Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование роли растворимого Fas-рецептора в патогенезе аутоиммунных заболеваний, ревматоидного артрита и системной красной волчанки

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование роли растворимого Fas-рецептора в патогенезе аутоиммунных заболеваний, ревматоидного артрита и системной красной волчанки"

На правах рукописи

Тедегвиа Екптеряяа Сергеева»

ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ РАСТВОРИМОГО РА8-РЕЦЕ1ГГОРА В ПАТОГЕНЕЗЕ АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ, РКВМАТОИДПОГО АРТРИТА Н СИСТЕМНОЙ

КРАСНОЙ ВОЛЧАНКИ

вЗ.СЭ.04 -Сяохимва

АВТОРЕФЕРАТ диссертации ва сспсканве ученой пенеш кандидата биологпяесжпх наук

2 3 МАЙ 2007

Пущгио 2097

003063105

Работа вынолвена в лаборатории генной инженерия НИИ молекулярной медицины ММА км. И М. Сеченова и в лаборатории клеточной иняйераа Ияститута тесгхтачесгой в экспериментальной биофзвиги РАН

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ академик РАН и РАМН,

доктор медацвнстх тук, профессор, Нальцгэ Мтыл Алгегаядрозич доктор биологических наук, Белецквй Игорь Петровяч

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ' догге р бяодопгчесвп каук. профессор,

Нпвеселеа Владешгр Ибеяоеич

гляди дат биологических наук, Иехлепкип Влнпш; Георгиевич

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ Шучво-исследоззтельсшщ институт реаматология РАМН

Защита состоится «24» м«а. 2007 г в 16.30 на заседании дкссергедкаишго совета Д 03X033,01 в Институте биофизики клспси РАН адресу 142290, Московжш область, г.Пущиво, ул. Институтсгаг, д 3, ИБК РАН

С диссертацией можно ознакомиться в центральной Бавшэтска НЦБИ РАН, Пущиао Автореферат разослан «24» апреля 2007 года

Ученый сехретврь диссертационного совета, кандидат биологических наук

ТЛ. Сыолихииа

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

В регуляция пролиферации, дифференцировал, клеточной гибели вахную роль юргяиг семейства рецепторов Фактора иежроза опухоли (ФНО) н соответствующих лягавдов Часть этих функций реализуется в результате активации траясмембралных рецепторов лш-авдемн (растворишош или травшенбрапшяш) н последующей передачи сигнала в клетку, которая несет рецептор Другие функции реализуются посредством так называемой «обратной сигнализации», при которой рецептор (растворимый или трансмсмбргнвый) выполняет роль лкганда, а трансмембраииый лигаяд выступает в качестве рецептора. Практически для всех членов семейств ФНО-рсцмггоров и ФНО-лвпшдов показаны биологические эффекта «обратной сигнализации» на различных типах клеток.

Fas-рецептор и Fas-лиганд являются члепаии семейств рецепторов ФНО и лигапдов ФНО, соответственно, и играют ключевую роль в поддержании гомеостаза иммунной системы. Активация трансмембранвого Fas-рецептора Fas-липшдом летят в основе селекции Т- и В-лимфоцитов, уничтожения клгтох-мтазеней цэтшоксяческшш лимфоцитами. Активация трансмембравяого Раз-рецептора растворимым или трансмембрашгам Раз-лигапдом в большинстве случаев приводят к гибели клеток по типу гпоптоза. Для системы Fas/FzsL была иве продемонстрировала возможность проведения обрзгвого сигнала через трапскембранный FasL (Desbarata et al, 1998, Suzuki, Рак, 2000; Prasakova et al, 2003).

Большое количество цзтогенпьи состояний, в честности аутоиммунных, связано с нарушением функционирования системы Fas/FasL При некоторых аутоиммунных заболеваниях, в том числе пра системной краевой волчанке (СКВ) и ревматоидном артрите (РА), уровень растворимого Рсз-рецецтора («Fas) в сыворотке хрови больных повышен по сравнению со здоровыми донорами (Cheng et al., 1994; Christension et al, 2002; Ales et al, 2ЖМ; Sabm et aL, 2007) Было сделано предположение о том, что sFas конкурирует с мембраино-связшным Fas-рецгптором за свяэызапие с лнгандом и является ингибитором Раз-опосредованного апоятоза (Cheng et aL, 1994; Токдпо et aL, 1996; Ifcunuma et al, 1997).

Однако в роботах других авторов показано, что увеличение уровня растворимого Fas-рецептора в сыворотке крови больных СЗСВ и РА коррелирует с количеством Еяоптотичесхнх лимфоцитов (Courtney et al ,1999, Smolewska tí ,si, 2003, Silvestns et al, 2003) Было обнаружено, что инкубация с sFas значительно подавляет пролиферацию Т клеток. Основываясь га этих наблвдеипях, можно полагать, что sFas вызывает

проажягтотачесхий эффект Проапоптотические эффекш sFas, как было похвзгно ранее, реализуются посредством «обратной сигнализации» через Fes-лигацд В настоящей работе была предпринята попытка изучить возыозшую роль sFax, как индуктора Рез-лиганд -опосредованной «обратной сигнализации» в патогенезе таких аутоиммунных заболеваний, как системная красная волчанка и ревматоидный артрзт.

Пмчвштииши

Цель данной работы заключалась в исследовании роли растворимого Fus-рецептора в патогенезе ревматоидного apipara и системной красной волчанки.

Задачи исследования

1. Разработать тест-систему типа «сэндвич» на осггове монокдональпых антител (МКА) да» определения уровня еРая в сыворотке крови.

2. Проанализировать концентрацию и форшу (олигоыеркая или мономер нал) sFas в сыворотке крови больных в сравнении со здоровыми донорами и выявить источник сто экспрессия

3 Исследовать возможную корреляцию уровня «Fas в сыворотке крови с клиническими параметрами больных РА и СКВ дал выяснения возможности использозгния анализа sFas в целях диагностики и прогноза ззболеигигй.

4 Исследовать биологическую активность сывороток больных, содержащих высокий уровень растворимого sFas, на культуре клеток.

5 Выявить типы клеток - потенциальных мишеней для sFas у больных РА в СКВ

Научная иовизн« и гсястич густя в^яяоеп» работы,

Впертые показало, что sFas, обнаруживаемый в сыворотке крова больных РА к СКВ в повышенной концентрации, прсдставлга олигоиерной формой и обладает цнтотоксической активностью.

Анти-пролифератавла* активность сывороток больных аутоиммунными заболеваниями, соддпкящах высокеЯ уровень олкгомериого sFas, наряду с высокими уровтамн экспрессии Рга-липшда в сикояиоцитах н лимфоцитах периферической крови позволяют предполагать возможность Fas-лкпшд - опосредованной «обратной сигнализации» в патогенезе РА н СКВ

Обнаружена корреляция мезеду концентрацией sFas и активностью заболевание, количеством болезненных и припухших суставоз у больных РА. Тгхкм образом, sFas

пожат рассматриваться кшс маркер клинической активности при РА, а также иметь прогностическое значение и исполиоваты а для мониторинга течения заболевания.

Показана взаимосвязь между уровнем sFas и наличием лейкопении, в твхке высокой частотой ссрозитоа, язн рогозой полости, поражения почет, суставов, щшунологических и гематологических нарушений у больных СКВ Тахим образом, sFas koset служить индшатороы повреждения органов и палей при СКВ

Полученные |)езузьтв™ дают основание дет поиска терапевтических средств, ивгибирующих цитотоксическую аггивноегь sFas

Апрсбяцжя рябдты

Материалы лис гертгцвонной работа представлены в шще докладов и стендовых сообщений на «окференциях: молодых ученых. «Биологи» - наука XXI века* (Пущино, 2003), «Molecular Mechanisms in Homeostasis and Disease» (Спецес, Греция, 2003), «Молекулярная медицина и бксбезопасвость» (Мосвза, 2005); на 31-м конгрессе FEBS «Molecules ш Health lud Disease» (Стшбу/, Турция, 200б)

Публикации

По теме диссертации опубликовало и находятся в печати 3 статьи и 2 тгаисов юнференцай,

Ctpyctvim и обьеи дяссерткпдя

Диссертация ссстоит из введашя, обзора литературы описания материалов и истодов наследована*, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и

списка датируемой литературы Работа изложена на_страницах, включает_

таблицы и_риезтш» Список летерахуры включает__ссылок

МАТЕРШ Л Ж МЕТОДЫ

В исследование включено 73 бол,пых РА, 99 больных СКВ, находившихся па печении в ГУ Иноитуте ревматология РАМН. Контрольную группу составаш 30 асровых доноров ^{иапюз РА или СКВ у всех больных соответствовал критериям Американской Коллегии Ревматологов (АКР) (Ainrett et aL, 1988; Tan et al, 1982) Методы а объекты исследования представлены в таблице 1

Получеиае мзггершла исследгванпп. Игбср сыворотки всох пациентов и здоровых доноров осуществляли после центрифугирования (1500 g) крови, йбразпы згморажинали и хранили при -70 С°.

Таблица 1.

Методы я объект исследования

Методы исследования Исследуемый мзтгрнал, в

РА СКВ Контроль

Иммуяофермягшый анализ (sFes) сыворотка крови, 78 сыворотка крови, 99 сыворотка крови, 30

Гедь-фшгьтргцих сыворотка крови, 6 сыворотка крови, 7 сыворотка крови, 3

Иммуногистохими» (Fa^L) синовий, 20 — —

ИммунофлуоресцентныЯ анализ (FasL) лимфоциты, 20 лимфоцита, 20 лимфоциты, 7

RT-PCR (sFas) лимфоциты, 20 лимфоциты, 20 лимфоциты ,7

Периферические лимфоциты крови выделит из геаарлннзнроваипой венозной кроаи пациентов я здоровых доноров в соответствии с протоколом (Flat? Laboratories, США).

Образцы синовиальной ткани получали ео время ертроскотш в снновкапсулэктомпн, пройденных согласно показавшем, н зэдоражнззш при -70 С. Анализ rFes в сыворотке крозп. Сыаоротки с высоким содержанием sFas разделали на FPLC с помощью гельфялиращш на колонке с Snperose - 12 (Pbsrmacia, Швеции) Разделение проводили в буфере, содержащем J 0 мМ Тряс-HCl, pH 7.4, 150 мМ Nad со сюоростью ОД шАше, поглощение элюента детектировали прн 280 ем. Анализ эксзрессвя травемембригиого FasL в сетгсгяальвой mm в лвмфоцэтах периферической хревп. Нммуногистохнмическую реакцию прозодила на серийных краоеппных срезах сиш>виально0 ткани толщиной S цт стацдаргаым стреитаЕпдин-биотиновым методом с использованием ыолосгошшьпых антител к FasL (R&D Systems, USA). Метку выяялкдн с помощью днгминобеизвдита (ДАБ) (Sigma, USA). Срезы дополнительно окрашивали гематоксилином.

Иммунофлуоресцентаое окрашивание лимфоцитов периферической крови проводили с помощью мопоклонгшышх антител к FasL (R&D Systems, USA). Первичные антитела выявляли вторичпьши антителами, мечеными FITC (Sigma, USA) При интерпретации результатов учитывали интенсивность свечения.

СтатЕстика, Статистическая обработка всех напученных данных прогсдшхась с ипюльзоваякеи вепзрамеярнческнх методов программы «Сгахксгкка 60» (Stateoft,

США). Ашшлэ *оррел*цкн концентрации sFes с сдагачесгимн параметре»! ироводюс* с иыгапьэсаэддоем коэффициента корреляции Свярмгна (î) Сгетистечесмя зна*тимостъ коызагелвй была определена как p<0,0S,

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОВСУЖДЕНИЕ 1. Разработка тест астат пга» таз яде «гч* ш мявм мопок.тлйяльвых «т*тел дла определяя™ мшяевгтрацкя iFu s tu мрет*« кро»в.

П;рвый этап работ заключили в получении ыоиокл овальных антител к растворимому Fas-pcuenropy. Дп» этого проводили гибрндаииш» клею* ми<то*ш NSO с клетками селезенки мыши, «ммупязироаан&ой рекоибнпвкгдым растворимым Fas-рецептором (FasATM). Полученные ийридоим игбиршшсь на седекгаваой среде, содержащей гапоксантиЕ, акныоятеряв к пошрх. Через две недели после процедуры гибридизации гуттуральную юадкоет» ан*лкзнро»аад на содержание антител, специфичных г РяьДТМ, методами иммуиоферыентного анализ» (ИОА). Были отобраны 4 клока, продуцирующие иоиоклонвлъиые антитела (МКА) с высотой аффропнхггью к рехщмбиааигному растворимому Кая-рвпегггору.

Дги полученм Чеобходямото количества МКА пионы, продуцирующие специфические антитела s Fas-рецегтгору, иереаодита в аецнгнукз форму, и МКА ta асдатной жвдкоьтя пояторяо тестировали с помощью ИФА (р«с. 1).

Рис. 1. Тестирование МКА (клэиы 1, 2, 3, 4) иэ асцвтной жидкости методом ИФА. В качестве аигигеиа наносили рекоийиа«итяы8 FasATM. В качестве отрицательного юетрол* (К-) исногсиоввлй регомбктщпгый белой В«. В качестве положительно™ юитролх (К+) использовали сыворотку имыуняэирояаииоймыши в разведении 1:1000.

1__________2 3 4

45кДа

Рже. 2. Темироьаяге МКА та каапной жидкости методом иымуяобпотткга. МКА, продуцируемые клонамн 1, % 3, 4, взаимодействуют с РмДТМ <~45кДа). В качестве натшена наносили лизат Е. соН, содержащий РакДТМ. В тачесгве отрицательного гоятрол» использовали лиэат клеток Е. соИ, содержащий реюмбиняйпшй белок Вс1-Х.

Затем МКА тестировал» с помощью ннмуноблотинга (рис. 2). Моноклонаданые антитела, продуцируемые клоидми 2,3,4, взаимолейсгвоаш и с РзеД'ТМ (молакулярпаи мшха -45 кДа).

После очнетси МКА конъюгировали с пероксидазой хрена и полученные коньюгаты проверили в рааякчяы* комбинациях с аеконъюгировавнымя МКА для подбора пар, уанающнх различные эпипнщ РавДТМ. В результате была выбрана гтра МКА дни «сэядвич» методики ИФА и подобраны оптимальные ковдентрадин МКА и пшикжи,

Концентрацию 8рав в сыворотке крови определяли с помощью ка^гибровочиоЙ хрввоЭ, отражающей зависимость оптической штате™,-™ при 490 им от концентрации контрольного образца с известный» содержанием рекомбинмггного ИахАТМ.

2. Исследование кокцектрацях яГа« я сыворотке яров* больных РА, СКВ ш здоровых доноре».

Ранее было показано, что для больных аутоиммунными заболеашдаЕмн характерно вдвыпшЕЕное содержание (Рад (Сйв^б е1 а!., 1994; СЬгЫтв&зп &. в!., 2001-, 8вЬт й а1,, 2007). Мы проверили уровень зКез в сыворотках больных РА и СКВ во сравнению со здоровым® донорами. Концентрация растворимого Рая-рецептора в сыворотках здоровых доноров составили 1,5*0,3 яг/мл Было установлено, что высокое содержание «Рая (превышающее контрольные значения в 2 и более раз) наблюдается у 11% больных РА, 10% больны* СКВ (та&т, 2).

Таблиц» 2.

Частот* встречатостк оовытеявого уровня вРа& в сызорсгте крови йчмдяых РА я СКВ.

РА, п=78 СКВ, в=99

Количество бодьеых с ковдеитрянией 5рав в сыворотке крови более 3 аг/мд 9(11%) 10(10%)

Количество больны* с концентрацией вЕаа в сыворотке храня от 1,8 до 2,8 нг/ия 24(31%) 17 (17%)

Суммарное количество больиых с концентрацией (Раа, превышающей »Жфолъные значения 33 (42%) 27(27%)

ЛТ-РСЙ анализ ыРНК, выделенной из лимфоцитов периферической крови, полученных от больны* с повышенным уровнем 9Рав, показал резкое увеличение синтеза мРНК ера» оо сравнению с больными с невысоким содержанием аРав и здоровыми донорами (рис, 3). Хаки» образом, источником аРав в крови иссдсдомшпд больных яадготи лимфоцит периферической хроан,

К 1

V} а и

Лгс. 3. ЙТ-РСЯ авааиз зидрессин мРНК трансмембранного н растворимого Рав-реаедтора в лиыфощгтал. Повышенная „ экспрессия «Ра» мР1ЕК обнвруживаегся в а^лямфодигах больных РА ОД! и СКВ (3) по сравнению с лимфоцитами здоровых доноров

яГаЗО-

3. Взаимосвязь уровня кРм ■ сыворотке крови больиык РА « СКВ с хаинвчмхяи* иршскркгпш! больных.

Лрж анализе всииожйой взаимосвязи между урввием аГи и квишиееювяг параметрами больных РА было обнаружено, что уровень вИа® коррелирует с числом [филумшя в болезненных суставов (рис. 4А, ,Б). Также была выявлена корреляция уровня «Ра» с индексом аккаваости заболевания ОА828 (рис. 401 Эти результаты согласуется с равными других исследователей, в работа* которых было показано, что уровень зГаа у больных с активное формой РА значительно выше по сравнению с неактивной формой (АСез « а1,2004).

г I 0.79 Р* 0.00000)

я ' 9 о

S0 se

2 * « i ю \2 i4 та II за гг гг гб а » Число припуяяа cvc'jeüi

i? и

г»

о

Г - 0.74 Р < 0.0X001

* & I 10 11 14 1« II 30 Число болезненны*, съездов

Рнс.4. Корреляции ypoeHj sFas с числом ripiinyxraiix н болезненных сустаяон (А.Б) в с индексам аьтпганосги РА. - DAS.1S (В)

30 JS JS и Í.O SS »0 es го л OAS28

Болите с высоким содержанием «Fis (более ЭнгЫв) гасит 1 или 4 стадию заболевании но сравнению с остальными больными. Взаямосв&за между уровнем sFas н наличием ревыютидного фактора обнаружите не было (табл. 3),

Таквч образом, можно полагать, что »Fas являете* маркером клинической активноегг при РА, может иметь прогностическое злачеинс н использоваться для мониторинге течения заболевания и оценки эффективности проводимой терапии. Однако, sFas не может использоваться в качестве диагностического маркера, так как на ранне* стадиях заболевания повышения уровня sFa» не было обнаружено.

Таблица 3.

Распределение стадии заболевания и сероцозатшшосго по ревматоидному фактору у бальных РА

Показатели >3 кг/мл, 1,1-3 кг/ил,

N=9 N=69

Сгадви заболевания п, (%) 1 0 0

2 0 17(24,6%)

3 5(55,6%) 32(46,0%)

4 4(44,4%) 21(30,4%)

Сфопозигазяость по ревматоидному фактору п (%) 7(77,8%) 48 (69,6%)

У больпых СКВ повышенный уровень аРая был связан с высокой частотой образования язв ротовой полости, серозитов, поражения суставов, почек, гематологических и иммунологических нарушений Хотя корреляции уровня вИаз с индексом активности заболевания - ЗЬЕВА! обнаружено не было, у всех больных с высоким уровнем вРаз £1Л>А1 был выше 10 баллов, что соответствовало умеренной и высокой степени активности заболевания (табл. 4) Эти данные согласуются с результатами, полученными другими исследователями (СЬпйегшоп е! а1,2002, Нао л а1, 2006)

Таблица 4

Критерии АКР и распределение индекса активности ЙГ.Р.ПА! у больных СКВ с разным

Критерии АКР- >3нг/мл, N=10 1,1-3 нг/мл, N=89

Эритема в области скуловых дуг 60% 48%

Дискоцдные очаги 20% 19%

Фотосенсибшшзация 70% 72%

Язвенный стоматит 60% 30%

Полиартрит 80% 35%

Серозиг 60% 26%

Нефрит 90% 60%

Поражение центральной нервной системы 30% 25%

Гематологические нарушения 70% 51%

Иммунологические нарушения 90% 74%

Наличие антиядерных антител 70% , 67%

ЙШШ (<10 /11-20Л>20) 0/40%/60% 33%/31%/29%

Характерной чертой заболевания СКВ является усиленный алоптоз лимфоцитов периф^ической крови, нейтрофилов и моноцитов (Emlen et al, 1994, Courtney et al, 1999, Ren et aL, 2003) Так как иммуиосупрессивная терапия влияет ва количество лейкоцитов, анализ корреляции между состоянием лейкопении (менее 4000 лейкоцитов в мм3) и уровнем sFas проводили у 42 больных, которые на момент исследования не получали кортикостерондной и цвтостатической терапии. Корреляционный анализ показал, что у таких больных высокий уровень sFas связав с низким числом лейкоцитов (г=-0,3, р<0,05)

Таким образом, можно полагать, что растворимый Fas-рецептор не является маркером клинической активности при СКВ, по может служит индикатором повреждения органов и тканей при данном заболевании.

4. Исследование структурных особ«ипостей и питстокспческоа ыстииеостп iFbs в сыворотке крови.

Ранее было показано, что рекомбинаягный растворимый Fas-рецептор способен олкгомеризоваться и в такой форме запускать клеточную гибель по типу впоптоза в трансформированных линиях клеток путем активации трансмембрадаого Раз-лкганда (Popoff et aL, 1999, Pm&akova et aL, 2003) Мономерпм форма не обладала цитотокскчесхой активностью

Рис. 5. В сыворотке крови больных РА и СКВ при высокой концентрации растворимый Fas-рецептор существует в олшгомерной форме Сыворотки разделяли с помощью гель-фильтрации, поглощение атоента определяли при 280 нм (сплошная линия) Полученные фракции тестировали на присутствие «Fas, используя «сэндвич» модификацию нммуноферменгного анализа (пунктирная двняя)

150 6629

номер фракции

Факт одигомернзащш рехомбинангаого растворимого Fas-рецептора позволял предполагать возможность существования естественных олигомераых форм растворимого Fas-рецептора. Поэтому была проанализирована степень его олигомеризащш в

сыворотках пациентов, страдающих РА и СКВ. Для зтого сыворотки разделяли с помощью гель-фильтрации, полученные фракции тестировали на присутствий Fas-рецептора, исшмыуя «сэндвич» модификацию нммуноферментного анализа (рис. 5)

Оказалось, что а сыворотках пациентов с уровнем экспрессии растворимого рецептора, превышающим контрольные значения и 2-5 раз, основная часть Рай-антиген а находится в высокомолекулярных фракциях <150-200 кДя). В сыворотках здоровых людей растворимый Fas был представлен исключительно мономерной формой.

Причины олигомеризацин остаются неясными. Возможно, спонтанная самоассоциация растворимого Fas-рецептор« происходит за счет взаимодействия участков экстраклеточной части Fas-рецепторе, ответственных за самоассоциацию рецептора (PLAD), или «доменов смерти» при высоких концентрациях (Boldin et ai, 1945; PapoÍT el al, 1999: Siege! et al. .2000).

Поскольку рекомбинантиый Fas в tum го черной форме проявлял цитотоксичноеть, была проверена цитотокеичеехая активность отдельных сывороток больных, содержащих олигомеризованный sFas в высокой концентрации. Добавление 20% сыворотки пациентов, содержащих высокий уровень shas, к культуре клеток приводило к подавлению их пролиферации. Причем прелинкубашя сывороток с пснитотокснчсским препаратом растворимого FasL. способного связываться с Fas-рецептором, заметно снижала зтот эффект. В то же время инкубация клеток с сыворотками здоровых доноров приводила к усилению пролиферации, и препарат FasL не влиял на пролиферацию клеток (рис. 6). ? i« i

шмШ

1 1 3 4 5 6

6. Сыворотка болы1ых РА с высоким уровнем sFa$ пролиферацию кяепж.

Клетки HeLa инкубировали в течение 24 часои с добавлением 20% сыворотки больных РА с высоким уровнем sFas (i-3) в здоровых доноров (4-6) в отсутствии (£} или присутствии {fi препарата неиитотоксичного растворимого FasL-FLAG Пролиферацию клеток оценивали с помощью окрашивания красителем нейтральным красным. Жизнеспособность контрольных клеток принимали за 100%. Показаны типичные результаты одного из четырех экспериментов. ,

Таким образом, сыворотки больных, содержащих sFas а высокой концентрация, обладаю! цктотоксической atiниносгью, обусловленной, но крайней мере сггчасли, олигомерным sFas.

5. выявление типов клеток - потенциальных мишеней для iFas у больных РА н СКВ.

Наличие биологической активности сывороточного я Fas стимулировало поиск клеток - потенциальных, мишеней для sFas. Характерной чертой заболеваний РА и СКВ является повышение уровня апоптеш лимфоцитов периферической крови. а в нашем исследовании уровень sFas коррелировал с наличием лейконении у больных СКВ,

Д-]я проверки возможной роли sFas в гибели лимфоцитов больных было исследовано влияние сыворотки больных на первичную культуру лимфоцитов. При добавлении к первичной культуре лимфоцитов 20%-ои сыворотки моровых доноров, в качестве контроля, и больных РА наблюдался штготоксическин эффект, который был значительно выше во втором случае (рис. 7). Добавление сыворотки больных РА с высоким уровнем sFas к первичной культуре лимфоцитов вызывало гибель клеток, а прединкубання сывороток с

нешп токсическим препаратом растворимою Fas лнганда снижала этот эффект. Цнтотоксический эффект при прединкубзшш контрольных сывороток с препаратом растворимого FasL не изменялся

Рис. 7. Лимфоциты пациентов инкубировали с 20% сывороткой больных РА с высокнм содержанием растворимого Кая-рецептора (2 и 4} н сывороткой здоровых доноров (1 н 3) в отсутствии (Я) или присутствии препарата нецитотоксичного растворимого Ра8Ь-П,АО. Дтя оцс!«га лсизнсспособности клеток использовали МТТ-теет. Жизнеспособность клеток, обработанных сывороткой здоровых доноров, принимали за 100% Показаны типичные результаты одного из четырех экспериментов.

И

Известно, что при "обратной сигнализации" в качестве акцегггоряоА молекулы, опосредующей действие sFas, выступает траншем бранный FasL. Поэтому была исследована экспрессия транс-мембранного FasL в лимфоцитах периферической крове больных РА к СКВ с высоким урожном sPas, Иммупофдуоресцентный анализ лимфоцитов крови таких больных показал, что значительная часть клеток иесет на поверхности траасмембранный FasL и подвергается впоптозу (рис. 8 а, б).

Таким образом, гибель лимфоцитов при активной форме исследованных аутоиммунных заболеваний, ио крайней мере отчасти обусловлена олигоыермым »Fas.

/ i ишш

* £ 1 ■ V А □ в

Рже. 8. Лимфоциты больных с высоким уровнем sFas в сыворотке крови э же пресс ируил грансысмСраянЫЙ FaaL и подвергаются алоотозу: а) иммунофлуоресцентное окрашивяине лимфоцитов периферической крот с антителами к FasL. Стрелками обозначены Fad^ позитивные клето. б) Флуоресцентный анализ аноитолгчесжих клеток с помощью окрашивания Depi Стрелками показаны клетки, экспресс ируюгцис трансмембралный FasL, с xipucrepeUMM да* погибювших киеиж ксаденсироьаяшлва snptwH (увеличение 400 х).

Е > • , 1 / - í'-i 4 »

. * It* 1 • 4

ч* * J : ^

• -Ч * - ' к" ■■

ЬГ& ' ' - ■ '

к / .

. 1,1 С Рже. 9. Иимуногнстохямнчеспгй лн :i'¡ri )

" ( трансисмбраннопо FasL в синовиальной

А • \ - ( f - тиим больного РА с wjçOdm уровней

■j > *j &Pbs, Стрелками обашкчегш клетки,

КФ Í . ■ • sitcnpcccBpyioinWe тр«ксмсмбр*нный

■*. L « FasL (увеличение 4Й0 ж).

, 'V* ,

IS

Известно, что уровень апоптоза синовиальных фибробластов на последних стадиях заболевания РА повышается (Catrina et al, 2002; Так ct al., 2000) При исследовании синовия больных РА с помощью иммушгастохимическогс' окрашивания был обнаружен высокий уровень экспрессии траясме! [бранного Fas-лиганда в скновнодитах бо-шных РА со значительным увеличением sFas в сыворотке кропи (рис 9) В норме FasL экспрессируется только активированными лимфоцитами и клетками иммунопривилепфоваяных тканей (Vignaux, 1995, Suda 1995).

Таким образом, лимфоциты nq жферичесюой крови и синовиальные клетки могут рассматриваться в качестве основных мишеней двтоток отческого действия sFas при активных формах СКВ я РА

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе была щхнереиа возможность Fas-лиганд - опосредованной «обратной сигнализации» в патогенезе аутоиммунных заболеваний, РА и СКВ.

Полученные данные, а именно повышенное содержание sFas в сыворотках крови больных РА и СКВ, анти-пролвфсративная активность сывороток, обусловленная одигомерным sF.m, и высокие уровни экспрессии траисмембранного Fas-лнганда в снковяоцнтах в дамфоцктах периферической кроен позволят предполагать возможность Fas-лиганд - опосредованной «обратной сигнализации» в шггогенеээ таких аутоиммунных заболеваний. Крахе того, известные дшные о повышенном содержании sFas в сыворотке больных другими аутоиммунными заболеваниями, в частности аятн-фосфокЕПИДВЫм синдромом и множественным см грогом (Dowling et al., 1996; Pittoiu et al., 2СОЗ), дают основание полап.ть, что активация sFas - зависимой «ofратной сигнал кзащгп» мажет выступать в качестве общего механизма развития аутоаммузных патологий

Результаты работы указывают на необходимость более внимательного изучения молекулярных механизмов действия существующих терапевтических подходов, направленных ш модификацию фуЕхциокированиж системы Fas/FasL. Так, эффекты метаялопрогеазы, расщепляющей мембраио-связанный FfsL, и ее ингибиторов мокло рассматривать с точки зрения «обратной сигнализации» кик процессы, обеспсшвсющне или препятствующие проведению снпада через 1ран(31смб:;гннцй FasL. Терапентичесхве эффекты Раз-яиганда или homamzcc антител к Fas-гтигену, описанные с случаях артритов, также могут быть обьяснени не только за счет аггавацки Fes-опосредованного мкялтяа, но и «нтибирования Fas-лнгапд - опосредованной «обратной сягвгишзации» (Matsuno et al, 2032; Ning et aL, 2004)

Обнаруженные в настоящей -работе авти-пролиферативные свойства сывороточного шшгомерязовапного растворимого Fas-антигена открывают новые направления в поиске терапевтических средств, Енгабирующих циютскспчсскую активность íFas

ВЫВОДЫ

1. Разработана тест-система ва основе мошяыкжальаих. «вписл для определенна уровня растворимого Рач-рецептора в сыворотке крози.

2. Концентрация растворимого Fas-рецгпторз в сыворотках здоровых доноров составляет 1,5±0,3 пг/мл Примерно у 10% исследованных пациентов с подтвержденным диагнозом РА и СКВ наблюдается повышенное содержание »Fas в сыворотке кровл (до 10 пг/мл) Источником растворимого Fas-рецептора в кротш тагах больных являются периферические лимфоциты крови

3 Высокий уровень растворного Раз-рецептора в сыворотках больных РА н СКВ коррелирует с активностью аутоиммунного процесса. Анализ растворимого Fas-рецептора моют иметь прогноствческог значение и использоваться для мониторинга течения РА, а таксе может служить кнргером повреждения органов я тканей при СКВ.

4. Растворимый Fas-рецептор в сыворотке крови больных РА и СКВ существует преимущественно в олигомериой форме и способен вызывать гибель трансформированных клеток HeLa и пгрвичпой культуры лимфоцитов.

5 Высокий уровень экспрессии Fas-янганда в синовиоцитях и лимфоцитах периферической крови, а также высокий уровень sFas в сыворотке позволяют предполагать возможность Faa-лигенд - опосредованной «обратной сигнализации» в патогенезе аутоиммунных заболеваний

1. Proussakova O.V., Rabaya NA., Moshnikova AS., Telegma E.S,. Tnranov A, Nanazashvili M.G, Beletslcy LP Ohgomsrizatioa of soluble Fas anbgen induces its cytotoxicity J Biol Chsm 2003, v 278. № 38, p 36236-36341.

2 Прусигова О .В, Р&бая НА, Мопшикова А.Б, Телегина B.C.. Белецкий И. П Цитотоксвтожм активность растворимого Fas-рецептора. Молекулярная мадшдава. 2005, № 2, стр. 33-41.

3 Тсеепшя В.С. Решета« Т.М, Молшикова АБ, Прусатова О В, Кузвецоза А.В, Ивашов АЛ., Белецкий II. П., Пальцев МА. Возмогшая роль Fas-лзгищ-оносредоваяной «обратной сигнализации» в патогенезе системной красной волчанки Молекулярная медицина. 2008, №1 (в печати)

4 Телегита ЕС.. Жукова АЛ, Белецкий И.П Разработка тест-системы для диагностика растворимого Fas-рецептора в сыворотке крова. Биология - наука XXI века, Пущина, ОНТИ ПНЦ РАН, 2003, стр. 380-381.

5 Trizna JA.. Telepaa Е S.. Popovich КЛ. Rabava ИЛ.. Proassafcova О V. FAS-liyrand-medisted "revene sigcaUing" ш autoimmunity, the possible impact The FEBS JonroaL 2006, v. 273, J61.P 117.

Отпечатано: ИЛА. А. Кулаков, г Серпухов, Борисовское шоссе, 18, тел.: 8-915-200-86-98, 39-11-20 Подписано в печать:20.04.2007г. Тираж 100экз.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Телегина, Екатерина Сергеевна

СОДЕРЖАНИЕ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Система Fas/FasL.

Структурно-функциональные особенности Fas-рецептора.

Структурно-функциональные особенности Fas лиганда.

Механизмы передачи апоптотического сигнала через Fas рецептор.

Механизм формирования сигнального комплекса.

Механизм передачи сигнала, опосредованный комплексом Fas/FADD.15 Молекулярные механизмы передачи сигнала, опосредованные взаимодействием Fas-рецептора с другими белками.

Механизмы устойчивости к Fas-опосредованному апоптозу.

Обратная сигнализация», запускаемая рецепторами семейства ФНО.

Дефекты апоптоза при системной красной волчанке и ревматодном артрите.

Система Fas/FasL при СКВ и РА.

ХАРАКТЕРИСТИКА ОБСЛЕДОВАННЫХ БОЛЬНЫХ, МАТЕРИАЛЫ И

МЕТОДЫ.

Общая характеристика больных РА.

Общая характеристика больных СКВ.

Получение экспериментального материала и методы исследования.

Оборудование и реактивы.

Методы.

Разработка тест-системы на основе МКА для исследования концентрации sFas в сыворотке крови.

Исследование экспрессии генов Fas и sFas в лимфоцитах крови.

МТТ тест.

Анализ цитотоксичности по прокрашиванию клеток нейтральным красным.

Анализ растворимого Fas рецептора в сыворотке крови.

Исследование экспрессии FasL на поверхности клеток синовия и лимфоцитов крови.

Статистическая обработка.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Разработка тест системы типа «сэндвич» на основе моноклональных антител для определения концентрации растворимого Fas-рецептора в сыворотке крови.

Исследование концентрации sFas-рецептора в сыворотке крови больных РА, СКВ и здоровых доноров.

Взаимосвязь уровня sFas в сыворотке крови больных РА и СКВ с клиническими характеристиками больных.

Исследование структурных особенностей и цитотоксической активности растворимого

Fas-рецептора в сыворотке крови.

Выявление типов клеток - потенциальных мишеней для sFas у больных РА и СКВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование роли растворимого Fas-рецептора в патогенезе аутоиммунных заболеваний, ревматоидного артрита и системной красной волчанки"

Апоптоз или программируемая клеточная гибель - нормальный физиологический процесс гибели клетки, который протекает при следующих морфологических изменениях: уменьшение размеров клетки, конденсация хроматина, нуклеосомная фрагментация ДНК и формирование апоптотических телец. Такой регулируемый процесс клеточной гибели играет важную роль в процессе эмбриогенеза, поддержании гомеостаза и перестройке тканей, обеспечивает удаление ненужных и потенциально опасных клеток, таких как аутореактивные лимфоциты, опухолевые клетки, клетки с нерепарируемыми повреждениями ДНК или клетки, инфицированные вирусами. Нарушения процессов апоптоза играют ключевую роль в развитии нейродегенеративных, вирусных, онкологических и аутоиммунных заболеваниий.

В регуляции пролиферации, дифференцировки, клеточной гибели важную роль играют семейства рецепторов Фактора некроза опухоли (ФНО) и соответствующих лигандов. Часть этих функций реализуется в результате активации трансмембранных рецепторов лигандами (растворимыми или трансмембранными) и последующей передачи сигнала в клетку, которая несет рецептор. Другие функции реализуются посредством так называемой «обратной сигнализации», при которой рецептор (растворимый или трансмембранный) выполняет роль лиганда, а трансмембранный лиганд выступает в качестве рецептора. Практически для всех членов семейств ФНО-рецепторов и ФНО-лигандов показаны биологические эффекты «обратной сигнализации» на различных типах клеток ^вэпег е1 а1., 2004; Глухова и др., 2006).

БаБ-рецептор и Раэ-лиганд являются членами семейств рецепторов ФНО и лигандов ФНО, соответственно, и играют ключевую роль в поддержании гомеостаза иммунной системы. Активация трансмембранного Раэ-рецептора Раэ-лигандом лежит в основе селекции Т- и В-лимфоцитов,уничтожения клеток-мишеней цитотоксическими лимфоцитами. Активация трансмембранного Fas-рецептора растворимым или трансмембранным Fas-лигандом в большинстве случаев приводит к гибели клеток по типу апоптоза. Для системы Fas/FasL была также продемонстрирована возможность проведения обратного сигнала через трансмембранный FasL (Desbarats et al., 1998; Suzuki, Fink, 2000; Prusakova et al., 2003).

Большое количество патогенных состояний, в частности аутоиммунных, связано с нарушением функционирования системы Fas/FasL. При некоторых аутоиммунных заболеваниях, в том числе при системной красной волчанке (СКВ) и ревматоидном артрите (РА), уровень растворимого Fas-рецептора (sFas) в сыворотке крови больных повышен по сравнению со здоровыми донорами (Cheng et al., 1994; Christensson et al., 2002; Ates et al., 2004; Sahin et al., 2007). Было сделано предположение о том, что растворимый Fas конкурирует с мембранно-связанным Fas-рецептором за связывание с лигандом и является ингибитором Fas-опосредованного апоптоза (Cheng et al., 1994; Tokano et al., 1996; Hasunuma et al., 1997).

Однако в работах других авторов показано, что увеличение уровня растворимого Fas-рецептора в сыворотке крови больных СКВ и РА коррелирует с количеством апоптотических лимфоцитов (Courtney et al., 1999; Smolewska et al., 2003; Silvestris et al., 2003). Было обнаружено, что инкубация с sFas значительно подавляет пролиферацию Т-клеток. Основываясь на этих наблюдениях, можно полагать, что sFas вызывает проапоптотический эффект. Проапоптотические эффекты sFas, как было показано ранее, реализуются посредством «обратной сигнализации» через Fas-лиганд. В настоящей работе была предпринята попытка изучить возможную роль sFas, как индуктора Fas-лиганд - опосредованной «обратной сигнализации» в патогенезе таких аутоиммунных заболеваний, как системная красная волчанка и ревматоидный артрит.

Цель работы заключалась в исследовании роли растворимого Баз-рецептора в патогенезе ревматоидного артрита и системной красной волчанки.

Задачи исследования:1. Разработать тест-систему типа «сэндвич» на основе моноклональных антител (МКА) для определения уровня вРаэ в сыворотке крови.

2. Проанализировать концентрацию и форму (олигомерная или мономерная) эРаБ в сыворотке крови больных в сравнении со здоровыми донорами и выявить источник его экспрессии.

3. Исследовать возможную корреляцию уровня Браэ в сыворотке крови с клиническими параметрами больных РА и СКВ для выяснения возможности использования анализа эРаБ в целях диагностики и прогноза заболеваний.

4. Исследовать биологическую активность сывороток больных, содержащих высокий уровень врав, на культуре клеток.

5. Выявить типы клеток - потенциальных мишеней для вРаэ у больных РА и СКВ.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Телегина, Екатерина Сергеевна

выводы

1. Разработана тест-система на основе моноклональных антител для определения уровня растворимого БаБ-рецептора в сыворотке крови.

2. Концентрация растворимого РаБ-рецептора в сыворотках здоровых доноров составляет 1,5±0,3 нг/мл. Примерно у 10 % исследованных пациентов с подтвержденным диагнозом РА и СКВ наблюдается повышенное содержание Браэ в сыворотке крови (до 10 нг/мл). Источником растворимого РаБ-рецептора в крови таких больных являются периферические лимфоциты крови.

3. Высокий уровень растворимого РаБ-рецептора в сыворотках больных РА и СКВ коррелирует с активностью аутоиммунного процесса. Анализ растворимого Раз-рецептора может иметь прогностическое значение и использоваться для мониторинга течения РА, а также может служить маркером повреждения органов и тканей при СКВ.

4. Растворимый РаБ-рецептор в сыворотке крови больных РА и СКВ существует преимущественно в олигомерной форме и способен вызывать гибель трансформированных клеток НеЬа и первичной культуры лимфоцитов.

5. Высокий уровень экспрессии РаБ-лиганда в синовиоцитах и лимфоцитах периферической крови, а также высокий уровень БРаБ в сыворотке позволяют предполагать возможность РаБ-лиганд -опосредованной «обратной сигнализации» в патогенезе аутоиммунных заболеваний.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Телегина, Екатерина Сергеевна, Москва

1. Адаме Р. Методы культуры клеток для биохимиков. Москва, Мир, 1983, стр. 68.

2. Глухова К.А., Тризна Ю.А. Щукин В.Н., Гороховатский А.Ю., Прусакова О.В., Белецкий И.П. Молекулярные механизмы "обратной сигнализации", опосредованной TNF-лигандами. Вестник НИИ Молекулярной медицины, 2006, вып. 6, стр. 57-63.

3. Райкундалия Ч., Браун Д., Линг Н.Р., Гордон Д., Арвие Ж., Уильяме А.Ф. Под ред. Кэтти Д. Антитела. Методы. 2 т., Москва, Мир, 1991, стр. 116-123.

4. Aggarwal В.В., Singh S., LaPushin R., Totpal K. Fas antigen signals proliferation of normal human diploid fibroblast and its mechanism is different from tumor necrosis factor receptor. FEBS Lett., 1995, v. 364, № l,p. 5-8.

5. Alam A., Cohen L.Y., Aouad S., Sekaly R.P. Early activation of caspases during T lymphocyte stimulation results in selective substrate cleavage in nonapoptotic cells. J. Exp. Med., 1999, v. 190, p. 1870-1890.

6. Alderson M.R., Armitage R.J., Maraskovsky E., Tough T.W., Roux E., Schooley K., Ramsdell F., Lynch D.H. Fas transduces activation signals in normal human T lymphocytes. J. Exp. Med., 1993, v. 178, p. 2231-2235.

7. Alecu M., Coman G., Alecu S. Serological levels of apoptotic bodies, sFAS and TNF in lupus erythematosus. Rom. J. Intern. Med., 2000-2001, № 38-39, p. 83-88.

8. Allen J.B., Manthey C.L., Hand A.R., Ohura K., Ellingsworth L., Wahl S.M. Rapid onset synovial inflammation and hyperplasia induced by transforming growth factor beta. J. Exp. Med., 1990, v. 171, № 1, p. 231247.

9. Ausubel F.M., Brent R., Kingston R.E., Moore D.D., Seidman J.G., Smith J.A., Struhl K. Short protocols in molecular biology. Second Edision. New York, John Wiley & Sons, 1992.

10. Barnhart B.C., Alappat E.C., Peter M.E. The CD95 type I/type II model. Semin Immunol., 2003, v. 15, № 3, p. 185-193.

11. Barnhart B.C., Legembre P., Pietras E., Bubici C., Franzoso G., Peter M.E. CD95 ligand induces motility and invasiveness of apoptosis-resistant tumor cells. EMBO J., 2004, v. 23, № 15, p. 3175-3185.

12. Behrmann I., Walczak H., Krammer P.H. Structure of the human APO-1 gene. Eur. J. Immunol., 1994, v. 24, № 12, p. 3057-62.

13. Blott E.J., Bossi G., Clark R., Zvelebil M., Griffiths G.M. Fas ligand is targeted to secretory lysosomes via a proline-rich domain in its cytoplasmic tail. J. Cell. Sci., 2001, v. 114, № 13, p. 2405-2416.

14. Bombardier C., Gladman D.D., Urowitz M.B., Caron D., Chang C.H. Derivation of the SLEDAI. A disease activity index for lupus patients. The Committee on Prognosis Studies in SLE. Arthritis Rheum., 1992, v. 35, № 6, p. 630-640.

15. Borenfreund E., Puerner J. Toxicity determined in vitro by morphological alterations and neutral red absorption. Toxicol Lett., 1985, № 24, p. 119-124.

16. Butler D.M., Leizer T., Hamilton J.A. Stimulation of human synovial fibroblast DNA synthesis by platelet-derived growth factor and fibroblast growth factor. Differences to the activation by IL-1. J. Immunol., 1989, № 142, p. 3098-3103.

17. Cantwell M.J., Hua T., Zvaifler N.J., Kipps T.J. Deficient Fas ligand expression by synovial lymphocytes from patients with rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum., 1997, v. 40, № 9, p. 1644-1652.

18. Cascino I., Fiucci G., Papoff G., Ruberti G. Tree functional soluble forms of the human apoptosis-inducing Fas molecule are produced by alternative splicing. J. Immunol., 1995, v. 154, № 6, p. 2706-2713.

19. Cascino I., Papoff G., Eramo A., Ruberti G. Soluble Fas/Apo-1 splicing variants and apoptosis. Front Biosci., 1996, № 1, p. 12-18.

20. Casciola-Rosen L.A., Anhalt G., Rosen A. Autoantigens targeted in systemic lupus erythematosus are clustered in two populations of surface structures on apoptotic keratinocytes. J. Exp. Med., 1994, № 179, p. 13171330.

21. Catrina A.I., Ulfgren A.K., Lindblad S., Grondal L., Klareskog L. Low level of apoptosis and high FLIP expression in early rheumatoid arthritis synovium. Ann. Reum. Dis., 2002 № 61, p. 934-936.

22. Cecconi F. Apafl and the apoptotic machinery. Cell Death Differ., 1999, v. 6,№ 11, p. 1087-1098.

23. Chan F.K.M., Chun H.J., Zheng L., Siegel R., Bui K., Lenardo M.J. A domain in tumor necrosis factor receptors that mediates ligand-independent receptor assembly and signaling. Science., 2000, № 288, p. 2531-2534.

24. Chan F.KM. The pre-ligand binding assembley doman: a potential target of inhibition of tumour necrosis factor receptor function, Ann. Rheum. Dis., 2000, № 59, p. 50-53.

25. Chang H.Y., Nishitoh H., Yang X., Ichijo H., Baltimore D. Activation of apoptosis signal-regulating kinase 1 (ASK1) by the adapter protein Daxx. Science., 1998, v. 281, № 5384, p. 1860-1863.

26. Chang H.Y., Yang X., Baltimore D. Dissecting Fas signaling with an altered-specificity death-domain mutant: requirement of FADD binding for apoptosis but not Jun N-terminal kinase activation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, v. 96, № 4, p. 1252-1256.

27. Charette S.J., Landry J. The interaction of HSP27 with Daxx identifies a potential regulatory role of HSP27 in Fas-induced apoptosis. Ann. Acad. Sci., 2000, № 926, p. 126-131.

28. Chen J.Y, Wang C.M., Ma C.C., Y.H. Chow, Luo S.F. The -844C/T polymorphism in the Fas ligand promoter associates with Taiwanese SLE. Genes and Immunity, 2005, № 6, p. 123-128.

29. Chen N.J., Huang M.W., Hsieh S.L. Enhanced secretion of IFN-gamma by activated Thl cells occurs via reverse signaling through TNF-related activation-induced cytokine. J. Immunol., 2001, v. 166, № 1, p. 270276.

30. Cheng J., Zhou T., Liu C., Shapiro J.P., Brauer M.J., Kiefer M.C., Barr P.J., Mountz J.D. Protection from Fas-mediated apoptosis by a soluble form of the Fas molecule. Science, 1994, № 263, p. 1759-1762.

31. Chinnaiyan A.M., O'Rourke K., Tewari M., Dixit V.M. FADD, a novel death domain-containing protein, interacts with the death domain of Fas and initiates apoptosis. Cell, 1995, v. 81, №4, p. 505-512.

32. Chou A.H., Tsai H.F., Lin L.L., Hsieh S.L., Hsu P.I., Hsu P.N. Enhanced proliferation and increased IFN-gamma production in T cells by signal transduced through TNF-related apoptosis-inducing ligand. J. Immunol., 2001, v. 167, № 3, p. 1347-1352.

33. Chou C.T., Yang J.S., Lee M.R. Apoptosis in rheumatoid arthritisexpression of Fas, Fas-L, p53, and Bcl-2 in rheumatoid synovial tissues. J. Pathol., 2001, v. 193, № 1, p. 110-116.

34. Chu K., Niu X., Williams L.T. A Fas-associated protein factor, FAF1, potentiates Fas-mediated apoptosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1995, v. 92, №25, p. 11894-11898.

35. Cohen P.L. and Eisenberg R.A. lpr and gld: single gene models of systemic autoimmunity and lymphoproliferative disease. Annu. Rev. Immunol., 1991, № 9, p. 243-269.

36. Cohen P.L. Apoptotic cell death and lupus. Springer Semin Immunopathol., 2006, v. 28, № 2, p. 145-152.

37. Cohen P.L., Eisenberg R.A. Lpr and gld: single gene models of systemic autoimmunity and lymphoproliferative disease. Annu. Rev. Immunol., 1991, № 9, p. 243-269.

38. Courtney P.A., Crockard A.D., Williamson K., McConnell J., Kennedy R.J., Bell A.L. Lymphocyte apoptosis in systemic lupus erythematosus: relationships with Fas expression, serum soluble Fas and disease activity. Lupus, 1999, v. 8, № 7, p. 508-513.

39. Cremesti A., Paris F., Grassme H., Holler N., Tschopp J., Fuks Z., Gulbins E., Kolesnick R. Ceramide enables fas to cap and kill. J. Biol. Chem., 2001, v. 276, № 26, p. 23954-23961.

40. Desbarats J., Duke R.C., Newell K.M. Newly discovered role for Fas ligand in the cell-cycle arrest of CD4+ T cells. Nat. Med., 1998, v. 4, № 12, p. 1377-1382.

41. Eissner G., Kolch W., Scheurich P. Ligands working as receptors: reverse signaling by members of the TNF superfamily enhance the plasticity of the immune system. Cytokine Growth Factor Rev., 2004, v. 15, № 5, p. 353-366.

42. Emlen W., Niebur J., Kadera R. Accelerated in vitro apoptosis of lymphocytes from patients with systemic lupus erythematosus. J. Immunol., 1994, v. 152, №7, p. 3685-3692.

43. Fujisawa K., Asahara H., Okamoto K., Aono H., Hasunuma T., Kobata T., Iwakura Y., Yonehara S., Sumida T., Nishioka K. Therapeuticeffect of the anti-Fas antibody on arthritis in HTLV-I tax transgenic mice. J Clin. Invest, 1996, № 98, p. 271-278.

44. Gatenby P.A., Irvine M. The bcl-2 proto-oncogene is overexpressed in systemic lupus erythematosus. J. Autoimmun, 1994, v. 7, № 5, p. 623-631.

45. Ghadimi M, Sanzenbacher R, Thiede B, Wenzel J, Jing Q, Plomann M, Borkhardt A, Kabelitz D, Janssen O. Identification of interaction partners of the cytosolic polyproline region of CD95 ligand (CD 178). FEBS Lett, 2002, № 519, p. 50-58.

46. Grammer A.C., McFarland R.D, Heaney J, Darnell B.F, Lipsky P.E. Expression, regulation, and function of B cell-expressed CD 154 in germinal centers. J. Immunol, 1999, v. 163, № 8, p. 4150-4519.

47. Griffith T.S, Ferguson T.A. The role of FasL-induced apoptosis in immune privelege. Immunol. Today, 1997, № 18, p. 240-244.

48. Griffith TS, Brunner T, Fletcher SM, Green DR, Ferguson TA. Fas ligand-induced apoptosis as a mechanism of immune privilege. Science, 1995, v. 270, №5239, p. 1189-1192.

49. Gross A, McDonnell J, Korsmeyer S. Bcl-2 family members and the mitochondria in apoptosis. Genes Dev., 1999, № 13, p. 1899-1911.

50. Gurtin J.F, Cotter T.G. Live and let die: regulatory mechanisms in Fas-mediated apoptosis. Cellular Signalling, 2003, № 15, p. 983-992.

51. Hahne M, Löwin B, Peitsch M, Becker K. and Tschopp. Characterization of the non-functional Fas ligand of gld mice. J. FEBS Iett, 1995, №373, p. 265-268.

52. Hane M, Löwin B, Peitsch M, Becker K, Tschopp J. Interaction of peptides derived from the Fas ligand with the Fyn-SH3 domain. FEBS Lett, 1995, v. 373, №3, p. 265-268.

53. Harris E.N., Hughes G.R., Gharavi A.E. Anti-cardiolipin antibodies and the lupus anticoagulant. Clin. Exp. Rheumatol., 1986, v. 4, № 2, p. 187190.

54. Hashimoto H., Tanaka M., Suda T., Tomita T., Hayashida K., Takeuchi E., Kaneko M., Takano H., Nagata S., Ochi T. Soluble Fas ligand in the joints of patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis. Arthritis Rheum., 1998, № 41, p. 657-662.

55. Hasunuma T., Hoa T.T.M., Aono H., Asara H., Yonehara S., Yamamoto K., Sumida T., Gay S., Nishioka K. Induction of Fas-dependent apoptosis in synovial infilterating cells in rheumatoid arthritis. Int Immunol., 1996, №8, p. 1595-1602.

56. Hasunuma T., Kayagaki N., Asahara H., Motokawa S., Kobata T., Yagita H., Aono H., Sumida T., Okumura K., Nishioka K. Accumulation of soluble Fas in inflamed joints of patients with rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 1997, №40, p. 80-86.

57. Hoang T.R., Hammermuller A., Mix E., Kreutzer H.J., Goerlich R., Kohler H., Nizze H., Thiesen H.J., Ibrahim S.M. A proinflammatory role for Fas in joints of mice with collagen-induced arthritis. Arthritis Res. Ther., 2004, v. 6, №5, p. 404-414.

58. Hochberg M.C., Chang R.W., Dwosh I., Lindsey S., Pincus T., Wolfe F. The American College of Rheumatology 1991 revised criteria for the classification of global functional status in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum., 1992, v. 35, № 5, p. 498-502.

59. Hohlbaum A.M., Moe S., Marshak-Rothstein A. Opposing effects of transmembrane and soluble Fas ligand expression on inflammation and tumor cell survival. J. Exp. Med., 2000, № 191, p. 1209-1219.

60. Houston A., O'Connell J. The Fas signalling pathway and its role in the pathogenesis of cancer. Curr Opin Pharmacol., 2004, v. 4, № 4, p. 321-6.

61. Hu Y., Benedict M.A., Ding L., Nunez G. Role of cytochrome c and dATP/ATP hydrolysis in Apaf-1-mediated caspase-9 activation and apoptosis. EMBO J., 1999, v. 18, №13, p. 3586-3595.

62. Hueber A.O. CD95: more than just a death factor? Nat. Cell Biol., 2000, № 2, p. 23-25.

63. Hueber A.O., Bernard A.M., Herincs Z., Couzinet A., He H.T. An essential role for membrane rafts in the initiation of Fas/CD95-triggered cell death in mouse thymocytes. EMBO Rep., 2002, № 3, p. 190-196.

64. Inazawa J., Itoh N., Abe T., Nagata S. Assignment of the human Fas antigen gene (Fas) to 10q24.1.Genomics. 1992, v. 14, № 3, Genomics, 1992, v. 14, №3, p. 821-822.

65. Itoh N., Nagata S. A novel protein domain required for apoptosis. Mutational analysis of human Fas antigen. J. Biol. Chem., 1993, № 268, p. 10932.

66. Itoh N., Yonehara S, Ishii A, Yonehara M, Mizushima S, Sameshima M, Hase A, Seto Y, Nagata S. The polypeptide Encoded by the cDNA for Human cell surface antigen Fas can mediate apoptosis. Cell, 1991, № 66, p. 233-243.

67. Ivanov V.N., Krasilnikov M., Ronai Z.J. Regulation of Fas expression by STAT3 and c-Jun is mediated by phosphatidylinositol 3-kinase-AKT signaling. Biol. Chem., 2002, № 277, p. 4932-4944.

68. Jang M.S., Ryu S.W., Kim E. Modification of Daxx by small ubiquitin-related modifier-1. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2002, v. 295, № 2, p. 495-500.

69. Juo P., Kuo C.J., Yuan J., Blenis J. Essential requirement for caspase-8/FLICE in the initiation of the Fas-induced apoptotic cascade. Curr. Biol., 1998, v. 8, № 18, p. 1001-1008.

70. Kamitani T., Nguyen H. P. and Yeh E. T. H. Preferential interaction of sentrin with a ubiquitin-conjugating enzyme, Ubc9. J. Biol. Chem., 1997, № 272, p. 14001-14004.

71. Kamitani T., Phi Nguyen H., Kito K., Fukuda-Kamitani T. and Yeh ET. Covalent Modification of PML by the Sentrin Family of Ubiquitin-like Proteins. J. Biol. Chem., 1998, v. 273, № 6, p. 3117-3120.

72. Karouzakis E., Neidhart M., Gay R.E., Gay S. Molecular and cellular basis of rheumatoid joint destraction. Immunology Letters., 2006, № 106, p. 8-13.

73. Kavurma M.M., Khachigian L.M. Signaling and transcriptional control of Fas ligand dene expression. Cell Death and Differentiation, 2003, № 10, p. 36-44.

74. Kawakami A., Eguchi K., Matsuoka N., Tsuboi M., Kawabe Y., Aoyagi T., Nagataki S. Inhibition of Fas antigen-mediated apoptosis of rheumatoid synovial cells in vitro by transforming growth factor pi. Arthritis Rheum., 1996, № 39, p. 1267-1276.

75. Kayagaki N., Kawasaki T., Ebata T., Ohmoto H., Ikeda S., Inoue S., Yoshino K., Okumara K., Yagita H. Metalloproteinase-mediated release of human Fas ligand. J. Exp. Med., 1995 v. 182, № 6, p. 1777-1783.

76. Kennedy N.J. Kataoka T., Tschopp J., Budd R.C. Caspase activation is required for T cell proliferasion. J. Exp. Med., 1999, № 190, p. 18911896.

77. Kinoshita, T., Imamura, J., Nagai, H., and Shimotohno, K. Quantification of gene expression over a wide range by the polymerase chain reaction Anal. Biochem., 1992; v. 206, № 2, p. 231-235.

78. Kischkel F.C., Hellbardt S., Behrmann I., Germer M., Pawlita M., Krammer P.H., Peter M.E. Cytotoxicity-dependent APO-l(Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor. EMBO J., 1995, № 14, p. 5579-5588.

79. Korb L.C., Ahearm J.M. C1 q binds directly and specifically to surface blebs of apoptotic human keratinocytes: complement deficiency and systemic lupus erythematosus revisited. J. Immunol., 1997, № 158, p. 45254528.

80. Krause A.,Scaletta N., Ji J.D., Ivashkiv L.B. Rheumatoid arthritis synoviocyte survival is dependent on stat3. J.Immunol., 2002, №169, p. 6610-6616.

81. Lee Y., Shacter E. Fas aggregation does not correlate with Fasmediated apoptosis. J. Immunol., 2001, v. 167, № 1, p. 82-89.

82. Lee Y.H., Kim Y.R., Ji J.D., Sohn J., Song G.G. Fas promoter -670 polymorphism is associated with development of anti-RNP antibodies insystemic lupus erythematosus. J. Rheumatol., 2001, v. 28, № 9, p. 20082011.

83. Lens S.M., Drillenburg P., den Drijver B.F., van Schijndel G. Pals S.T., van Lier RA, Pals ST, van Lier RA, van Oers MH. Aberrant expression and reverse signaling of CD70 on malignant B cells. Br. J. Haematol., 1999, v. 106, №2, p. 491-503.

84. Lisanti M.P., Scherer P.E., Tang Z., Sargiacomo M. Caveolae, caveolin and caveolin-rich membrane domains: a signaling hypothesis. Trends Cell Biol., 1994, v. 4, № 7, p. 231-235.

85. Liston P., Roy N., Tamai K. et al. Suppression of apoptosis in mammalian cells by NAIP and a related family of IAP genes. Nature, 1996, № 379, p. 349-353.

86. Liu C., Cheng J., Mountz J.D. Differential expression of human Fas mRNA species upon peripheral blood mononuclear cell activation. Biochem. J., 1995, №310, p. 957-963.

87. Liu H., Pope R.M. The role of apoptosis in rheumatoid arthritis. Current Opinion in Pharmacology, 2003, № 3, p. 317-322.

88. Liu N.L., Nie H., Yu Q.W., Zhang J.Y., Ma A.L., Shen B.H., Wang L., Bai J., Chen X.H., Zhou T., Zhang DQ. Role of soluble Fas ligand in autoimmune disease. World Journal of Gastroenterology, 2004, v. 10, № 21, p. 3151-3156.

89. Liu X., Zou H., Slaughter C., Wang X. DFF, a heterodimeric protein that functions downstream of caspase-3 to trigger DNA fragmentation during apoptosis. Cell, 1997, v. 89, № 2, p. 175-184.

90. Mahajan R., Delphin C., Guan T., Gerace L. and Melchior F. A small ubiquitin-related polypeptide involved in targeting RanGAPl to nuclear pore complex protein RanBP2. Cell. 1997, v. 88, № 1, p. 97-107.

91. Mahmoud R.K., Ansary A.K., Eishi H.H., Kamal H.M., Saeed N.H. Matrix metalloproteinases MMP-3 and MMP-1 levels in sera and synovial fluids in patients with rheumatoid arthritisand osteoarthritis. Ital. J. Biochem., 2005, v. 54 № 3-4, p. 248-257.

92. Manayama R., Tanaka H., Miyasaka K., Aozasa K., Koike M., Uchiyama Y., Nagata S. Autoimmune disease and impaired uptake of apoptotic cells in MFG-E8- deficient mice. Science, № 304, p. 1147-1150.

93. Mariani S.M., Matiba B., Baumler C., Krammer P.H., Regulation of cell surface APO-l/Fas (CD95) ligand expression by metalloproteases. Eur. J. Immunol., 1995 v. 25, № 8, p. 2303-2307.

94. Matsuno H., Yudoh K., Watanabe Y. Nakazawa F., Aono H., Kimura T. Stromelysin-1 (MMP-3) in synovial fluid of patients with rheumatoid arthritis has potential to cleave membrane bound Fas ligand. J. Rheumatol., 2001, v. 28, № l,p. 22-28.

95. Matunis M.J., Coutavas E., Blobel GJ. A novel ubiquitin-like modification modulates the partitioning of the Ran-GTPase-activating protein RanGAPl between the cytosol and the nuclear pore complex. Cell

96. Biol., 1996 v. 135, №6, p. 1457-1470.

97. Medema J.P., Scaffidi C., Kischkel F.C., Shevchenko A., Mann M., Krammer P.H., Peter M.E. FLICE is activated by association with the CD95 death-inducing signaling complex (DISC). EMBO J., 1997, v. 16, № 10, p. 2794-2804.

98. Melnyk V.O., Shipley G.D., Sternfeld M.D, Sherman L., Rosenbaum J.T. Synoviocytes synthesize, bind, and respond to basic fibroblast growth factor. Arthritis Rheum., 1990, № 33, p. 493-500.

99. Mevorach D., Mascarenhas J.O., Gershov D., Elkon K.B. Complement-dependent clearance of apoptotic cells by human macrophages. J. Exp. Med., 1998, v. 188, № 12, p. 2313-2320.

100. Mevorach D., Zhou J.L., Song X., Elkon K.B. Systemic exposure to irradiated apoptotic cells induced autoantibody production. J. Exp. Med., 1998, № 188, p. 387-392.

101. Michaelson J.S. Bader D., Kuo F., Kozak C., Leder P. Loss of Daxx, a promiscuously interacting protein, results in extensive apoptosis in early mouse development. Genes Dev., № 13, 1918-1923.

102. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol Methods., 1983, v.65, № 1-2, p. 55-63.

103. Muller-Ladner U, Kriegsmann J, Gay RE, Gay S. Oncogenes in rheumatoid arthritis.Rheum Dis Clin North Am., 1995, v 21, № 3, p. 675-90.

104. Muppidi J.R., Siegel R.M. Ligand-independent redistribution of Fas(CD95) into lipid rafts mediates clonotypic T cell death. Nat. Immunol., 2004, №5, p. 182-189.

105. Mysler E., Bini P., Drappa J., Ramos P., Friedman S.M., Krammer P.H., Elkon K.B. The apoptosis-l/Fas protein in human systemic lupus erythematosus. J. Clin. Invest., 1994, v. 93, № 3, p. 1029-1034.

106. Nachbur U., Kassahn D., Yousefi S., Legler D.F., Brunner T. Posttranscriptional regulation of Fas (CD95) ligand killing activity by lipid rafts. Blood, 2006, v. 107, № 7, p. 2790-2796.

107. Nagata S., Golstein P. The Fas death factor. Science, 1995, № 267, p. 1449-1456.

108. Napirei M., Gultekin A., Kloeckl T., Moroy T., Frostegard J., Mannherz H.G. Systemic lupus-erythematosus: deoxyribonuclease 1 in necrotic chromatin disposal. Int. J. Biochem. Cell Biol., 2006, № 38, p. 297306. '

109. Newton K., Harris A.W., Bath M.L., Smith K.G., Strasser A. A dominant interfering mutant of FADD/MORT1 enhances deletion of autoreactive thymocytes and inhibits proliferation of mature T lymphocytes. EMBO J., 1998, № 17, p. 706-718.

110. Ning L.L., Nie H, Yu Q.W., Zhang J.Y., Ma A.L., Shen B.H., Wang L, Bai J., Chen X.H., Zhou T., Zhang D.Q. Role of soluble Fas ligand in autoimmune diseases. World J. Gastroenterol., 2004, v. 10, № 21, p. 31513156.

111. O'Connell J., Houston A., Bennett M.W., O'Sullivan G.C. and Shanahan F. Immune privilege or inflammation? Insights into the Fas ligand enigma. Nat. Med., 2001, v. 7, № 3, p. 271-274.

112. Okura T., Gong L., Kamitani T., Wada T., Okura I., Wei C.F., Chang H.M., Yeh E.T. Protection against Fas/APO-1- and tumor necrosis factor-mediated cell death by a novel protein, sentrin. J. Immunol., 1996, v. 157, 4277-4281.

113. Orlinick J.R. Vishnaw A., Elkon K., Chao M. Requirement of cyctein-rich repeats of the Fas receptor for binding by the Fas ligand. J. Biol. Chem., 1997, v. 272, № 46, p. 28889-28894 (a).

114. Orlinick J.R., Elkon K.B., Chao M.V. Separate domains of the human Fas ligand dictate self-association and receptor binding. J. Biol. Chem., 1997, v. 272, № 51, p. 32221-32229 (b).

115. Pan G., Humke E.W., Dixit V.M. Activation of caspases triggered by cytochrome c in vitro. FEBS Lett., 1998, v. 426, № 1, p. 151-154.

116. Papo T., Parizot C., Ortova M., Piette J.C., Frances C., Debre P., Godeau P., Gorochov G. Apoptosis and expression of soluble Fas mRNA in systemic lupus erythematosus. Lupus. 1998, v. 7, № 7, p. 455-461.

117. Papoff G., Cascino I., Eramo A., Starace G., Lynch D. H. & Ruberti G. An N-terminal domain shared by Fas/Apo-1 (CD95) soluble variants prevents cell death in vitro. J. Immunol., 1996, v. 156, № 12, p. 4622-4630.

118. Pitti R.M., Marsters S.A, Lawrence D.A., Roy M., Kischkel F.C., Dowd P., Huang A., Donahue C.J., Sherwood S.W., Baldwin D.T. Genomic amplification of a decoy receptor for Fas ligandin lung and colon cancer. Nature, 1998, v. 396, № 6712, p. 699- 703.

119. Pope R.M, Perlman H. Rheumatoid Arthritis. In Principles of Molecular Rheumatology. Edited by Tsokas GC. Totowa, New Jersey: Humana Press, 2000, p. 325-361.

120. Proussakova O.V, Rabaya N.A, Moshnikova A.B, Telegina E.S, Turanov A, Nanazashvili M.G, Beletsky I.P. Oligomerization of soluble Fas antigen induces its cytotoxicity. J. Biol. Chem, 2003, v. 278, № 38, p. 36236-36241.

121. Raoul C, Barthélémy C, Couzinet A. Hancock D, Pettmann B, Hueber A.O. Expression of a dominant negative form of Daxx in vivo rescues motoneurons from Fas (CD95)-induced cell death. J. Neurobiol, 2005, v. 62, №2, p. 178-188.

122. Rathmell J.C, Townsend S.E, Xu J.C, Flavell R.A, Goodnow C.C. Expansion or elimination of B cells in vivo: dual roles for CD40-and Fas (CD95)-ligands modulated by the B cell antigen receptor. Cell, 1996, № 87, p. 319-329.

123. Ren Y, Tang J, Mok M.Y, Chan A.W, Wu A, Lau C.S. Increased apoptotic neutrophils and macrophages and impaired macrophage phagocytic clearance of apoptotic neutrophils in systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum, 2003, № 48, p. 2888-2897.

124. Rose L.M., Latchman D.S., Isenberg D.A. Elevated soluble Fas production in SLE correlates with HLA status not with disease activity. Lupus, 1997, v. 6, № 9, p. 717-722.

125. Roths J.B., Murphy E.D. and Eicher E.M. A new mutation, gld, that produces lymphoproliferation and autoimmunity in C3H/HeJ mice. J. Exp. Med, 1984, № 159, p. 1-20.

126. Rouvier E, Luciani M.F, Golstein P. Fas involvement in Ca(2+)-independent T cell-mediated cytotoxicity. J. Exp. Med, 1993, v. 177, № 1, p. 195-200.

127. Ruiz-Ruiz M.C, Izquierdo M, de Murcia G, Lopez-Rivas A. Activation of protein kinase C attenuates early signals in Fas-mediated apoptosis. Eur. J. Immunol, 1997, v. 27, № 6, p. 1442-1450.

128. Ryu S.W, Chae S.K., Kim E. Interaction of Daxx, a Fas binding protein, with sentrin and Ubc9. Biochem Biophys Res Commun, 2000, v. 279, №1, p. 6-10.

129. Sakata K, Sakata A, Vela-Roch N, Espinosa R, Escalante A, Kong L, Nakabayashi T, Cheng J, Talal N, Dang H. Fas (CD95)-transduced signal preferentially stimulates lupus peripheral T lymphocytes. Eur. J. Immunol, 1998, № 28, p. 2648-2660.

130. Saleh A, Srinivasula S.M, Acharya S, Fishel R, Alnemri E.S. Cytochrome c and dATP-mediated oligomerization of Apaf-1 is a prerequisite for procaspase-9 activation. J. Biol. Chem, 1999 v. 274, № 25, p. 17941-17945.

131. Sallai K., Nagy E., Derfalvy B., Muzes G., Gergely P. Antinucleosome antibodies and decreased deoxyribonuclease activity in sera of patients with systemic lupus erythematosus. Clin. Diagn. Lab. Immunol., 2005, v. 12, № 1, p. 56-59.

132. Salmon M., Scheel-Toellner D., Huissoon A.P., Pilling D., Shamasadeen N., Hyde H., D' Andeac A.D., Bacon P.A., Emery P., Akbar A.N. Inhibition of T cell apoptosis in the rheumatoid synovium. J. Clin. Invest., 1997, № 99, p. 439-446.

133. Salmon M., Scheel-Toellner D., Huissoon A.P., Pilling D., Shamsadeen N., Hyde H, D'Angeac A.D., Bacon P.A., Emery P., Akbar A.N. Inhibition of T cell apoptosis in the rheumatoid synovium. J. Clin. Invest., 1997, v. 99, № 3, p. 439-446.

134. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual., v. 3. Cold Spring Harbor, N.-Y., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

135. Sato T., Irie S., Kitada S., and Reed J.C. FAP-1: a protein tyrosine phosphatase that associates with Fas. Science, 1997 v. 268, № 5209, p. 411415.

136. Sato T., Irie S., Kitada S., Reed J.C. FAP-1: a protein tyrosine phosphatase that associates with Fas. Science., 1995, № 268, p. 411415.

137. Scaffidi C., Schmitz I., Zha J., Korsmeyer S.J., Krammer P.H., Peter M.E. Differential modulation of apoptosis sensitivity in CD95 type I and type II cells. J. Biol. Chem., 1999, v. 274, № 32, p. 22532-22538.

138. Scott D.L. A simple index to assess disease activity in rheumatoid arthritis. J. Rheumatol., 1993, v. 20, № 3, p. 582-584.94

139. Shi G, Luo H, Wan X., Salcedo T.W, Zang J, Wu J. Mouse T cells reseive costimulatory signals from LIGHT, a TNF family member. Blood, 2002, v. 100, №9, p. 3279-3286.

140. Shi G, Mao J., Yu Guang, Zhang J. and Wu J. Tumor vaccine based on cell surface expression of DcR3/TR6. J. Immunol, 2005, № 174: 47274735.

141. Shi G, Wu Y, Zhang J, Wu J. Death decoy receptor TR6/DcR3 inhibits T cell chemotaxis in vitro and in vivo. J. Immunol, 2003, v. 171, № 7, p. 3407-3414.

142. Shin H.D., Park B.L., Kim L.H, Lee H.S, Kim T.Y, Bae S.C. Common DNase I polymorphism associated with autoantibody production among systemic lupus erythematosus patients. Hum. Mol. Genet, 2004, v. 13, №20, p. 2343-2350.

143. Siegel R.M, Frederiksen J.K, Zacharias D.A, Chan F.K, Johnson M, Lynch D, Tsien R.Y, Lenardo M.J. Fas pre-association required for apoptosis signaling and dominant inhibition by pathogenic mutations. Science, 2000, v. 288, p. 2354-2357.

144. Silvestric F, Williams R.C. Calvani N, Grinello D, Tucci M, Cafforio P, Dammacco F. Serum elevetions of soluble Fas(CD95/Apo-I) concur in deregulatin T cell apoptosis during active lupus disease. Clin. Exp. Med, 2002, №2, p. 13-27.

145. Smith C.A, Farrah T, Goodwin R.G. The TNF receptor superfamily of cellular and viral proteins: activation, costimulation, and death. Cell, 1994, v. 76, №6, p. 959-962.

146. Smolewska E., Brozik H., Smolewski P., Biernacka-Zielinska M., Darzynkiewicz Z., Stanczyk J. Apoptosis of peripheral blood lymphocytes in patients with juvenile idiopathic arthritis. Ann. Rheum. Dis., 2003, v. 62, № 8, p. 761-763.

147. Song J.J., Lee Y.J. Role of the ASK1-SEK1-JNK1-HIPK1 signal in Daxx trafficking and ASK1 oligomerization. J. Biol. Chem., 2003, v. 278, №47, p. 47245-47252 (a).

148. Song J.J., Lee Y.J. Effect of glucose concentration on activation of the ASK1-SEK1-JNK1 signal transduction pathway. J. Cell Biochem., 2003, v. 89, № 4, p. 653-662 (b).

149. Song J.J., Lee Y.J. Tryptophan 621 and serine 667 residues of Daxx regulate its nuclear export during glucose deprivation. J. Biol. Chem., 2004, v. 279, № 29, p. 30573-30578.

150. Stanger B.Z., Leder P., Lee T.H., Kim E., Seed B. RIP: a novel protein containing a death domain that interacts with Fas/APO-1 (CD95) in yeast and causes cell death. Cell, 1995, v. 81, № 4, p. 513-523.

151. Steinbroker O., Traeger C.H., Batterman R.C. Therapeutic criteria in rheumatoid arthritis. J. Am. Med. Assoc., 1949, № 140, p. 659-662.

152. Strasser A., Whittingham S., Valux D.L., Bath M.L., Adams J.M., Cory S., Harris A.W. Eforced Bcl-2 expression in B-lymphoid cells prolongs antibody responses and elicits autoimmune disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, №88, p. 8661-8665.

153. Suzuki I., Fink P. The dual functions of Fas ligand in the regulations of periferal CD8+, CD4+T cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 2000, № 97, p. 1707-1712.

154. Suzuki I., Fink P.J. Maximal proliferation of cytotoxic T lymphocytes requires reverse signaling through Fas ligand. J. Exp. Med., 1998, № 187, p. 123-128.

155. Szodoray P., Jellestad S., Nakken B., Bran J.G., Jonsson R. Programmed cell death in rheumatoid arthritis peripheral blood T-cell subpopulations determined by laser scanning cytometry. Lab. Invest., 2003, v. 83, № 12, p. 1839-1848.

156. Takahashi T., Tanaka M., Brannan C.I., Jenkins N. A., Copeland N.G., Suda T., Nagata S. Generalized lymphoproliferative disease in mice, caused by a point mutation in the Fas ligand. Cell, 1994, v. 76, № 6, p. 969-976.

157. Takahashi T., Tanaka M., Inazawa J. Abe T., Suda T., Nagata S. Human Fas ligand: gene structure, chromosomal location and species specifity. I. Immunol., 1994, № 6, p. 1567-1574.

158. Tan E.M., Cohen A.S., Fries J.F., Masi A.T., McShane D.J., Rothfield N.F., Schaller J.G., Talal N., Winchester R.J. The 1982 revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum. 1982; v. 25, № 11, p. 1271-1277.

159. Trauth B.C., Klas C., Peters A.M., Matzku S., Moller P., Falk W., Debatin K.M., Krammer P.H. Monoclonal antibody-mediated tumor regression by induction of apoptosis. Science, 1989, v. 245, № 4915, p. 301305.

160. Tschopp J., Irmler M., Thome M. Inhibition of Fas death signals by Flips. Curr. Opin. Immunol., 1998, № 10, p. 552-558.

161. Walsh C.M., Wen B.G., Chrinnaiyan A.M., O'Rourke K., Dixit V.M., Hedrick S.M. A role for FADD in T cell activation and development. Immunity, 1998, № 8, p. 439-449.

162. Wan X.J., Zang H. L., Shi G., Kapnik E., Kim S., Kanakaraj P., Wu J. A TNF family member LIGHT transduces costimulatory signal into human T cells. J Immunol., 2002, v. 169, № 12, p. 6813-6821.

163. Watanabe-Fukunaga R., Brannan C.I., Copeland N.G., Jenkins N.A. and Nagata S. Lymphoproliferation disorder in mice explained by defects in Fas antigen that mediates apoptosis. Nature, 1992, № 356, p. 314-317.

164. Weston C.R., Davis R.J. The JNK signal transduction pathway. Curr Opin Genet. Dev, 2002, v. 12, № 1, p. 14-21.

165. Stuber E., Neurath M., Calderhead D., Fell H.P., Strober W. Cross-linking of 0X40 ligand, a member of the TNF/NGF cytokine family, induces proliferation and differentiation in murine splenic B cells Immunity., 1995, v. 2, № 5, p. 507-521.

166. Ohshima Y., Tanaka Y., Tozawa H., Takahashi Y., Maliszewski C., Delespesse G. Expression and function of 0X40 ligand on human dendritic cells. J. Immunol., 1997, v. 159, № 8, p. 3838-3848.

167. Wu J., Wilson J., He J., Xiang L., Schur P.H., Mountz J.D. Fas ligand mutation in a patient with systemic lupus erythematosus and lymphoproliferative disease. J. Clin. Invest. 1996, v. 98, № 5, p. 1107-1113.

168. Xue C., Lan-Lan W., Bei C., Jie C., Wei-Hua F. Abnormal Fas/FasL and caspase-3-mediated apoptotic signaling pathways of T lymphocytesubset in patients with systemic lupus erythematosus. Cell Immunol., 2006, v. 239, №2, p. 121-128.

169. Yang X., Khosravi-Far R., Chang H.Y., Baltimore D. Daxx, a novel Fas-binding protein that activates JNK and apoptosis. Cell, 1997, v. 89, №7, p. 1067-1076.

170. Yao Q., Glorioso J.C., Evans C.H., Robbins P.D., Kovesdi I., Oligino T.J., Ghivizzani S.C. Adenoviral mediated delivery of Fas ligand to arthritic joints causes extensive apoptosis in the synovial lining. J. Gene Med., 2000, №2, p. 210-219.

171. Yonehara S., Ishii A., Yonehara M. A cell-killing monoclonal antibody (anti-Fas) to a cell surface antigen co-downregulated with the receptor of tumor necrosis factor. J. Exp. Med., 1989, v. 169, № 5, p. 17471756.

172. Yonehara S., Ishii A., Yonehara M. A cell-killing monoclonal antibody (anti-Fas) to a cell surfase antigen co-downregulated with receptor of tumor necrosis factor. J. Exp. Med., 1989, № 169, p. 1747-1750.

173. Zhang H., Gao G., Clayburne G., Schumacher H.R. Elimination of rheumatoid synovium in situ using a Fas ligand "gene scalpel". Arthritis Research&Therapy, 2005, № 7, p 1235-1243.

174. Zhang J., Cado D., Chen A., Kabra N.H., Winoto A. Fas-mediated apoptosis and activation-induced T-cell proliferation are defective in mice lacking FADD/Mortl. Nature, 1998, v. 392, № 6673, p. 296-300.

175. Zhong S., Salomoni P., Ronchetti S., Guo A., Ruggero D., Pandolfi PP. Promyelocytic leukemia protein (PML) and Daxx participate in a novel nuclear pathway for apoptosis. J. Exp. Med., 2000, v. 191, № 4, p. 631-640.

176. Zhou Y.W., Komada Y., Inaba H., Azuma E., Sakurai M. Down-regulation of Fas-associated phosphatase-1 (FAP-1) in interleukin-2-activated T cells. Cell Immunol., 1998, v. 186, № 2, p. 103-110.

177. Zou H., Henzel W.J., Liu X., Lutschg A., Wang X. Apaf-1, a human protein homologous to C. elegans CED-4, participates in cytochrome c-dependent activation of caspase-3.Cell, 1997, v. 90, № 3, p. 405-413.

178. Zou H., Li Y., Liu X., Wang X. An APAF-1.cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9. J. Biol. Chem., 1999, v. 274, № 17, p. 11549-11556.