Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование реакций трансгликозилирования, катализируемых гликозидгидролазами экзо- и эндодействия

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование реакций трансгликозилирования, катализируемых гликозидгидролазами экзо- и эндодействия"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

Шишлянников Сергей Михайлович

ИССЛЕДОВАНИЕ РЕАКЦИЙ ТРАНСГЛИКОЗИЛИРОВАНИЯ, КАТАЛИЗИРУЕМЫХ ГЛИКОЗИДГИДРОЛАЗАМИ ЭКЗО- И ЭНДОДЕЙСТВИЯ

03 00 04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург

2007 г \

с-, ^

003160785

Работа выполнена в Петербургском инстюуге ядерной физики им Б П Константинова Российской академии наук

Научный руководитель кандидат биологических наук

Неустроев Кирилл Николаевич

Научный консультант кандидат биологических наук

Кульминская Анна Алексеевна

Официальные оппоненты доктор биологических наук, проф

Скворцевич Евгений Георгиевич

доктор биологических наук, проф Морозов Владимир Игоревич

Ведущее учреждение Институт биоорганической химии им М М Шемякина и Ю А Овчинникова

Защита диссертации состоится «_»_2007 г в_ час на заседании

диссертационного совета Д 212 232 09 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Санкт-Петербургском Государственном Университете по адресу 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб , д 7/9

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им АМ Горького Санкт-Петербургского Государственного Университета

Автореферат разослан «_»_2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор 3 И Крутецкая

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Углеводы - биомолекулы, по биологической значимости стоящие в одном ряду вместе с белками, липидами и нуклеиновыми кислотами В последние несколько лет показано, что олигосахариды играют роль не только энергетического источника и структурной компоненты клетки, но и обладают другими ключевыми биологическими функциями Присутствие углеводных единиц в различных биологических структурах влияет на их физические, химические и биологические свойства Широкое разнообразие углеводных структур в гликопротеинах отражает их функциональное многообразие Например, О- и JV-гликозилированные пектины обуславливают вирулентность от микроорганизмов в качестве маркеров в межклеточном взаимодействии, а также играют важную роль в воспалительных процессах и иммунных ответах Так называемое «правильное» гликозилирование белков имеет важное значение в процессе их экспрессии и укладки и увеличивает их термо- и протеолитическую стабильности Существенна роль гликоконьюгатов и в медицине Например, глюкозилирование и галактозилирование гелдамицина улучшает его антираковую активность

Большинство биологически важных гликоконьюгатов (олигосахариды, гликопротеины и гликолипиды) и их производных трудно получить в больших количествах из природных источников Синтез различных олигосахаридов и углеводных компонент гликоконьюгатов может быть выполнен химическим или ферментативным методами Химические методы синтеза предполагают использование реакций блокирования и деблокирования реакционно-способных групп, что приводит к трудоемким и дорогостоящим многостадийным процессам В результате, синтез олигосахаридов с длиной цепи более 3 гликозидных остатков является экономически невыгодным Альтернативным решением этой проблемы остается ферментативный синтез с использованием ферментов, способных катализировать перенос гликозильных групп Такой способностью обладают две группы ферментов гликозилтрансферазы (К Ф 2 4 X ) и гликозидгидролазы (К Ф 3 2 1 X ), обладающие трансгликозилирующей активностью

In vivo гликозилтрансферазы осуществляют образование гликозидной связи с высокой региоселективностью Однако существенным недостатком применения гликозилтрансфераз в ферментативном синтезе является их низкая стабильность и необходимость в использовании in vitro в большом количестве дорогих кофакторов (например, уридин дифосфат)

В отличие от гликозилтрасфераз гликозидгидролазы катализируют образование олигосахаридов с абсолютной стереоспецифичностью без применения кофакторов К тому же они продуцируются микроорганизмами в больших количествах, термостабильны и устойчивы в широких диапазонах рН, что важно для их использования в производственных целях На сегодняшний день описано более сотни различных гликозидгидролаз, способных не только катализировать расщепление гликозидных связей, но и осуществлять перенос гликозильного остатка на другую молекулу (реакция трансгликозшшрования) Выделяемые из широкого круга микроорганизмов и растений, они успешно применяются в ферментативном синтезе новых биологически активных веществ Основными недостатками использования большинства ранее полученных гликозидгидролаз в ферментативном синтезе является их относительно низкая региоселективность и низкие выходы продуктов реакции трансгликозилирования Таким образом, перед исследователями стоит задача выделения гликозидгидролаз, обладающих трансгликозилирующей активностью

для использования их в реакциях ферментативного синтеза с целью получения строго определенных стереоизомеров с высокой региоселективностью и достаточно высоким выходом продуктов реакции Для этого используют различные приемы Во-первых, проводят поиск и выделение новых гликозидгидролаз из природных источников, обладающих высокой трансгликозилирующей способностью Во-вторых, увеличение выхода продуктов реакций трансгликозилирования можно достичь подбором и синтезом новых субстратов, используемых в качестве доноров реакций ферментативного синтеза, катализируемых гликозидгидролазами

В представленной работе, на примере трех гликозидгидролаз ((3-галактозидаза из Pénicillium sp, ламинариназа из Oerskovia sp, ламинариназа Spisula sachalinensis), обладающих трансгликозилирующей активностью, продемонстрированы различные стратегии получения олигосахиродов с высокой региоселективностью и высоким выходом Полученные данные о способности ферментов к проведению реакции трансгликозилирования и строении их активных центров дают возможность не только эффективно использовать гликозидгидролазы в ферментативном синтезе, но и получать новую информацию о механизме действия гликозидгидролаз в целом

Цели и задачи исследования. Целью данной работы является исследование реакций трансгликозилирования, катализируемых гликозидгидролазами экзо- и эндодействия, для дальнейшего их использования в синтезе олигосахаридов Исходя из цели работы, были поставлены следующие задачи

1 Выделить и очистить до гомогенного состояния следующие гликозидгидролазы, обладающие трансгликозилирующей активностью |3-галактозидазу из Pénicillium sp (фермент экзо-действия) и Р-1 3-глюканазу (ламинариназу) из Oerskovia sp и р-1 3-глюканазу из Spisula sachalinensis (ферменты эндо-действия)

2 Исследовать трансгликозилирующие активности изучаемых р-галактозидазы и р-1 3-глюканаз и идентифицировать спектр продуктов реакций трансгликозилирования методами ЯМР и масс-спектрометрии

3 Изучить влияние синтетических субстратов, в том числе, 1 -О-ацетил-p-D-галактопиранозида, на выход продуктов реакций трансгликозилирования, катализируемых р-галактозидазой из Pénicillium sp

4 Использовать реакцию трансгликозилирования, катализируемую ламинариназами, для получения новых флуоресцентных и хромофорных субстратов, с целью изучения кинетических параметров эндо-глюканаз, в частности, ламинариназы из Rhodothermus martnus

Научная новизна полученных результатов В настоящей работе впервые установлено, что р-галактозидаза из Pénicillium sp является ферментом, сохраняющим конфигурацию аномерного центра в результате реакции гидролиза субстрата, и обладает трансгликозилирующей активностью Показано, что впервые синтезированное соединение 1-О-ацетил-р-галактопиранозид является субстратом для реакций гидролиза и трансгликозилирования, катализируемых р-галактозидазой, более эффективным по сравнению с другими природными и синтетическими субстратами

Впервые разработаны схемы ферментативного синтеза с использованием ламинариназ бактериального и животного происхождения и получены новые субстраты для Р-1,3-глюканаз, а именно, па/га-нитрофенил- и 4-метилумбеллиферил-р-1,3-глюкоолигосахариды (.PWGlcn и MuGlcn) со степенью полимеризации от 2 до 6 Структуры продуктов реакций трансгликозилирования были установлены методами H и 13С ЯМР спектроскопии и масс-

спектрометрического анализа Впервые на основе кинетического анализа гидролиза новых ЛУР-р-ЬЗ-ппокоолигосахаридов с различной степенью полимеризации обнаружены четыре позиции связывания субстрата в гликоновой части активного центра ламинариназы из S marmus

Теоретическое и практическое значение работы Подробное исследование реакций трансгликозилирования, катализируемых экзо- и эндо-гликозидгидролазами, имеет большое значение для решения как фундаментальных, так и прикладных задач, так как дает возможность эффективно использовать эти ферменты в синтезе различных гликоконьюгатов, а также получать новую информацию о механизме действия гликозидгидролаз экзо- и эндодействия в целом Основные положения, выносимые на защиту.

1 Новое соединение, 1 -О-ацетил-р-О-галактопиранозид, является субстратом для p-D-галактозидазы из Pénicillium sp Использование l-O-auermi-P-D-галактопиранозида в реакции трансгликозилирования позволяет увеличить выход продуктов реакции ферментативного синтеза

2 Для препаративного ферментативного синтеза PNP и MU-$-l,3-глюкоолигосахаридов со степенью полимеризации от 2 до б целесообразно использовать ламинариназы из Oerskovia sp и из S sachalinensis

3 Впервые полученные PNP- и М7-р-1,3-глюкоолигосахариды с различной степенью полимеризации эффективны для изучения механизма действия эндо-глюканаз, что показано на примере исследования ламинариназы из R marinus

Личный вклад соискателя Соискателем проведены выделение и очистка используемых в работе ферментов, подробно исследованы кинетические характеристики реакций гидролиза, катализируемых р-галактозидазой и ламинариназами, изучены их трансгликозилирующие активности Синтезированы и выделены хроматографическими методами продукты реакций трансгликозилирования для дальнейшего определения структуры Автором осуществлено построение субсайтной модели активного центра ламинариназы из R marinus

Апробация работы. Материалы работы были представлены на следующих семинарах и конференциях

• 2-й Немецко-польско-российский Симпозиум по бактериальным углеводам (Москва, сентябрь 10-12,2002)

• Политехнический симпозиум «Молодые ученые промышленности Северо-западного региона» (Санкт-Петербург 2005)

• Четвертый Московский международный конгресс «Биотехнология состояние и перспективы развития» (Москва, март 2007 г )

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и обсуждения, заключения и списка литературы Диссертация иллюстрирована 10 таблицами и 24 рисунками Благодарности за помощь в работе Данная работа посвящается научному руководителю, кандидату биологических наук Неустроеву К H Автор выражает искреннюю благодарность за всестороннюю помощь в работе научному консультанту, руководителю лаборатории этимологии к б н Кульминской А А , а также всему коллективу лаборатории

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Обзор литературы

В обзоре литературы дано представление о современной классификации и механизме действия гликозидгидролаз Описан механизм действия реакции трансгликозшшрования и возможности ее использования в ферментативном синтезе различных олигосахаридов, катализируемыми гликозидгидролазами экзодействия (на примере р-Ц-галактозидаз) и эндодействия (на примере р-1,3-О-глюканаз)

Материалы и методы Объект исследования. В качестве объектов исследования использовали гликозидгидролазы экзо- и эндодействия, выделенные из различных источников Р-галактозидаза из РетсгПгит ер, ламинариназа из Оегхкоуш ер, ламинариназа из ЗршЛа хасИаЬпетм

Методы определение кинетических характеристик реакций гидролиза, катализируемых ферментами. Кинетические характеристики реакций гидролиза (константы Михаэлиса (Кт) и каталитические константы скоростей гидролиза (Кет) каждого из субстратов, катализируемых ферментами определяли методом начальных скоростей в диапазоне различных концентраций субстратов 0,1-8 Кт с последующей обработкой данных с помощью нелинейного регрессионного анализа уравнения Михаэлиса-Ментен Исследование трансгликозилирующей активности р-Б-галактозидазы из РепкШшт «р. Трансгликозилирующую активность фермента исследовали, проводя реакцию гидролиза в растворах 50 мМ натрий - ацетатного буфера рН 6 0с исходной концентрацией субстратов 60 мМ Продукты реакции анализировали методом ТСХ и ЯМР- спектроскопией Влияние рН на выход продуктов трансгликозилирования исследовали в диапазоне значений рН 3 - 9 в 100 мМ растворах фосфат-цитратного буфера

Препаративный синтез 1-0-метил-р-О-галактопиранозил-(1,6)-р-О-галактопиранозида и метил-Р-В-галактопиранозил-(1,3)-Р-0-

галактопиранозида Реакционную смесь, содержащую 50 мг 1-0-метил-|3-0-галактопиранозида (МеЛуЮа1), Р-галактозидазу (70 ед) в растворе 30 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 6 0) инкубировали при температуре 37°С в течение 90 минут Продукты реакции анализировали методом ТСХ, разделяли методом ВЭЖХ и гель-фильтрации

Препаративный синтез 1-0-ацетил-Р-О-галактопиранозил-(1,б)-Р-О-галактопиранозида. Реакционную смесь, содержащую 40 мг 1-0-ацетил-(3-0-галакгопиранозида (Асе(уЮаУ), [3-галактозидазу (0,002 ед) в растворе в 30 мМ ацетатного буфера (рН б 0) инкубировали при температуре 37°С в течение 30 минут Продукты реакции анализировали методом ТСХ, разделяли методом ВЭЖХ и гель-фильтрации

Препаративный синтез 4-метилумбеллифсрил-р-1,3-Б-

глюкоолигосахаридов со степенью полимеризации от 2 до 4 с использованием ламинариназы из Оеккорш. Смесь, содержащую 500 мг курдлана, 100 мг 4-метилумбеллиферил-р-0-глюкопиранозида (МИСЛс) ламинариназу из Оепкоуга (20-30 ед) в растворе 20 мМ натрий-ацетатного буфера, рН 6 0, инкубировали в при 37°С в течение 48 часов Полноту прохождения реакции проверяли методом ТСХ Продукты реакции разделяли методом ВЭЖХ и гель-фильтрации

Препаративный синтез 4-метилумбеллиферил-Р-глюкоолигосахаридов со степенью полимеризации 5 и б. Смесь, содержащую 200 мг ламинарина, 100

мг MUQXc, ламинариназу из морского моллюска S sachalinensis (20 ед) в растворе 50мМ натрий-адетатного буфера (pH 4 8) инкубировали при 37°С в течение 48 часов Индивидуальные фракции MU-fi-1,3 -D-глюкоолигосахаридов разделяли хроматографически, как описано выше для ди-, три-, и тетрасахаридных аналогов

Препаративный синтез яара-нитрофенил-1,3-Р-В-глюкоолигосахаридов со степенью полимеризации от 2 до 6. Смесь, содержащую 200 мг ламинарина, 60 мг и0ра-нитрофенил-1,3-р-0-глюкопиранозида (PNPQXc), ламинариназу из S sachaltnensts (20 ед) в растворе 20 мМ натрий-ацетатного буфера (pH 4 8) инкубировали в течение 48 часов при 37°С Полноту прохождения реакции проверяли при помощи ТСХ Продукты реакции разделяли методом ВЭЖХ и гель-фильтрации

Характеристика структуры продуктов трансгликозилирования методом ЯМР. Все 'Н и 13С ЯМР спектры регистрировали на ЯМР спектрометре АМХ-500 Bruker ('Н 500 13 МГц, 13С 125 МГц,) в D20 при комнатной температуре, с использованим ацетона в качестве внутреннего стандарта Химические сдвиги определяли относительно внутреннего стандарта 2 23 ррм для 'Н и 31 50 ррм для 13С Результаты анализировали с использованием пакета программ XWINNMR (Bruker)

Характеристика структуры продуктов трансгликозилирования методом масс-спектрометрии. Масс-спектры продуктов трансгликозилирования снимали в режиме регистрации положительных ионов на Micromass Q-TOF2 (ортогонально ускоряющий квадруполь/время-пролетный масс-спектрометр), соединенном с нанофлоу источником ионов (Micromass, Manchester, UK), (Королевский институт биотехнологии, Швеция) Для создания центроидного спектра использовали 60-80 индивидуальных МС/МС спектров Для калибровки МС/МС спектров использовали массу моноизотопного фрагментарного иона В-2 (287 0743 массовой единицы)

Исследование характера действия ламинариназы из R marinus в реакциях гидролиза MV- PTVP-ß-l ^-D-глюкоолигосахаридов Реакции гидролиза PNPG\c2-6 и MUG\c2.6, катализируемые исследуемой ламинариназой, проводили в растворе 50 мМ натрий-ацетатного буфера (pH 5 0) с исходной концентрацией субстрата 1 2 мМ при 37°С

Метод определения показателей сродства позиций связывания активного центра ламинариназы из R. mannus. Число позиций связывания с субстратом в гликоновой части активного центра фермента оценивали на основе теории Хироми для гликозидгидролаз эндодействия [1], и номенклатуры Дэвиса с соавт [2], с использованием в качестве субстратов PNP-ß-1,3-D-глюкоолигосахаридов со степенью полимеризации от 2 до б

Результаты и обсуждение

Изучаемые в работе ферменты были очищены до гомогенного состояния с использованием хроматографических методов Основные физико-химические характеристики использованных гликозидгидролаз представлены в табл 1 Экзо-Р-галактозидаза из PenicUhum sp. в ферментативном синтезе Ранее было показано, что экзо-р-галактозидаза обладает трансгликозилирующей активностью в реакциях с использованием синтетических субстратов, MethylG&\ и /WP-ß-галактопиранозида (/WPGal) Сотрудником института органической химии им Зелинского Зининым А И было синтезировано и любезно предоставлено новое соединение 1-(9-ацетил-р-0-галактопиранозид С использованием методов ВЭЖХ и анализа реакции методом ЯМР-спектроскопии

в режиме реального времени было показано, что реакция гидролиза данного соединения подчиняется кинетике Михаэлиса-Ментен и следовательно, АсеуЮа! является субстратом для (3-галактозидазы

Таблица 1. Физико-химические характеристики, использованных в работе ферментов.

Объект исследования Мол масса фермента, кДа Удельная активность, Ед/мг рН-оптимум реакций гидролиза

З-Галактозидаза из РетсШшт ер 120 ±5 58±5 5

Ламинариназа из Oerskovш 30±2 400±40 5,0

Ламинариназа из £/>ми/а заекаИпетк 27±2 65б±60 5,5

Фермент гидролизует его со скоростью, на несколько порядков превышающей скорость гидролиза традиционных субстратов (табл 2) рН-Оптимум гидролиза АсеуКтХ лежит в том же диапазоне значений, что и для других используемых субстратов, а именно в диапазоне рН 4 5-60

Таблица 2 Кинетические параметры реакций гидролиза, катализируемых р-галактозидазой

Субстрат Кт (мМ) ксгЛ (сек1) рН-оптимум

Асе1уЮа1 3,9 2500 4,5

РМРва1 1,0 22,4 5,0

МеЛуЮ а! 5,9 0,14 5,5

Лактоза 11,1 7,43 5,0

С помощью ЯМР-спектроскопии было показано, что р-галактозидаза гидролизует Асе1уЮа1 с сохранением конфигурации аномерного центра в продукте реакции (рис 1) Кроме того, из ЯМР-спектра реакции гидролиза р-галактозидазой АШуКлъХ видно, что в ходе реакции образуются соединения, отличные от ожидаемых продуктов реакции гидролиза, которые являются продуктами реакции трансгликозилирования

(•рл)

Рисунок 1 Анализ реакции гидролиза 1-0-ацетил-р-О-галактопиранозида, (!-галактозидазой в режиме реального времени

Таким образом, анализируя свойства нового субстрата и поведение р-галактозидазы в гидролизе этого соединения, было предположено, что АсеуЮа1 должен быть эффективным в реакциях трансгликозилирования Анализ временной зависимости выхода продуктов реакций гидролиза и трансгликозилирования Асе1уЮа\, выполненный при помощи ЯМР-спектрометрии, показал, что помимо продуктов гидролиза происходит образование продукта реакции трансгликозилирования, а именно, 0-0а1-Р-1,6-Б-Оа1-р-Асе1у1

Аналогичный эксперимент был проведен с использованием в качестве субстрата МеЛуЮгЛ Было показано, что в результате реакции трансгликозилирования происходит образование двух изомеров, Т)-0а.1-$-Х)-0&\-$-МеЛу1 с конфигурацией связи р-1,6- и 0-1,3- Сравнение рН-зависимостей выхода продуктов реакции трансгликозилирования с использованием МегкуКза1 и Асе1уЮеЛ в качестве субстратов выявило, что для обоих соединений рН-оптимумы близки и находятся в диапазоне значений рН от 5 до 6 Характеристика структуры продуктов трансгликозилирования Осуществлены препаративные синтезы дигалактозидов с использованием Ме1куЮд.\ и Лсе!уЮа1 в качестве субстратов Полученные соединения были очищены хроматографически и охарактеризованы при помощи ЯМР-спектроскопии Сводные результаты по выходу и структуре продуктов реакции трансгликозилирования приведены в таблице

Выходы продуктов реакции трансгликозилирования с использованием Асе1уЮа\ рассчитывали по уравнению

Выход =:^°ДУ1СГ трансгликозилирования]_х100о/о

[Продукт трансгликозилирования] + [галактоза]

Таблица 3. Выход и структуры продуктов реакций трансгликозилирования, катализируемые (i-D-галактозидазой.

Субстрат Продукты реакции трансгликозилирования Продукты реакции трансгликозилирования, %

, MethylGaX D-Gal-P-(1,6)-D-Gal-P-M>%/ 36

D-Gal-P-(1,3)-D-Gal-P-Me%/ 9

D-Gal-p-(l ,4)-D-Gal-P-Afe%/ следы

AcetylG al D-Gal-P-(l,6)-D-Gal-P-^ce/v/ 70

D-Gal-P-(1,3)-D-Gal-P-Acetyl следы

D-Gal-p-0,4)-D-Gal-fi-A cetyl следы

Из данных видно, что в результате реакции трансгликозилирования с участием в качестве субстрата MethylGa.1 образуются два продукта с конфигурацией связи р-1,6- и (5-1,3- Выходы синтезированных дигалактозидов составляют, соответственно, 36 и 9% В реакции с использованием в качестве субстрата JcetylGal был получен D-Gal-p-D-Gal-fi-Ace/yl с конфигурацией связи р-1,6- и выходом 70%

Таким образом, использование нового субстрата 1 -О-ацетил-P-D-галактопиранозида в качестве донора реакции трансгликозилирования, катализируемой Pénicillium sp, дает возможность увеличить выход продукта реакции почти в 2 раза, при этом происходит образование продукта реакции преимущественно с одной конфигурацией связи

Эндогликозидгидролазы в ферментативном синтезе углеводсодержащих соединений Для характеристики эндо-гликозидгаролаз необходимы субстраш, представляющие собой олигосахариды с высокой степенью полимеризации и модифицированные хромофорной или флуоресцентной группой Химический синтез подобных соединений включает не менее 8 стадий и весьма дорогостоящий Поэтому поиск и использование эндогликозидгидролаз с трансгликозилирующими свойствами представляется весьма актуальным Эндогликозидгидролазы катализируют реакцию гидролиза гликозидной связи в гомо- или гетерополисахаридах, которая удалена от начального и концевого остатков полимера Поэтому продуктами реакций (гидролиза и трансгликозилирования) эндо-ферментов с трангликозилирующей активностью будут олигосахариды с различной степенью полимеризации Так, например, в результате гидролиза jî-глюкана эндо-р-1,3(4)-глюканазой продуктами являются короткие олигосахариды Для того, чтобы увидеть образование новой гликозидной связи, необходимо использовать акцептор, несущий хромофорную или флуофорную группу В результате будет получен удлиненный олигосахарид, модифицированный меткой

В качестве иллюстрации данной стратегии была предложена следующая схема синтеза Р-1,3-глюкоолигосахаридов, модифицированных хромогенной или флуоресцентной группами В качестве объектов исследования были выбраны

следующие ферменты ламинариназа (р-1,3-Т>-глюканаза), выделенная из Оегйкта ер , и ламинариназа из тканей морского моллюска 5 $асЪ.а1тетш В качестве субстратов (доноров) для этих ферментов были использованы ламинарин или курдлан В качестве акцепторов в реакциях трансгликозилирования, катализируемых ламинариназами, были использованы Ми- или РЛУ-р-глюкопираяозиды

Для ламинариназы из Оепкота эр исследование условий ферментативного синтеза при различных значениях рН показало, что максимальный выход продуктов трансгликозилирования наблюдается при рН 6 0, в то время как рН-оптимум реакции гидролиза находится в области рН 4 5-50 С использованием данного фермента в ферментативном синтезе были получены АШ- или РИР-содержащие р-Б-глюкоолигосахариды со сп от 2 до 4, более длинные олигосахариды находились в следовых количествах (табл 4) Из таблицы видно, что выходы продуктов реакции трансгликозилирования были выше, если в реакции используется курдлан (гомополисахарид - 1,3-р-П-глюкан) в качестве донора

Таблица 4. Выход МП- и РЛГР-р-1,3-В-глюкоолигосахарндов в результате ферментативного синтеза, катализируемого ламинариназой из Оепкоуш ер

Продукт Донор, выход (%)

Курдлан Ламинарин

АГ-01с2 30 21

Х-Мсз 25 17

Х-01с4 8 4

Я-вк* Следы Следы

дг-етсб Следы Следы

X 4-метилумбеллиферил-, пара-нитрофенил-

Для получения олигосахаридов с более высокой степенью полимеризации была использована ламинариназа из 5 засЪаЬпетк Выбор фермента был обусловлен успешным использованием его для синтеза РЛ^-р-глюкоолигосахаридов (степень полимеризации > 6), полученных в лаборатории химии ферментов Тихоокеанского института биоорганической химии под руководством профессора Т Н Звягинцевой [Звягинцева Т Н, и др 1998] В результате реакции трансгликозилирования, катализируемой ламинариназой из 5' васкаЬпетк, с использованием ламинарина в качестве субстрата и глюкопиранозида в качестве акцептора были получены продукты со степенью полимеризации 5 и 6 (табл 5)

Из анализа данных, приведенных в табл 5, видно, что выходы продуктов трансгликозилирования были выше, если в ферментативном синтезе использовали ламинарин в качестве донора

Таблица 5. Выход MU- к Р/УР-р-Х^-Б-глюкоолигосахаридов в результате ферментативного синтеза, катализируемого ламинариназой из Spisula sachalinensis

Продукт Донор, выход (%)

Курдлан Ламинарии

X-Glc2 12 30

х-а\с3 8 20

X-G1c4 Следы 15

-X-Glc 5 Следы 8

A--Glc6 Следы 6

X 4-метилумбеллиферил-, пара-нитрофенил-

Следует отметить, что гликозидгидролазы микробного происхождения традиционно рассматриваются как эффективный инструмент для ферментативного синтеза олигосахаридов, вследствие их более высокой pH- и термостабильности, а также достаточно быстрого их получения в промышленном масштабе, в отличие от гликозидгидролаз растительного и животного происхождения, которые используются значительно реже В то же время совместное использование ферментов, выделенных из различных источников и совпадающих по своей субстратной специфичности и набору получаемых олигосахаридов, эффективно в тех случаях, когда необходимо получение набора модифицированных хромофорной и флюоресцентной меткой олигосахаридов с разной степенью полимеризации Кроме того, ферментативный синтез имеет определенные преимущества по сравнению с традиционным химическим синтезом Так, например, синтез ß-D-[Glc-(l,4)]„-ß-D-Glc-(l,3)-ß-D-Gcl-M7 (и = 1-3) включает восемь стадий [Malet С, et al 1995] Ферментативный синтез не требует трудоемкого многостадийного процесса, а конечный выход продуктов реакции намного выше Кроме того, для органического синтеза MU-ß-1,3-0-глюкоолигосахаридов необходимы в большом количестве индивидуально очищенные олигосахариды, выделенные первоначально из ß-глюканов Такие олигосахариды могут быть получены только из ламинарина или курдлана ферментативным или химическим гидролизом, с последующей хроматографической очисткой, что уменьшает конечный выход продуктов К тому же, только при помощи ферментативного синтеза можно получить Р-1,3-0-глюкоолигосахариды с высокой сп, модифицированные флуоресцентной меткой

Характеристика структуры продуктов реакций трансгликозилирования МУ-ß-1,3-О-глюкоолигосахариды были впервые получены нашей лабораторий в результате ферментативного синтеза (рис 3) и подробно охарактеризованы ESI-TOF масс-спектрометрией и 'Н и 13С ЯМР-спектрометрией

Рисувок 3 Общая структурная формула ЛЛ/-р-1,3-0-глюкоолигосахаридов со степенью полимеризации от 2 до 6

Все пики 'Н и 13С ЯМР спектров были соотнесены так, что бы было возможно 1) определить спиновую систему для каждого индивидуального ¡3-D-глюпиранозного остатка, и 2) установить межсахаридные связи р-Аномерные конфигурации всех моносахаридных остатков также следуют из величин химического сдвига для аномерных атомов углерода Подтверждение конфигурации р-(1,3)-связи в олигосахаридах было определено анализом 13С ЯМР-спектроскопии позиций низкопольных сигналов для С-3 атома Корреляционная спектроскопия (COSY) была использована для идентификации групп протонов, принадлежащих отдельным глюкопиранозным остаткам Это облегчалось тем фактом, что сигналы аномерного протона гликозидной (восстанавливающей) единицы сдвинуты в низкопольную область по сравнению с другими аномерными протонами Экспериментальные данные, полученные с помощью ESI-TOF масс-спектрометрии для каждого иона новых соединений, показали точную корреляцию с рассчитанными молекулярными массами ожидаемых продуктов

Использование модифицированных p-глюкоолигосахаридов для измерения активности и картирования активного центра ламинариназ Известно что использование хромогенных и флюорогенных субстратов в изучении кинетических свойств гликозидгидролаз позволяет с высокой чувствительностью детектировать продукты реакции спектрофотометрическими и флюорометрическими методами Ферментативно синтезированные MU- и PNP-fi-1,3-0-глюкоолигосахаридов со степенью полимеризации от 2 до 6 были использованы для измерения активности и картирования активного центра ламинариназы термофильной бактерии Rhodotermus marmus Ген ламинариназы из R marmus был экспрессирован в штамм Е coll Dh5a и было показано, что рекомбинантный белок демонстрировал те же свойства, что и исходный фермент дикого типа[КгаЬ М, et а1 1998] Дальнейшие работы проводили с экспрессированным белком

Характер действия фермента исследовали в реакциях гидролиза MU- и PNP-Q-1,3-0-глюкоолигосахаридов со степенью полимеризации от 2 до 6 при помощи метода ВЭЖХ Было показано, что реакция гидролиза происходит, в основном, в месте соединения гликона и агликона, тес освобождением свободного пара-нитрофенола или 4-метилумбеллиферона Эти данные указывают на то, что модифицированные метками р-1,3-глюкоолигосахариды со степенью полимеризации от 2 до 6 являются идеальными субстратами для точных кинетических исследований этого фермента Действительно, метод детектирования флуоресцентных и хромофорных групп в процессе гидролиза таких соединений отличается высокой чувствительностью, в отличие от обычного метода детектирования восстанавливающих Сахаров, образующихся в процессе гидролиза, или использования альтернативных субстратов, таких как меченных «красным Конго» р-глюканов Способность высвобождать свободный хромофор или флюорофор в процессе реакции является отличительной

особенностью ß-1,3(4)-0-глюканаз и ß-1,3-D-глюканаз, относящихся к 16 семейству гликозидгидролаз (http //www cazy org/fam/acc_GH html) Так например, MU- ОН является единственным флуоресцентным продуктом гидролиза этих субстратов ß-1,3 -D-глюканазой из Pyrococcus furiosus В табл 6 приведены значения каталитической эффективности в процессе гидролиза модифицированных ß-1,3-0-глюкоолигосахаридов

Таблица 6. Значения каталитической эффективности ламинариназы из К. таппш в реакциях гидролиза ЙГО- или Р1ЧР-р-1,3-глюкоодигосахаридов

Субстрат Km, MM jfcatj kcattKm,

сек 1 (сек мМ)"'

MV-GXcz 0,103±0,001 0,10±0,03 1,00±0,07

MU-Glci 0,028±0,002 0,18±0,05 6,5±0,1

PNP- Glc3 0,014±0,001 1,2±0,1 85±3

PNP-G\u 0,012±0,001 1,9±0,1 158±12

PNP- Glcs 0,010±0,002 2,1 ±0,1 205±15

PNP-Gla 0,009±0,001 2,0±0,1 238±18

Кинетический анализ реакций гидролиза, катализируемых ламинариназой из К таппш, показал, что скорость расщепления глюкоолигосахаридов находится в прямой линейной зависимости от длины цепи соответствующих субстратов Фактор каталитической эффективности, ксЛ/Км, также увеличивается по мере увеличения сп субстрата Полученные данные позволяют применить модель Хироми для определения минимального количества позиций активного центра фермента и рассчитать значения сродства для каждого из них в соответствии с представленным уравнением

АС*поз = АО\+1 - АС\ = -КТ1п \(кш/Кт)п + ЖЖЛ,}

Значения энергий активации для позиций -5, -6 ниже значений, вносящих достаточный вклад в стабилизацию переходного состояния фермент-субстратного комплекса ламинариназы из таппш по сравнению с

позициями -3 и -4 (Рис 24) Таким образом, из полученных данных можно предположить наличие четырех сайтов связывания для гликоновой части активного центра фермента четырех позиций связывания в гликоновой части активного центра ламинариназы из КИо^Легтш таппш

Позиция -6

AG",

nos -0 09 (±0 02)

-015 (±0 03)

-0 39 (±005)

-3

-2 51 (±0 17)

-1

+1

Рисунок 4. Энергетический вклад позиций гликоновой части активного центра ламииариназы из ДА татти$ в стабилизацию переходного состояния фермент-субстратного комплекса.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенной работы были исследованы гликозидгидролазы экзо- и эндодействия, выделенные из разных источников, обладающие трансгликозилируницей активностью Разработаны эффективные схемы синтеза биологически значимых углеводных структур с помощью (3-галактозидазы из РетсгИтт ер, ламинариназ из Оегяколча ер и 8рки1а васЪсйтепш Это позволяет существенно раздвинуть рамки использования ферментативного синтеза в различных областях фармакологии и биотехнологии и исключить вредные и экологически опасные технологические процессы

ВЫВОДЫ

1 Р-Галактозидаза из Pénicillium, sp гидролизует новое соединение, 1 -О-ацетил-Р-О-галактопиранозид, с сохранением конфигурации аномерного центра

2 Выход продуктов реакции трансгликозилирования при использовании 1-О-ацетил-Р-О-галактопиранозида увеличивается до 25% по сравнению с использованием других субстратов Основным продуктом реакции является D-

Gal-P-(l,6)-D-Gal-M<*<W

3 Продуктами реакции трансгликозилирования ламинариназ из Oerskovia sp и S sachahnensis с использованием в качестве субстратов природных р-глюканов, а в качестве акцепторов PNP- и MU-p-глюкопиранозидов, являются линейные р1,3-глюкоолигосахариды со степенью полимеризации от 2 до 6, модифицированные соответствующей хромофорной или флуоресцентной меткой

4 Полученные модифицированные глнжоолигосахариды являются эффективными субстратами для измерения глюканазной активности, что показано на примере исследования механизма реакции, катализируемой ламинариназой из Rhodothermus marinus

5 Анализ значений каталитической эффективности гидролиза модифицированных р-1,3-глюкоолигосахаридов со степенью полимеризации от 2 до 6 предполагает наличие четырех позиций связывания субстрата в гликоновой части активного центра ламинариназы из Rhodothermus marinus

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Zimn, А V , Shabalin, К А, Kulminskaya, А А, Shishlyannikov, S.M, Neustroev, KN 1-O-Acetyl-beta-D-galactopyranose A novel substrate for the transglycosylation reaction catalyzed by the beta-galactosidase from Pemcillium sp Carbohydr Res 337(7) 635-642 (2002)

2 M Arand, A M Golubev, J R Brandao Neto, I Polikarpov, R Wattiez, О S Korneeva, Б V Eneyskaya, A A Kulminskaya, К A Shabalm, S M Shishliannikov, О V Chepurnaya and К N Neustroev (2002) Purification, characterisation, gene cloning, and preliminary X-ray data of the exo-mulinase from Aspergillus awamori, Biochem J 362(1) 131-135

3 Bornss, R, Krah, M, Brumer III, Й, Kerzhner, M A, Elyakova, L A, Ivanen, D R, Eneyskaya, E V , Shishlyannikov, S.M, Shabalin, К A, and Neustroev, К N Enzymatic synthesis of 4-methylumbelhferyl (l,3)-beta-D-glucoohgosaccharides-new substrates for beta-l,3-l,4-D-glucanase Carbohydr Res Jul 4,338(14) 1455-67 (2003)

4 Шишлянников C.M, Неустроев К H Трансгликозилирующая активность гликозидгидролаз Политехнический симпозиум «Молодые ученые промышленности Северо-западного региона» стр 42 (2005)

5 К. N Neustroev, А М Golubev, М L Smnott, R Bornss, М Krah, Н Brumer 1П, Е V Eneyskaya, S.Sbishlyanmkov, К A Shabalin, V Т Peshechonov, V G Korolev, A A Kulminskaya Transferase and Hydrolytic Activity of the p-1,3(4)-Glucanase from Rhodothermus marinus and its mutant forms Glycoconj J 23 p 499-509 (2006)

Лицензия ЛР №020593 от 07 08 97

Подписано в печать 18 09 2007 Формат 60x84/16 Печать цифровая Уел печ л 1,0 Тираж 100 Заказ 1967Ь

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул , 29 Тел 550-40-14

Тел /факс 297-57-76

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шишлянников, Сергей Михайлович

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ГЛИКОЗИДГИДРОЛАЗЫ

1.1 Классификация гликозидгидролаз.

1.2 Каталитический механизм гликозидгидролаз.

1.3 Трансгликозилирование.

1.4. (З-О-Галактозидаза.

1.5. Ламинариназа и 16 семейство гликозидгидролаз.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Ферменты.

2.2 Физико-химические методы.

2.3 Субстраты.

2.4 Измерение ферментативных активностей.

2.5 Кинетические параметры изучаемых гликозидгидролаз.

2.6 Исследования трансгликозилирующей активности изучаемых гликозидгидролаз.

2.7. Характеристика структур продуктов трансгликозилирования методом ЯМР.

2.8. Характеристика структуры продуктов трансгликозилирования методом масс-спектрометрии.

2.9. Метод определения показателей сродства позиций связывания активного центра ламинариназы из R. marinus.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Физико-химические характеристики использованных в работе ферментов.

3.2. Исследование гидролитической активности P-D-галактозидазы из Penicillium sp.

3.3. Исследование трансгликозилирующей активности p-D-галактозиды из Penicillium sp. в реакциях с использованием AcetylG al

MethylG al.

3.3. Структура продуктов реакции трансгликозилирования с участием в качестве субстратов AcetylG al и MethylG al.

3.5. Эндо-гликозидгидролазы в ферментативном синтезе модифицированных (З-глюкоолигосахаридов.

3.5. Использование модифицированных (3-1,3-глюколигосахаридов для измерения активности и картирования активного центра ламинариназы из Rhodothermus marinus.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование реакций трансгликозилирования, катализируемых гликозидгидролазами экзо- и эндодействия"

Актуальность проблемы

Углеводы - биомолекулы, стоящие в одном ряду по биологической значимости вместе с белками, липидами и нуклеиновыми кислотами. В последние несколько лет показано, что олигосахариды выполняют не только роль энергетического источника и структурной компоненты клетки, но обладают и другими ключевыми биологическими функциями (P. Sears, (1999)). Присутствие углеводных единиц в различных биологических структурах влияет на их физические, химические и биологические свойства. Широкое разнообразие углеводных компонент в гликопротеинах отражает их функциональное многообразие. Например, в качестве маркеров в межклеточном взаимодействии О- и N-гликозилированные лектины обуславливают вирулентность от микроорганизмов (Sharon, N.; Lis, Н. Essays Biochem. (1995)); играют важную роль в воспалительных процессах (Lasky, L. А. (1995); Weis, W. I.; Drickamer, К. (1996) и в иммунных ответах (Varki, А. (1993); Rudd, Р. М.; Elliot, et al. (2001)). К тому же так называемое «правильное» гликозилирование белков имеет важное значение в процессе их экспрессии и укладки (Helenius, А. (1994); Trombetta, Е. S.; Helenius, А. (1998); Helenius, A.; Aebi, М. (2001)), а также увеличивает их термо- и протеолетическую стабильности (Opdenakker, G.; Rudd, P. М. et al. (1993)). Существенна роль гликоконьюгатов и в медицине. Например, глюкозилирование и галактозилирование гелдамицина улучшает его антираковую активность (Cheng Н, Cao X, et al. (2005)).

Большинство биологически важных гликоконьюгатов (олигосахариды, гликопротеины и гликолипиды) и их производные трудно получить в больших количествах из природных источников. Синтез различных олигосахаридов и углеводных компонент гликоконьюгатов может быть выполнен химически или ферментативно. Химические методы синтеза предполагают использование реакций блокирования и деблокирования реакционно-способных групп, что приводит к трудоемким и дорогостоящим многостадийном процессам (К. Igarashi (1977)). В результате, синтез олигосахаридов с длиной цепи более 3 гликозидных остатков является экономически невыгодным. Альтернативным решением этой проблемы остается ферментативный синтез с использованием ферментов, способных катализировать перенос гликозильных групп (Singh, S.; Scigelova, М. et al. (1996)). Такой способностью обладают две группы ферментов: гликозилтрансферазы (К.Ф 2.4.Х.) и гликозидгидролазы (К.Ф. З.2.1.Х.), обладающие трансгликозилирующей активностью

In vivo гликозидтрансферазы осуществляют образование гликозидной связи с высокой региоселективностью. Однако существенным недостатком гликозидтрансфераз является их относительно низкая стабильность и необходимость в использовании in vitro в большом количестве дорогих кофакторов (например, уридин дифосфат).

В отличие от гликозидтрасфераз, гликозидгидролазы, относящиеся к классу гидролаз, катализируют образование олигосахаридов с абсолютной стереоспецифичностью без применения кофакторов. К тому же, они продуцируются микроорганизмами в больших количествах, термостабильны и устойчивы в широких диапазонах рН, что важно для их использования в производственных целях. На сегодняшний день описано более сотни различных гликозидгидролаз, способных не только катализировать расщепление гликозидных связей, но также осуществлять перенос гликозильного остатка на другую молекулу (реакция трансгликозилирования). Выделяемые из широкого круга микроорганизмов и растений, они успешно применяются в ферментативном синтезе новых биологически активных веществ (V. Kren and L. Martmkova, (2001); Kathryn

М. Koeller and Chi-Huey Wong, (1999)). Основными недостатками использования большинства ранее полученных траснгликозидаз является их относительно низкая региоселективность и низкий выход продуктов реакции трансгликозилирования. Таким образом, перед исследователями стоит задача выделения гликозидгидролаз с трансгликозилирующей активностью для использования их в реакциях ферментативного синтеза с целью получения строго определенных стереоизомеров с высокой региоселективностью и высоким выходом продуктов реакции. Для этого используются различные приемы. Во-первых, проводят поиск и выделение новых гликозидгидролаз из природных источников, обладающих высокой трансгликозилирующей способностью. Во-вторых, увеличение выхода продуктов реакций трансгликозилирования можно достичь подбором и синтезом новых субстратов, используемых в качестве доноров реакций ферментативного синтеза, катализируемых гликозидгидролазами. В представленной работе, на примере трех гликозидгидролаз ((3-галактозидаза из Penicillium sp., ламинариназа из Oerskovia sp., ламинариназа Spisula sachalinensis), обладающих трансгликозилирующей активностью, продемонстрированы различные стратегии получения олигосахиродов с высокой региоселективностью и высоким выходом. Полученные данные о способности ферментов к проведению трансгликозилирующей реакции и строении их активных центров дают возможность не только эффективно использовать гликозидгидролазы в энзиматическом синтезе, но и получать новую информацию о механизме действия гликозидгидролаз в целом. Цели и задачи исследования

Целью данной работы является исследование реакций трансгликозилирования, катализируемых гликозидгидролазами экзо- и эндодействия, для дальнейшего их использования в синтезе олигосахаридов Исходя из цели работы, были поставлены следующие задачи: 1. Выделить и очистить до гомогенного состояния следующие гликозидгидролазы, обладающие трансглкозилирующей активностью: (З-галактозидазу из Penicillium sp. (фермент экзо-действия) и (3-1.3-глюканазу (ламинариназу) из Oerskovia sp. и |3-1.3-глюканазу из Spisula sachalinensis (ферменты эндо-действия).

2. Исследовать трансгликозилирующие активности изучаемых Р-галактозидазы и р-1.3-глюканаз и идентифицировать спектр продуктов реакций трансгликозилирования методами ЯМР и масс-спектрометрии.

3. Изучить влияние синтетических субстратов, в том числе, 1-0-ацетил-Р-Э-галактопиранозида на выход продуктов реакций трансгликозилирования, катализируемых Р-галактозидазой из Penicillium sp.

4. Использовать реакцию трансгликозилирования, катализируемую ламинариназами, для получения новых флуорофорных и хромофорных субстратов, необходимых для изучения кинетических параметров эндо-глюканаз, в частности, ламинариназы из Rhodothermus marinus.

Научная новизна полученных результатов

В настоящей работе впервые установлено, что Р-галактозидаза из Penicillium sp. является - ферментом, сохраняющим конфигурацию аномерного центра в результате реакции гидролиза субстрата, и обладает трансгликозилирующей активностью. Показано, что впервые синтезированное соединение 1-0-ацетил-р-галактопиранозид является субстратом для реакций гидролиза и трансгликозилирования, катализируемых р-галактозидазой, более эффективным по сравнению с другими субстратами.

Впервые разработаны схемы ферментативного синтеза с использованием ламинариназ бактериального и животного происхождения и получены новые субстраты для ламинариназ, а именно, шра-нитрофенил- и 4-метилумбеллиферил-Р-1,3-глюкоолигосахариды со степенью полимеризации от 2 до 6. Структуры продуктов реакций трансгликозилирования были установлены методами 'Н и |3С ЯМР спектроскопии и масс-спектрометрического анализа. Впервые на основе кинетического анализа гидролиза новых (3-1,3-глюкоолигосахаридов с различной степенью полимеризации обнаружены четыре позиции связывания в гликоновой части активного центра ламинариназы из R. marinus.

Теоретическое и практическое значение работы.

Подробное исследование реакций трансгликозилирования, катализируемых экзо- и эндогликозидгидролазами имеет большое значение для решения как фундаментальных, так и прикладных задач, так как дает возможность эффективно использовать эти ферменты в синтезе различных гликоконьюгатов, а также получать новую информацию о механизме действия гликозидгидролаз экзо- и эндодействия в целом. Основные положения, выносимые на защиту.

1. Новое соединение, 1-О-ацетил-р-О-галактопиранозид, является субстратом для P-D-галактозидазы из Penicillium sp. Использование 1-0-ацетил-(3-0-галактопиранозида в реакции трансгликозилирования позволяет увеличить выход продуктов реакции ферментативного синтеза.

2. Для препаративного ферментативного синтеза PNP и MU-Р-1,3-глюкоолигосахаридов со степенью полимеризации от 2 до 6 целесообразно использовать ламинариназы из Oerskovia sp. и из S. sachalinensis.

3. Впервые полученные PNP- и М/-Р-1,3-глюкоолигосахариды с различной степенью полимеризации эффективны для изучения механизма действия эндо-глюканаз, что показано на примере исследования ламинариназы из R. marinus.

Апробация работы.

Материалы работы были представлены на следующих семинарах и конференциях:

• 2-й Немецко-польско-российский Симпозиум по бактериальным углеводам (Москва, сентябрь 10-12, 2002).

• Политехнический симпозиум «Молодые ученые промышленности Северо-западного региона». (Санкт-Петербург, январь 2005).

• Четвертый Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, март 2007 г.).

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Шишлянников, Сергей Михайлович

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенного исследования были изучены гликозидгидролазы экзо- и эндодействия различного биологического происхождения, обладающие трансгликозилирующей активностью. Разработаны эффективные схемы синтеза биологически значимых углеводных структур с помощью Р-галактозидазы из Penicillium sp., ламинариназ из Oerskovia sp. и из Spisula sachalinensis. Это позволяет существенно раздвинуть рамки использования ферментативного синтеза в различных областях фармакологии и биотехнологии и исключить вредные и экологически опасные технологические процессы.

На основании выполненного исследования могут быть сделаны следующие выводы:

1. р-Галактозидаза из Penicillium sp. гидролизует новое соединение, 1 -О-ацетил-(3-0-галактопиранозид, с сохранением конфигурации аномерного центра.

2. Выход продуктов реакции трансгликозилирования при использовании 1-0-ацетил-(3-О-галактопиранозида увеличивается до 25% по сравнению с использованием других субстратов. Основным продуктом реакции является D-Gal-p-( 1,6)-D-Gal-P-^cefv/.

3. Продуктами реакции трансгликозилирования ламинариназ из Oerskovia sp. и S. sachalinensis с использованием в качестве субстратов природных Рглюканов, а в качестве акцепторов PNP- и MU-p-глюкопиранозидов, являются линейные р1,3-глюкоолигосахариды со степенью полимеризации

97 от 2 до 6, модифицированные соответствующей хромофорной или флуоресцентной меткой.

4. Полученные модифицированные глюкоолигосахариды являются эффективными субстратами для измерения глюканазной активности, что показано на примере исследования механизма реакции, катализируемой ламинариназой из Rhodothermus marinus

5. Анализ значений каталитической эффективности гидролиза модифицированных р1,3-глюкоолигосахаридов со степенью полимеризации от 2 до 6 предполагает наличие четырех позиций связывания в гликоновой части активного центра ламинариназы из Rhodothermus marinus.

Список опубликованных работ по теме

1. Zinin, A.V., Shabalin, К.A., Kulminskaya, A.A., Shishlyannikov, S.M., Neustroev, K.N. (2002) 1-O-Acetyl-beta-D-galactopyranose: A novel substrate for the transglycosylation reaction catalyzed by the beta-galactosidase from Penicillium sp. Carbohydr. Res. 337(7): 635-642.

2. M. Arand, A.M. Golubev, J.R. Brandao Neto, I. Polikarpov, R. Wattiez, O.S. Korneeva, E.V. Eneyskaya, A.A. Kulminskaya, K.A. Shabalin, S.M. Shishliannikov, O.V. Chepurnaya and K.N. Neustroev (2002) Purification, characterisation, gene cloning, and preliminary X-ray data of the exo-inulinase from Aspergillus awamori, Biochem J. 362(1): 131-135.

3. Borriss, R., Krah, M., Brumer III, H., Kerzhner, M.A., Elyakova, L.A., Ivanen, D.R., Eneyskaya, E.V., Shishlyannikov, S.M., Shabalin, K.A., and Neustroev, K.N. (2003)Enzymatic synthesis of 4-methylumbelliferyl (l->3)-beta-D-glucooligosaccharides-new substrates for beta-l,3-l,4-D-glucanase.Car£o/2ydr Res. Jul 4;338(14):1455-67

4. Шишлянников C.M., Неустроев K.H. Трансгликозилирующая активность гликозидгидролаз. Политехнический симпозиум «Молодые ученые промышленности Северо-западного региона» стр. 42 (2005)

5. К. N. Neustroev, A.M. Golubev, М. L. Sinnott, R. Borriss, M. Krah, H. Brumer III, E. V. Eneyskaya, S.Shishlyannikov, K.A. Shabalin, V. T. Peshechonov, V. G. Korolev, A. A. Kulminskaya. Transferase and Hydrolytic Activity of the (3-l,3(4)-Glucanase from Rhodothermus marinus and its mutant forms. Glycoconj. journal v.23. p 499-509 (2006).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шишлянников, Сергей Михайлович, Санкт-Петербург

1. P. Sears, С. Н. Wong, 1998. Enzyme action in glycoprotein synthesis. Cell. Mol. Life Sci. 54:223.

2. Sharon, N.; Lis, H. 1995. Lectins-proteins with a sweet tooth: functions in cell recognition. Essays Biochem. 3: 59

3. Lasky, L. A. 1995. Selectin-carbohydrate interactions and the initiation of the inflammatory response, Annu. Rev. Biochem 64: 113.

4. Weis, W. I.; Drickamer, K. 1996. Structural basis of lectin-carbohydrate recognition, Annu. Rev. Biochem. 65: 441.

5. A. Varki, 1993. Biological roles of oligosaccharides: all of the theories are correct. Glycobiology 3: 97.

6. Rudd P. M., T. Elliott, P. Cress well, I. A. Wilson, R. A. Dwek. 2001. Glycosylation and the immune system. Science. 291: 2370-2376.

7. Helenius, A.How 1994. N-linked oligosaccharides affect glycoprotein folding in the endoplasmic reticulum. Mol. Biol Cell, 5: 253.

8. Trombetta, E. S.; Helenius, A. 1998. Lectins as chaperones in glycoprotein folding Curr. Opin. Struct. Biol, 8: 587.

9. Helenius, A.; Aebi, M. 2001. Intracellular Functions of N-Linked Glycans, Science, 29: 2364.

10. Opdenakker, G.; Rudd, P. M.; Ponting, C. P.; Dwek, R. A. 1993. Concepts and principles of glycobiology FASEBJ., 7: 1330.

11. Cheng H, Cao X, Xian M, Fang L, Cai ТВ, Ji JJ, Tunac JB, Sun D, Wang PG., 2005. Synthesis and enzyme-specific activation of carbohydrate-geldanamycin conjugates with potent anticancer activity. J Med Chem:,48(2): 645-52.

12. K. Igarashi, 1977. The Koenigs-Knorr reaction. Adv. Carbohydr. Chem. Biochem 34: 243.

13. Kathryn M. Koeller and Chi-Huey Wong. 1999. Synthesis of Biologically Active Glycopeptides, J. Chin. Chem. Soc., 46 (5): 659-686.

14. V. Kren and L. Martfnkova. 2001. Glycosides in Medicine: "The Role of Glycosidic Residue in Biological Activity", Current Medicinal Chemistry, 8: 1313-1338.

15. G. Reuter and H.-J. Gabius. 1999. Eukaryotic glycosylation: whim of nature or multipurpose tool?. Cell. Mol. Life Sci. 55: 368-422.

16. Voragen, A.G.J, and Pilnik, W. 1989. ACS Symposium Series 389, Eds. Whitaker, J.R. and Sonnet, Ph. E.: 93-115.

17. Hidaka, H., Eida, Т., Hashimoto, K., and Nakazawa, T. 1987. Eur. Patent, 0,133,547.

18. Davies GJ, Wilson KS, Henrissat B. 1997. Nomenclature for sugar-bindingsubsites in glycosyl hydrolases. Biochem J. 321 ( Pt 2): 557-9.

19. Henrissat, В. 1991. A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similariries. Biochem. J. 280: 309-316.

20. Henrissat B, Callebaut I, Fabrega S, Lehn P, Mornon J-P & Davies G 1995. Conserved catalytic machinery and the prediction of a common fold for several families of glycosyl hydrolases. Proc Natl Acad Sci USA 92: 7090-7094.

21. Henrissat В & Davies G 1997. Structural and sequence-based classification of glycoside hydrolases. Curr Opin Struct Biol 7: 637-644.

22. Henrissat В & Davies G. 2000. Glycoside hydrolases and glycosyltransferases. Families, modules, and implications for genomics. Plant Physiol 124: 1515-1519.

23. Bourne Y & Henrissat B. 2001. Glycoside hydrolases and glycosyltransferases: families and functional modules. Curr Opin Struct Biol 11 : 593-600.

24. Henrissat В & Romeu A. 1995. Families, superfamilies and subfamilies of glycosyl hydrolases. Biochem J. 311: 350-351.

25. Henrissat В & Davies G. 2000. Glycoside hydrolases and glycosyltransferases. Families, modules, and implications for genomics. Plant Physiol 124: 1515-1519.

26. Gebler J, Gilkes NR, Claeyssens M, Wilson DB, Beguin P, Wakarchuk WW, Kilburn DG, Miller RC Jr, Warren RA, Withers SG. 1992. Stereoselective hydrolysis catalyzed by related beta-l,4-glucanases and beta-l,4-xylanases. J Biol Chem. 267(18): 12559-61.

27. Henrissat В, Bairoch A. 1996. Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases. Biochem J. 316: 695-6.

28. Davies G, Henrissat B. 1995. Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases. Structure. 3(9): 853-9.

29. Henrissat B, Davies G. 1997. Structural and sequence-based classification of glycoside hydrolases. Curr Opin Struct Biol. 7(5): 637-44.

30. Wolfenden R., Lu X., and Young G., 1998. Spontaneous hydrolysis of glycosides. J. Am. Soc. 120: 7532-7533.

31. Koshland, D.E. 1953. Stereochemistry and the mechanism of enzymatic reactions E.Biol.Rev., 28: 416.

32. Sinnott, M.S. 1990. Stereochemistry and the mechanisms of enzymatic glycosyl transfer. Chem. rev., 90: 1171-1202.

33. C.B. Post, M.Karplus. 1986. Does lysozyme follow the lysozyme pathway? An alternative based on dynamic, structural and stereoelectronic considerations. J.Am.Chem.Soc. 108: 1317.

34. Markovic-Housley Z, Miglierini G, Soldatova L, Rizkallah PJ, Muller U, Schirmer T. 2000. Crystal structure of hyaluronidase, a major allergen of bee venom., Structure. 8(10): 1025-35.

35. Watts AG, Damager I, Amaya ML, Buschiazzo A, Alzari P, Frasch AC, Withers SG. 2003. Trypanosoma cruzi trans-sialidase operates through a covalent sialyl-enzyme intermediate: tyrosine is the catalytic nucleophile, J Am Chem Soc. 125 (25): 7532-3.

36. McCarter J.D., and S.G. Withers. 1994. Mechnism of enzymatic glycoside hydrolysis. Curr. Opin. Struct. Biol. 4: 885-892.

37. Withers S.G. 2001. Mechanism of glycosyltransferase and hydrolase. Carbohydr. Poly. 44: 325-337.

38. Usui T, Kubota S, Ohi H. 1993. A convenient synthesis of beta-D-galactosyl disaccharide derivatives using the beta-D-galactosidase from Bacillus circulans. Carbohydr Res. 244(2):315-23.

39. Zeng X, Yoshino R, Murata T, Ajisaka K, Usui T. 2000. Regioselective synthesis of p-nitrophenyl glycosides of beta-D-galactopyranosyl-disaccharides by transglycosylation with beta-D-galactosidases. Carbohydr Res. 325(2): 120-31.

40. Нага К, Fujita К, Kuwahara N, Tanimoto T, Hashimoto H, Koizumi К, Kitahata S., 1994. Galactosylation of cyclodextrins and branched cyclodextrins by alpha-galactosidases. Biosci Biotechnol Biochem. 58(4): 652-9.

41. Fujimoto, H., Nishida, H., and Ajisaka, K. 1988. Agric. Biol. Chem. 52: 1345-1351

42. Nikolov, Z. L., Meagher, M. M., and Reilly, P. J. 1989. Biotechnol. Bioeng. 34, 694-704.

43. P.J.Halling. 1994. Thermodynamic predictions for biocatalysis in nonconventional media: Theory, tests, and recommendations for experimental design and analysis Enzyme Microb. Technol. 16: 178.

44. Oikawa T, Tsukagawa Y, Chino M, Soda K. 2001. Increased transglycosylation activity of Rhodotorula glutinis endo-beta-glucanase in media containing organic solvent, Biosci Biotechnol Biochem.65(8): 1889-92.

45. S.W.M. Kengen, E.J. Luesink, A.J.M. Stams, A.J.B. Zehn- der. 1993. Eur. J. Biochem. 213:305.

46. Eun-Su Ji, Nyun-Ho Park and Deok-Kun Oh. 2005. Galacto-oligosaccharide production by a thermostable recombinant b-galactosidase from Thermotoga maritima, World Journal of Microbiology & Biotechnology 21:759-764.

47. Spencer J. Williams, Stephen G. Withers. 2000. Glycosyl fluorides in enzymatic reactions, Carbohydr. Res. 327: 27-46.

48. C. Andre, P. Spangenberg, E. Gentil and C. Rabiller. 2001. Study by means of in situ 19F NMR of the enzymatic transglycosylation reactions using 1-fluoro-a-glycosides as donors and acceptor Tetrahedron, Asymmetry, 12: 779.

49. S. Komba and Y. Ito. 2001. Tetrahedron Lett., 42: 8501.

50. P. Spangenberg, C. Andre, V. Langlois, M. Dion and C. Rabiller. 2002. Alpha-galactosyl fluoride in transfer reactions mediated by the green coffee beans alpha-galactosidase in ice. Carbohydr. Res., 337: 221.

51. Mariko Miyasato and Katsumi Ajisaka. 2004. Regioselectivity in |3-Galacosidase-catalyzed Transglycosylation for the Enzymatic Assembly of D-galactosyl-D-mannose. Biosci. Biotechnol. Biochem., 68: 2086-2090.

52. Xiaoxiong Zeng, Rika Yoshino, Takeomi Murata, Katsumi Ajisaka, Taichi Usui. 2000. Regioselective synthesis of p-nitrophenyl glycosides of p-D-galactopyranosyl-disaccharides by transglycosylation with b-D-galactosidases. Carbohyd. Res. 325: 120-131.

53. L.F. Mackenzie, Q.P. Wang, R.A.J. Warren, S.G. Withers. 1998 J. Am. Chem. Soc. 120: 5583-5584.

54. Kim YW, Lee SS, Warren RA, Withers SG. 2004. Directed evolution of a glycosynthase from Agrobacterium sp. increases its catalytic activity dramatically and expands its substrate repertoire. J Biol Chem. 279(41): 42787-93.

55. Fujimoto H, Miyasato M, Ito Y, Sasaki T, Ajisaka K. 1998. Purification and properties of recombinant beta-galactosidase from Bacillus circulans. Glycoconj J. 15(2): 155-60.

56. Mozdziak, Paul E; Pophal, Simone; Borwornpinyo, Suparerk; Petitte, James 2003. Transgenic chickens expressing beta.-galactosidase hydrolyze lactose in the intestine 1. Journal of Nutrition, 133: 3076.

57. Frost RG, Holmes EW, Norden AG, O'Brien JS. 1978. Characterization of purified human liver acid beta-D-galactosidases A2 and A3 .Biochem J. 175(1): 181-8.

58. Chinchetru MA, Cabezas J A, Calvo P. 1983. Characterization and kinetics of beta-D-gluco/fuco/galactosidase from sheep liver. Comp Biochem Physiol B. 75(4):719-28.

59. C. Scheckermann, F. Wagner. 1997. Galactosylation of antibiotics using the b-galactosidase from Aspergillus oryzae, L. Fischer Enzyme and Microbial Technology, 20 (8): 629-634.

60. R.E. Mouton, M.E. Venable. 2000. Ceramide induces expression of the senescence histochemical marker, b-galactosidase, in human fibroblasts. Mechanisms of Ageing and Development, 113:169-181.

61. Hartz PA, Wilson PD. 1997. Functional defects in lysosomal enzymes in autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD): abnormalities in synthesis, molecular processing, polarity, and secretion, Biochem Mol Med. 60(l):8-2.

62. F. Morgan, D. Molle, G. Henry, J. Leonil, Y. Le Graet, S.S. Bouhallab. 1999. Resistance of b-lactoglobulin-bound lactose to the hydrolysis by b-galactosidase, International Dairy Journal, 11:813-816.

63. Vetere A, Paoletti S. 1998. Separation and characterization of three beta-galactosidases from Bacillus circulans. Biochim Biophys Acta. 1380(2):223-31.

64. Ogawa T, Kitajima T, Nukada T. 1983. Synthesis of a nonahexosyl unit of a complex type of glycan chain of a glycoprotein. Carbohydr. Res. 123(1): C8-1.

65. Nilsson, K. G. I. 1987. Carbohydr. Res., 167: 95-103.

66. Hedbys L, Johansson E, Mosbach K, Larsson PO, Gunnarsson A, Svensson

67. S, Lonn H. 1989. Synthesis of Gal beta l-3GlcNAc and Gal beta l-3GlcNAc beta

68. SEt by an enzymatic method comprising the sequential use of beta-galactosidasesfrom bovine testes and Escherichia coli., Glycoconj J.;6(2): 161-8.108

69. Cantacuzene D, Attal S, Bay S. 1991. Synthesis of alpha and beta-glycopyranosyl-serine derivatives by enzymic transglycosylation, Biomed BiochimActa. 50(10-11): S231-6.

70. Bay, S.; Namane, A.; Cantacuzene, D. 1993. Carbohydr. Res., 248: 317-325

71. Maeda M, Nisizawa K. 1968. Laminaran of Ishige okamurai. Carbohydr. Res. 7: 94-97.

72. Usui T, Toriyama T, Mizuno T. 1979. Structural investigation of laminaran of Eisenia bicyclis. Agric Biol Chem 43: 603-611.

73. Elyakova LA, Zvyagintseva TN. 1974. A study of the laminarins of some Far-Eastern, brown seaweeds. Carbohydr. Res. 34: 241-248.

74. Rouhier P, Kopp M, Begot V, Bruneteau M, Fritig B. 1995. Structural features of fungal beta-D-glucans for the efficient inhibition of the initiation of virus infection on Nicotiana tabacum., PhytochemisrteyL 39(1): 57-62.

75. Sasaki T, Takasuka N, Chihara G, Maeda YY. 1976. Antitumor activity of degraded products of lentinan: its correlation with molecular weight, Gann. 67(2):191-5.

76. Reagents for immunology. \99§.Nature. 346: 591.

77. Lepagnol-Descamps V, Richard С, Lahaye M, Potin P, Yvin JC, Kloareg B. 1998. Purification and determination of the action pattern of Haliotis tuberculata laminarinase, Carbohedr. Res;310(4):283-9.

78. Barbeyron T, Gerard A, Potin P, Henrissat B, Kloareg B. 1998. The kappa-carrageenase of the marine bacterium Cytophaga drobachiensis. Structural and phylogenetic relationships within family-16 glycoside hydrolases., Mol Biol Evol. 15(5):528-37.

79. Hoj PB, Fincher GB. 1995. Molecular evolution of plant beta-glucan endohydrolases, Plant J. 7(3):367-79.

80. S.H Shen, P. Chretien, L. Bastian, and S.N. Slilaty. 1991. Primary sequence of the glucanase gene from Oerskovia xanthineolytica, J. Mol. Biol., 266: 10581063.

81. Michel C, Chantalat L, Duee E, Barbeyron T, Henrissat B, Kloareg B, Dideberg O. 2001. The (3-carrageenanase of P. carrageenovora features a tunnel-shaped active site: a novel insight in the evolution of clan В glycoside hydrolases, Structure 9:513-525.

82. Allouch J, Jam M, Helbert W, Barbeyron T, Kloareg B, Henrissat B, Czjzek M. 2003. The three-dimensional structures of two (3-agarases, J. Biol. Chem., 278: 47171-47180.

83. Planas A. 2000.Bacterial l,3-l,4-f3-glucanases: structure, function and protein engineering, Biochim. Biophys. Acta, 1543:361-382.

84. Gueguen, Y., Voorhorst, W. G. В., van der Oost, J. & de Vos, W. 1997. Molecular and biochemical characterization of an endo-/?-l,3-glucanase of the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus, J. Biol Chem. 272: 3125831264.

85. Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук. Молекулярное клонирование. Мир. 1984, стр. 240-241.

86. Laemmli UK., 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227(5259):680-5.

87. Lowry, O.H; Rosenbrough, N.J.; Farr, A.L.; Randall, R.J. 1951. Protein measurement with the Folin phenol reagent, J. Biol Chem. 193: 265-275.

88. Somogyi, M. 1952. Notes on sugar determination. J Biol Chem. 195:19-23.

89. Lloyd, J. В.; Whelan, W. J. 1969. An improved method for enzymic determination of glucose in the presence of maltose, Anal Biochem. 30: 467-470.

90. Dixon, M., 1953. The determination of enzyme inhibitor constants, Biochem. J., 55:170-171.1.l

91. Hiromi, K., Ohnishi, M., and Tanaka, A. 1983. Subsite structure and ligand binding mechanism of glucoamylase. Mol. Cell. Biochem. 51: 79-95.

92. Nagy Z, Kiss T, Szentirmai A, Biro S. 2001. Beta-galactosidase of Penicillium chrysogenum: production, purification, and characterization of the enzyme Protein Expr Purif. 21(1): 24-9.

93. Gebler, J.; Gilkes, N. R.; Claeyssens, M.; Wilson, D. В.; Beguin, P.; Wakarchuk, W. W.; Kilburn, D. G.; Miller, R. C., Jr.; Warren, R. A. J.; Withers, S. G. 1992. J. Biol. Chem. 267: 12559-12561.

94. Brumer, H. Ill; Sims, P. F. G.; Sinnott, M. L. 1999. Lignocellulose degradation by Phanerochaete chrysosporium: purification and characterization of the main alpha-galactosidase. Biochem. J. 339: 43-53.

95. Abel, M.; Planas, A.; Christensen, U. 2001. Biochem. J., 357:195-202.

96. Savel'ev, A. N.; Ibatullin, F. M.; Eneyskaya, E. V. Kachurin, A. M.;

97. Neutroev, K. N. 1996.Carbohydr. Res. 296: 261-273.

98. Konstantinidis, A.; Sinnott, L. 1991. The interaction of 1-fluoro-D-glucopyranosyl fluoride with glucosidases. Biochem. J. 279:587-593.

99. Williams, S. J.; Withers, S. G. 2000. Glycosyl fluorides in enzymatic reactions. Carbohydr. Res., 327: 27-46.

100. Spangenberg, P.; Andre, C.; Dion, M.; Rabiller, C.; Mattes, R. 2000. Comparative study of new alpha-galactosidases in transglycosylation reactions. Carbohydr. Res. 329:65-73.

101. Nilsson, K. G. 1987. A simple strategy for changing the regioselectivity of glycosidase-catalysed formation of disaccharides. Carbohydr. Res. 167: 95-103.

102. Van Laere, К. M. J.; Hartemink, R.; Beldman, G.; Pitson, S.; Dijkema, C.; Schols, H. A.; Voragen, A. G. 1999. Transglycosidase activity of Bifidobacterium adolescentis DSM 20083 alpha-galactosidase. Appl. Microbiol. Biotechnol, 52: 681-688.

103. M. Arand, A.M. Golubev, J.R. Brandao Neto, I. Polikarpov, R. Wattiez, O.S.

104. Korneeva, E.V. Eneyskaya, A.A. Kulminskaya, K.A. Shabalin, S.M.113

105. Shishliannikov, O.V. Chepurnaya and K.N. Neustroev. 2002. Purification, characterisation, gene cloning, and preliminary X-ray data of the exo-inulinase from Aspergillus awamori. Biochem. J. 362(1): 131-135.

106. Zvyagintseva, T.N.; Makar'eva, T.N.; Ermakova, S.P.; Elyakova, L.A. 1998. Synthesis of p-nitrophenyl laminarioligosides via transglycosylation reaction catalyzed by endo-l,3-beta-D- glucanase from marine mollusk Russian J. Bioorg. Chem. 24:219-223.

107. Wong, C.H.; Whitesides, G.M.; Baldwin, J.E.; Magnus, P.D. 1994. Enzymes in Synthetic Organic Chemistry, Tetrahedron Organic Chemistry Series, Pergamon, Oxford 5: 252-311.

108. Stowell, C.P.; Lee, Y.C. 1980. Neoglycoproteins: the preparation and application of synthetic glycoproteins. Adv. Carbohyd. Chem. Biochem., 37: 225281.

109. Malet, C.; Validot, J.L.; Ochoa, A.; Gallego, В.; Brosa, C.; Planas, A. 1995.

110. Synthesis of 4-methylumbelliferyl-beta-D-glucan oligosaccharides as specific114chromophoric substrates of (1—»3),(1—>4)-beta-D-glucan 4-glucanohydroIases. Carbohydr. Res., , 274: 285-301.

111. Нед, P. В.; Rodriguez,E. В.; Stick, R. V.; Stone, B. A. 1989. J. Biol. Chem. 264: 4939-4947.

112. Wood, P. J. 1981. Carbohydr. Res. 94: 35-39.

113. J. van Lieshout, M. Faijes, J. Nieto, J. van der Oost and A. Planas. 2004. Hydrolase and glycosynthase activity of endo-l,3-(3-glucanase from the thermophile Pyrococcus furiosus, Archaea 1: 285-292.

114. Abel, M.; Planas, A.; Christensen, U. 2001. Biochem J. 357: 195-202.