособной теории субстратной специфичности МКП, на основе которой возможно получать ферменты с желаемой селективностью действия. Учитывая потенциал применения МКП в биотехнологии и медицине, прикладной аспект этой работы - создание на основе КПТ бактериальных аналогов ферментов млекопитающих, очевиден.

Обзор литературы. Рациональное конструирование ферментов с измененной субстратной специфичностьюВведениеС момента определения структуры ДНК (1953 г.) (Watson и Crick, 1953) и первой структуры белка - в 1958 г. группой Джона Кендрю была определена структура миоглобина (Kendrew и др., 1958), а в 1960 г. Максом Перуцом - структура гемоглобина (Perutz, 1960), начался «золотой» век структурной биохимии. За прошедшие полвека с единичных работ структурная биохимия оформилась в целое семейство направлений, таких как сворачивание белка (Dill и др., 2007), белковая инженерия (Polaka и Handel, 2001), изучение взаимосвязи между структурой и функцией белковых молекул (Lee и др., 2007), взаимодействия белок-белок (Fernandez-Ballester и Serrano, 2006), белок-лиганд (Vajda и Guarnieri, 2006), фермент-субстрат и катализ (Benkovic и Hammes-Schiffer, 2003), разработка лекарств и ингибиторов (Lundstrom, 2006) и других.

Среди всех вышеуказанных направлений, исследование структурных основ субстратной специфичности, с одной стороны, позволяет проверять правильность наших представлений о работе фермента, включая продвижение по каталитическому циклу, связывание субстрата и диссоциацию продуктов реакции (Antikainen и Martin, 2005). С другой стороны, несомненна практическая ценность этих работ. Высокая эффективность биокатализа в «мягких условиях», узкая субстратная и энантиоселективность, экологичность делают его чрезвычайно привлекательным для промышленности (Schafer at al., 2007).

На данный момент насчитываются десятки подходов для изучения структурных основ субстратной специфичности ферментов. Рациональное конструирование ферментов занимает среди них едва ли не ведущее место.

Это практически единственный метод направленного изменения структуры фермента. Рентгеноструктурный анализ и ЯМР, классические инструменты структурной биохимии, буквально «открыли глаза» исследователям, изучающим структуру белков, однако без белковой инженерии невозможна экспериментальная проверка роли выявленных этими методами структурных элементов белка, от отдельных остатков до доменов, в проявлении его функций (Nakajima и др., 2006; Sansen и др., 2007; Jogl и др., 2005).

По сравнению с используемым повсеместно множественном выравнивании первичных структур, энзиматическое реконструирование позволяет непосредственно доказать роль тех или иных остатков, выдвигаемых в качестве детерминант субстратной специфичности (Miyazaki, 2005; Jost и др., 2005; Kamiya и др., 2004).

Компьютерные подходы, компьютерная графика и молекулярное моделирование позволяют оценить вклад отдельных остатков в энергию взаимодействия белка с лигандом или предсказать структуру мутантов, но и здесь невозможно обойтись без экспериментальной проверки вычислений методами белковой инженерии (Allert и др., 2007; Bolon и Мауо, 2001; Chevalier и др., 2002).

Дав науке возможность создания ферментов с наперед заданными характеристиками, рациональная белковая инженерия превратила структурную энзимологию из науки описательной в науку творящую (Fersht, 1999, с. 413-420).

Другим подходом для направленного изменения структуры белка является химическая модификация. Возможности последней, ранее широко использовавшейся для исследования структуры белка, лимитированы из-за определенной неспецифичности метода и ограниченности точек модификации химически активными боковыми радикалами аминокислотных остатков (Fersht, 1999, с. 273-288). Изменение природы боковых радикалов после модификации может служить причинойдосадных артефактов, как это было в случае проверки роли фенольной группы Туг248 у карбоксипептидазы А путем её нитрования (Riordan и др., 1967). Правильный результат был достигнут только с помощью сайт-направленного мутагенеза заменой Туг248 на Phe (Gardell и др., 1985). В настоящее время химическое модифицирование используется в единичных работах в комбинации с генной инженерией ферментов (Ivarsson и др., 2007).

В конце 80-х годов оформилось два принципиально разных подхода для реконструирования ферментов: рациональная белковая инженерия и направленная эволюция (Antikainen и Martin, 2005; Lanio и др., 2002). В первом случае исследователь вначале сам определяет, какие изменения будут внесены в структуру фермента с целью изменения его свойств. Во втором — в первичную структуру белка случайным образом вносятся мутации, затем библиотека вариантов фермента тестируется с целью найти мутант с желаемыми свойствами. Рациональная белковая инженерия оперирует с ограниченным числом энзиматических вариантов, от единиц до десятков, тогда как направленная эволюция имеет дело со многими тысячами вариантов белка. За последние 4 года соотношение работ рациональное реконструирование / направленная эволюция составило 4:1. Большинство исследователей предпочитают понимать, что они изменяют в ферменте. Впервые метод рационального реконструирования природного белка был использован для изучения структурных основ субстратной специфичности трипсина (Craik и др., 1985), а затем субтилизина (Estell и др., 1986) и альфа-литической протеазы (Bone и др., 1989).

С тех пор и до настоящего времени, рациональное реконструирование ферментов представляет собой постоянно развивающуюся область знания. Количество публикаций по этой теме выросло с единичных работ в год в середине 80-х гг. до десятков - сотен в настоящее время (рис. 1).

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Гришин, Андрей Михайлович

Выводы

2. Подтверждена роль заряда в 253 или 255 положениях кармана первичной специфичности, как детерминанты сродства карбоксипептидазы Т к заряженным субстратам.

4. Найдены новые детерминанты селективности карбоксипептидазы Т: остаток Leu247, принадлежащий карману первичной специфичности, и структурные ионы кальция, удаленные от активного центра.

Список публикаций по теме диссертации

2. Гришин, A.M. Остаток Leu254 и ионы кальция - новые структурные детерминанты субстратной специфичности карбоксипептидазы Т / Гришин A.M., Акпаров В.Х., Честухина Г.Г.// Биохимия. 2008. -Т. 73. -№1. -С. 1422-1428.

3. Grishin, A.M. Structural principles of the broad substrate specificity of Thermoactinomyces vulgaris carboxypeptidase T - role of amino acid residues at positions 260 and 262 / Grishin A.M., Akparov V.Kh., Chestukhina G.G // Protein Engineering, Design and Selection. -2008. -Vol. 21. -№9.-P.545-551.

4. Гришин, A.M. Дизайн карбоксипептидазы T Thermoactinomyces vulgaris со специфичностью карбоксипептидазы В // Системная биология и биоинженерия: Материалы международной школы-конференции для молодых ученых. Москва, 28 ноября - 02 декабря 2005 г. -М.: Изд-во Макс Пресс, 2005. -С. 21.

5. Гришин, A.M. Исследование субстратной специфичности карбоксипептидазы Т Thermoactinomyces vulgaris / A.M. Гришин, В.Х. Акпаров, Г.Г. Честухина // Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии: Материалы XVIII зимней молодежной научной школы. Москва 7-10 февраля 2006 г. -М.: Изд-во Учебно-научного центра института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 2006. -С. 33.

6. Гришин, A.M. Исследование влияния отдельных аминокислотных замен в кармане первичной специфичности карбоксипептидазы Т Thermoactinomyces vulgaris на субстратную специфичность этого фермента / A.M. Гришин, В.Х. Акпаров, Г.Г. Честухина // Биология - наука XXI века: Материалы 10-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых. Пущино 17-21 апреля 2006 г. -М.: Изд-во Пущинского научного центра РАН, 2006. -С. 71.

7. Grishin, A.M. Carboxypeptidase Т with the reconstructed primary specificity pocket of carboxypeptidase В / A.M. Grishin, V.Kh. Akparov, G.G. Chestukhina // Molecules in Health and Disease: 31st FEBS Congress. Istanbul, 24-29 june 2006. FEBS Journal. -2006. -Vol.273, -№sl -P. 309.

8. Гришин, A.M. Гипотеза о двух зонах связывания в кармане первичной специфичности карбоксипептидазы Т Thermoactinomyces vulgaris / A.M. Гришин, В.Х. Акпаров, Г.Г. Честухина // МЕДБИОТЕК. Актуальные вопросы инновационной деятельности в биологии и медицине: Материалы третьей международной научно-практической школы-конференции. Москва 4-5 декабря 2006 г. -М.: Изд-во ОАО «Авиаиздат», 2006. -С. 28

9. Гришин, A.M. Исследование взаимосвязи между структурой и функцией в молекулах ферментов на примере карбоксипептидазы Т / A.M. Гришин, В.Х. Акпаров, Г.Г. Честухина // Химия протеолитических ферментов: Материалы VI Симпозиума. Москва 23-25 апреля 2007 г. -М.: Изд-во Института биоорганической химии им. Академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 2007. -С. 20.

10. Гришин, A.M. Роль Asp253 в определении субстратной специфичности карбоксипептидазы Т Thermoactinomyces vulgaris / A.M. Гришин, В.Х. Акпаров, Г.Г. Честухина // Белки и пептиды: Материалы III Симпозиума (16-21 сентября 2007 г., г. Пущино, Московская обл.), -М.: Изд-во Института биоорганической химии им. Академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 2007. -С. 44.

11. Гришин, A.M. Влияет ли длина петли активного центра металлокарбоксипептидазы Т Thermoactinomyces vulgaris на субстратную специфичность этого фермента? / A.M. Гришин, В.Х. Акпаров, Г.Г. Честухина // Биология - наука XXI века: Материалы 11 -ой Пущинской школы-конференции молодых ученых. Пущино 29 октября — 2 ноября 2007 г. -М.: Изд-во Пущинского научного центра РАН, 2007. -С. 58.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гришин, Андрей Михайлович, Москва

1. Воюшина, Т.Д. Синтез и-нитроанилидов ацилированных пептидов, катализируемый термолизином / Воюшина T.JL, Люблинская И.А., Тимохина Е.А., Степанов В.М. // Биоорганическая химия. -1987. -Т. 13. -С. 615-22.

2. Клесов, А.А. Субстратная специфичность и кинетика действия карбоксипептидазы А: роль металла активного центра в специфичности связывания и катализа / Клесов А.А., Вэлли Б.Л. // Биоорганическая Химия. -1977. -Т. 3. -С. 806-16.

3. Люблинская, Л.А. Синтез пептидных субстратов субтилизина и их аналогов / Люблинская Л.А., Якушева Л.Д., Степанов В.М. // Биоорганическая химия. -1977. -Т. 3. -С. 273-9.

4. Остерман, А.Л. Карбоксипептидаза Т внеклеточная карбоксипептидаза термоактиномицетов - отдаленный аналог карбоксипептидаз животных / Остерман А.Л., Степанов В.М., Руденская Г.Н., Ходова О.М., Цаплина И.А. // Биохимия. -1984. -Т. 49. № 2. -С. 292301.

5. Патент 20010055786 США, МПК1-7 C12Q001/26. Screening method for the discovery and directed evolution of oxygenase enzymes / Arnold F.H., Joern J., Sakamoto Т., Schwaneberg U.

6. Патент 20020012959 США, МПК1-7 C12Q001/37; C12Q001/44. Chemically modified mutant enzymes and methods for producing them, and screening them for amidase and/or esterase activity / Jones B.J., Plettner E.

7. Патент 20020049994 США, МПК1-7 C12N009/00; C07H021/04; A01H005/00; C12N005/04. Fatty acid elongase 3-ketoacyl CoA synthase polypeptides / Jaworski J.G., Blacklock В J.

8. Патент 20020061564 США, МПК1-7 C12P013/04. Method for chemical transformation using a mutated enzyme / David R.J. Jr.

9. Патент 20020081670 США, МПК1-7 C12N009/44; C12N015/00; C12P019/04. Starch debranching enzymes / Bisgard-frantzen H., Svendsen A.

10. Патент 20020086358 США, МПК1-7 C12N005/06; C12N009/00; C12P021/02; C07H021/04. Enzyme isolated from a Bifidobacterium / Jorgensen

11. F., Hansen O.C., Stougaard P.

12. Патент 20020137153 США, МПК1-7 C12N009/78; C12P013/02. Enantioselective production of amino carboxylic acids / Ramer S.W., Huisman

13. G., Millis J., Sheldon R., Delcardayre S., Tobin M., Cox A., Davis C.S.

14. Патент 20020137171 США, МПК1-7 C12N005/06; C12N009/16; C12P021/02; C07H021/04. Hydrolase enzymes and their use in kinetic resolution / Short J. Mathur E.J., Baumann M., Bornscheuer U.T.

15. Патент 20030003512 США, МПК1-7 G01N033/53; G01N033/542. Directed enzymatic modification of analytes for affinity capture and analysis / Schulman H.

16. Патент 20030054520 США, МПК1-7 C12P021/02; C12N015/74; C12N001/21; C12N009/04. Recombinant enzymes having improved NAD (H) affinity / Bommanus В., Hummel W., Bommarius A.

17. Патент 20030100467 США, МПК1-7 C12N009/00; C11D003/00; CI 1D003/386. Binding phenol oxidizing enzyme-peptide complexes / Aehle

18. W., Baldwin T.M., Van Gastel F J.C., Janssen G.G., Murray С .J., Wang H., Winetzky D.S.

19. Патент 20030113881 США,. МПК1-7 C12N009/16; C12P013/04; C12N009/02. D-enzyme compositions and methods of their use / Kent S.B.H., Milton S.C.F., Delisle M.R.C.

20. Патент 20030124680 США, МПК1-7 C12P021/02; C07H017/08; C12N009/10; C12P019/62; C12N015/74; C12N001/21. Alteration of acyltransferase domain substrate specificity / Reeves C., Mcdaniel R., Reid R.

21. Патент 20030144165 США, МПК1-7 C12N009/20; A21D008/02; C12P021/02; C12N001/18; C11D001/00; C12N015/74. Lipolytic enzyme variant / Roggen E.L.

22. Патент 20030162173 США, МПК1-7 C12P021/02; C12N009/22; C07H021/04; C12Q001/68; C12P019/34; C12N015/74; C12N001/21. Nucleic acid modifying enzymes / Wang Y., Lei X.I., Prosen D.E.

23. Патент 20030191038 США, МПК1-7 C12N009/56; C12P021/02; C07H021/04; CI 1D003/386; C12N015/74; C12N001/21. Subtilase enzymes / Hansen P.K., Bauditz P., Mikkelsen F., Andersen K.V., Andersen C., Norregaard-madsen M.

24. Патент 20030207408 США, МПК1-7 A21D008/02; C12P019/04. Amylolytic enzyme variants / Cherry J.R., Svendsen A., Andersen C., Beier L., Frandsen T.P., Schafer T.

25. Патент 20040014187 США, МПК1-7 C12N009/48. Bacterial carboxypeptidase cpg2 variants and their use in gene directed enzyme prodrug therapy / Springer С .J., Marais R.M., Spooner R.

26. Патент 20040023342 США, МПК1-7 C12P019/60. Polyketides and their synthesis / Petkovic H., Kendrew S.G., Leadlay P.F.

27. Патент 20040072168 США, МПК1-7 C12P021/02; A61K048/00; C07H021/04; C12N009/12; C12Q001/68; C12N001/21. Novel deoxynucleoside kinase enzyme variants / Knecht W., Minch-petersen В., Piskur J.

28. Патент 20040115691 США, МПК1-7 С07Н021/04; C12Q001/68; C12N009/06. Mutants of enzymes and methods for their use / Rozzell D.J., Hua L., Mayhew M., Novick S.

29. Патент 20040216185 США, МПК1-7 C12N015/82; A01H005/00; C12N005/04; C12N015/63; C12N015/87. Engineering beta-ketoacyl ACP synthase for novel substrate specificity / Dehesh K., Val D.

30. Патент 20040248250 США, МПК1-7 C12N009/02; C12N015/85. Method for modifying enzyme and oxidoreductive variant / Nakai Т., Morikawa S., Kizaki N., Yasohara Y.

31. Патент 20050003420 США, МПК1-7 C12P021/04; C12N009/22; C07H021/04; C12Q001/68. Recycled mutagenesis of restriction endonuclease toward enhanced catalytic activity / Xu S., Zhu Z., Riggs P.D., Hsieh P.

32. Патент 20050005325 США, МПК1-7 C07H021/04; C12N015/82; C12Q001/68; A01H005/00; C12N005/04; A01H001/00; C12N009/04. Mutant fatty acid desaturase and methods for directed mutagenesis / Shanklin J., Whittle EJ.

33. Патент 20050008648 США, МПК1-7 C12N009/00; A61K039/395. Use of specifically engineered enzymes to enhance the efficacy of prodrugs / Lavie A., Konrad M., Ravandi F.

34. Патент 20050013808 США, МПК1-7 A61K038/44; C07H021/04; C12Q001/68; C12N009/06. Nitroreductase enzymes / Grove J.I., Searle P.F., Lovering A.L.

35. Патент 20050054071 США, МПК1-7 C12N009/24. Enzymes for starch processing / Udagawa H., Taira R., Takagi S., Allain E., Hjort C., Vikso-nielsen A.

36. Патент 20050059045 США, МПК1-7 G01N033/53; C12Q001/68; C12N009/02. Labraries of optimized cytochrome P450 enzymes and the optimized P450 enzymes / Arnold F.H., Otey C.R.

37. Патент 20050059130 США, МПК1-7 C12N009/20; С07Н021/04; CI 1D003/386. Lipolytic enzyme variants / Bojsen К., Svendsen A., Fuglsang C.C., Patkar S.A., Borch K., Vind J., Petri A., Schroder G.S., Budolfsen G.

38. Патент 20050089966 США, МПК1-7 C07H021/04; C12N015/74; C12N009/54. Chemically modified enzymes with multiple charged variants / David B.G., Jones J.B., Bott R.R.

39. Патент 20050136462 США, МПК1-7 C12N009/22; C12Q001/68; C12N015/85. Method for engineering nicking enzymes / Zhu Z., Xu S.

40. Патент 20050158839 США, МПК1-7 C12N001/16; C07H021/04; C12N009/32; C12N015/74. Hybrid enzymes / Borchert T.V., Danielsen S., Allain E.J.

41. Патент 20050164186 США, МПК1-7 C12Q001/68; C12N015/85. Alteration of restriction endonuclease specificity by genetic selection / Samuelson J.C., Xu S.

42. Патент 20050208633 США, МПК1-7 C07H021/04; C12N009/12; C07H005/06; C12N015/74; C12N001/21; C08B037/00. Sugar kinases with expanded substrate specificity and their use / Thorson J.S.

43. Патент 20050255544 США, МПК1-7 C12N009/20; C12N001/14; C12N015/74; C12P021/06. Lipolytic enzyme variants and method for their production / Svendsen A., Vind J., Heldt-hansen H.P., Erlandsen L.

44. Патент 20050281912 США, МПК1-7 C12N009/20; A21D008/02; CI 1D003/386. Chemically modified lipolytic enzyme / Callisen Т.Н., Patkar S.A., Svendsen A., Vind J.

45. Патент 20060035342 США, МПК1-7 C12P19/60; C07H21/04; C12N9/24; C12N15/74; C12N1/21; C07H5/10. Engineered enzymes and their use for synthesis of thioglycosides / Withers S.G., Jahn M.

46. Патент 20060057696 США, МПК1-7 C12N9/10; C12P21/06. Sugar chain synthases / Takashima S., Tsujimoto M., Tsuji S.

47. Патент 20060134266 США, МПК1-7 A23K 1/18 20060101 A23K001/18, C07H 21/04 20060101 C07H021/04, C12P 21/06 20060101

48. С12Р021/06, C12N9/32 20060101 C12N009/32, C12N 15/74 20060101 C12N015/74. Enzyme / Kragh K.M., Leemhuis H., Dijkhuizen L., Dijkstra B.W.

49. Патент 20070015677 США. Variant subtilising enzymes (subtilases) / Minning S., Knotzel J.C.F., Sorensen N.H., Ness J.E., Welch M.D., Giver L.J., Cherry J., Borchert T.V., Minshull J.

50. Патент 20070020653 США, МПК1-7 C12Q1/68; C07H21/04; C12P21/06; C12P19/34; C12N9/22. DNA polymerase / Holliger P., Ghadessy F., D'abbadie M.

51. Патент 20070037239 США, МПК1-7 C12Q1/54. Composition for measuring glucose having improved substrate specificity / Kitabayashi M, Aiba H.

52. Патент 20070042379 США, МПК1-7 C12Q1/68; C07H21/04; С12Р21/06; C12N9/22. Modified DNA cleavage enzymes and methods for use / Guan C., Kumar S., Kucera R.

53. Патент 20070254355 США, МПК1-7 A62D3/02; B09B3/00; B09C1/10. Improved nitroreductase enzymes for bioremediation / Matin A.C., Barak Y., Ackerley D.F.

54. Патент 20070254852 США, МПК1-7 A61K31/7052; C07H21/04; C12N9/06; C12Q1/26. Improved nitroreductase enzymes / Matin A.C., Barak Y., Lynch S.V., Ackerly D.F., Thorne S.H., Contag C.H., Rao J.

55. Патент 6406896 США, МПК1-7 C12N9/22; C12N15/10; C12N15/90; C12N15/87; C12Q1/00; C12Q1/44; C12N9/00; C12N15/00. Transposase enzyme and method for use / Reznikoff W.S., Naumann T.A.

56. Патент 6465630 США, МПК1-7 C07H 021/02, C07H 021/04. Genetic sequences encoding substrate-specific dihydroflavonol 4-reductase and uses therefor / Choi G., Johnson E.T., Yi H., Shin B.

57. Патент 6759226 США, МПК1-7 C12N15/55; C12N9/22; C12P19/34. Enzymes for the detection of specific nucleic acid sequences / Ma W., Lyamichev V.I., Kaiser M.W., Lyamicheva N.E., Allawi H.T., Schaefer J.J., Neri B.P.

58. Патент 6838257 США, МПК1-7 C12N9/44; G01N31/00; C12N9/00; C07H21/04; C12N15/00. Pullulanase variants and methods for preparing such variants with predetermined properties / Svendsen A.

59. Патент 6890726 США, МПК1-7 C12N15/10; G01N33/573. Method for selecting recombinase variants with altered specificity / Sauer B.L., Rufer A.W.

60. Патент 6905853 США, МПК1-7 C07K14/37; C11D3/386; C12N9/02; C11D3/38; C12N9/00; C07H21/04; C12N9/02. Phenol oxidizing enzyme variants / Wang H.

61. Патент 7078194 США, МПК1-7 C12P19/60; C07H21/04; C12N9/24; C12N15/74; C12N1/21; C07H5/10. Methods and compositions for synthesis of oligosaccharides using mutant glycosidase enzymes / Withers S.G., Mackenzie L., Wang Q.

62. Патент 7122359 США, МПК1-7 C12N9/10; C12N15/00. Active-site engineering of nucleotidylyltransferases and general enzymatic methods for the synthesis of natural and "unnatural" UDP- and TDP-nucleotide sugars / Thorson J., Nikilov D.B.

63. Патент 7132253 США, МПК1-7 C12Q1/26; C12N9/06; С12Р21/06; C12Q1/34; С07Н21/04; C12N15/00. Modified sarcosine oxidases, modified sarcosine oxidase genes, and methods for preparing the modified sarcosine oxidases / Furukawa K., Kajiyama N.

64. Патент 7256032 США, МПК1-7 C12N 9/42 , C07H 21/02 , C12N 1/00 , C12N 1/20 , C12P 19/34 , С12Р 21/06 (20060101). Enzymes / Valtakari L., Alapuranen M., Hooman S., Siika-Aho M., Kallio J., Viikari L., Ojapalo P., Vehmaanpera J.

65. Финкелыптейн А.В. Физика Белка : курс лекций / А.В. Финкелыптейн, О.Б. Птицын О.Б. -М.: Изд-во МГУ. 2005.

66. Юсупова, М.П. Ферментативный синтез пептидов аргинина -хромофорных субстратов металлопротеиназ и карбоксипептидаз / Юсупова М.П., Котлова Е.К., Тимохина Е.А., Степанов В.М. // Биоорганическая химия. -1995. -Т. 21. -С. 33-38.

67. Abramowitz, N. On the size of the active site in proteases. II. Carboxypeptidase-A / Abramowitz N., Schechter I., Berger A. // Biochem Biophys Res Commun. -1967. -Vol 29, -№6. -P. 862-867.

68. Allert, M. Local encoding of computationally designed enzyme activity / Allert M., Dwyer M.A., Hellinga H.W. // J Mol Biol. -2007. -Vol. 366, -№ 3. -P. 945-53.

69. Alter, G.M. Kinetic properties of carboxypeptidase В in solutions and crystals / Alter G.M., Leussing D.L., Neurath H., Vallee B.L. // Biochemistry. -1977. -Vol. 16, -№ 16. -P. 3663-8.

70. Antikainen N.M. Altering protein specificity: techniques and applications / Antikainen N.M., Martin S.F. // Bioorg Med Chem. -2005. -Vol. 13, -№ 8. -P. 2701-16.

71. Arima, J. Alteration of leucine aminopeptidase from Streptomyces septatus TH-2 to phenylalanine aminopeptidase by site-directed mutagenesis / Arima J., Uesugi Y., Iwabuchi M., Hatanaka T. // Appl Environ Microbiol. -2005. -Vol. 71, -№ 11. -p. 7229-35.

72. Arolas, J.L. Metallocarboxypeptidases: emerging drug targets in biomedicine / Arolas J.L., Vendrell J., Aviles F.X., Fricker L.D. // Curr Pharm Des. -2007. -Vol. 13, -№ 4. -P. 349-66.

73. Arolas, J.L. The three-dimensional structures of tick carboxypeptidase inhibitor in complex with A/B carboxypeptidases reveal a novel double-headed binding mode / Arolas J.L., Popowicz G.M., Lorenzo J., Sommerhoff C.P.,

74. Huber R., Aviles F.X., Holak T.A. // J Mol Biol. -2005. -Vol. 350, -№ 3. -P. 489-98.

75. Auld D.S. Carboxypeptidase A / D.S. Auld // Handbook of Proteolytic Enzymes / A.J. Barrett, N.D. Rawlings, J.F. Woessner, Eds. London : Academic Press, Inc., cop. 1998. -P. 1321-8.

76. Auld, D.S. Kinetics of carboxypeptidase A. II. Inhibitors of the hydrolysis of oligopeptides / Auld D.S., Vallee B.L. //Biochemistry. -1970. -Vol. 9, -№ 3. -P. 602-9.

77. Aviles F.X. Carboxypeptidase В / F.X. Aviles, J. Vendrell // Handbook of proteolytic enzymes / A.J. Barrett, N.D. Rawlings, J.F. Woessner, Eds. -London : Academic Press, Inc., cop. 1998. -P. 1333-5.

78. Bagneris, C. Subtle difference between benzene and toluene dioxygenases of Pseudomonas putida / Bagneris C., Cammack R., Mason J.R. // Appl Environ Microbiol. -2005. -Vol. 71, -№ 3. -P. 1570-80.

79. Baird, T.T. Jr. Conversion of trypsin to a functional threonine protease / Baird T.T. Jr., Wright W.D., Craik C.S. // Protein Sci. -2006. -Vol. 15, -№ 6. -P. 1229-38.

80. Ballinger, M.D. Designing subtilisin BPN' to cleave substrates containing dibasic residues / Ballinger M.D., Tom J., Wells J.A. // Biochemistry. 1995. 34(41): 13312-9.

81. Ballinger, M.D. Furilisin: a variant of subtilisin BPN' engineered for cleaving tribasic substrates. / Ballinger M.D., Tom J., Wells J.A. // Biochemistry. -1996. -Vol. 35, -№ 42. -P. 13579-85.

82. Baltz, R.H. Molecular engineering approaches to peptide, polyketide and other antibiotics / Baltz R.H. // Nat Biotechnol. -2006. -Vol. 24, -№ 12. -P. 1533-40.

83. Bech, L.M. Mutational replacements in subtilisin 309. Vail04 has a modulating effect on the P4 substrate preference / Bech L.M., Sorensen S.B., Breddam K. // Eur J Biochem. -1992. -Vol. 209, -№ 3. -P. 869-74.

84. Bejar, C.M. Molecular architecture of the glucose 1-phosphate site in ADP-glucose pyrophosphorylases / Bejar C.M., Jin X., Ballicora M.A., Preiss J. // J Biol Chem. -2006. -Vol. 281, -№ 52. -P. 40473-84.

85. Benkovic, S.J. A perspective on enzyme catalysis / Benkovic S.J., Hammes-Schiffer S. // Science. -2003. -Vol. 301, 5637. -P. 1196-202.

86. Ben-Meir, D. Specificity of Streptomyces griseus aminopeptidase and modulation of activity by divalent metal ion binding and substitution / Ben-Meir D., Spungin A., Ashkenazi R., Blumberg S. // Eur J Biochem. -1993. -Vol. 212, -№ 1. -P.107-12.

87. Benson, D.E. Rational design of nascent metalloenzymes / Benson D.E., Wisz M.S., Hellinga H.W. // Proc Natl Acad Sci USA. -2000. -Vol. 97, -№ 12. -P.6292-7.

88. Bolon, D.N. Enzyme-like proteins by computational design / Bolon D.N., Mayo S.L. // Proc Natl Acad Sci USA. -2001. -Vol. 98, -№ 25. -P. 14274-9.

89. Bone, R. Structural plasticity broadens the specificity of an engineered protease / Bone R., Silen J.L., Agard D.A. // Nature. -1989. -Vol. 339, -№ 6221. -P. 191-5.

90. Bradford, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / Bradford M.M. // Anal Biochem. -1976. -Vol. 72. -P. 248-54.

91. Byers, L.D. Binding of the by-product analog benzylsuccinic acid by carboxypeptidase A / Byers L.D., Wolfenden R. // Biochemistry. -1973. -Vol. 12,-№ 11.-P. 2070-8.

92. Chevalier, B.S. Design, activity, and structure of a highly specific artificial endonuclease / Chevalier B.S., Kortemme Т., Chadsey M.S., Baker D., Monnat R.J., Stoddard B.L. // Mol Cell. -2002. -Vol. 10, -№ 4. -P. 895-905.

93. Choi, В. Guanylate kinase, induced fit, and the allosteric spring probe / Choi В., Zocchi G // Biophys J. -2007. -Vol. 92, -№ 5. -P. 1651-8.

94. Christianson, D.W. Carboxypeptidase A / Christianson D.W., Lipscomb W.N. // Acc. Chem. Res. -1989. -Vol 22. -P. 62-9.

95. Christianson, D.W. Carboxypeptidase A: novel enzyme-substrate-product complex / Christianson D.W., Lipscomb W.N. // J Am Chem Soc. -1987. -Vol. 109,-№ 18.-P. 5536-8.

96. Christianson, D.W. Novel structure of the complex between carboxypeptidase A and a ketonic substrate analog / Christianson D.W., Kuo L.C., Lipscomb W.N. // J Am Chem Soc. -1985. -Vol. 107, -№ 26. -P. 82818283.

97. Coll, M. Three-dimensional structure of porcine procarboxypeptidase В: a structural basis of its inactivity / Coll M., Guasch A., Aviles F.X., Huber R. // EMBO J. -1991. -Vol. 10, -№> l.-P. 1-9.

98. Craik, C.S. Redesigning trypsin via genetic engineering / Craik C.S., Roczniak S., Sprang S., Fletterick R., Rutter W. // J Cell Biochem. -1987. -Vol. 33, -№ 3. -P. 199-211.

99. Craik, C.S. Redesigning trypsin: alteration of substrate specificity / Craik C.S., Largman C., Fletcher Т., Roczniak S., Barr P.J., Fletterick R., Rutter W.J. // Science. -1985. -Vol 228, -№ 4697. -P. 291-7.

100. Cristea, M. A G316 A mutation of manganese lipoxygenase augments hydroperoxide isomerase activity: mechanism of biosynthesis of epoxyalcohols / CristeaM., OliwE.H. //JBiol Chem. -2006. -Vol. 281, -№ 26. -P. 17612-23.

101. Dahiyat, B.I. De novo protein design: fully automated sequence selection / Dahiyat B.I., Mayo S.L. // Science. -1997. -Vol. 278, -№ 5335. -P. 82-7.

102. Dill, K.A. The protein folding problem: when will it be solved? / Dill K.A., Ozkan S.B., Weikl T.R., Chodera J.D., Voelz V.A. // Curr Opin Struct Biol. -2007. -Vol. 17, -№ 3. -P. 342-6.

103. Directed molecular evolution of proteins / S. Sussman, K. Johnsson, Eds. Weinheim : Wiley-VCH, cop. 2002.

104. Dorovska, V.N. The influence of the geometric properties of the active centre on the specificity of -chymotrypsin catalysis / Dorovska V.N., Varfolomeyev S.D., Kazanskaya N.F., Klyosov A.A., Martinek K. // FEBS Lett. -1972 -Vol. 23, -№ 1. -P. 122-4.

105. Eaton, D.L. Isolation, molecular cloning, and partial characterization of a novel carboxypeptidase В from human plasma / Eaton D.L., Malloy B.E., Tsai S.P., Henzel W., Drayna D. // J Biol Chem. -1991. -Vol. 266, -№ 32. -P. 18338.

106. Estell, D.A. Probing Steric and Hydrophobic Effects on Enzyme-Substrate Interactions by Protein Engineering / Estell D.A., Graycar T.P., Miller J.V., Powers D.B., Wells J.A., Burnier J.P., Ng P.G. // Science. -1986. -Vol. 233, -№ 4764. -P. 659-663.

107. Faming, Z. Structural evolution of an enzyme specificity. The structure of rat carboxypeptidase A2 at 1.9-A resolution / Faming Z., Kobe В., Stewart C.B., Rutter W.J., Goldsmith EJ. // J Biol Chem. -1991. -Vol. 266, -№ 36. -P. 2460612.

108. Fernandez-Ballester, G. Prediction of protein-protein interaction based on structure / Fernandez-Ballester G., Serrano L. // Methods Mol Biol. -2006. -Vol. 340. -P. 207-34.

109. Fersht A.R. Structure and mechanism in protein science / Alan R. Fersht. -New York : Freeman, 1999.

110. Fersht, A.R. Hydrogen bonding and biological specificity analysed by protein engineering / Fersht A.R., Shi J.P., Knill-Jones J., Lowe D.M.,

111. Wilkinson A .J., Blow D.M., Brick P., Carter P., Waye M.M., Winter G. // Nature. -1985. -Vol. 314, -№ 6008. -P. 235-8.

112. Fisher E. Einfluss der configuration auf die wirkung derenzyme / Fisher E. // Ber Dt Chem Ges. -1894. -Vol. 27. -P. 2985.

113. Fukasawa, K.M. Aspartic acid 405 contributes to the substrate specificity of aminopeptidase В / Fukasawa K.M., Hirose J., Hata Т., Ono Y. // Biochemistry. -2006. -Vol. 45, -№ 38. -P. 11425-31.

114. Galdes, A. Cryokinetic studies of the intermediates in the mechanism of carboxypeptidase A / Galdes A., Auld D.S., Vallee B.L. // Biochemistry. -1983. -Vol. 22, -№ 8. -P. 1888-93.

115. Gardell, S.J. Site-directed mutagenesis shows that tyrosine 248 of carboxypeptidase A does not play a crucial role in catalysis / Gardell S.J., Craik C.S., Hilvert D., Urdea M.S., Rutter W.J // Nature. -1985. -Vol. 317, -№ 6037. -P. 551-5.

116. Goetzman, E.S. Convergent evolution of a 2-methylbutyryl-CoA dehydrogenase from isovaleryl-CoA dehydrogenase in Solanum tuberosum / Goetzman E.S., Mohsen A.W., Prasad K., Vockley J. // J Biol Chem. -2005. -Vol. 280, -№ 6. -P. 4873-9.

117. Gololobov, M.Yu. Subtilisin from Bacillus subtilis strain 72. The influence of substrate structure, temperature and pH on catalytic properties /

118. Gololobov M.Yu., Morozova I.P., Vojushina T.L., Timokhina E.A., Stepanov V.M. // Biochim Biophys Acta. -1992. -Vol. 1118, -№ 3. -P. 267-76.

119. Guex, N. SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: an environment for comparative protein modeling / Guex N., Peitsch M.C. // Electrophoresis. -1997. -Vol. 18, -№ 15. -P. 2714-23.

120. Haldane J.B.S. / J.B.S. Haldane // Enzymes / -London : Longmans, Green and Co., 1930.-P. 182.

121. Hammes-Schiffer, S. Relating protein motion to catalysis / Hammes-Schiffer S., Benkovic S.J. // Annu. Rev. Biochem. -2006. -Vol. 75. -P. 519-41.

122. Handbook of Proteolytic Enzymes / A.J. Barrett, N.D. Rawlings, J.F. Woessner, eds. -London : Academic Press, Inc. Cop. 1997. -P. 1318-50.

123. Harbury, P.B. High-resolution protein design with backbone freedom / Harbury P.B., Plecs J.J., Tidor В., Alber Т., Kim P.S. // Science. -1998. -Vol. 282.-No. 5393.-P. 1462-7.

124. He, X.Z. Mutational analysis of the Medicago glycosyltransferase UGT71G1 reveals residues that control regioselectivity for (iso)flavonoid glycosylation / He X.Z., Wang X., Dixon R.A. // J Biol Chem. -2006. -Vol. 281. -No. 45. -P. 34441-7.

125. Hedstrom, L. Converting trypsin to chymotrypsin: the role of surface loops / Hedstrom L., Szilagyi L., Rutter W.J. // Science. -1992. -Vol. 255. -P. 1249-53.

126. Heinemann, I.U. Functional definition of the tobacco protoporphyrinogen IX oxidase substrate-binding site / Heinemann I.U., Diekmann N., Masoumi A., Koch M., Messerschmidt A., Jahn M., Jahn D. // Biochem J. -2007. -Vol. 402. -No. 3. -P. 575-80.

127. Hellinga, H.W. Construction of new ligand binding sites in proteins of known structure. I. Computer-aided modeling of sites with pre-defined geometry / Hellinga H.W., Richards F.M. // J Mol Biol. -1991. -Vol. 222. -No. 3. -P. 763-85.

128. Ho, S.N. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction / Ho S.N., Hunt H.D., Horton R.M., Pullen J.K., Pease L.R. // Gene. -1989 -Vol. 77. -No. 1. -P. 51-9.

129. Hohsaka, T. Incorporation of non-natural amino acids into proteins / Hohsaka Т., Sisido M. // Curr Opin Chem Biol. -2002. -Vol. 6. -No. 6. -P. 80915.

130. Host, G. Redesign of human carbonic anhydrase II for increased esterase activity and specificity towards esters with long acyl chains / Host G., Martensson L.G., Jonsson B.H. // Biochim Biophys Acta. -2006. -Vol. 1764. -No. 10.-P. 1601-6.

131. Humphrey, W. VMD: visual molecular dynamics / Humphrey W., Dalke A., Schulten K. // J Mol Graph. -1996. -Vol. 14. -No. 1. -P. 33-8.

132. Jeltsch, A. Engineering novel restriction endonucleases: principles and applications / Jeltsch A., Wenz C., Wende W., Selent U., Pingoud A. // Trends Biotechnol. -1996. -Vol. 14. -No. 7. -P. 235-8.

133. Jogl, G. Crystal structure of mouse carnitine octanoyltransferase and molecular determinants of substrate selectivity / Jogl G., Hsiao Y.S., Tong L. // J Biol Chem. -2005. -Vol. 280. -No. 1. -P. 738-44.

134. Jost, F. Mutation of amino acids in the alpha 1,3-fucosyltransferase motif affects enzyme activity and Km for donor and acceptor substrates / Jost F., de Vries Т., Knegtel R.M., Macher B.A. // Glycobiology. -2005. -Vol. 15. -No. 2. -P. 165-75.

135. Kamiya, H. Important amino acids in the phosphohydrolase module of Escherichia coli Orfl35 / Kamiya H., Iida E., Harashima H. // Biochem Biophys Res Commun. -2004. -Vol. 323. -No. 3. -P. 1063-8.

136. Karimaki, J. Engineering the substrate specificity of xylose isomerase / Karimaki J., Parkkinen Т., Santa H., Pastinen O., Leisola M., Rouvinen J., Turunen O. // Protein Eng Des Sel. -2004. -Vol. 17. -No. 12. -P. 861-9.

137. Kendrew, J.C. A three-dimensional model of the myoglobin molecule obtained by x-ray analysis / Kendrew J.C., Bodo G., Dinrzis H.M., Parrish R.G., Wyckoff H., Phillips D.C. // Nature. -1958. -Vol. 181. -No. 4610. -P. 662-6.

138. Khan, I.H. Altering the substrate specificity of glutamate dehydrogenase from Bacillus subtilis by site-directed mutagenesis / Khan I.H., Kim H., Ashida

139. H., Ishikawa Т., Shibata H., Sawa Y. // Biosci Biotechnol Biochem. -2005. -Vol. 69.-No. 9.-P. 1802-5.

140. Kilshtain-Vardi, A. Refined structure of bovine carboxypeptidase A at

141. A resolution / Kilshtain-Vardi A., Glick M., Greenblatt H.M., Goldblum A., Shoham G. // Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. -2003. -Vol. 59. -No. Pt 2.-P. 323-33.

142. Kim, H. Comparison of the structures of three carboxypeptidase A-phosphonate complexes determined by X-ray crystallography / Kim H., Lipscomb W.N. //Biochemistry. -1991. -Vol. 30. -No. 33. -P. 8171-80.

143. Kirk, O. Industrial enzyme applications / Kirk O., Borchert T.V., Fuglsang C.C. // Curr Opin Biotechnol. -2002. -Vol. 13. -No. 4. -P. 345-51.

144. Koshland, D.E. Application of a theory of enzyme specificity to protein synthesis / Koshland D.E. // Proc Nat Acad Sci USA. -1958. -Vol. 44. -No. 2. -P. 98-104.

145. Ma, W. Specificity of trypsin and chymotrypsin: loop-motion-controlled dynamic correlation as a determinant / Ma W., Tang C., Lai L. // Biophys J. -2005.-Vol. 89.-P. 1183-93.

146. Mahan, S.D. Alanine-scanning mutagenesis reveals a cytosine deaminase mutant with altered substrate preference / Mahan S.D., Ireton G.C., Stoddard B.L., Black M.E. // Biochemistry. -2004. -Vol. 43. -No. 28. -P. 8957-64.

147. Majiduddin F.K., Palzkill T. Amino acid residues that contribute to substrate specificity of class A beta-lactamase SME-1 / Majiduddin F.K., Palzkill T. // Antimicrob Agents Chemother. -2005. -Vol. 49. -No. 8. -P. 34217.

148. Markova, M. Determinants of substrate specificity in omega-aminotransferases / Markova M., Peneff C., Hewlins M.J., Schirmer Т., John R.A. // J Biol Chem. -2005. -Vol. 280. -No. 43. -P. 36409-16.

149. Marvin, J.S. Manipulation of ligand binding affinity by exploitation of conformational coupling / Marvin J.S., Hellinga H.W. // Nat Str Biol. -2001. -Vol. 8. -No. 9. -P. 795-8

150. Mayer, K.M. Identification of amino acid residues involved in substrate specificity of plant acyl-ACP thioesterases using a bioinformatics-guided approach / Mayer K.M., Shanklin J. // BMC Plant Biol. -2007. -Vol. 7. -P. 1.

151. McCammon, J.A. Dynamics of folded proteins / McCammon J.A., Gelin B.R., Karplus M. // Nature. -1977. -Vol. 267. -No. 5612. -P. 585-90.

152. McKay, T.L. Comparative studies on human carboxypeptidase В and N / McKay T.L., Phelan A.W., Plummer Т.Н. Jr. // Arch Biochem Biophys. -1979. -Vol. 2. -P. 487-92.

153. Miller, D.W. Enzyme specificity under dynamic control: a normal mode analysis of alpha-lytic protease / Miller D.W., Agard D.A. // J Mol Biol. -1999. -Vol. 286. -No. 1. -P. 267-78.

154. Miyazaki, К. Identification of a novel trifunctional homoisocitrate dehydrogenase and modulation of the broad substrate specificity through site-directed mutagenesis / Miyazaki K. // Biochem Biophys Res Commun. -2005. -Vol. 336. -No. 2. -P. 596-602.

155. Muller, T.A. Structural basis for the enantiospecificities of R- and S-specific phenoxypropionate/alpha-ketoglutarate dioxygenases / Muller T.A., Zavodszky M.I., Feig M., Kuhn L.A., Hausinger R.P. // Protein Sci. -2006. -Vol. 15. -No. 6. -P. 1356-68.

156. Nalamachu, S.R. Regulation of carboxypeptidase E. Effect of Ca on enzyme activity and stability / Nalamachu S.R., Song L., Fricker L.D. // J Biol Chem. -1994. -Vol. 269. -No. 15. -P. 11192-5.

157. Narahashi, Y. Purification and some properties of a new metallo carboxypeptidase of Streptomyces griseus K-l / Narahashi Y., Yoda K. // J Biochem. -1979. -Vol. 86. -No. 3. -P. 683-94.

158. Narahashi, Y. The amino acid sequence of zinc-carboxypeptidase from Streptomyces griseus / Narahashi Y. // J Biochem. -1990. -Vol. 107. -No. 6. -P. 879-86.

159. Nomura, W. In vivo site-specific DNA methylation with a designed sequence-enabled DNA methylase / Nomura W., Barbas C.F. 3rd. // J Am Chem Soc. -2007. -Vol. 129. -No. 28. -P. 8676-7.

160. Nordland, P. Ribonucleotide reductases / Nordland P., Reichard P. // Annu Rev Biochem. -2006. -Vol. 75. -P. 681-706.

161. Norrgard, M.A. Alternative mutations of a positively selected residue elicit gain or loss of functionalities in enzyme evolution / Norrgard M.A., Ivarsson Y., Tars K., Mannervik B. // Proc Natl Acad Sci USA. -2006. -Vol. 103.-No. 13.-P. 4876-81.

162. Oelschlaeger, P. Modeling domino effects in enzymes: molecular basis of the substrate specificity of the bacterial metallo-beta-lactamases IMP-1 and IMP-6 / Oelschlaeger P., Schmid R.D., Pleiss J. // Biochemistry. -2003. -Vol. 42. -No. 30. -P. 8945-56.

163. Oh, B. Modifying the substrate specificity of penicillin G acylase to cephalosporin acylase by mutating active-site residues / , Kim K., Park J., Yoon J., Han D., Kim Y.// Biochim Biophys Res Commun. -2004. -Vol. 319. -P. 48592.

164. Okuyama, M. Structural elements to convert Escherichia coli alpha-xylosidase (YicI) into alpha-glucosidase / Okuyama M., Kaneko A., Mori H., Chiba S., Kimura A. // FEBS Lett. -2006. -Vol. 580. -No. 11. -P. 2707-11.

165. Ottosson, J. Substrate entropy in enzyme enantioselectivity: an experimental and molecular modeling study of a lipase / Ottosson J., Fransson L., Hult K. // Protein Sci. -2002. -Vol. 11. -No. 6. -P. 1462-71.

166. Pace, C.N. How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein / Pace C.N., Vajdos F., Fee L., Grimsley G., Gray T. // Protein Sci. -1995.-Vol. 11.-P. 2411-23.

167. Page, M.J. Engineering protein allostery: 1.05 A resolution structure and enzymatic properties of a Na+-activated trypsin / Page M.J., Christopher C.J., di Cera E. // J Mol Biol. -2008. -Vol. 378. -P. 666-72.

168. Pal, G. Mutant rat trypsin selectively cleaves tyrosyl peptide bonds / Pal G., Patthy A., Antal J., Graf L. // Anal Biochem. -2004. -Vol. 326. -No. 2. -P. 190-9.

169. Parker, J. Errors and alternatives in reading the universal genetic code / Parker J. // Microbiological reviews. -1989. -Vol. 53. -No. 3. -P. 273-98.

170. Pauling L. / Pauling L. // Am Scient. -1948. -Vol. 36. -P. 51.

171. Perona J.J., Evnin L.B., Craik C.S. A genetic selection elucidates structural determinants of arginine versus lysine specificity in trypsin / Perona J.J., Evnin L.B., Craik C.S. // Gene. -1993b. -Vol. 137. -No. 1. -P. 121-6.

172. Perona, J.J. Relocating a negative charge in the binding pocket of trypsin / Perona J .J., Tsu C.A., McGrath M.E., Craik C.S., Fletterick R.J. // J Mol Biol. -1993a. -Vol. 230. -No. 3. -P. 934-49.

173. Perona, J J. Structural basis of substrate specificity in the serine proteases / Perona J.J., Craik C.S. // Protein Sci. -1995. -Vol. 4. -No. 3. -P. 337-60.

174. Perutz, M.F. Structure of hemoglobin / Perutz M.F. // Brookhaven Symp Biol. -1960. -Vol. 13. -P. 165-83.

175. Phillips, M.A. Arginine 127 stabilizes the transition state in carboxypeptidase / Phillips M.A., Fletterick R, Rutter WJ. // J Biol Chem. -1990. -Vol. 265. -No. 33. -P. 20692-8.

176. Phillips, M.A. Role of the prodomain in folding and secretion of rat pancreatic carboxypeptidase A1 / Phillips M.A., Rutter W.J. // Biochemistry. -1995.-Vol. 35.-P. 3771-6.

177. Pokala, N. Review: protein design—where we were, where we are, where we're going / Pokala N., Handel T.M. // J Struct Biol. -2001. -Vol. 134. -No. 2-3.-P. 269-81.

178. Prosser, D.E. Structural motif-based homology modeling of CYP27A1 and site-directed mutational analyses affecting vitamin D hydroxylation / Prosser D.E., Guo Y., Jia Z., Jones G. // Biophys J. -2006. -Vol. 90. -No. 10. -P. 3389-409.

179. Quemeneur E. Engineering cyclophilin into a proline-specific endopeptidase / Quemeneur E., Moutiez M., Charbonnier J.B., Menez A. // Nature. -1998. -Vol. 391. -No. 6664. -P. 301-4.

180. Rai, R. Molecular dissection of arginyltransferases guided by similarity to bacterial peptidoglycan synthases / Rai R., Mushegian A., Makarova K., Kashina A. // EMBO Rep. -2006. -Vol. 7. -No. 8. -P. 800-5.

181. Reeck, G.R. New forms of bovine carboxypeptidase В and their homologous relationships to carboxypeptidase A / Reeck G.R., Walsh K.A., Hermodson M.A., Neurath H. // Proc Natl Acad Sci USA. -1971. -Vol. 68. -No. 6. -P. 1226-30.

182. Rheinnecker, M. Variants of subtilisin BPN' with altered specificity profiles / Rheinnecker M., Eder J., Pandey P.S., Fersht A.R. // Biochemistry. -1994. -Vol. 33. -No. 1. -P. 221-5.

183. Riordan, J.F. The functional tyrosyl residues of carboxypeptidase A. Nitration with tetranitromethane / Riordan J.F., Sokolovsky M., Vallee B.L. // Biochemistry. -1967. -Vol. 6. -No. 11. -P. 3609-17.

184. Russell, A.J. Rational modification of enzyme catalysis by engineering surface charge / Russell A.J., Fersht A.R. // Nature. -1987. -Vol. 328. -No. 6130. -P. 496-500

185. Sambrook J. Molecular cloning: a laboratory manual / J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis. -New York: Cold Spring Harbor Press, 1989.

186. Sansen, S. Structural insight into the altered substrate specificity of human cytochrome P450 2A6 mutants / Sansen S., Hsu M.H., Stout C.D., Johnson E.F. // Arch Biochem Biophys. -2007. -Vol. 464. -No. 2. -P. 197-206.

187. Sayari, A. N-terminal peptide of Rhizopus oryzae lipase is important for its catalytic properties / Sayari A., Frikha F., Miled N., Mtibaa H., Ben Ali Y., Verger R., Gargouri Y. // FEBS Lett. -2005. -Vol. 579. -No. 5. -P. 976-82.

188. Schechter, I. On the size of the active site in proteases. I. Papain / Schechter I., Berger A. // Biochem Biophys Res Commun. -1967. -Vol. 27. -No. 2.-P. 157-62.

189. Schmid, M.F. Structure of carboxypeptidase В at 2.8 A resolution / Schmid M.F., Herriott J.R. // J Mol Biol. -1976. -Vol. 103. -No. 1. -P. 175-90.

190. Schnell, J.R. Structure, dynamics and catalytic function of dihydrofolate reductase / Schnell J.R., Dyson H.J., Wright P.E. // Annu Rev Biophys Biomol Struct. -2004. -Vol. 33. -P. 119-40.

191. Schoemaker, H.E. Dispelling the myths—biocatalysis in industrial synthesis / Schoemaker H.E., Mink D., Wubbolts M.G. // Science. -2003. -Vol. 299.-No. 5613.-P. 1694-7.

192. Shindle, U. Protein memory through altered folding mediated by intramolecular chaperones / Shindle U., Liu J.J., Inouye M.// Nature. -1997. -Vol. 389. -P. 520-2.

193. Silva, G.H. From monomeric to homodimeric endonucleases and back: engineering novel specificity of LAGLIDADG enzymes / Silva G.H., Belfort M., Wende W., Pingoud A. // J Mol Biol. -2006. -Vol. 361. -No. 4. -P. 744-54.

194. Simonson, T. Free energy simulations come of age: protein-ligand recognition / Simonson Т., Archontis G., Karplus M. // Acc Chem Res. -2002. -Vol. 35. -No. 6. -P. 430-7.

195. Skidgel, R.A. Human carboxypeptidase M. Purification and characterization of a membrane-bound carboxypeptidase that cleaves peptide hormones / Skidgel R.A., Davis R.M., Tan F. // J Biol Chem. -1989. -Vol. 264. -No. 4.-P. 2236-41.

196. Slobin, L.I. Kinetic studies on the action of carboxypeptidase A on bovine insulin and related model peptides / Slobin L.I., Carpenter F.H. // Biochemistry. -1966. -Vol. 5. -No. 2. -P. 499-508.

197. Song, L. Purification and characterization of carboxypeptidase D, a novel carboxypeptidase E-like enzyme, from bovine pituitary / Song L., Fricker L.D. // J Biol Chem. -1995. -Vol. 270. -No. 42. -P. 25007-13.

198. Sorensen, S.B. Mutational replacements of the amino acid residues forming the hydrophobic S4 binding pocket of subtilisin 309 from Bacillus lentus / Sorensen S.B., Bech L.M., Meldal M., Breddam K. // Biochemistry. -1993. -Vol. 32. -No. 35. -P. 8994-9.

199. Sorensen, S.B. The specificity of carboxypeptidase Y may be altered by changing the hydrophobicity of the SI' binding pocket / Sorensen S.B., Breddam K. // Protein Science. -1997. -Vol. 6. -P. 2227-32.

200. Spungin, A. Streptomyces griseus aminopeptidase is a calcium-activated zinc metalloprotein. Purification and properties of the enzyme / Spungin A., Blumberg S. // Eur J Biochem. -1989. -Vol. 183. -No. 2. -P. 471-7.

201. Sreerama, N. Estimation of protein secondary structure from circular dichroism spectra: comparison of CONTIN, SELCON, and CDSSTR methods with an expanded reference set / Sreerama N., Woody R.W. // Anal Biochem. -2000. -Vol. 287. -No. 2. -P. 252-60.

202. Starcevic, D. The hydrophobic hinge region of rat DNA polymerase beta is critical for substrate binding pocket geometry / Starcevic D., Dalai S., Jaeger J., Sweasy J.B // J Biol Chem. -2005. -Vol. 280. -No. 31. -P. 28388-93.

203. Stepanov, V.M. Carboxypeptidase T / Stepanov V.M. // Methods Enzymol. -1995. -Vol. 248. -P. 675-83.

204. Suel, G.M. Evolutionarily conserved networks of residues mediate allosteric communication in proteins / Suel G.M., Lockless S.W., Wall M.A., Ranganathan R // Nat Struct Biol. -2003. -Vol. 10. -No. 1. -P. 59-69.

205. Sussman, D. Isolation and characterization of new homing endonuclease specificities at individual target site positions / Sussman D., Chadsey M., Fauce

206. S., Engel A., Bruett A., Monnat R. Jr., Stoddard B.L., Seligman L.M. // J Mol Biol. -2004. -Vol. 342. -No. 1. -P. 31-41.

207. Tanaka, T. Redesign of catalytic center of an enzyme: aspartic to serine proteinase / Tanaka Т., Yada R.Y. // Biochem Biophys Res Commun. -2004. -Vol. 323.-No. 3.-P. 947-53.

208. Teplyakov, A. High-resolution structure of the complex between carboxypeptidase A and L-phenyl lactate / Teplyakov A., Wilson K.S., Orioli P., Mangani S // Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. -1993. -Vol. 49. -No. Pt 6. -P. 534-40.

209. Thorson, J.S. Natures Carbohydrate Chemists. The Enzymatic Glycosylation of Bioactive Bacterial Metabolites / , Hosted T.J. Jr., Jiang J., Biggins J.B., Ahlert J. // Curr. Org. Chem. -2001. -Vol. 5. -No. 2. -P. 139-67.

210. Tsu, C.A. Structural basis for the broad substrate specificity of fiddler crab collagenolytic serine protease 1 / Tsu C.A., Perona J.J., Fletterick R.J., Craik C.S. // Biochemistry. -1997. -Vol. 36. -P. 5393-401.

211. Vajda, S. Characterization of protein-ligand interaction sites using experimental and computational methods / Vajda S., Guarnieri F. // Curr Opin Drug Discov Devel. -2006. -Vol. 9. -No. 3. -P. 354-62.

212. Vallee, B.L. Carboxypeptidase, a zinc metallo-protein. Carboxypeptidase, a zinc metalloenzyme / Vallee B.L., Neurath H. // J Biol Chem. -1955. -Vol. 217.-No. l.-P. 253-61.

213. Van Der Spoel, D. GROMACS: fast, flexible, and free / Van Der Spoel D., Lindahl E., Hess В., Groenhof G., Mark A.E., Berendsen H.J. // J Comput Chem. -2005. -Vol. 26. -No. 16. -P. 1701-18.

214. Venekei, I. Attempts to convert chymotrypsin to trypsin / Venekei I., Szilagyi L., Graf L., Rutter W.J. // FEBS Lett. -1996. -Vol. 379. -P. 143-7.

215. Villegas, V. The activation pathway of procarboxypeptidase В from porcine pancreas: participation of the active enzyme in the proteolytic processing / Villegas V., Vendrell J., Aviles X. // Protein Sci. -1995. -Vol. 4. -No. 9.-P. 1792-800.

216. Wang, Q. Discrimination of esterase and peptidase activities of acylaminoacyl peptidase from hyperthermophilic Aeropyrum pernix K1 by a single mutation / Wang Q., Yang G., Liu Y., Feng Y. // J Biol Chem. -2006. -Vol. 281. -No. 27. -P. 18618-25.

217. Watson, J.D. A structure for deoxyribose nucleic acid / Watson J.D., Crick F.H.C. // Nature. -1953. -Vol. 171. -P. 737-8.

218. Weiner, М.Р. Rapid PCR site-directed mutagenesis / Weiner M.P., Costa

219. G.L. // PCR Methods Appl. -1994. -Vol. 4. -No. 3. -P. S131-6.

220. Wells, J.A. Designing substrate specificity by protein engineering of electrostatic interactions / Wells J.A., Powers D.B., Bott R.R., Graycar T.P., Estell D.A. // Proc Natl Acad Sci USA. -1987. -Vol. 84. -No. 5. -P. 1219-23.

221. Wolff, E.C. The kinetics of carboxypeptidase В activity / Wolff E.C., Schirmer E.W., Folk J.E. // J Biol Chem. -1962. -Vol. 237. -P. 3094-9.

222. Xu, G. Strategies for enzyme/prodrug cancer therapy / Xu G., McLeod

223. H.L. // Clin Cancer Res. -2001. -Vol. 7. -No. 11. -P. 3314-24.

224. Yep, A. Determinants of substrate specificity in KdcA, a thiamin diphosphate-dependent decarboxylase / Yep A., Kenyon G.L., McLeish M.J. // Bioorg Chem. -2006. -Vol. 34. -No. 6. -P. 325-36.

225. Youngblood, B. Engineered extrahelical base destabilization enhances sequence discrimination of DNA methyltransferase M.Hhal / Youngblood В.,

226. Shieh F.K., De Los Rios S., Perona JJ., Reich N.O. // J Mol Biol. -2006. -Vol. 362. -No. 2. -P. 334-46.

227. Zha, W. Characterization of the substrate specificity of PhlD, a type III polyketide synthase from Pseudomonas fluorescens / Zha W., Rubin-Pitel S.B., Zhao H. // J Biol Chem. -2006. -Vol. 281. -No. 42. -P. 32036-47.

228. Zhao, L. Mutations in the substrate binding site of thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor (TAFI) alter its substrate specificity / Zhao L., Buckman В., Seto M., Morser J., Nagashima M. // J Biol Chem. -2003. -Vol. 278. -No. 34. -P. 32359-66.

229. Zhao, Y. Structure-function analysis of cytochromes P450 2B / Zhao Y., Halpert J.R. // Biochim Biophys Acta. -2007. -Vol. 1770. -No. 3. -P. 402-12

Информация о работе

Гришин, Андрей Михайлович
кандидата биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.03

Диссертация

Исследование структурных основ субстратной специфичности карбоксипептидазы T Thermoactinomyces vulgaris - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы