Исследование регуляции экспрессии генов цитохрома Р450 подсемейства 1А в печени инбредных линий мышей

Михайлова, Ольга Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование регуляции экспрессии генов цитохрома Р450 подсемейства 1А в печени инбредных линий мышей
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование регуляции экспрессии генов цитохрома Р450 подсемейства 1А в печени инбредных линий мышей"

□03055473

На правах рукописи

Михайлова Ольга Николаевна

ИССЛЕДОВАНИЕ РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ЦИТОХРОМА Р450 ПОДСЕМЕЙСТВА 1А В ПЕЧЕНИ ИНБРЕДНЫХ ЛИНИЙ МЫШЕЙ

Специальность: 03.00.04 - биохимия

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 2007

003055473

Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательском институте молекулярной биологии и биофизики СО РАМН (Новосибирск, Россия)

Научные руководители:

доктор биологических наук Л.Ф. Гуляева

кандидат биологических наук М.Л. Филипенко

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук И.Ф. Усынин

доктор медицинских наук А.Г. Покровский

Ведущая организация:

Институт цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск)

Защита диссертации состоится «_»_2007 г. в _ часов на

заседании диссертационного совета Д.001.034.01 в ГУ Научно-исследовательском институте биохимии СО РАМН (630117, Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2; тел. 8 (3833) 33-54-81).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Научно-исследовательского института биохимии СО РАМН.

Автореферат диссертации разослан « г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук, /?

старший научный сотрудник /^^^^'^/^Т.С. Русских

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Цитохромы Р450 (CYP) подсемейства 1А окисляют многие канцерогены с образованием активных метаболитов, способных связываться с нуклеофильными сайтами макромолекул клетки, что может приводить к различным токсическим процессам, в том числе канцерогенезу (Nebert, McKinnon, 1994; Ioannides, Lewis, 2004). Канцерогены, особенно относящиеся к полициклическим ароматическим углеводородам (ПАУ), вызывают индукцию этих CYP, что сопровождается многократным увеличением уровня их мРНК и ферментативных активностей (Cheung et al, 1994; Shimada, 2006). Токсический эффект от канцерогена, попавшего в живой организм, определяется количеством его активного метаболита, который может образоваться, и эффективностью его детоксификации, что напрямую зависит от уровня индуцируемой формы цитохрома Р450, активирующей канцероген. CYP1A1 и CYP1A2 осуществляют биоактивацию многих прооксидантов и проканцерогенов: Р450 1А1 — бенз[а]пирена и других ПАУ, Р450 1А2 - ПАУ, ароматических аминов, нитрозоаминов, парацетамола, гетероциклических аминов (Ioannides, Lewis, 2004).

Показано, что для активации генов CYP1A необходимо взаимодействие цитозольного белка - Ah-рецептора (AhR) с ксенобиотиком, транслокация активированного комплекса в ядро с последующим его взаимодействием с ядерным фактором ARNT и взаимодействие комплекса AhR- ARNT с цис-активными элементами генов CYP1A (Whitlock, 1999; Fujii-Kuriyama, 2005).

В окислительном метаболизме лекарств и других ксенобиотиков, как в популяции людей, так и грызунов, существенную роль играет полиморфизм генов CYP1A1 и CYP1A2 (Nebert et al., 2004; Daly, 2003). Впервые такие

генетические различия показаны на инбредных линиях мышей. Так, введение ПАУ мышам индуцибельных линий, обладающих Ah+ генотипом, приводит к значительному увеличению активности CYP1A, тогда как у мышей, обладающих Ah" генотипом, этого не наблюдается (Nebert, 1989). Инбредные линии мышей широко используются в качестве модели для изучения механизмов активации генов цитохрома Р450, а также процессов химического канцерогенеза. Показано, что такие мыши различаются по чувствительности к канцерогенному действию ПАУ, аминоазобензолов и других соединений (Gonzalez et al., 1993; Nebert et al., 2004; Каледин и др., 1999; Гуляева и др., 2000). Однако молекулярный механизм таких различий остается до конца не исследованным. Кроме того, выявлен и Ah-независимый механизм индукции цитохрома Р450 1А2 (Chaloupka et al., 1994). Все это говорит о более сложной картине регуляции экспрессии CYP1A в генетически различающихся линиях мышей, чем существующие на сегодняшний день представления, объясняющие это явление лишь различиями в генотипе AhR. В связи с этим представляется весьма актуальным исследование индукции CYP1A в норме и при воздействии

ксенобиотиков в печени мышей, различающихся по чувствительности к индуцирующему действию ПАУ-соединений.

Целью настоящей работы является исследование регуляции экспрессии генов цитохрома Р450 1А в печени мышей, различающихся по генотипу Ah рецептора, при индукции химическими канцерогенами и под влиянием физиологических факторов.

Для достижения цели решались следующие задачи:

1. Определить содержание мРНК, наличие белка и ферментативную активность CYP1A1 и CYP1A2 в печени инбредных линий мышей, различающихся по генотипу Ah рецептора при индукции 3-метилхолантреном и о-аминоазотолуолом;

2. Для выяснения роли транскрипционных факторов в регуляции экспрессии генов цитохрома Р450 подсемейства 1А определить уровень экспрессии генов AhR и ARNT в печени инбредных линий мышей, различающихся по генотипу Ah рецептора при индукции 3-метилхолантреном;

3. Провести сравнительный анализ регуляторной последовательности гена CYP1A2 (от -4675 до -4204), содержащей энхансерные модули, необходимые для конститутивной экспрессии гена CYP1A2, у инбредных линий мышей;

4. На модели иммобилизационного стресса исследовать влияние физиологических факторов на индукцию цитохрома Р4501А у молодых и старых животных.

Научная новизна работы

Несмотря на то, что исследования механизмов индукции цитохромов Р450 подсемейства 1А и регуляции экспрессии их генов ведутся на протяжении многих лет, вопрос о том, как экспрессируются гены основных транскрипционных факторов AhR и ARNT, оставался нерешенным. В данной работе была впервые определена конститутивная экспрессия этих факторов в печени инбредных линий мышей, различающихся по чувствительности к индукции цитохрома Р4501А различными канцерогенными полициклическими углеводородами (ПАУ).

Впервые было проведено комплексное исследование экспрессии транскрипционных факторов AhR, ARNT и их генов-мишеней CYP1A1 и CYP1A2 в печени мышей различных инбредных линий при индукции 3-метилхолантреном. Впервые была измерена динамика накопления мРНК исследуемых генов и выявлен максимум ее синтеза в интервале 10-20 часов после воздействия индуктора. Показано, что в печени мышей, как чувствительных к индуцирующему действию ПАУ (Ah+ генотип), так и дефектных по этому рецептору линиях (Ah"), определяется существенное количество мРНК CYP1A2, AhR, ARNT. Впервые показано наличие транскрипта гена CYP1A1 при индукции MX и О AT в печени линий SWR,

AKR и DBA, ранее считавшихся нечувствительными к ПАУ-индукции линиями. Эти результаты свидетельствуют о более сложном механизме формирования чувствительности к индуцирующему действию ПАУ, чем это считалось ранее.

Наличие при индукции MX увеличения содержания мРНК CYP1A у всех линий, независимо от генотипа Ah рецептора, указывает на то, что межлинейные различия не связаны с дефектом Ah рецептора. Полученные данные позволяют предположить существование транскрипционных механизмов регуляции CYP1A у мышей Ah+ линий и CYP1A2 у линии SWR (Ah"), и постгранскрипционных - у мышей AKR и DBA (Ah").

В работе впервые показано влияние возраста и стресса на экспрессию генов CYP1A1, CYPIA2, AhR и ARNT. Содержание мРНК исследуемых генов, за исключением CYP1A1, различается между группами взрослых и старых животных. Содержание мРНК CYP1A2 и ARNT в печени старых мышей заметно выше, чем в печени взрослых особей, в то время как содержание мРНК AhR у старых животных понижено по сравнению со взрослыми. Кроме того, под влиянием стресса увеличивается экспрессия генов CYP1A2, AhR и ARNT, что в большей мере проявляется у взрослых особей. Полученные результаты указывают на существенное ослабление реакции адаптации на стресс у старых животных.

Научно-практическая значимость

По своему содержанию работа носит преимущественно фундаментальный характер и представляет собой исследование молекулярных механизмов индукции CYP1A в печени инбредных линий мышей. Важность исследования экспрессии генов AhR, ARNT, CYP1A1 и CYP1A2, прежде всего, определяется вовлечением кодируемых ими белков в процессы канцерогенеза, особенно на его инициирующих этапах. Этот факт имеет фундаментальное значение для понимания механизма действия канцерогенных химических соединений на организм животных и человека и ведет к раскрытию природы фундаментальных биологических процессов в клетке.

Изучение механизмов воздействия канцерогенов на организм имеет также важное практическое значение как для экспериментальной работы, так и клинических исследований в ближайшем будущем.

Так, результаты, свидетельствующие об индивидуальных различиях в индукции CYP1A у мышей, генетически различающихся по чувствительности к ПАУ, важно учитывать при изучении механизмов химически индуцированного канцерогенеза, где традиционно используются данные линии мышей. Данные об экспрессии генов CYP1A и их транскрипционных факторов важны в разработке новых высокочувствительных тестов по определению канцерогенной активности химических соединений. Понимание механизмов биоактивации

проканцерогенов раскрывает широкие перспективы для предотвращения и/или модификации канцерогенеза в терапевтических целях.

Основные положения, выносимые на защиту

1. При введении как MX, так и ОАТ, активность CYP1A1 и CYP1A2 в печени мышей увеличивается у линий с генотипом Ah+, и не изменяется у мышей с генотипом Ah", что подтверждает наличие генетических различий в индуцибельности цитохрома Р450 1А у мышей.

2. Под действием как MX, так и ОАТ, содержание мРНК CYP1A2 увеличивается у мышей всех линий, за исключением мышей SWR. Содержание мРНК CYP1A1 также увеличивается у всех линий мышей, независимо от генотипа Ah рецептора, в том числе у мышей SWR, AKR и DBA, традиционно считающихся нечувствительными к индукции ПАУ.

3. Вне зависимости от генотипа Ah рецептора в печени мышей определяется мРНК транскрипционных факторов AhR и ARNT, причем введение MX существенно не влияет на уровень их экспрессии. Вместе с результатами по экспрессии генов CYP1A1 и CYP1A2 это свидетельствует о том, что межлинейные различия у мышей в чувствительности к индукции ПАУ обусловлены не только дефектом Ah-рецептора.

5. Уровень экспрессии исследуемых генов, за исключением CYP1A1, различается у молодых и старых мышей в норме и под воздействием стресса. Содержание мРНК CYP1A2 и ARNT в печени старых мышей заметно выше, чем в печени молодых особей, в то время как содержание мРНК AhR у старых животных понижено по сравнению с молодыми. Под влиянием стресса увеличивается экспрессия генов CYP1A2, AhR и ARNT, что в большей мере проявляется у молодых особей и может свидетельствовать об отсутствии или существенном ослаблении у старых животных реакции адаптации на стресс.

Апробация работы

Орландо, США, 2002; на международном конгрессе «3rd European Congress of Biogerontology» Флоренция, Италия, 2002; на международной конференции «8th European ISSX Meeting» Дижон, Франция, 2003; на международном симпозиуме «8th Symposium on Catecholamines and other Neurotransmitters in Stress» Смоленице, Словакия, 2003; на международной конференции «7th International ISSX Meeting» Ванкувер, Канада, 2004.

Публикации. По материалам диссертации имеется 13 печатных работ.

Структура работы. Диссертационная работа изложена на 120 страницах машинописного текста с полуторным интервалом, содержит 5 таблиц и 15 рисунков и состоит из 6 разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения результатов, выводов, а также списка цитируемой литературы, содержащего 13 отечественных и 218 зарубежных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе были использованы мыши линий C57BL, СВА, A/Sn, DBA, AKR, SWR, CC57BR, A/He, BALB/c, СЗН/а и DD, получаемые из питомника ИЦиГ СО РАН г. Новосибирска. Животные содержались по 2 - 3 особи в условиях естественного освещения при свободном доступе к воде и пище. Эксперименты проводились в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. N 755). Животные находились на стандартной диете и перед забоем сутки не получали еды.

В экспериментах по определению межлинейных различий в экспрессии CYP1A индукцию микросомных ферментов осуществляли однократным внутрибрюшинным введением растворенным в 0,3 мл растительного масла MX (80 мг/кг веса) или ОАТ (225 мг/кг веса). Микросомальную фракцию печени в этих случаях получали через 72 часа, а препараты РНК - через 4-72 часа после введения индуктора. Контролем служили животные, получавшие растительное масло (25 мл/кг веса).

В экспериментах по влиянию стресса на экспрессию CYP1A каждая экспериментальная группа мышей («молодые» и «старые») была разделена на две подгруппы из семи животных: интактные и те, которые подвергались иммобилизационному стрессу посредством фиксации в положении лежа на спине в течение двух часов. Через час после завершения иммобилизационного воздействия проводили декапитацию животных. В течение семи дней непосредственно перед экспериментом мыши

содержались в индивидуальных клетках для снятия эффекта групповых отношений.

Микросомы печени выделяли при температуре +4°С общепринятым методом дифференциального центрифугирования. Количество белка в микросомах определяли по методу Лоури, общее содержание цитохрома Р450 измеряли как описано Омура Т. и Сато P. (Omura, Sato, 1964). Скорость О-деалкилирования ряда алкоксирезоруфинов - ЭР, MP определялась спектрофлуориметрически по методу Бурке и Майера (Burke, Mayer, 1974). (Burke et al., 1985).

Для детекции белков CYP1A микросомальные белки разделяли электрофорезом (Laemmli, 1970), переносили на нитроцеллюлозную мембрану полусухим способом в буфере 25 мМ Трис-НС1, 195 мМ глицин, 20% этанол на приборе Fastblot "Biometra" (Германия) в соответствии с инструкцией производителя. Мембрану инкубировали с первичными антителами (клон 14Н5) против Р450 1А1/2 крыс. Белки визуализировали окрашивая мембраны раствором 5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфата (ВС1Р) и р-нитротетразолиума голубого (NBT) в буфере АР 9,5. Работа проводилась совместно с Захаровой Л.Ю.

Препараты суммарной РНК получали SDS/фенольным методом, как описано (Chattopadhyay et al., 1993). Относительное содержание мРНК генов CYP1A1, CYP1A2, Ahr и ARNT определяли методом мультиплексной ОТ-ПЦР (Wong et al., 1994). В качестве эндогенного внутреннего контроля, относительно которого проводилось выравнивание продуктов амплификации исследуемых генов, были выбраны гены «домашнего хозяйства» р-актин, RPL30 и GAPDH. Для синтеза кДНК in vitro брали по 1 мкг РНК на пробу. ПЦР предварительно оптимизировали по числу циклов, концентрации Mg2+, количеству праймеров. Каждая амплификационная смесь содержала в качестве матрицы количество кДНК, соответствующее 100 нг суммарной РНК, 1 X буфер для ПЦР, 50 мкМ каждого дезоксирибонуклеозидтрифосфата, 20 пкМ каждого праймера для амплификации кДНК CYP1A1, CYP1A1, AhR, ARNT, СОМТ или GSTM1 и 2 ед. акт. Taq ДНК-полимеразы. Равные количества (20 пкМ) праймеров для амплификации /?-актина, циклофилина или GAPDH были добавлены через несколько циклов. Чтобы определить количество циклов, необходимых, чтобы, с одной стороны, визуализировать продукты амплификации, а, с другой - остановить ПЦР в экспоненциальной фазе амплификации, реакцию амплификации останавливали на разных циклах, и продукты амплификации анализировали гель-электрофорезом. В наших условиях наиболее подходящее число циклов было для /?-актина, RPL30 или GAPDH — 22, для CYP1A1 - 30, для CYP1A2 - 27, для AhR и ARNT - 36. Каждую пробу амплифицировали трижды. Продукты ПЦР анализировали электрофорезом в 1,5 - 2% агарозном геле. Гель окрашивали бромистым этидием, сканировали с помощью видеосистемы «DNA Analyzer» (Литех,Москва) и

денситометрировали с помощью программы "Scionlmage". Относительное содержание мРНК генов CYP1A1, CYP1A2, Ahr и ARNT оценивали в относительных единицах как отношение интенсивности окрашивания специфической полосы генов к интенсивности полосы гена «домашнего хозяйства» ^-актина, RPL30 или GAPDH.

Препараты геномной ДНК получали из печени мышей, как описано ранее (Aljanabi, Martinez, 1997). Очистку продуктов ПЦР (472 п.н.) проводили на спин-колонках (Qiagen, Германия) и далее проводили прямое секвенирование согласно протоколу (dye-terminator method) для ABI-системы капиллярного электрофореза (Applied Biosystems, Великобритания) в соответствии с протоколом производителя. Все продукты ПЦР были секвенированы в обоих направлениях с использованием прямого и обратного праймеров.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программ STATISTICA и Excel. Результаты представлены в виде М ± т, где М - среднее, т - ошибка среднего. Для оценки статистически значимых различий между выборками использовался t -критерий Стьюдента. В экспериментах по изучению влияния стресса использовали многофакторный анализ вариации (MANOVA) и метод Tukey для итогового многофакторного сравнения средних величин.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Индукция CYP1A1 и CYP1A2 в печени инбредных линий мышей, обработанных 3-метилхолантреном (МХ) и о-аминоазотолуолом (ОАТ)

В нашем исследовании были использованы классический индуктор МХ, относящийся к классу ПАУ-соединений (Nebert, 1989; Carretero et al., 2001), и относящийся к классу азобензолов о-аминоазотолуол (ОАТ). По оценке Международного агентства изучения рака (IARC) ОАТ является возможным канцерогеном для человека (IARC, 1975). ОАТ интересен прежде всего тем, что вызывает развитие опухолей исключительно в печени мышей, но не крыс, причем мыши разных инбредных линий различаются по чувствительности к его действию (Каледин и др., 1990).

Для выявления межлинейных различий при индукции канцерогенными соединениями были проведены эксперименты по определению содержания белков CYP1A1 и CYP1A2 и их ферментативной активности в печени инбредных линий мышей.

Для определения белка был использован метод Вестерн-блот анализа (белковый иммуноблоттинг) с применением моноклональных антител против Р450 1А. Данные этого эксперимента приведены на рисунке 1.

DBA SWR AKR C57BL CBA A/Sn

_ CYP1A1 CYP1A2

DBA SWR AKR C57BL

. tm — ша = £££

OAT К OAT К OAT К OAT

Рисунок 1. Вестерн-блот анализ белков СУР1А в печени мышей с различным генотипом АЬ рецептора. К - в норме; МХ - при индукции 3-метилхолантреном, ОАТ -при индукции о-аминоазотолуолом.

Видно, что в печени мышей всех линий, не обработанных индукторами, регистрировался CYP1A2, что подтверждает его конститутивную экспрессию независимо от генотипа Ah-рецептора. Введение как MX, так и ОАТ, мышам ПАУ-индуцибельных линий, C57BL, СВА и A/Sn, приводит к увеличению содержания CYP1A2, а также к индукции CYP1A1. В тоже время, при введении индукторов мышам Ah'-линий SWR, AKR и DBA (ПАУ-неиндуцибельные линии), подобного эффекта, не обнаружилось. Однако в отдельных случаях регистрировалось незначительное усиление интенсивности белковой полосы, соответствующей CYP1A2 (линии AKR, DBA).

Данные по анализу белка CYP1A были сопоставлены с ферментативной активностью цитохромов Р4501А1 и 1А2 в метаболизме 7-этокси- и 7-метоксирезоруфина соответственно. Результаты этого эксперимента представлены в таблице 1.

Как следует из полученных результатов, у контрольных животных не существует статистически значимых межлинейных различий в параметрах ЭРОД и МРОД. Таким образом, базальный уровень активности CYP1A1 и CYP1A2 практически одинаков для всех исследуемых линий мышей.

Введение как MX, так и ОАТ, вызывало многократное увеличение ЭРОД и МРОД в печени мышей, обладающих Ah+ генотипом (C57BL, СВА и A/Sn). У мышей линий SWR, AKR, DBA, обладающих генотипом Ah", введение как MX, так и ОАТ, не приводило к статистически значимому увеличению общего содержания Р450 и ферментативной активности CYP1 AI и CYP1A2. Эти результаты согласуются с данными белкового иммуноблота и с результатами исследований группы Неберта, полученными ранее на ограниченном количестве линий мышей (Nebert, 1989). Таким образом, наши данные подтверждают наличие генетических различий в индуцибельности цитохрома 1А у мышей.

Таблица 1. 7-этоксирезоруфин- (ЭРОД) и 7-метоксирезоруфин-(МРОД)-О-деалкилазные активности цитохромов Р450 1А1 и 1А2 в печени мышей инбредных линий при индукции MX и ОАТ.

Линия Индуктор Р450 нмоль/мг белка ЭРОД пкмоль резоруфина/мин/ мг белка МРОД пкмоль резоруфина/мин/ мг белка

SWR контроль MX ОАТ 0,47 ±0,04 0,45 ± 0,03 0,42 ± 0,08 126 ±25 173 ±30 178 ±19 109 ±15 148 ± 22 165 ± 30

AKR контроль MX ОАТ 0,6 ±0,04 0,58 ±0,1 0,55 ±0,12 89 ±25 75 ±28 69 ±15 100 ±19 115 ± 14 125 ±21

DBA контроль MX ОАТ 0,45 ±0,11 0,5 ±0,11 0,47 ± 0,08 144± 14 185 ±70 178 ±20 182 ±25 220 ±41 192 ± 27

СБА контроль MX ОАТ 0,62 ±0,05 0,89 ± 0,03 н о 76 ±22 685 ±64 (9,01)* но 89 ±16 730 ±49 (8,20)* но

A/Sn контроль MX ОАТ 0,55 ±0,05 1,1±0,14 (2,0)* 1,2 ±0,22 (2,18)* 90 ±11 1695 ± 148 (18,83)* 1878± 320(20,86)* 82 ±15 1934 ±200 (23,59)* 2194 ±250 (26,76)*

C57BL контроль MX ОАТ 0,78 ±0,01 1,5±0,07 (1,92)* 1,36 ±0,04 (1,74)* 153 ±20 2472 ±190 (16,16)* 2911 ±580 (19,03)* 144 ± 34 3682 ±301 (25,57)* 3261 ±428 (22,65)*

В таблице приведены средние значения данных, полученные для групп животных из 6-ти особей, ± стандартное отклонение. Степень индукции указана в скобках. ^Статистически значимое отличие от контроля по критерию Стьюдента (Р < 0,05). Н.о. — не определяли

Исследование экспрессии генов СУР1А1, СУР1А2, АИЛ и АЛМТ в зависимости от времени после введения МХ в качестве индуктора

Общепринятым на сегодняшний день, является представление о дефекте АЬ рецептора, как о причине различий в индуцибельности цитохрома 1А у мышей. Однако до сих пор не исследовали, существует ли корреляция между увеличением ферментативной активности и транскрипцией соответствующего гена, а также существует ли прямая

взаимосвязь с изменением экспрессии соответствующих транскрипционных факторов. Поэтому следующим шагом в нашей работе было определение методом мультиплексной ОТ-ПЦР уровня мРНК CYP1АI и CYP1А2, а также AhR и ARNT в норме и при индукции MX и ОАТ.

На первом этапе необходимо было определить максимум накопления мРНК в зависимости от времени после введения индуктора. Для ответа на вопрос, существует ли корреляция между увеличением ферментативной активности и транскрипцией соответствующего гена были проведены эксперименты по определению уровня мРНК CYP1A1 и CYPIA2, а также транскрипционных факторов AhR и ARNT в норме и при индукции MX и ОАТ.

А)

jh CVPIAI <- GAPDH

— CVP1A3

— GAPDII

«-. AliR GAPDH

<- ARNT <- GAPDH

Б)

Рисунок 2. Изменение экспрессии исследуемых генов в зависимости от времени после введения MX и качестве индуктора у мышей линии DBA (АЬ-нсчувствигельиая). А), Электрофоре грамм а разделения продуктов мультиплексной ОТ-ПЦР в 2%-агарозном геле. К - контрольная группа животных. Б) Данные представлены как средние значения для групп животных из шести особей ± стандартное отклонение.

К 4 ч 8 ч 16 ч 20 ч 24 ч 72 ч

А)

К 4 ч 6н 16 ч 20 ч 24 ч 72 ч

СУР1Л1 — Сарпн

-— . — СУР1Л1 «- (,Л1'1>Н

*— AhR — GAPDII

t— ARNT <-GAPI)H

Б)

- ■ ■ д-- ■ ARNT AhR —д—Cyplal Cyp1a2

Рисунок 3. Изменение экспрессии исследуемых генов в зависимости от времени после введения МХ в качестве индуктора у мышей линии СБА (АЬ-чуаств и тельная). А), Электрофоре грамма разделения продуктов мультиплексной ОТ-ГГЦР в 2%-агарозном геле. К - контрольная группа животных. Б). Данные представлены как среднее значения для групп животных из шести особей ± стандартное отклонение.

Для определения экспрессии генов транскрипционных факторов AhR, ARNT и цитохромов Р4501А в печени мышей был использован метод мультиплексной ОТ-ПНР, ранее используемый в нашей лаборатории и адаптированный для наших условий. Для определения максимального уровня экспрессии исследуемых генов после введения мышам индуктора 3-метилхолантрена (MX), было взято несколько временных точек: 4, 8, 16, 20, 24 и 72 часа после действия индуктора. В эксперимент были взяты две линии мышей - DBA (Ah-нечувствительная) и СВА {Ah-чувствительиая) (Nebert, 1989; Nebert et al., 2004). Результаты этого эксперимента приведены на рисунках 2 и 3.

Как видно, максимальный уровень экспрессии исследуемых генов приходится на 16 — 20-ти часовой интервал после введения индуктора. В дальнейших экспериментах содержание мРНК определяли через 20 часов после введения мышам индуктора.

Содержание мРНК цитохромов Р450 1А1 и 1А2 в печени мышей в норме и при индукции MX и ОАТ

Методом мультиплексной ОТ-ПЦР были определены уровни мРНК цитохромов Р450 1А1 и 1А2 в печени 6-ти инбредных линий мышей, различающихся по генотипу Ah-рецептора, т.е. по чувствительности к индуцирующему действию полициклических ароматических углеводородов (ПАУ), в норме и при ш-дукции MX,

C57BL WSn СБА AKR SWR DBA А) к м о к м 0~ к М "к м о 1 М о И и (Г

w------— — —— mm • —RPL30

— — w------.— — — — .------- — CYP1A2

— —— — — — — — — — _, ---- — -— RRL 30

Рисунок 4. Уровень экспрессии генов CYP1AI и СУР1А2 в печени мышей инбредных линий в нормг и при индукции MX и ОАТ. А) Электрофореграмма разделения продуктов мультиплексной ОТ-ПЦР в 2%-агарозном геле: к, группа контрольных мышей; м, при индукции MX; о, при индукции ОАТ (у мышей линии СВА индукцию ОАТ не исследовали). Б) Данные представлены как средние значения для групп животных из восьми особей, ± стандартное отклонение. *Р<0,05; **Р<0.01; ***Р<0.001. (Статистически значимые различия между индуцированными и интактными животными по критерию Стьюдента).

Среди выбранных мышей три линии обладали AhR+ генотипом (СВА, C57BL, A/Sn) и три линии были нечувствительны к индукции ПАУ (DBA, AKR и SWR - АЬЯ~генотип) (Nebert, 1989; Nebert et al., 2004). Полученные данные представлены на рисунке 4.

В печени интактных мышей исследуемых линий мРНК CYP1A1 практически не регистрировался, в то время как конститутивный уровень экспрессии гена CYP1A2 был достаточно высок, что вполне согласуется с результатами Вестерн-иммуноблота, а также с ранее полученными результатами (Kimura et al., 1986).

Обнаружено, что в печени всех исследуемых линий мышей регистрируется значительное увеличение количества мРНК цитохрома Р450 1А1 (рис. 4) при индукции 3-метилхолантреном. Этот факт оказался неожиданным, поскольку мыши линий SWR, AKR и DBA традиционно считаются ПАУ-неиндуцибельными (Nebert, 1989), т.е. обладают генотипом Ahd Ahd. Увеличение содержания уровня мРНК CYP1A1 достаточно трудно оценить вследствие её низкого содержания в контроле. Тем не менее, видна разница в уровне мРНК CYP1A1 среди исследуемых линий. Особенно это заметно для линий Ah+ генотипа. У линий, дефектных по Ah-рецептору, также наблюдалось увеличение содержания мРНК CYP1A1, хотя оно было не столь ярко выраженным: в 2 - 3 раза ниже по сравнению с Ah+ линиями.

При исследовании экспрессии гена CYP1A2 обнаружено, что, в отличие от CYP1A1, в печени необработанных индуктором мышей регистрируется заметное количество мРНК (рис. 4). Количество мРНК CYP1A2 различается среди исследуемых линий не значительно. Исключение составляют мыши линии SWR, у которых количество мРНК CYP1A2 в контроле в 3-4 раза выше, по сравнению с мышами линий C57BL, A/Sn, СВА, AKR и DBA и сравним с индуцированным MX.

Введение животным 3-метилхолантрена сопровождалось усилением экспрессии CYP1A2 в печени мышей A/Sn, C57BL, СВА и AKR в 3-4 раза. Содержание мРНК CYP1A2 не изменялось у SWR мышей, но статистически значимо (р < 0.05), увеличивалось у DBA мышей при индукции MX.

Аналогичные эксперименты были проведены с использованием ОАТ в качестве индуктора. Методом мультиплексной ОТ-ПЦР были определены уровни мРНК цитохромов Р450 1А1 и 1А2 в печени 5-ти инбредных линий мышей, различающихся по генотипу Ah-рецептора. Полученные данные представлены на рисунке 4.

Как видно, индукция ОАТ проходит схожим с MX образом. Можно лишь отметить, что уровень индукции в случае ОАТ выше, чем в случае с MX.

Таким образом, вне зависимости от генотипа индуцибельности (генотипа Ah-рецептора) все исследуемые линии мышей реагировали на введение химических канцерогенов (MX или ОАТ) усилением экспрессии генов CYP1A1 и CYP1A2. Этот факт оказался неожиданным, поскольку

мыши линий SWR, AKR и DBA традиционно считаются ПАУ-неиндуцибельными. Полученные результаты выявили несоответствие между усилением транскрипции генов CYP1A1 и CYP1A2 и индуцибельностью соответствующих ферментов в печени мышей, что не согласуется с общепринятыми представлениями о механизмах индукции CYP1A1 и CYP1A2. Наличие при индукции MX и ОАТ увеличения мРНК CYP1A1 у всех линий, независимо от генотипа Ah рецептора указывает на то, что межлинейные различия не связаны с дефектом Ah рецептора, и позволяет предположить существование посттранскрипционных механизмов регуляции CYP1A. Однако невозможно все объяснить с точки зрения только постгранскрипционных механизмов регуляции. Так у Ah+ линий обнаружено увеличение как уровня мРНК для генов CYP1A, так и уровня ферментативных активностей соответствующих ферментов. Также линия SWR ведет себя, как классическая неиндуцибельная линия в отношении CYP1A2. Скорее всего, существует вклад в межлинейные различия индуцибельности CYP1А и на транскрипционном уровне.

Содержание мРНК генов AhR и ARNT в печени мышей в норме и при индукции MX

До настоящего времени тестируемые линии не были охарактеризованы по уровню экспрессии генов AhR и ARNT. Поэтому следующим шагом в нашей работе было определение уровня мРНК этих транскрипционных факторов в норме и при индукции. Поскольку предварительно не было обнаружено существенных отличий при индукции CYP1A ОАТ и MX, то дальнейшие эксперименты проводили только с использованием MX в качестве индуктора.

Методом мультиплексной ОТ-ПЦР были определены уровни мРНК транскрипционных факторов AhR и ARNT в печени 6-ти инбредных линий мышей, различающихся по генотипу Ah-рецептора, т.е. по чувствительности к индуцирующему действию полициклических ароматических углеводородов (ПАУ). Результаты представлены на рисунке 5.

На рисунке 5а приведены значения относительного содержания мРНК Ah-рецептора в печени мышей исследуемых линий. Видно, что вне зависимости от генотипа AhR, его экспрессия практически одинакова у всех мышей. И лишь для линии SWR можно отметить почти двукратное снижение его экспрессии по сравнению с другими линиями. Видно также, что экспрессия этого фактора практически не изменяется при введении мышам индуктора. При индукции MX содержание мРНК AhR статистически значимо (р < 0.05) увеличивалось только у мышей линий AKR и DBA, тогда как у C57BL, A/Sn, СВА и SWR мышей - не изменялось.

Аналогичные эксперименты были проведены для ARNT (рис. 56). И в этом случае нами не было выявлено существенных межлинейных различий и зависимости от введения индуктора. Конститутивный уровень мРНК ARNT различался статистически значимо (р < 0.05), но лишь незначительно среди исследуемых линий мышей: немного повышен у мышей линий СВА и SWR и слегка понижен у AKR и DBA по сравнению с C57BL и A/Sn. После индукции MX содержание мРНК ARNT не изменялось у мышей с Ah+-генотипом и слегка уменьшалось у мышей с Ah'-генотипом.

Таким образом, проведенные эксперименты показали, что уровень экспрессии генов AhR и ARNT существенно не зависит от генотипа Ah рецептора и индукции 3-метилхолантреном.

C57BL A/Sn СВА AKR SWR DBA

Рисунок 5. Эффект МХ на относительное содержание мРНК АЬЯ (А) и АШ^Т (Б) в печени мышей разных линий. Данные представлены как средние значения для групп животных из шести особей ± стандартное отклонение. *Р<0,05; **Р<0,01; ***Р<0,001 (Статистически значимые различия между МХ-индуцированными и интактными животными по Критерию Стьюдента).

Анализ полученных данных позволяет сделать ряд важных заключений. Во-первых, стабильная экспрессия AhR и ARNT, регулирующих транскрипцию генов CYP1A, обнаруживается у всех исследуемых линий мышей, различающихся по чувствительности к ПАУ-индукции, причем введение MX не влияет существенно на их экспрессию. Во-вторых, изменение экспрессии генов CYP1A в ответ на индукцию MX обнаруживается у всех исследуемых линий мышей независимо от генотипа Ah рецептора. Можно допустить, что у мышей с Ah+ генотипом (C57BL, СВА и A/Sn) индукция CYP1A осуществляется через традиционный транскрипционный механизм, как это было предложено ранее другими исследователями (Nebert, 1989; Gonzalez et al., 1984). В то же время у мышей с Ah" генотипом (SWR, AKR и DBA) включается другой механизм индукции CYP1A, который, возможно, не связан напрямую с AhR-опосредованным механизмом регуляции. Эти результаты свидетельствуют в пользу AhR-независимого механизма индукции CYP1A1 и CYP1A2, что подтверждается случаями, известными для CYP1A2 (Chaloupka et al., 1994; Nerurkar et al., 1993; Adams et al., 1993). Механизм феномена AhR-независимого пути остается неизвестным. Предполагается, что он реализуется благодаря активации посттранскрипционных механизмов стабилизации мРНК и/или посттрансляционной стабилизации комплекса фермент-индуктор. По-видимому, также в отсутствие Ah рецептора, другие транскрипционные факторы способны связываться со специфической последовательностью ДНК (DRE) с последующей инициацией транскрипции гена CYP1A2 (Coreos et al., 1998), хотя для CYP1A1 такой механизм до сих пор не показан. Другая гипотеза может быть связана с существованием у мышей с Ah' генотипом посттранскрипционного механизма регуляции CYP1A, который ингибирует синтез белков CYP1A. Отсутствие накопления белков во время стабильной транскрипции соответствующих генов может указывать на дефекты в трансляции CYP1A1 и CYP1A2. Для определения точного механизма данного явления требуется более глубокое исследование молекулярной генетики Ah рецептора, а также дальнейшее исследование посттранскрипционных механизмов регуляции генов CYP1A1 и CYP1A2 в печени мышей различных инбредных линий.

В результате нашего исследования показаны индивидуальные различия в конститутивном и индуцированном уровне экспрессии генов CYP1A1, CYP1A2, AhR и ARNT для каждой исследуемой линии мышей, даже если некоторая корреляция была обнаружена в отношении генотипа Ah рецептора. Таким образом, инбредные линии мышей представляют уникальную модель для изучения индивидуальных различий в механизме экспрессии генов цитохрома Р450 1А, что, возможно, является основной причиной различной индивидуальной чувствительности к канцерогенам.

Сравнительный анализ регуляторной последовательности гена CYP1A2 (от -4675 до -4204) у мышей инбредных линий

В настоящей работе было показано, что в случае мышей линии SWR содержание мРНК в норме существенно повышено по сравнению с мышами других исследуемых линий. К тому же, не было обнаружено увеличения количества мРНК CYP1A2 при индукции MX и ОАТ, как в случае мышей остальных тестируемых линий мышей (рис. 4). Мы предположили, что такая неодинаковая картина экспрессии гена CYP1A2 под действием индукторов у инбредных линий при стабильной экспрессии транскрипционных факторов может быть связана с мутациями/заменами в ДНК-связывающей области промотора гена CYP1A2. Ранее в промоторе гена CYP1A2 мыши была идентифицирована область, содержащая два энхансерных элемента, которая, как было показано, необходима для конститутивной экспрессии гена CYP1A2 (Uchida et al., 2002) (рис. 7). В нашем эксперименте мы проверили гипотезу, что возможные полиморфизмы в этой регуляторной области гена CYP1A2 могут вносить вклад в генетические различия экспресии и/или индукции CYP1A2 среди различных инбредных линий мышей.

Для этого в микросомах печени мышей была определена МРОД активность, которая, как считается, отражает ферментативную активность CYP1A2. Для анализа использовали 11 линий мышей, различающихся по генотипу Ah рецептора и чувствительности к гепатоканцерогенному действию ОАТ (табл. 2).

Таблица 2. Используемые в эксперименте линии мышей

Чувствительные к индукции ПАУ** Нечувствительные к индукции ПАУ**

Чувствительные к ОАТ-ивдуцированному канцерогенезу * C57BL, A/Sn, А/Не, СВА, СЗН/а DBA, SWR, DD

Устойчивые к ОАТ-ивдуцированному канцерогенезу * BALB/c, CC57BR AKR

♦Каледин, Захарова, 1984; Каледин и др., 1990; ** Nebert, 1989

Результаты эксперимента представлены на рисунке 6. Можно заметить различия среди исследуемых линий: некоторые из них имеют сравнимый конститутивный уровень ферментативной активности CYP1A2, в то время как у других он повышен (CC57BR) или понижен (СЗН/а, A/Sn, AKR, SWR).

_300

§250

¡200 ю

5 150 "2

§100 *

к ш

о о

ш о

< ш

¡г

со

* Ю < <

Рисунок 6. Конститутивная активность МРОД в печени мышей различных линий.Статистический анализ проведен с использованием Критерия Стьюдента. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение для группы из восьми животных.

Для проверки, не является ли причиной обнаруженных различий возможный полиморфизм в регуляторном районе гена СУР1А2, была секвенирована последовательность ДНК гена СУР1А2 от -4675 до -4204, содержащая необходимые для конститутивной экспрессии элементы Е1 и Е2, у всех исследуемых линий мышей (рис. 7).

- 4675 ccacatcttggctcattactgcctataattccagtctcaagggaatttgatgcccccttc tggcccccgtgggtgctgcacccatgtgatccacaaacatgcatgaaggcaaaacattca cacatgcttataataagataatttttgtttgtttaactttgtattggttctttatgaatt tcacatcatgcaccccagtcccacccatcccctggttcccttgtactcaccctatgccct ^сас^сс^сссаааадаааасааааЪс^дЪдСААСТТСТАСТСАСТСАТТСАТСТСС ТТСААССССТСТСССТТССССТАСАСТАТСАСТАСТССАССТСАСТСАСАСТССТСТСАС ATACCCTGCTGTTGCTCTGTGTCAtagtgattctgcagatttggacctgtagaagcagtc ccttcatgtgctctggcagttcatagatgaggtagatgttggcgtgggacaa ^^

Рисунок 7. Нуклеотидная последовательность исследуемого района. Энхансерный район и 5'- и 3'-фланкирующие последовательности представлены заглавными и прописными буквами соответственно. Энхансерные элементы Е1 и Е2 подчеркнуты.

В результате анализа не было обнаружено полиморфизмов в исследуемом фрагменте ДНК, который, по-видимому, является консервативным и не связан с межлинейными различиями в экспрессии CYP1А2 и чувствительности к гепатоканцерогенному действию ОАТ.

С другой стороны, подобная стабильность в регуляторном районе гена может отражать ключевую роль, которую этот район играет в конститутивной экспрессии гена CYP1A2. В этом случае фенотипические различия могли бы быть связаны с регуляцией экспрессии этого гена или, возможно, с полиморфизмами других районов гена CYP1A2.

Идентификация возможных полиморфных вариантов гена имеет значение для фармакогенетических исследований, включая экспрессию гена CYP1A2, так же как и поиск новых детерминант метаболизма ксенобиотиков в токсикологии. Действительно, недавно несколько полиморфизмов были обнаружены в гене CYP1A2 в экспериментах с APN и C3H/HeJ мышами, различающимися по скорости метаболизма кофеина (Casley et al., 1999; Casley et al., 2000). Таким образом, представляют интерес дальнейшие исследования других районов гена CYP1A2 среди различных линий мышей.

Влияние стресса на индукцию цитохрома Р4501А, AhR и ARNT

В возрастных изменениях особое значение имеют сдвиги на двух уровнях: изменения в регуляции работы генов и изменения в нервной и гормональной регуляции. Известно, что и при стрессе в основе многих изменений клеточного метаболизма лежат гормональные сдвиги (Frolkis, 1993). У человека активность ферментов метаболизма ксенобиотиков в печени существенно снижается при старении (Anantharaju et al., 2002). Данные по экспрессии цитохромов Р450 у экспериментальных животных при старении на сегодняшний день не систематизированы. Из многочисленных исследований следует, что возрастная зависимость экспрессии этих ферментов различается у различных видов и линий животных, у мужских и женских особей (Pegram et al., 1995; Mote et al., 1990; Cao et al., 2001).

Показано, что продолжительность жизни животных, находящихся в обычных условиях, в условиях умеренных стрессов, больше, чем тех, которые жили при резком ограничении стрессовых воздействий или, наоборот, в условиях частых "сильных" стрессов. Многие проявления старения сходны с теми изменениями, которые наступают у взрослых животных, у людей при стрессе. Например, общими для старения и стресса являются повышение концентрации адреналина, вазопрессина, АКТГ и кортизола в крови, снижение концентрации тестостерона, тироксина, трийодглобулина, падение инсулиновой активности крови.

Недавние исследования обнаружили непосредственное влияние как психологического, так и физиологического стресса на экспрессию генов

СУР1А1 и СУР1А2 в печени мышей и крыс (Кот^апсН е1 а!., 2004; Ког^апсН ег а1., 1998). Очевидно, реакция системы фементов метаболизма ксенобиотиков на внешние регуляторные факторы может модифицироваться в условиях с измененной физиологической регуляцией. Широко известно, что рак чаще всего развивается при старении, что, в свою очередь, связано с динамикой возрастных генорегуляторных изменений. Таким образом, существует очевидная связь между стрессом, старением и системой ферментов цитохрома Р450.

Поскольку СУР1А участвуют в метаболизме не только экзогенных, но также и эндогенных соединений, то определенный интерес представляют исследования воздействия физиологических и психологических факторов на систему ферментов метаболизма ксенобиотиков. В связи с этим, следующим этапом нашей работы было изучение влияния стресса и старения на регуляцию генов СУР1А1 и СУР1А2.

В работе проведено исследование экспрессии генов СУР1А1, СУР1А2, АИЯ и АШТ в печени взрослых (3-месячных) и старых (26 месячных) мышей-самцов линии СЗН/а, подвергнутых иммобилизационному стрессу.

На рисунке 8 показана типичная электрофореграмма разделения продуктов амплификации мультиплексной ПЦР. Результаты эксперимента представлены на рисунке 9. В печени мышей исследуемых линий мРНК СУР1А1 не регистрировался, как у интактных животных, так и у подверженных иммобилизационному стрессу (данные не представлены). Содержание мРНК АКГчГГ было чрезвычайно низким у молодых животных и достаточно высоким у старых.

Статистическая обработка данных с использованием многофакторного анализа вариации (МА№)УА) показала эффекты старения (РА) и стресса (Б8) на экспрессию гена СУР1А2 (РА(1>22) = 173,02, /><0,00001; Р^^) = 11,70, /><0,003) и АИЯ (Ра(1)22) = 721,34, ><0,00001; Б^г) = 113,47, Р<0,00001), а также взаимодействие двух факторов СтарениехСтресс (Р^^) = 31,50, Р<0,00002 для СУР1А2; Т(и22) = 62,90, /><0,00001 для АИР).

Методом Тикеу для итогового многофакторного сравнения средних величин были обнаружены различия между экспериментальными группами. В печени старых интактных мышей по сравнению с молодыми интактными значительно увеличивалось содержание мРНК СУР1А2 (в 3,9 раза, /'<0,001) и уменьшалось содержание мРНК АЬЯ (в 2,9 раза, .Р<0,001). В печени молодых животных, подверженных стрессу, по сравнению с молодыми контрольными увеличивалось содержание мРНК СУР1А2 и АЫ1 (в 2,4 раза, /><0,001 и в 1,6 раза, /><0,001 соответственно). В печени старых, подверженных стрессу мышей по сравнению со старыми контрольными животными содержание мРНК статистически значимо увеличивалось в случае АЬЯ (в 1,3 раза, Р<0,05) и АЮЧТ (в 1,6 раза, /><0,001) и не изменялось в случае СУР1А2.

Из результатов нашего эксперимента видно, что имеет место ощутимое влияние стресса на экспрессию исследуемых генов, которое в большей мере проявляется у молодых особей (рис, 9). Обнаружены статистически значимые различия между молодыми и старыми животными внутри контрольной группы для всех исследуемых генов, за исключением СУР1А1. Так содержание мРНК СУР1А2 и АИТ^Т в печени старых мышей выше, чем в печени моле дых особей, в то время как содержание мРНК АЫ1 у старых животных понижено по сравнению с молодыми.

старые-контроль старые-стресс молодые-коктроль молодью-стресс

__ ' - - - — <-СУР1А2

**" ** — З-асИп

Рисунок 8. Электрофореграмма разделения продуктов мультиплексной ОТ-ПЦР в 2%-агарозиом геле.

4,5

со 4 , и

¥ 3,5 £

1 3

» 2,5 ■

1 ). | 1.5 -

1 '

= 0.0.5 ■ О г

П молодые - контроль

□ молодые - стресс

□ старые - контроль ■ старые - стресс

СУР1А2 АНИ А1*МТ

Рисунок 9. Относительное количество мРНК в печени мышей. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение для группы из семи животных. ***Р<0.001, **Р<0.0] в сравнении с молодыми контрольными животными; 001, ~Р<0.05 в сравнении со старыми контрольными животными.

В печени интакгн-ах взрослых мышей мРНК С.УР1Л1 практически не регистрировалась, в то время как содержание мРНК СУР1А2 было достаточно высоким, что подтверждает результаты наших исследований и вполне согласуется с полученными ранее данными (К1тига е1 а1., 19Я6; Тикеу, Nebert, 1984), По нашим оценкам содержание мРНК СУР1А1 у интактных животных было приблизительно на два порядка ниже содержания

мРНК CYP1A2 (данные не представлены). Не обнаружено влияния стресса и старения на содержание мРНК CYP1A1. Напротив, содержание мРНК CYP1A2 было выше у старых интактных животных по сравнению с молодыми и увеличивалось под воздействием стресса у молодых особей. У старых животных содержание мРНК CYP1A2 было почти в 4 раза выше по сравнению с молодыми и практически не изменялось при стрессе.

Ранее было показано, что ЭРОД и ацетанилид-4-гидроксилазная активности, отражающие ферментативную активность CYP1A1 и CYP1A2 соответственно, были одинаковы как у молодых (10-недельного возраста), так и у старых (28-месячного возраста) мышей линии C57BL/6N (Pegram et al., 1995). У мышей линии B10.RIII (Н-2г) 28-месячного возраста содержание мРНК CYP1A1 и CYP1A2 существенно уменьшалось на 65 и 95% соответственно, по сравнению с мышами 4-месячного возраста. Однако у мышей линии C57BL/10 (Н-2Ь) не было обнаружено существенных изменений в конститутивном содержании мРНК CYP1A1 и CYP1A2 (Mote et al., 1990). У женских особей мышиной линии C3B10RF1 было показано уменьшение экспрессии генов jY-сульфотрансферазы и трех генов цитохрома Р450, включая CYP1A2, а также гена 5-трансферазы omega 1 (фермента II фазы) при старении (Cao et al., 2001). Эти данные противоречат результатам нашего исследования, где у старых интактных мышей-самцов линии СЗН/а содержание мРНК CYP1A2 было почти в 4 раза выше по сравнению с молодыми. Повышенное содержание мРНК CYP1A2 у старых животных могло бы быть объяснен гипотезой, что хронические индукции этого фермента ПАУ и многими другими ксенобиотиками на протяжении всей жизни приводят к высокому уровню конститутивной экспрессии гена CYP1A2. Однако это может зависеть и от используемой линии мышей или, что наиболее вероятно, являться сложной функцией от изменений в генной экспрессии, включая несколько ядерных факторов, и гормонального статуса.

В большинстве известных случаев, индукция CYP1A1 и CYP1A2 осуществляется через так называемый Ah-зависимый рецепторный механизм, в котором непосредственное участие принимают транскрипционные факторы Ah рецептор и AKNT. В связи с этим, возникает определенный интерес изучить особенности экспрессии AhR и ARNT при стрессе и старении.

В настоящей работе показано, что содержание мРНК AhR у старых интактных животных почти в три раза ниже по сравнению с молодыми. Эти результаты согласуются с данными по онтогенезу AhR у крыс Sprague-Dawley: концентрация печеночного и легочного Ah рецепторов быстро увеличивалась после рождения и оставалась на максимальном уровне со 2-ого по 21-ый день. После этого концентрация AhR в этих тканях медленно снижалась с возрастом (Gasiewicz et al., 1984). Интересно, что мы не смогли оценить уровень экспрессии ARNT у молодых животных вследствие весьма низкого содержания его мРНК, хотя линия СЗН/а традиционно считается ПАУ-индуцибельной, Кроме того, в других экспериментах мы обнаружили

достаточно высокую экспрессию ARNT у молодых мышей других линий, как ПАУ-индуцибельных, так и ПАУ-неиндуцибельных.

У старых животных, однако, содержание мРНК ARNT было достаточно высоким. Можно предположить, что подобное увеличение экспрессии ARNT при старении могло бы способствовать транслокации Ah рецептора и его аккумуляции в ядре, приводя к транскрипционно активному комплексу AhR-ARNT, способному индуцировать экспрессию генов-мишеней, включая CYP1A2, содержание мРНК которого было значительно увеличенным у старых мышей по сравнению с молодыми.

В некоторых исследований было показано, что как психологический, так и физиологический стресс могут модулировать экспрессию генов ферментов ММС (Konstandi et al., 1998; Konstandi et al., 2004). У грызунов под воздействием различных стрессов было показано уменьшение скорости оксидативного метаболизма ксенобиотиков (Pollack et al., 1991), что могло модифицировать токсичность этих соединений. Различные модели стресса, как было установлено, различаются по своим эффектам на ферменты биотрансформации. Например, при стрессе ограничения пространства (restraint stress) увеличиваются некоторые ферментативные активности в печени мышей и уменьшаются другие, в то время как умеренный непредсказуемый стресс (unpredictable mild stress) действует по другому, иногда даже противоположному пути (Konstandi et al., 1998; Konstandi et al., 2004; Matamoros, Levine, 1996).

До сих пор при изучении животных используются многие стрессовые воздействия, такие как касание или ношение в руках, иммобилизационный стресс, ожидание болевых стимулов и гипотензивное кровотечение. Ханс Селье был первым исследователем, применившим иммобилизационный стресс в экспериментах на крысах (Selye, 1936). Впоследствии данный тип стресса был хорошо изучен в отношении различных аспектов эндокринной и нервной системы. В нашем эксперименте мы использовали в качестве модели модель иммобилизационного стресса, описанную ранее (Kvetnansky, Mikulaj, 1970). Было показано, что воздействие иммобилизационного стресса в течение 30-180 мин приводит к изменениям мРНК уровня ряда генов в тканях различных органов (Pacak, Palkovits, 2001; Kvetnansky et al., 1995). Однако до сих пор немного известно о системе ферментов метаболизма в период поздних стадий развития организма и в условиях стресса.

Можно предположить, что благодаря индукции CYP1A2 у мышей, подвергнутых иммобилизационному стрессу, и повышенному уровню экспрессии гена CYP1A2 у старых животных, в печени может происходить ускоренное разложение какого-либо эндогенного субстрата, и, соответственно, падение его уровня в крови. В этом случае нарушается сигнальная система, функционирующая по принципу обратной связи, что может способствовать усиленной гормональной секреции, и, как следствие, развитию опухолей. Так, например, гипофиз, в который не поступает

тироксин, постоянно выделяет ТТГ (тиреотропный гормон), что вызывает пролиферацию клеток щитовидной железы с последующим развитием опухоли (Ра§т, 1994).

Полученные нами результаты определенным образом согласуются с данными по исследованию активности НАДН: и НАД(Ф)Н: 2,6-дихлорфенолиндофенол редуктаз в микросомах печени взрослых и старых крыс, подвергнутых иммобилизационному стрессу. Было показано, что активность обеих редуктаз резко снижена у старых животных по сравнению со взрослыми. При стрессе у взрослых крыс происходило выраженное уменьшение активности НАДН-редуктазы (Рудько, Давыдов, 2001). Таким образом, нами показано, что содержание мРНК исследуемых генов, за исключением СУР1А1, различается между контрольными группами взрослых и старых животных. Содержание мРНК СУР1А2 и АКЫТ в печени старых мышей заметно выше, чем в печени взрослых особей, в то время как содержание мРНК АЬЯ у старых животных понижено по сравнению со взрослыми.

Кроме того, под влиянием стресса увеличивается экспрессия генов СУР1А2, АИЯ и АШТ, что в большей мере проявляется у взрослых особей. Полученные результаты указывают на существенное ослабление реакции адаптации на стресс у старых животных. Дальнейшее изучение данного вопроса помогло бы объяснить причины изменений функции печени при старении и установить роль стресса в формировании возрастной патологии этого органа.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Инбредные линии мышей, различающиеся по чувствительности к индуцирующему действию ПАУ, являются общепризнанной удобной моделью не только для изучения индуцирующего действия многих химических соединений на живые организмы, но и для изучения механизмов химически индуцированного канцерогенеза. Поэтому исследование различных этапов индукции, начиная от активации генов и заканчивая «созреванием» ферментативной активности, является актуальной проблемой современной биохимии и токсикологии. В настоящей работе было проведено исследование индукции цитохромов Р450 1А1 и 1А2 в печени инбредных линий мышей с различным генотипом АЬ рецептора с одновременным измерением таких параметров, как активность ферментов и экспрессия соответствующих генов, а также уровень экспрессии транскрипционных факторов, вовлеченных в индукцию.

В ходе выполнения работы было показано, что индукция цитохромов Р450 подсемейства 1А зависит не только от генотипа АЬ-рецептора, но и от

таких физиологических факторов, как возраст и стресс. Количество мРНК генов CYP1A1, CYP1A2, AhR и ARNT различается у молодых и старых мышей в норме и под воздействием стресса. Влияние стресса в большей мере проявляется у молодых особей, что, по-видимому, демонстрирует отсутствие или существенное ослабление у старых животных реакции адаптации на стресс.

В печени взрослых мышей, как чувствительных к индуцирующему действию ПАУ (Ah+ генотип), так и нечувствительных линиях (Ah" генотип), регистрировалась существенная конститутивная экспрессии генов CYP1A2, AhR, ARNT при отсутствии экспрессии гена CYP1A1. Последний, будучи конститутивно неактивным, высоко чувствителен к индукции многими планарными ПАУ, как это показано и в нашем случае, когда в эксперимент были взяты линии C57BL, A/Sn и СВА (Ah+ генотипом). Для этих мышей увеличение содержания мРНК CYP1A1 сопровождалось многократным усилением ферментативной активности, специфичной для этой формы цитохрома Р450. Этот факт свидетельствует о классическом варианте индукции, когда увеличению ферментативной активности предшествует усиление транскрипции гена.

Однако для мышей линий SWR, AKR и DBA (Ah" генотип), являющихся нечувствительными к ПАУ-индукции, характерен другой механизм, когда при наличии транскрипта гена CYP1A1 не регистрируется увеличение активности фермента. Этот факт свидетельствует о посттранскрипционной супрессии синтеза белка, о чем также говорят и результаты Вестерн-блот анализа. И если до сих пор отсутствие индуцирующего эффекта ПАУ на монооксигеназы данных линий мышей объясняли дефектом Ah-рецептора, то полученные результаты опровергают это предположение. В таком случае целесообразно говорить о дефекте белкового синтеза у мышей линий SWR, AKR и DBA. Чтобы окончательно выяснить механизм этого явления, необходимо провести детальное исследование синтеза белковой молекулы CYP1A, начиная от полисом и заканчивая фолдингом белка в микросомах.

Проведенные эксперименты показали, что уровень экспрессии генов транскрипционных факторов AhR и ARNT существенно не зависит от генотипа Ah рецептора и индукции ПАУ. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о различных механизмах индукции CYP1A у мышей, генетически различающихся по чувствительности к ПАУ, причем эти различия выявляются для каждой индивидуальной линии. Тогда при исследовании механизмов канцерогенного действия химических соединений, в том числе и ПАУ, целесообразно применять индивидуальный подход для каждой исследуемой линии инбредных мышей.

выводы

1. Уровень ферментативной активности CYP1A1 и CYP1A2 в печени не различается в норме между мышами всех исследуемых линий. При введении как MX, так и ОАТ, активность CYP1A1 и CYP1A2 в 8-27 раз увеличивается у мышей C57BL, СВА и A/Sn, обладающих Ah+ генотипом, и не изменяется у мышей SWR, AKR, DBA, обладающих генотипом Ah", что подтверждает наличие генетических различий в индуцибельности цитохрома Р450 1А у мышей.

2. В печени мышей всех исследуемых линий (с Ah+ или Ah" генотипом) в норме определяется мРНК CYP1A2, но не CYP1A1. Под действием MX и ОАТ содержание мРНК CYP1A2 увеличивается в 2-4 раза у мышей всех линий, за исключением мышей SWR. Содержание мРНК CYP1A1 также увеличивается в 10-200 раз у всех линий мышей, независимо от генотипа Ah рецептора, в том числе у мышей SWR, AKR и DBA, традиционно считающихся нечувствительными к индукции ПАУ.

3. В печени мышей всех исследуемых линий, различающихся по чувствительности к индукции ПАУ, определяется мРНК транскрипционных факторов AhR и ARNT, причем введение MX существенно не влияет на уровень их экспрессии. Вместе с результатами по экспрессии генов CYP1A1 и CYP1A2 это свидетельствует о том, что межлинейные различия у мышей в чувствительности к индукции ПАУ обусловлены не только дефектом Ah-рецептора.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Mikhailova O.N., Filipenko M.L., Timofeeva О.А., Kaledin V.I., Gulyaeva L.F., Lyakhovich V.V. Induction of CYP1A1 and CYP1A2 gene expression by different xenobiotics in liver of C57BL mice. // 13th International Symposium on Microsomes and Drug Oxidations "MD02000". - 2000. -Stresa, Italy.-P. 140.

2. Mikhailova O.N., Filipenko M.L., Timofeeva O.A., Kaledin V.I., Gulyaeva L.F., Lyakhovich V.V. CYP1A1 and CYP1A2 gene expression during induction with different xenobiotics in liver of C57BL mice. // Analytical Cellular Pathology. - 2001. - V. 22. - P. 24-25.

3. Mikhailova O.N., Gulyaeva L.F., Filipenko M.L. Differences in gene expression and regulation of biotransformation enzymes in liver of adult and aged mice during stress. // 18th European Workshop on Drug Metabolism "DMW2002". - 2002. - Valencia, Spain. - P.46.

4. Михайлова O.H., Гуляева Л.Ф., Филипенко M.JI. Возрастные изменения экспрессии ферментов метаболизма гормонов и других эндогенных субстратов в печени и влияние стресса. // "Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии". - Сб. докладов. - 2002. - Новосибирск, Россия. - С. 93.

5. Mikhailova O.N., Gulyaeva L.F., Filipenko M.L. Effect of immobilization stress on drug metabolizing enzymes in liver of adult and aged mice. // Drug Metabolism Reviews. - V. 34 - 2002. - P. 114.

6. Mikhailova O.N., Gulyaeva L.F., Filipenko M.L. Age-dependent alterations in expression of metabolizing enzymes in mouse liver during stress. // 3rd European Congress of Biogerontology. - 2002. - Florence, Italy. - P. 119

7. Zacharova L.Yu., Gulyaeva L.F., Lyakhovich V.V., Mikhailova O.N., Timofeeva O.A., Filipenko M.L., Kaledin V.I. Comparison of cytochrome P450 la gene expression in the liver of aromatic hydrocarbon - responsive and - nonresponsive mice treated with 3-methylcholanthrene or o-aminoazotoluene. // Drug Metabolism Reviews. - 2003. - V. 35. - P. 81.

8. Mikhailova O.N., Gulyaeva L.F., Filipenko M.L. Age-dependent alterations in expression of metabolizing enzymes in the mouse liver during stress. // Endocrine Reguluation. - 2003. - V. 37. - P. 98

9. Zacharova L.Yu., Gulyaeva L.F., Lyakhovich V.V., Mikhailova O.N., Timofeeva O.A., Filipenko M.L., Kaledin V.I. Cytochrome P4501A1 and 1A2 gene expression in the liver of 3-methylcholanthrene- and o-aminoazotoluene treated mice: A comparison between РАН-responsive and PAH-nonresponsive strains. // Toxicological Sciences. - 2003. - V. 73. - P. 108-113.

10. Михайлова O.H., Филипенко M.JI., Тимофеева О.А., Каледин В.И.,. Гуляева Л.Ф, Ляхович В.В. Уровень мРНК и активность цитохромов

Р450 1А в печени мышей линии C57BL при индукции различными ксенобиотиками. // Биомедицинская химия. - 2003. - Т. 49. - С. 388-393.

11. Mikhailova O.N., Gulyaeva L.F., Filipenko M.L., Kaledin V.I. A comparative sequencing of enhancer elements in the mouse CYP1A2 gene among mouse strains. // Drug Metabolism Reviews. - 2004. - V. 36. - P. 72.

12. Mikhailova O.N., Gulyaeva L.F., Filipenko M.L. Gene expression of drug metabolizing enzymes in adult and aged mouse liver: a modulation by immobilization stress. // Toxicology. - 2005. - V. 210. - P. 189-196.

13. Mikhailova O.N., Vasyunina E.A., Ovchinnikova L.P., Gulyaeva L.F., Timofeeva O.A., Filipenko M.L., Kaledin V.I.. O-Aminoazotoluene does induce the enzymes of its own mutagenic activation in mouse liver. //

Toxicology. - 2005. - V. 211. - P. 132-138.

Список используемых сокращений:

МРОД

OAT

ПАУ

RPL30

ЭРОД

XRE

AhR

ARNT

CYP

CYP1A1, CYP1A2 GAPDH

арилгидрокарбоновый рецептор переносчик ЛИЯ в ядро цитохром Р450

цитохром Р450 1А1, цитохром Р450 1А2 глицеральдегид-3 -фосфат дегидрогеназа 3-метилхолантрен метоксирезоруфин-О-деметилаза о-аминоазотолуол

полициклические ароматические углеводороды рибосомный белок ЬЗО этоксирезоруфин-О-деэтилаза ксенобиотик-чувствительный элемент

Соискатель

Подписано к печати 6 марта 2007 г. Тираж 100 экз. Заказ № 442. Отпечатано "Документ-Сервис", 630090, Новосибирск, Институтская 4/1, тел. 335-66-00

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Михайлова, Ольга Николаевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. 1.1. Микросомальная монооксигеназная система в метаболизме экзогенных и ^ ^ эндогенных соединений.

1.1.1. Цитохром Р450 - ключевой компонент микросомальной ^ монооксигеназной системы.

1.1.2. Множественные формы цитохромов Р450.

1.1.3. Феномен индукции цитохромов Р450.

1.1.3.1. Индукторы цитохромов Р450.

1.1.3.2. Молекулярные механизмы индукции цитохромов Р450.

1.2. Характеристика цитохромов Р450 подсемейства 1А.

1.2.1. Субстратная специфичность СУР1А1 и СУР1А2.

1.2.2. Регуляция экспрессии гена цитохрома Р450 1А1.

9 1.2.2.1. Индукция цитохрома Р450 1А1 полициклическими ароматическими ^ углеводородами.

1.2.2.2. Неклассические индукторы СУР1А1.

1.2.2.3. Негативная регуляция СУР1А1.

1.2.3. Регуляция экспрессии гена цитохрома Р450 1А2.

1.2.4. Роль физиологических факторов в индукции СУР 1А.

1.2.4.1. Эндогенные индукторы СУР 1А.

1.2.4.2. Старение и стресс: влияние на регуляцию экспрессии СУР1А.

1.2.5. Межлинейные различия в активности СУР1А у мышей.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование регуляции экспрессии генов цитохрома Р450 подсемейства 1А в печени инбредных линий мышей"

Цитохромы Р450 (CYP) подсемейства 1А окисляют многие канцерогены с образованием активных метаболитов, способных связываться с нуклеофильными сайтами макромолекул клетки, что может приводить к различным токсическим процессам, в том числе канцерогенезу (Pelkonen, Nebert, 1982; Nebert, McKinnon, 1994; Ioannides, Lewis, 2004). В свою очередь, канцерогенные соединения, особенно относящиеся к полициклическим ароматическим углеводородам (ПАУ), вызывают индукцию этих CYP, что сопровождается многократным увеличением, как уровня их мРНК, так и ферментативных активностей (Nebert, 1994; Cheung et al, 1994; Shimada, 2006). Токсический эффект от канцерогена, попавшего в живой организм, определяется количеством его активного метаболита, который может образоваться, и эффективностью его детоксификации, что напрямую зависит от уровня индуцируемой формы цитохрома Р450, активирующей канцероген. У большинства видов млекопитающих подсемейство 1А состоит из двух форм: CYP1A1 и CYP1A2. Цитохром Р450 1А (CYP1A) наиболее изучен у экспериментальных животных: крыс и мышей. CYP1A1 и CYP1A2 осуществляют биоактивацию многих прооксидантов и проканцерогенов: Р450 1А1 - бенз[д]пирена и других ПАУ, Р450 1А2 - ПАУ, ароматических аминов, нитрозоаминов, парацетамола, гетероциклических аминов (Nebert, 1994; Ioannides, Lewis, 2004).

Показано, что для активации генов CYP1A необходимо взаимодействие цитозольного белка - Ah-рецептора с ксенобиотиком, транслокация активированного комплекса в ядро с последующим его взаимодействием с ядерным фактором ARNT и, наконец, взаимодействие вновь образованного комплекса Ah-рецептор - ARNT с цис-активными элементами генов CYP1A (Whitlock, 1999; Nebert et al., 2004; Fujii-Kuriyama, 2005).

В окислительном метаболизме лекарств и других ксенобиотиков, как в популяции людей, так и грызунов, существенную роль играет полиморфизм генов CYP, в том числе CYP1A1 и CYP1A2 (Nebert et al., 2004; Daly, 2003). В последнее время проводятся интенсивные исследования в данной области. Впервые такие генетические различия показаны на инбредных линиях мышей.

Так, введение ПАУ мышам индуцибельных линий, обладающих генотипом AhbAhb или AhbAhd (Ah+ генотип), приводит к значительному увеличению активности CYP1A1 и CYP1A2, тогда как у мышей, обладающих генотипом AhdAhd (Ah- генотип), этого не наблюдается (Nebert, 1989). Инбредные линии мышей широко используются в качестве модели для изучения механизмов активации генов цитохрома Р450, а также процессов химического канцерогенеза. Показано, что такие мыши различаются по чувствительности к канцерогенному действию ПАУ, аминоазобензолов и других соединений (Gonzalez et al., 1993; Nebert et al., 2004; Каледин и др., 1990; Каледин и др., 1999; Захарова и др., 1998; Гуляева и др., 2000). Однако молекулярный механизм таких различий остается до конца не исследованным. Кроме того, выявлен и Ah-независимый механизм индукции цитохрома Р450 1А2 (Chaloupka et al., 1994; Nerurkar et al., 1993). Все это говорит о более сложной картине регуляции экспрессии цитохрома Р450 1А в генетически различающихся линиях мышей, чем существующие на сегодняшний день представления, объясняющие это явление лишь различиями в генотипе Ah рецептора. В связи с этим представляется весьма актуальным исследование индукции цитохромов Р450 1А1 и 1А2 в норме и при воздействии ксенобиотиков в печени мышей, различающихся по чувствительности к индуцирующему действию ПАУ-соединений.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

3. Провести сравнительный анализ регуляторной последовательности гена СУР1А2 (от -4675 до -4204), содержащей энхансерные модули, необходимые для конститутивной экспрессии гена СУР1А2, у инбредных линий мышей;

Таким образом, использование генетической модели мышей с одновременным измерением таких параметров, как активность ферментов и экспрессия соответствующих генов, а также уровень экспрессии транскрипционных факторов, вовлеченных в индукцию, возможно, позволит выстроить последовательность молекулярных событий активации генов цитохрома Р450 1А для мышей с различным генотипом АЬ-рецептора.

Научная новизна работы

Несмотря на то, что исследования механизмов индукции цитохромов Р450 подсемейства 1А и регуляции экспрессии их генов ведутся на протяжении многих лет, вопрос о том, как экспрессируются гены основных транскрипционных факторов АЫ1 и А1ШТ, оставался нерешенным. В данной работе была впервые определена конститутивная экспрессия этих факторов в печени инбредных линий мышей, различающихся по чувствительности к индукции цитохрома Р4501А различными канцерогенными полициклическими углеводородами (ПАУ).

Впервые было проведено комплексное исследование экспрессии транскрипционных факторов АкЯ, АШТ и их генов-мишеней СУР1А1 и СУР1А2 в печени мышей различных инбредных линий при индукции 3-метилхолантреном. Впервые была измерена динамика накопления мРНК исследуемых генов и выявлен максимум ее синтеза в интервале 10-20 часов после воздействия индуктора. Показано, что в печени мышей, как чувствительных к индуцирующему действию ПАУ (АЬ+ генотип), так и дефектных по этому рецептору линиях (АЬ"), определяется существенное количество мРНК CYP1A2, AhR, ARNT. Впервые показано наличие транскрипта гена CYP1A1 при индукции MX и О AT в печени линий SWR, AKR и DBA, ранее считавшихся нечувствительными к ПАУ-индукции линиями. Эти результаты свидетельствуют о более сложном механизме формирования чувствительности к индуцирующему действию ПАУ, чем это считалось ранее.

Наличие при индукции MX увеличения содержания мРНК CYP1A у всех линий, независимо от генотипа Ah рецептора, указывает на то, что межлинейные различия не связаны с дефектом Ah рецептора. Полученные данные позволяют предположить существование транскрипционных механизмов регуляции CYP1A у мышей Ah+ линий и CYP1A2 у линии SWR (Ah'), и посттранскрипционных - у мышей AKR и DBA (Ah").

В работе впервые показано влияние возраста и стресса на экспрессию генов CYP1A1, CYP1A2, AhR и ARNT. Содержание мРНК исследуемых генов, за исключением CYP1A1, различается между группами взрослых и старых животных. Содержание мРНК CYP1A2 и ARNT в печени старых мышей заметно выше, чем в печени взрослых особей, в то время как содержание мРНК AhR у старых животных понижено по сравнению со взрослыми. Кроме того, под влиянием стресса увеличивается экспрессия генов CYP1A2, AhR и ARNT, что в большей мере проявляется у взрослых особей. Полученные результаты указывают на существенное ослабление реакции адаптации на стресс у старых животных.

Научно-практическая значимость работы

Основные положения, выносимые на защиту

4. Последовательность регуляторной области гена CYP1A2 (от -4675 до -4204), содержащая энхансерные модули, необходимые для конститутивной экспрессии гена CYP1A2, у различных инбредных линий мышей является консервативной и не связана с межлинейными различиями в экспрессии CYP1A2 и чувствительностью к гепатоканцерогенному действию ОАТ. 5. Уровень экспрессии исследуемых генов, за исключением CYP1A1, различается у молодых и старых мышей в норме и под воздействием стресса. Содержание мРНК CYP1A2 и ARNT в печени старых мышей заметно выше, чем в печени молодых особей, в то время как содержание мРНК AhR у старых животных понижено по сравнению с молодыми. Под влиянием стресса увеличивается экспрессия генов CYP1A2, AhR и ARNT, что в большей мере проявляется у молодых особей и может свидетельствовать об отсутствии или существенном ослаблении у старых животных реакции адаптации на стресс.

Апробация работы

Результаты работы были представлены и обсуждены на международном симпозиуме «13th International Symposium on Microsomes and Drug Oxidations» Стреза, Италия, 2000; на международном конгрессе «7th ESACP Congress» Кон, Франция, 2001; на международной конференции «18th European Workshop on Drug Metabolism» Валенсия, Испания, 2002; на Второй научной конференции с международным участием "Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии" Новосибирск, Россия, 2002; на международной конференции «1 Ith North American ISSX Meeting» Орландо, США, 2002; на международном конгрессе «3rd European Congress of Biogerontology» Флоренция, Италия, 2002; на международной конференции «8th European ISSX Meeting» Дижон, Франция, 2003; на международном симпозиуме «8th Symposium on Catecholamines and other Neurotransmitters in Stress» Смоленице, Словакия, 2003; на международной конференции «7th International ISSX Meeting» Ванкувер, Канада, 2004.

Публикации. Автор имеет 25 печатных работ, из них 13 - по теме диссертации.

Автор выражает глубокую благодарность научным руководителям -заведующей лабораторией молекулярных механизмов канцерогенеза НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН, профессору, доктору биологических наук, Гуляевой Людмиле Федоровне и заведующему Группой Фармакогеномики Инстититута Химической Биологии и Фундаментальной Медицины СО РАН, кандидату биологических наук, Филипенко Максиму

• Леонидовичу - за руководство работой на всех ее этапах, неоценимую методическую помощь, а также за помощь в написании диссертации.

Автор благодарит директора НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН, академика РАМН, Ляховича Вячеслава Валентиновича за постоянную поддержку и консультации.

Автор выражает особую признательность Каледину Василию Ивановичу (Институт Цитологии и Генетики СО РАН), в тесном сотрудничестве с которым были выполнены большинство исследований.

Автор благодарит заведующего лабораторией генно-инженерных методов исследования НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН Коваленко Сергея Петровича за внимательное прочтение диссертации и ценные замечания.

Автор благодарит весь коллектив НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН, а также всех сотрудников Группы Фармакогеномики Инстититута Химической Биологии и Фундаментальной

1 Медицины СО РАН, за прекрасную творческую и дружескую атмосферу.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Михайлова, Ольга Николаевна

выводы

1. Уровень ферментативной активности CYP1A1 и CYP1A2 в печени не различается в норме между мышами всех исследуемых линий. При введении как MX, так и ОАТ, активность CYP1A1 и CYP1A2 в 8-27 раз увеличивается у мышей C57BL, СБА и A/Sn, обладающих Ah+генотипом, и не изменяется у мышей SWR, AKR, DBA, обладающих генотипом Ah", что подтверждает наличие генетических различий в индуцибельности цитохрома Р450 1А у мышей.

2. В печени мышей всех исследуемых линий (с Ah+ или Ah" генотипом) в норме определяется мРНК CYPIA2, но не CYP1Ä1. Под действием MX и ОАТ содержание мРНК CYP1A2 увеличивается в 2-4 раза у мышей всех линий, за исключением мышей SWR. Содержание мРНК СУР 1 AI также увеличивается в 10-200 раз у всех линий мышей, независимо от генотипа Ah рецептора, в том числе у мышей SWR, AKR и DBA, традиционно считающихся нечувствительными к индукции ПАУ.

5. Уровень экспрессии исследуемых генов, за исключением CYP1A1, различается у молодых и старых мышей в норме и под воздействием стресса. Содержание мРНК CYP1A2 и ARNT в печени старых мышей заметно выше, чем в печени молодых особей, в то время как содержание мРНК АЫ1 у старых животных понижено по сравнению с молодыми. Под влиянием стресса увеличивается экспрессия генов СТР1А2, А1гЯ и АШТ, что в большей мере проявляется у молодых особей и может свидетельствовать об отсутствии или существенном ослаблении у старых животных реакции адаптации на стресс.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Инбредные линии мышей, различающиеся по чувствительности к индуцирующему действию ПАУ, являются общепризнанной удобной моделью не только для изучения индуцирующего действия многих химических соединений на живые организмы, но и для изучения механизмов химически индуцированного канцерогенеза. Поэтому исследование различных этапов индукции, начиная от активации генов и заканчивая «созреванием» ферментативной активности, является актуальной проблемой современной биохимии и токсикологии. В настоящей работе было проведено исследование индукции цитохромов Р450 1А1 и 1А2 в печени инбредных линий мышей с различным генотипом АИ рецептора с одновременным измерением таких параметров, как активность ферментов и экспрессия соответствующих генов, а таюке уровень экспрессии транскрипционных факторов, вовлеченных в индукцию.

В ходе выполнения работы было показано, что индукция цитохромов Р450 подсемейства 1А зависит не только от генотипа АЬ-рецептора, но и от таких физиологических факторов, как возраст и стресс. Содержание мРНК генов СУР1А1, СУР1А2, АНЯ. и АШТ различается у молодых и старых мышей в норме и под воздействием стресса. Влияние стресса в большей мере проявляется у молодых особей, что, по-видимому, демонстрирует отсутствие или существенное ослабление у старых животных реакции адаптации на стресс.

В печени взрослых мышей, как чувствительных к индуцирующему действию ПАУ (АЬ+ генотип), так и нечувствительных линиях (АЬ" генотип), регистрировалась существенная конститутивная экспрессии генов СУР1А2, АкЯ, АШТ при отсутствии экспрессии гена СУР1А1. Последний, будучи конститутивно неактивным, высоко чувствителен к индукции многими планарными ПАУ, как это показано и в нашем случае, когда в эксперимент были взяты линии С57ВЬ, А/Бп и СВА (АЬ+ генотипом). Для этих мышей увеличение содержания мРНК СУР1А1 сопровождалось многократным усилением ферментативной активности, специфичной для этой формы цитохрома Р450. Этот факт свидетельствует о классическом варианте индукции, когда увеличению ферментативной активности предшествует усиление транскрипции гена.

Проведенные эксперименты показали, что уровень экспрессии генов транскрипционных факторов AHR и ARNT существенно не зависит от генотипа Ah рецептора и индукции ПАУ. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о различных механизмах индукции CYP1A у мышей, генетически различающихся по чувствительности к ПАУ, причем эти различия выявляются для каждой индивидуальной линии. Тогда при исследовании механизмов канцерогенного действия химических соединений, в том числе и ПАУ, целесообразно применять индивидуальный подход для каждой исследуемой линии инбредных мышей.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Михайлова, Ольга Николаевна, Новосибирск

1. Гришанова А. Ю., Зуева Т.В. Билирубин как эндогенный посредник в активации экспрессии СУР1А1 под действием ультразвука. // Вопр. Мед. Хим. 2000. - Т. 46. - С. 117-126.

2. Гуляева Л. Ф., Гришанова А. Ю., Громова О. А., Слынько Н. Н., Вавилин В. А., Ляхович В. В. Микросомная монооксигеназная система живых организмов в биомониторинге окружающей среды. Новосибирск: Наука. Сиб. отделение, 1994. -100 с.

3. Гуляева Л. Ф., Ляхович В. В., Каледин В. И. Активность цитохрома Р450-1а в печени мышей линий СВА и СС57ВК при долговременной многократной индукции о-аминоазотолуолом. // Бюлл. Эксп. Биол. Мед. -2000.-Т. 129.-С. 280-282.

4. Ляхович В. В., Цырлов И. Б. Структурные аспекты биохимии монооксигеназ. Новосибирск: Наука. Сиб. отделение, 1978.-238 с.

5. Каледин В. И., Серова И. А., Семенова Л. А. Неодинаковая предрасположенность к развитию спонтанных и индуцированных опухолей у мышей разных линий и их гибридов. // Эксперим. Онкология. 1990.-Т. 12.-С. 28-30.

6. Каледин В. И., Захарова Н. П. Исследования по индукции и метастазированию злокачественных опухолей у экспериментальных животных // под ред. Грунтенко Е.В. Новосибирск: ИЦиГ, 1984. С. 146185.

7. Ю.Курченко В. П., Усанов С. А., Метелица Д. И. Иммунохимическое изучение каталитической активности цитохрома P450LM2 из микросом печени кролика. // Биохимия. 1982. - Т. 47. - С. 1431-1436.

8. Метелица Д.И. Активация кислорода ферментными системами Р450. Москва: Наука, 1982. 255 с.

9. Мишин В. М., Ляхович В. В. Множественные формы цитохрома Р450. -Новосибирск: Наука. Сиб. отделение, 1985. 181 с.

10. Рудько Н. П., Давыдов В. В. Изучение особенностей регуляции активности редуктаз микросом печени взрослых и старых крыс при стрессе. // Вопр. Мед. Хим. 2001. - 47 - С. 599-604.

11. Adams N.H., Levi P.E., Hodgson E. Regulation of cytochrome P-450 isozymes by methylenedioxyphenyl compounds. // Chem. Biol. Interact. 1993. - V. 86. -P.-255-274.

12. Aljanabi S.M., Martinez I. Universal and rapid salt-extraction of high quality genomic DNA for PCR-based techniques. // Nucleic Acids Res. 1997. - V. 25.-P. 4692-4693.

13. Anantharaju A., Feller A., Chedid A. Aging Liver, a review. // Gerontology. -2002.-V. 48.-P. 343-353.

14. Aoyama Т., Korzekwa K., Nagata K., Gillette J., Gelboin H.V., Gonzalez F.J. Estradiol metabolism by complementary deoxyribonucleic-acid expressed human cytochrome P450. // Endocrinology. 1990. - V. 126. - P. 3101-3106.

15. Astrom A., DePerre J.W. Rat liver microsomes cytochrome P450, purification, characterization, multiplicity and induction. // Biochem. Biophys. Acta. 1986. -V. 853.-P. 1-27.

16. Backlund M., Ingelman-Sundberg M. Different structural requirements of the ligand binding domain of the aryl hydrocarbon receptor for high- and low-affinity ligand binding and receptor activation. // Mol. Pharmacol. 2004. - V. 65.-P. 416-425.

17. Backlund M., Ingelman-Sundberg M. Regulation of aryl hydrocarbon receptor signal transduction by protein tyrosine kinases. // Cell Signal. 2005. - V. 17. -P. 39-48.

18. Bartsch H., Nair U., Risch A., Rojas M., Wikman H., Alexandrov K. Genetic Polymorphism of CYP Genes, Alone or in Combination, as a Risk Modifier of Tobacco-related Cancers. // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 2000. - V. 9.-P. 3-28.

19. Bhat R., Weaver J.A., Sterling K.M., Bresnick E. Nuclear transcription factor Oct-1 binds to the 5-upstream region of CYP1A1 and negatively regulates its expression. // Int. J. Biochem. Cell. Biol. 1996. - V. 28. - P. 217-227.

20. Burke M.D., Mayer R.T. Ethoxyresorufin: direct fluorimetric assay of a microsomal in ReaO-dealkylation which is preferentially inducible by 3-methylcholanthrene. // Drug Metab. Dispos. 1974. -V. 2. - P. 583-588.

21. Cao S.X., Dhahbi J.M., Mote P.L., Spindler S. R. Genomic profiling of short-and long-term caloric restriction effects in the liver of aging mice. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2001. V. 98. - P. 10630-10635.

22. Carrier F., Owens R.A., Nebert D.W., Puga A. Dioxin-dependent activation of murine Cypla-1 gene transcription requires protein kinase C-dependent phosphorylation. // Mol. Cell Biol. 1992. - V. 12. - P. 1856-1863.

23. Carver L.A., Jackiw V., Bradfield C.A. The 90-kDa heat shock protein is essential for Ah receptor signaling in a yeast expression system. // J. Biol. Chem. 1994. - V. 269. - P. 30109-30112.

24. Carver L.A., Bradfield C.A. Ligand-dependent interaction of the aryl hydrocarbon receptor with a novel immunophilin homolog in vivo. // J. Biol. Chem. 1997. - V. 272. - P. 11452-11456.

25. Casley W.L., Menzies J.A., Whitehouse L.W., Moon T.W. Detection of Quantitative Trait Loci Affecting Caffeine Metabolism by Interval Mapping in a Genome-Wide Scan of C3H/HeJ x APN F2 Mice. // Drug Metab. Dispos. -1999.-V. 27.-P. 1375-1380.

26. Catteau A., Bechtel Y.C., Poisson N., Bechtel P.R., Bonaiti-Pellie C. A population and family study of CYP1A2 using caffeine urinary metabolites. // Eur. J. Clin. Pharmacol. 1995. -V. 47. - P. 423-430.

27. Chang C.-Y., Puga A. Constitutive activation of the aromatic hydrocarbon receptor. // Mol. Cell. Biol. -1998. V.18. - P. 525 - 535.

28. Chattopadhyay N., Kher R., Godbole M. Inexpensive SDS/phenol method for RNA extraction from tissues. // Biotechniques. 1993. - V. 15. - P. 24-26.

29. Chawla A., Repa J.J., Evans R.M., Mangelsdorf D.J. Nuclear resceptors and Lipid physiology: opening the X-files. // Science. 2001. - V. 294. - P. 18661870.

30. Chen Y.H., Tukey R.H. Protein kinase C modulates regulation of the CYP1A1 gene by the aryl hydrocarbon receptor. // J. Biol. Chem. 1996. - V. 271. - P. 26261-26266.

31. Cheung Y.L., Puddicombe S.M., Gray T.J., Ioannides C. Mutagenicity and CYP1A induction by azobenzenes correlates with their carcinogenicity. // Carcinogenesis. 1994. -V. 15. - P. 1257-1263.

32. Cho I J., Kim S.G. Oltipraz inhibits 3-methylcholanthrene induction of CYP1A1 by CCAAT/enhancer-binding protein activation. // J. Biol. Chem. -2003. V. 278. -P. 44103-44112.

33. Christiansen L., Bygum A., Jensen A., Thomsen K., Brandrup F., Horder M., Petersen N.E. Association between CYP1A2 polymorphism and susceptibility to porphyria cutanea tarda. // Hum. Genet. 2000. - V. 107. - P. 612-614.

34. Christou M., Wilson N.M., Jefcoate C.R. Expression and function of three cytochrome P-450 isozymes in rat extrahepatic tissues. // Arch. Biochem. Biophys. 1987. - Y. 258. - P. 519-534.

35. Chung I., Bresnick, E. Identification of positive and negative regulatory elements of the human cytochrome P4501A2 (CYP1A2) gene. // Arch. Biochem. Biophys. 1997. - V. 338. - P. 220-226.

36. Cribb A.E., Delaporte E., Kim S.G., Novak R.F., Renton K.W. Regulation of cytochrome P-4501A and cytochrome P-4502E induction in the rat during the production of interferon alpha/beta. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1994. - V. 268.-P. 487-494.

37. Daly A.K., Cholerton S., Armstrong M., Idle J.R. Genotyping for polymorphisms in xenobiotic metabolism as a predictor of diseaser susceptibility. // Environ. Health Perspect. 1994. - V. 102. - P. 55-61.

38. Daly A.K.: Pharmacogenetics of the major polymorphic metabolizing enzymes. // Fundam. Clin. Pharmacol. 2003. - V. 17. -P. 27-41.

39. Daujat M., Peryt B., Lesca P., Fourtanier G., Domergue J., Maurel P. Omeprazole, an inducer of human CYP1A1 and 1A2, is not a ligand of Ah receptor. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992. - V. 188. - P. 820-825.

40. Davarinos N.A., Pollenz R.S. Aryl hydrocarbon receptor imported into the nucleus following ligand binding is rapidly degraded via the cytosplasmic

41. H proteasome following nuclear export. // J. Biol. Chem. 1999. - V. 274. - P.28708-28715.

42. Delaporte E., Renton K.W. Cytochrome P4501A1 and cytochrome P4501A2 are downregulated at both transcriptional and post-transcriptional levels by conditions resulting in interferon-alpha/beta induction. // Life Sci. 1997. - V. 60.-P. 787-796.

43. Delescluse C., Lemaire G., de Sousa G., Rahmani R. Is CYP1A1 inductionalways related to AHR signaling pathway? // Toxicology. 2000. - V. 153. - P. 73-82.

44. Denison M.S., Health-Pagliuso S. The Ah receptor: a regulator of the biochemical and toxicological actions of structurally diverse chemicals. // Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1998. - V. 61. - P. 557-568.

45. Denison M.S., Whitlock J.P.Jr. Xenobiotic-inducible transcription of cytochrome P450 genes. // J. Biol. Chem. 1995. - V. 270. - P. 18175-18178.

46. Denison M.S., Nagy S.R.D. Activation of the aryl hydrocarbon receptor bystructurally diverse exogenous and endogenous chemicals. // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2003 - V. 43. - P. 309-334.

47. Dey A., Nebert D.W. Markedly increased constitutive CYP1A1 mRNA levels in the fertilized ovum of the mouse. // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1998.-V. 250.-P. 657-661.

48. Dogra S.C., Whitelaw M.L., May B.K. Transcriptional activation of cytochrome P450 genes by different classes of chemical inducers. // Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 1998. - V. 25. - P. 1-9.

49. Doostzadeh J, Urban P, Pompon P, Morfin R. Pregnenolone-7 beta-hydroxylating activities of yeast-expressed mouse cytochrome P450-1A1 and mouse-tissue microsomes. // Eur. J. Biochem. 1996. - V. 242. - P. 641-647.

50. Eaton D.L., Gallagher E.P., Bammler T.K., Kunze K.L. Role of cytochrome P4501A2 in chemical carcinogenesis: implications for human variability in expression and enzyme activity. // Pharmacogenetics. 1995. - V. 5. - P. 259274.

51. Estabrook R.W., Hildebrandt A., Ullrich V. Oxygen interaction with reduced cytochrome P-450. // Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem. 1968. - V. 349. - P. 1605-1608.

52. Fagin J. Molecular pathogenesis of human thyroid neoplasms. //Thyroid Today. -1994.-Y. 17.-P. 1-7.

53. Fontaine F., Delescluse C., de Sousa G., Lesca P., Rahmani R. Cytochrome 1A1 induction by primaquine in human hepatocytes and HepG2 cell: absense of binding to the aryl hydrocarbon receptor. // Biochem. Pharmacol. 1999. - V. 57.-P. 255-262.

54. Frolkis V.V. Stress-age syndrome. // Mech. Ageing Dev. 1993. - V. 69. - P. 93-107.

55. Fujii-Kuriyama Y., Mimura J. Molecular mechanisms of AhR functions in the regulation of cytochrome P450 gene. // Biochem. Biophys. Res. Commun. -2005.-V. 338.-P. 311-317.

56. Garfinkel D. Studies on pig liver microsomes. I. Enzymic and pigment composition of different microsomal fractions. // Arch. Biochem. Biophys. -1958.-V. 77.-P. 493-509.

57. Gasiewicz T.A., Ness W.C., Rucci G. Ontogeny of the cytosolic receptor for 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in rat liver, lung, and thymus. // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1984. -V. 118. P. 183-190.

58. Gibson G.G. The cytochrome P450 IV family: constitutive and inducible haemoproteins. // Biochem. Soc. Transact. 1990. - V. 18. - P. 14-15.

59. Gonzalez F.J. The molecular biology of cytochrome P450s. // Pharmacol. Rev. 1988. -V. 40.-P. 243-285.

60. Gonzalez F.J., Tukey R.H., Nebert D.W. Structural gene products of the Ah locus. Transcriptional regulation of cytochrome P1-450 and P3-450 mRNA levels by 3-methylcholanthrene. // Mol. Pharmacol. 1984. - V. 26. - P. 117— 121.

61. Gonzalez F.J., Liu S.Y., Yano M. Regulation of cytochrome P450 genes: molecular mechanisms. // Pharmacogenetics. 1993. - V. 3. - P. 51-57.

62. Gonzalez F.J., Lee Y.H. Constitutive expression of hepatic cytochrome P450 genes. // FASEB J. 1996. - V. 10. -P. 1112-1117.

63. Gonzalez F.J., Nebert D.W. Evolution of the P450 gene superfamily: animal-plant 'warfare1, molecular drive and human genetic differences in drug$ oxidation. // Trends Genet. 1990. - V. 6. - P. 182-186.

64. Gradin K., Whitelaw M.L., Toftgard R., Poellinger L., Berghard A. A tyrosin kinase-dependent pathway regulates ligand-dependent activation of the dioxin receptor in human keratinocytes. // J. Biol. Chem. 1994. - V. 269. - P. 2380023807.

65. Guengerich F.P., Dannan G.A., Wright S.T., Martin M.V., Kaminsky L.S.

66. Purification and characterization of microsomal cytochrome P-450s. // Xenobiotica. 1982. - V. 12. - P. 701-716.

67. Guengerich F.P. Cytochrome P450: what have we learned and what are the future issues? // Drug. Metab. Rev. 2004. - V. 36. - P. 159-197.

68. Guengerich F.P., Shimada T. Oxidation of toxic and carcinogenic chemicals byhuman cytochrome P450. // Chem. Res. Toxicol. 1991. - V. 4. - P. 391-407.

69. Hahn M.E., Poland A., Glover E., Stegeman J.J. Photoaffinity labeling of the Ah receptor: phylogenetic survey of diverse vertebrate and invertebrate species. // Arch. Biochem. Biophys. -1994. -V. 310. -P. 218-228.

70. Methoxyresorufin: an inappropriate substrate for CYP1A2 in the mouse. // Biochem. Pharmacol. 1998. -V. 56. - P. 1657-1660.

71. Handschin C., Meyer U.A. Induction of Drug Metabolism: The role of nuclear receptors. // Phamacol. Rev. 2003. - V. 55. - P. 649-673.

72. Handschin C., Meyer U.A. Regulatory network of lipid-sensing nuclear receptors: roles for CAR, PXR, LXR, and FXR. // Arch. Biochem. Biophys. -2005.-V. 433.-P. 387-396.

73. Hayaishi O., Katagiri M., Rothberg S. Studies on oxygenases; pyrocatechase. // J Biol. Chem. 1957. - V. 229. - P. 905-920.

74. Heath-Pagliuso S., Rogers W. J., Tullis K., Seidel S.D., Cenijn P.H., Brouwer

75. A., Denison M.S. Activation of the Ah receptor by tryptophan and tryptophan metabolites. // Biochemistry. 1998. - V. 37. - P. 11508-11515.

76. Hedlund E., Gustafsson J.-A., Warner M. Cytochrome P450 in the brain; a review // Current Drug Metabolism. 2001. - V. 2. - P. 245-263.

77. Heilmann L.J., Sheen Y.-Y., Bigelow S.W., Nebert D.W. The trout P4501A1 gene: cDNA and deduced protein sequence, expression in liver, and evolutionary significance. // DNA. 1988. - V. 7. - P. 853-857.

78. Hiang J.Y.L. Interaction of purified microsomal cytochrome P450 withcytochrome b5 // Arch. Biochem. Biophys. 1981. - V. 211. - P. 662-673.

79. Hines R.N., Levy J.B., Conrad R.D., Iverson P.L., Shen P.L., Renil A.M., Bresnick E. Gene structure and nucleotide sequence for rat cytochrome P-450c. // Arch. Biochem. Biophys. 1985. - V. 237. - P. 465-476.

80. Honkakoski P., Negishi M. Regulation of cytochrome P450 (CYP) genes by nuclear receptors. // Biochem. J. 2000. - V. 347. - P. 321-337.

81. Imai Y, Sato R. A gel-electrophoretically homogeneous preparation of cytochrome P-450 from liver microsomes of phenobarbital-pretreated rabbits. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1974. - V. 60. - P. 8-14.

82. Ishii Y, Mukoyama H, Hata S. Metabolism of finasteride in rat hepaticmicrosomes: age and sex differences and effects of P450 inducers. // Xenobiotica. 1994. - V. 24. - P. 863-872.

83. Ioannides C. Effect of diet and nutrition on the expression of cytochromes P450. // Xenobiotica. 1999. - V. 29. - P. 109-154.

84. Ioannides C., Parke D.V. Induction of cytochrome P4501 as an indicator of potential chemical carcinogenesis. // Drug Metab. Rev. 1993. - V. 25. - P. 485-501.

85. Ioannides C., Lewis D.F. Cytochromes P450 in the bioactivation ofchemicals. // Curr. Top Med. Chem. 2004. - V. 4. - P. 1767-1788.

86. Jaiswal A.K., Nebert D.W., Gonzalez F.J. Human P3-450: cDNA and complete amino acid sequence. // Nucl. Acids Res. 1986. - V. 14. - P. 67736774.

87. Jaiswal A.K., Gonzalez F.J., Nebert D.W. Human dioxin-inducible cytochrome Pj-450: complementary DNA and amino acid sequence. // Science. 1985.-V. 228.-P. 80-83.

88. Jana N.R., Sarkar S., Ishizuka M., Yonemoto J., Tohyama C., Sone H.

89. Jin B., Ryu D.Y. Regulation of CYP1A2 by histone deacetylase inhibitors in mouse hepatocytes. // J. Biochem. Mol. Toxicol. 2004. - V. 18. -P. 131-132.

90. Jones K.W., Whitlock J.P.Jr. Functional analysis of the transcriptional promoter for the CYP1A1 gene. // Mol. Cell Biol. 1990. - V. 10. - P. 50985105.

91. Kadlubar F.F. Biochemical individuality and its implications for drug and carcinogen metabolism: recent insights from acetyltransferase and cytochrome P4501A2 phenotyping and genotyping in humans. // Drug Metab. Rev.-1994.-V. 26.-P. 37-46.

92. Kapitulnik J., Gonzalez F.J. Marked endogenous activation of the CYP1A1 and CYP1A2 genes in the congenitally jaundiced Gunn rats. // Mol. Pharmacol. 1993. - V. 43. - P. 722-725.

93. Kapitulnik J., Hardwick J.P., Ostrow J.D., Webster C.C., Park S.S., Gelboin H.V. Increase in a specific cytochrome P-450 isoenzyme in liver of congenitally jaundiced Gunn rats. // Biochem. J. 1987. - V. 242. - P. 297300.

94. Karchner S.I., Franks D.G., Powell W.H., Hahn M.E. Regulatory interactions among three members of the vertebrate aryl hydrocarbon receptor family: AHR repressor, AHR1, and AHR2. // J. Biol. Chem. 2002. - V. 277. -P. 6949-6959.

95. Kastner P., Mark M., Chambon P. Nonsteroid nuclear reseptors: What are genetic studies telling us about their role in real life? // Cell. 1995. - V. 83.-P. 859-869.

96. Kimura S., Gonzales F.G., Nebert D.W. The murine Ah locus: comparison of the complete cytochrome Pi 450 and P3 - 450 cDNA nucleotide and amino acid sequences. // J. Biol. Chem. - 1984. - V. 259. - P. 10705-10713.

97. Kimura S., Donovan J.C., Nebert D.W. Expression of the mouse Pi 450 gene during differentiation without foreign chemical stimulation. // J. Exp. Pathology. 1987. - V. 3. - P. 61-74.

98. Kliewer S.A., Moore J.T., Wade L., Staudinger J.L., Watson M.A., Jones

99. S.A., McKee D.D., Oliver B.B., Willson T.M., Zetterstrom R.H., Perlmann T., Lehmann J.M. An orphan nuclear receptor activated by pregnanes defines a novel steroid signaling pathway. // Cell. 1998. - V. 92. - P. 73-82.

100. Klingenberg M. Pigments of rat liver microsomes //Arch. Biochem. Biophys. 1958. - V. 75. - P. 376-387.

101. Konstandi M., Marselos M., Radon-Camus A.M., Johnson E., Lang M.A. The role of stress in the regulation of drug metabolizing enzymes in mice. // Eur. J. Drug Metab. Pharmacokinet. -1998. V. 23. - P. 483-490.

102. Konstandi M., Johnson E.O., Marselos M., Kostakis D., Fotopopoulos A., Lang M.A. Stress-mediated modulation of B(alpha)P-induced hepatic

103. CYP1A1: role of catecholamines. // Chem. Biol. Interact. 2004. -V. 147. - P.65.77.

104. Kozak K.R., Abbott B., Hankinson O. ARNT-deficient mice and placental differentiation. // Dev Biol. 1997. - V. 191. - P. 297-305.

105. Krusekopf S., Roots I., Hildebrandt A.G., Kleeberg U. Time-dependenttranscriptional induction of CYP1A1, CYP1A2 and CYP1B1 mRNAs by H+/K+ -ATPase inhibitors and other xenobiotics. // Xenobiotica. 2003. - V. 33.-P. 107-118.

106. Kuwahara S., Harada N., Yoshioka H., Miyata T., Omura T. Purification and characterization of four forms of cytochrome P-450 from liver microsomes of phenobarbital-treated and 3-methylcholanthrene-treated rats. // J. Biochem.1984.-V. 95.-P. 703-714.

107. Kvetnansky R., Mikulaj L. Adrenal and urinary catecholamines in rats during adaptation to repeated immobilization stress. // Endocrinology. 1970. -V. 87.-P. 738-743.

108. Lee S.H., Wang X., DeJong J. Functional interaction between atypical NF-kB site from the rat CYP 2B1 promotor and the transcriptional repressorg RBP-Jk/CBFI. // Nucl. Acids Res. 2000. - V. 28. - P. 2091-2098.

109. Long W.P., Pray-Grant M., Tsai J.C., Perdew G.H. Protein kinase C activity is required for aryl hydrocarbon receptor pathway-mediated signal transduction. // Mol. Pharmacol. -1998. V. 53. - P. 691-700.

110. Lowry O.U., Rosebrough N.I., Farr A.L., Randall R.I. Proteinmeasurements with the Folin reagent. // J. Biol. Chem. 1951. - V. 153. - P. 265-275.

111. Lusska A, Shen E, Whitlock JPJr. Protein-DNA interactions at a dioxin-responsive enhancer. Analysis of six bona fide DNA-binding sites for the liganded Ah receptor. // J. Biol. Chem. 1993. - V. 268. - P. 6575-6580.

112. Ma Q. Induction of CYP1A1. The AhR/DRE paradigm: transcription, receptor regulation and expanding biological roles. // Current Drug. Met.2001.-V.2.-P. 149-164.

113. Mason M.S., Fowlks W.L., Peterson E. Oxygen transfer and electron transport by the phenolase complex. // J. Amer. Chem. Soc. 1955. - V. 77. -P. 2914-2915.

114. Masters B.S.S., Williams C.H., Kamin H. The preparation and properties of microsomal TPNH-cytochtome c reductase from pig liver // Methods Enzymol. 1967. - V. 10. - P. 565-573.

115. Masters B.S.S., Okita R.T. The histore, properties and function of NADPH-cytochrome P450 reductase // Pharmac. Ther. 1979. - V. 9. - P. 227-244.

116. Matamoros R.A., Levine B.S. Stress response and drug metabolism in mice. // Fundam. Appl. Toxicol. 1996. - V. 30. - P. 255-263.

117. McKinnon R.A. Cytochrome P450. Multiplicity and Function. // Australian J. Hospital Pharmacy. 2000. - V. 30. - P. 54-56.

118. Monk S.A., Denison M.S., Rice R.H. Transient expression of CYP1A1 in rat epithelial cells cultured in suspension. // Arch Biochem Biophys. 2001. -V. 393.-P. 154-162.

119. Moreno F., Minzlaff M., Hauptmeier K.H., Teschke R. Alterations of hepatic alcohol metabolizing enzyme activities due to thyroid hormones. // Adv. Exp. Med. Biol.- 1980.-V. 132.-P. 109-115.

120. Morgan E.T. Regulation of cytochromes P450 during inflammation and infection. // Drug Metab. Rev. 1997. - V. 29. - P. 1129-1188.

121. Morrow D., Qin C., Smith R. 3rd, Safe S. Aryl hydrocarbon receptor-mediated inhibition of LNCaP prostate cancer cell growth and hormone-induced transactivation. // J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 2004. - V. 88. - P. 27-36.

122. Mote P.L., Grizzle J.M., Walford R.L., Spindler S.R. Age-related down regulation of hepatic cytochrome PI-450, P3-450, catalase and CuZn-superoxide dismutase RNA. // Mech. Ageing. Dev. 1990. - V. 53. - P. 101110.

123. Mugford C.A., Kedderis G.L. Sex-dependent metabolism of xenobiotics. // Drug Metab. Rev. 1998. - V. 30. - P. 441-498.

124. Murray G.I., Foster C.O., Barnes T.S., Weaver RJ, Ewen S.W., Melvin W.T., Burke M.D. Expression of cytochrome P4501A in breast cancer // Br. J.$ Cancer.-1991.-V. 63.-P. 1021-1023.

125. Nebert D.W. The Ah locus: Genetic differences in toxicity, cancer, mutation, and birth defects. // Crit. Rev. Toxicol. 1989. - V. 20. - P. 153-174.

126. Nebert D.W. Drug-metabolizing enzymes in ligand-modulated transcription. // Biochem. Pharmacol. 1994. - V. 47. - P. 25-37.

127. Nebert D.W., Gonzalez F.J. P450 genes: structure, evolution and regulation. // Annu. Rev.Biochem. 1987. - V. 56. - P. 945-993.

128. Nebert D.W., Gonzalez F.J., Coon M.J., Estabrook R.W., Feyereisen R., * Guengerich F.P., Gunsalus I.C., Jonson E.F., Loper J.C., Nelson D.R., Sato R.,

129. Waterman M.R, Waxman D.J. The P450 Superfamily: Update on New Sequences Characterized, Gene Mapping, and Recommended Nomenclature. // DNA and Cell. Biol. 1991. -V. 10.-P. 1-14.

130. Nebert D.W., Roe A.L., Dieter M.Z., Solis W.A., Yang Y.f Dalton T.P. Role of the aromatic hydrocarbon receptor and Ah. gene battery in the oxidative stress response, cell cycle control, and apoptosis. // Biochem.

131. Pharmacol. -2000.-V. 59.-P. 65-85.

132. Nebert D.W., McKinnon R.A. Cytochrome P450: evolution and functional diversity. // Prog. Liver Dis. 1994. - V. 12. - P. 63-97.

133. Nebert D.W., Dalton T.P., Okey A.B., Gonzalez F.J. Role of aryl hydrocarbon receptor-mediated induction of the CYP1 enzymes in environmental toxicity and cancer. // J. Biol. Chem. 2004. - V. 279. - P. 23847-23850.

134. Nebert D.W., Jensen N.M. The Ah locus: genetic regulation of the ' metabolism of carcinogens, drugs, and other environmental chemicals bycytochrome P-450-mediated monooxygenases. // CRC Crit. Rev. Biochem. -1979.-V. 6.-P. 401-437.

135. Okamoto T., Mitsuhashi M., Fujita I., Sindhu R.K., Kikkawa Y. Induction of cytochrome P450 1A1 and 1A2 by hyperoxia. // Biochem.$ Biophys. Res. Commun. 1993. - V. 197. - P. 878-885.

136. Omura T., Sato R. The carbon monooxide binding pigment of liver microsomes. Solubilization, purification and properties. // J. Biol. Chem. -1964.-V. 239.-P. 2370-2385.

137. Pacak K., Palkovits M. Stressor specificity of central neuroendocrine responses: implications for stress-related disorders. // Endocr. Rev. 2001. - V. 22.-P. 502-548.

138. Parkinson A. Biotransformation of xenobiotics. In: Casaret & Doll's ft toxicology: the basic science of poisons // ed. by Klaassen C. 5.ed. New York:

139. Mc Graw Hill. 1996. - P. 113-186.

140. Pascussi J.M., Ger bal-Chaloin S., Drocourt L., Maurel P., Vilarem M.J. 1 The expression of CYP2B6, CYP2C9 and CYP3A4 genes: a tangle of networksof nuclear and steroid receptors. // Biochim. Biophys. Acta. 2003. - V. 1619. -P. 243-245.

141. Paton T.E., Renton K.W. Cytokine-mediated down-regulation of CYP1A1 in Hepal cells. // Biochem. Pharmacol. 1998. - V. 55. - P. 17911796.

142. Pegram R.A., Diliberto J.J., Moore T.C., Gao P., Bimbaum L.S. 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) distribution and cytochrome P4501Ainduction in young adult and senescent male mice. // Toxicol. Lett. 1995. - V.76.-P. 119-126.

143. Pelkonen O., Nebert D.W. Metabolism of polycyclic hydrocarbons: etiologic role in carcinogenesis. // Pharmacol. Rev. 1982. - V. 34. - P. 189222.

144. Phelan D., Winter G.M., Rogers W.J., Lam J.C., Denison M.S. Activation of the Ah receptor signal transduction pathway by bilirubin and biliverdin. // Arch. Biochem. Biophys. 1998. - V. 375. - P. 155-163.

145. Pineau T., Fernandez-Salguero P., Susanna S.T.L. Lee S.S., McPhail T., Ward G.M., Gonzalez F.J. Neonatal lethality associated with respiratory distress in mice lacking cytochrome P450 1A2. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1995.-V. 92. -P.5134-5138.

146. Piechocki M.P., Hines R.N. Functional characterization of the human CYP1A1 negative regulatory element: modulation of Ah receptor mediated transcriptional activity. // Carcinogenesis. 1998. - V. 19. - P. 771-780.

147. Pimental R.A., Liang B., Yee G.K., Wilhelmsson A., Poellinger L., Paulson K.E. Dioxin receptor and C/EBP regulate the function of the glutathione S-transferase Ya gene xenobiotic response element. // Mol. Cell Biol. 1993. - V. 13. - P. 4365-4373.

148. Poland A., Palen D., Glover E. Analysis of the four alleles of the murine aryl hydrocarbon receptor. // Mol. Pharmacol. 1994. - V. 46. - P. 915-921.

149. Poland A., Knutson J.C. 2,3,7,8- tetrachlorodibenzo-p-dioxin and related halogenated aromatic hydrocarbons: examination of the mechanism of toxicity. // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1982. - V. 22. - P.517-542.

150. Pollack G.M., Browne J.L., Marton J., Haberer L.J. Chronic stress impairs oxidative metabolism and hepatic excretion of model xenobiotic substrates in the rat. // Drug Metab. Dispos. 1991. -V. 19. -P. 130-134.

151. Porter T.D., Coon M.J. Cytochrom P450. Multiplicity of isoforms, substrates and catalytic and regulatory mechanisms. // J. Biol. Chem. 1991. -V. 266.-P. 13469-13472.

152. Pratt W.B., Silverstein A.M., Galigniana M.D. A model for the cytoplasmic trafficking of signalling proteins involving the hsp90-binding immunophilins and p-50cdc37. // Cell. Signal. 1999. - V. 11. - P. 839-851.

153. Quattrochi L.C., Vu T., Tukey R.H. The human CYP1A2 gene and induction by 3-methylcholanthrene: A region of DNA that supports Ah receptor binding andpromoter-specific induction. // J. Biol. Chem. 1994. - V. 269. - P. 6949-6954.

154. RayChaudhuri B., Nebert D.W., Puga A. The murine Cypla-1 gene negatively regulates its own transcription and that of other members of the aromatic hydrocarbon-responsive Ah. gene battery. // Mol. Endocrinol. -1990.-V. 4.-P. 1773-1781.

155. Safe S. Modulation of gene expression and endocrine response pathways to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin and related compounds // Pharm. Ther. -1998.-V. 67.-P. 247-281.

156. Safe S. Molecular biology of the Ah receptor and its role in carcinogenesis. // Toxicol. Lett. 2001. - V. 120. - P. 1-7.

157. Safe S., Wormke M., Samudio I. Mechanisms of inhibitory aryl hydrocarbon receptor-estrogen receptor crosstalk in human breast cancer cells. // J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 2000. - V. 5. - P. 295-306.

158. Schaldach C.M., Riby J., Bjeldanes L.F. Lipoxin A4: a new class of ligand for the Ah receptor. // Biochemistry. 1999. - V. 38. - P. 7594-7600.

159. Schlichting I., Berendzen J., Chu K., Stock A. M., Maves S.A., Benson D.E., Sweet R.M., Ringe D., Petsko G.A., Sligar S.G. The catalytic pathway of cytochrome P450cam at atomic resolution. // Science. 2000. - V. 287. - P. 1615-1622.

160. Schmidt J.V., Bradfield C.A. Ah receptor signaling pathways. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 1996. - V. 12. - P. 55-89.

161. Schweikl H, Taylor J A, Kitareewan S, Linko P, Nagorney D, Goldstein JA. Expression of CYP1A1 and CYP1A2 genes in human liver. // Pharmacogenetics. 1993. - V. 3. - P. 239-249.

162. Selye H. Thymus and adrenals in the response of the organism to injuries and intoxications. // Br. J. Exp. Pathol. 1936. - V. 17. - P. 234-248.

163. Shao D., Lazar M.A. Modulating nuclear receptor function: may the phos be with you.//J. Clin. Invest.-1999.-V. 103.-P. 1617-1618.

164. Shimada T. Xenobiotic-metabolizing enzymes involved in activation and detoxification of carcinogenic polycyclic aromatic hydrocarbons. // Drug Metab. Pharmacokinet. 2006. - V. 21. - P. 257-276.

165. Silver G., Krauter K.S. Expression of cytochromes P-450c and P-450d mRNAs in cultured rat hepatocytes. // J. Biol. Chem. 1988. - V. 263. - P. 11802-11807.

166. Song Z., Pollenz R.S. Functional analysis of murine aryl hydrocarbon (AH) receptors defective in nuclear import: impact on AH receptor degradation and gene regulation. // Mol. Pharmacol. 2003. - V. 63. - P. 597-606.

167. Srivastava P.K., Waxman D.J. Sex-dependent expression and growth hormone regulation of class alpha and class mu glutathione S-transferase mRNAs in adult rat liver. // Biochem. J. 1993. - V. 294. - P. 159-165.

168. Sterling K., Bresnick E. Oct-1 transcription factor is a negative regulator of rat CYP1A1 expression via an octamer sequence in its negative regulatory element. // Mol. Pharmacol. 1996. - V. 49. - P. 329-337.

169. Sterling K., Weaver J., Ho K.L., Xu L.C., Bresnick E. Rat CYP1A1 negative regulatory element: biological activity and interaction with a protein from liver and hepatoma cells. // Mol. Pharmacol. 1993. - V. 44. - P. 560568.

170. Sueyoshi T., Kawamoto T., Zelko I., Honkakoski P., Negishi M. The repressed nuclear receptor CAR responds to phenobarbital in activating the human CYP2B6 gene. // J. Biol. Chem. 1999. - V. 274. - P. 6043-6046.

171. Swanson H.I., Bradfield C.A. The AH-receptor: genetics, structure and function. // Pharmacogenetics. 1993. - V. 3. - P. 213-230.

172. Tamasi V., Vereczkey L., Falus A., Monostory K. Some aspects of interindividual variations in the metabolism of xenobiotics. // Inflamm. Res. -2003.-V. 52.-P. 322-333.

173. Thuerl C., Otten U., Knoth R., Meyer R.P., Volk B. Possible role of cytochrome P450 in inactivation of testosterone in immortalized hippocampal neurons. // Brain Res. 1997. - V. 762. - P. 47-55.

174. Tian Y., Ke S., Denison M.S., Rabson A.B., Gallo M.A. Ah receptor and NF-kappaB interactions, a potential mechanism for dioxin toxicity. // J. Biol. Chem. 1999. - V. 274. - P. 510-515.

175. Tukey R.H., Nebert D.W. Regulation of mouse cytochrome P3-450 by the Ah receptor. Studies with a P3-450 cDNA clone. // Biochemistry. 1984. -V. 23.-P. 6003-6008.

176. Turesky R.J., Guengerich F.P., Guillouzo A., Langouet S. Metabolism of heterocyclic aromatic amines by human hepatocytes and cytochrome P4501A2. // Mutat. Res. 2002. - V. 30. - P. 187-195.

177. Uchida Y., Yano A., Kumakura S., Sakuma T., Nemoto N. Enhancer elements in the mouse Cypla2 gene for constitutive expression. // Biochem.y Biophys. Res. Commun. 2002.- V. 297. - P. 1297.

178. Ueda A., Hamadeh H.K., Webb H.K., Yamamoto Y., Sueyoshi T., Afshari C.A., Lehmann J.M., Negishi M. Diverse roles of the nuclear orphan receptor CAR in regulating hepatic genes in response to phenobarbital. // Mol. Pharmacol. -2002.-V. 61.-P. 1-6.

179. Van der Hoeven T.A, Haugen D.A, Coon M.J. Cytochrome P-450 purified to apparent homogeneity from phenobarbital-induced rabbit liver microsomes: catalytic activity and other properties. // Biochem. Biophys. Res.

180. Commun. 1974. - V. 60. - P. 569-575.

181. Vermilion J.L., Coon M.J. Purified liver microsomal NADPH-cytochrome P-450 reductase. Spectral characterization of oxidation-reductioni states. // J. Biol. Chem. 1978. - V. 253. - P. 2694-2704.

182. Wanner R., Brommer S., Czarnetzki B.M., Rosenbach T. The differentiation-related upregulation of aryl hydrocarbon receptor transcript levels is suppressed by retinoid acid. // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1995.-V. 209.-P. 706-711.

183. Waxman D.J. Interactions of hepatic cytochromes P-450 with steroid hormones. Regioselectivity and stereospecificity of steroid metabolism and hormonal regulation of rat P-450 enzyme expression. // Biochem. Pharmacol.1988. V. 37. - P. 71-84.

184. Wei Y.D., Helleberg H., Rannug U., Rannug A. Rapid and transient induction of CYP1A1 gene expression in human cells by the tryptophan photoproduct 6-formylindolo3,2-b.carbazole. // Chem. Biol. Interact. 1998. -V.110.-P. 39-55.

185. Wei Y.D., Rannug U., Rannug A. UV-induced CYP1A1 gene expression in human cells is mediated by tryptophan. // Chem. Biol. Interact. 1999. - V.1118.-P. 127-140.

186. Whalen R., Boyer T.D. Human glutathione S-transferases. // Semin. Liver Dis. 1998. - V. 18. - P. 345-358.

187. Whitlock J.PJr. Induction of cytochrome P4501A1. // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1999. - V. 39. - P. 103-125.

188. Burghardt R., Safe S. The aryl hydrocarbon receptor mediates degradation of estrogen receptor alpha through activation of proteasomes. // Mol. Cell. Biol. -2003.-V. 23.-P. 1843-1855.

189. Wong H., Anderson W.D., Cheng T., Riabowol K.T. Monitoring mRNA expression by polymerase chain reaction: the "primer-dropping" method. // Anal. Biochem. 1994. - V. 223. - P. 251-258.

190. Xu L.C., Bresnick E. Induction of cytochrome P4501A1 in rat hepatoma cell by polycyclic hydrocarbons and a dioxin. // Biochem. Pharmacol. 1990. -V. 40.-P.1399-1403.

191. Yang Y.M., Huang D.Y., Liu G.F., Zhong J.C., Du K., Li Y.F., Song

192. X.H. Inhibitory Effects of Vitamin A on TCDD-induced Cytochrome P-450 1A1 Enzyme Activity and Expression. // Toxicol. Sci. 2005. - V. 85. - P. 727-734.

193. Zhang W., Shields J.M., Sogawa K., Fujii-Kuriyama Y., Yang V.W. The Gut-enriched Kriippel-like Factor Suppresses the Activity of the CYP1A1 Promoter in an Spl-dependent Fashion. // J. Biol. Chem. 1998. - V. 273. - P. 17917-17925.

Информация о работе

Михайлова, Ольга Николаевна
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2007
ВАК 03.00.04

Диссертация

Исследование регуляции экспрессии генов цитохрома Р450 подсемейства 1А в печени инбредных линий мышей - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы