Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
О-гликозилгидролазы морских мицелиальных грибов
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "О-гликозилгидролазы морских мицелиальных грибов"
На правах
БУРЦЕВА Юлия Валериевна
О-ГЛИКОЗИЛГИДРОЛАЗЫ МОРСКИХ МИЦЕЛИАЛЬНЫХ ГРИБОВ
03.00.04 - биохимия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Владивосток 2003
Работа выполнена в Тихоокеанском институте биоорганической химии Дальневосточного отделения
Российской академии наук
Научный руководитель:
кандидат химических наук Сова В.В.
Научный консультант:
доктор химических наук Звягинцева Т.Н.
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук Пивненко Т.Н. кандидат химических наук Мензорова Н.И.
Ведущая организация: Институт органической химии им Н Д Зелинского РАН
Защита состоится " 10 " июня 2003 г. в iO часов на заседании диссертационного совета Д 005 005 01 в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу. 690022, г Владивосток, Проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ Факс (4232) 31-40-50
С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (Владивосток, Проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН)
Автореферат разослан " 5 * мая 2003 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, к.х.н.
Прокопенко Г.И
2-ооЗ-А
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Значительный интерес к О-гликозилгидролазам и, в частности к 1,3-р-0-глюканазам, связан с их важной ролью в жизнедеятельности микро- и макроорганизмов. 1,3-р-1Э-Глкжаназы входят в состав пищеварительных ферментов морских и наземных беспозвоночных, РК-белков высших растений, участвуют в репродуктивных процессах и защитных реакциях различных организмов Способность этих ферментов расщеплять клеточные глюканы определяет не только их прямое участие в утилизации углеводсодержащих биополимеров различными организмами, но и регуляторную функцию в клетке. Еще одной важной причиной внимания к 1,3-Р-0-глюканазам является возможность их применения в качестве новых катализаторов для различных биотехнологических процессов. Расширение общих знаний
0 глюканазах и, особенно, получение новых ценных препаратов для биотехнологии может дать изучение ферментных систем морских мицелиальных грибов.
Обитатели моря являются самой малоизученной среди экологических групп грибов Биохимические и морфологические характеристики морских грибов обусловлены влиянием таких специфических факторов среды обитания, как высокая концентрация солей, относительная гипоксия, гидростатическое давление, слабо щелочное рН, низкие температуры. Исследованиями микологов показано, что основная численность экологической группы грибов моря представлена вторичными морскими грибами. Адаптацию грибов в море, в первую очередь, обеспечивают ферментные системы, свойства которых могут отличаться от ферментных систем наземных видов. Морские грибы, обладающие эффективным и разносторонним ферментным аппаратом, активно участвуют в жизни моря и являются одним из звеньев пищевых цепей
Большая часть работ по ферментам морских грибов традиционно посвящена целлюлазам Однако показано, что эта организмы способны продуцировать и другие О-гликозилгидролазы: 1,3-р-0-глюканаэы, амилазы, гликозидазы. Поэтому актуальными являются систематические исследования распространения О-гликозипгидролаз в морских грибах, поиск перспективных продуцентов, разработка методов выделения ферментов, исследование их свойств, специфичности, механизма действия и возможности практического использования в научных исследованиях и биотехнологических процессах.
Цель и задачи исследования. Целью работы является поиск, выделение и характеристика свойств 1,3-|3-0-глюканаз морских мицелиальных грибов Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1 Изучение распространения О-гликозилгидролаз в морских грибах, собранных в различных регионах Тихого океана.
2. Выбор новых продуцентов 1,3-р-О-глюканаз.
3. Подбор оптимальных условий культивирования продуцентов для повышения синтеза ими 1,3-р-О-
4. Разработка методов выделения 1,3-р-0-глюканаз из двух видов грибов: СЬаеЬтшт /гкЬсит и ТпФодегта аигв^пбв.
5. Исследование свойств, специфичности, типа действия и возможностей применения выделенных
глюканаз.
ферментов.
6. Изучение способов регуляции активности и состава О-гликозилгидропаз в морских грибах
Положения, выносимые на защиту: 1. Среди морских мицелиальных грибов имеются продуценты как отдельных О-гликозилгидролаз, так и
широкого набора этих ферментов
НАЦИОНАЛЬНАЯ
2. 1,3-p-D-rлюканазы морских грибов Ch. indicum и Т. aureviride, устойчивые к изменению температуры и рН, специфичны к р-1,3-связям в глюканах и являются ферментами экзо-типа действия (1,3-|3-0-глюкан-глюканогидролазы КФ 3.2.1.58). 3 Эндо-1,3-р-С>-глюканазы из различных источников отличаются по способности катализировать реакцию трансгликозилирования. Экзо-1.3-р-О-глюканазы морских фибов и наземного моллюска Bulota maakli не обладают трансгликозилирующей активностью. 4. Возможно использование 1,3-р-О-глкжаназ морских мицелиальных фибов в исследованиях структуры и функции углеводсодержащих биополимеров.
Научная новизна и практическая значимость работы. Изучено распространение некоторых О-гликозилгидролаз среди морских мицелиальных фибов. Выявлены ранее неизвестные продуценты как отдельных О-гликозилгидролаз, так и широкого набора ферментов. Впервые детально исследованы физико-химические и каталитические свойства 1,3-р-0-глюканаз двух видов факультативных морских фибов Ch indicum и Т. aureviride: оптимумы рН и температуры, молекулярные массы и Km, тип действия, специфичность, влияние природных ингибиторов и фупп-специфичных реагентов. Экзо-1,3-р-0-глюканаза Ch. indicum была успешно использована в научных исследованиях для установления природы ингибитора 1,3-р-0-глюканаз из бурой водоросли и для подтверждения структуры глюкана клеточной стенки морского гриба Ph. glomerate. Показана возможность применения метаболитов бурых водорослей для направленного регулирования процессов синтеза ферментов морскими фибами Экзо-ферменты морских грибов, осуществляющие глубокий гидролиз глюканов с образованием глюкозы, могут быть рекомендованы для использования в биотехнологических целях' для получения глюкозы ферментативным способом из природного сырья, содержащего p-D-глюканы; разрушения клеточных стенок растений и микроорганизмов с целью более полной экстракции полезных веществ и для утилизации отходов микробиологических производств.
Апробация работы. Результаты работы были доложены на:
• 2-м Всероссийском Биохимическом съезде, Москва, 1997;
• Региональной естественнонаучной конференции "Актуальные проблемы морской биологии и экологии ДВ России", Владивосток, 1998;
• Научной конференции ТИБОХ ДВО РАН "Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии", Владивосток, 1998;
• 2nd IUPAC International Conference on Biodiversity, Belo Horizonte, MG, Brazil, 1999;
• Phytochemical Society of Europe Symposium "Future Trends in Phytochemistry", Rolduc, Netherlands, 2000,
• Всероссийской конференции "Химия и технология растительных веществ", Сыктывкар, 2000;
• 2-м Международном симпозиуме "Химия и химическое образование", Владивосток 2000;
• Научной конференции ТИБОХ ДВО РАН "Биоактивные вещества из морских макро- и микроорганизмов и наземных растений", Владивосток, 2001;
• 8th International Marine and freshwater mycology symposium, Hurghada, Egypt, 2001;
• 1-ом съезде микологов России, Москва, 2002;
• 2nd German-Polish-Russian Meeting on Bacterial Carbohydrates, Москва, 2002,
• Конференции НОЦ ДВГУ "Фундаментальные исследования морской биоты", Владивосток, 2002.
Публикации. По материалам исследования опубликовано 13 научных работ
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Список литературы включает 2S2 публикации. Диссертация изложена на 137 стр. машинописного текста, содержит 13 таблиц и él рисунок
Работа выполнена в лаборатории химии ферментов совместно с лабораторией микробиологии (к б н. Пивкин М В.) ТИБОХ ДВО РАН.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Материалы и методы исследования
Объектами исследования служили 103 штамма морских мицелиальных грибов. Грибы были собраны в ходе экспедиций на НИС "Академик Опарин" в районе Курильских островов, в заливах Японского моря и Южно-Китайском море из различных мест обитания (живущие в грунте, а также ассоциированные с бурыми водорослями и морскими беспозвоночными). В настоящее время они хранятся в коллекции морских микроорганизмов, лаборатории микробиологии ТИБОХ ДВО РАН. Грибы культивировали на модифицированной среде Тубаки следующего состава: 1л морской воды, 2 г неочищенного пластинчатого агара, 1 г пептона, 1 г КН2РОч, 0,5 г дрожжевого экстракта, 0,5 г MgS04 х 7 Н20, 0,02 г FeSO«, pH 7,0 (Методы..., 1982).
Активность 0-глииозипгидролаз определяли на стационарной фазе развития грибов. Стандартная реакционная смесь содержала 20 мкп раствора фермента и 500 мкл раствора субстрата (1 мг/мл) в 0,05 М сукцинатном буфере, pH 5,2. Время инкубации 20 мин при 37°С. За единицу активности принимали количество фермента, которое катализирует образование 1 мкмоля глюкозы (л-нитрофенола) за 1 мин в условиях определения. Удельную активность выражали в ед./мг белка. Статистическую обработку данных проводили при помощи критерия Стьюдента Данные представлены как среднее значение ± se трех независимых измерений.
Концентрацию балков устанавливали по методу Лоури (Lowry et al, 1951).
Восстанавливающие сахара определяли методом Нельсона (Nelson, 1944).
Определение нейтральных Сахаров осуществляли фенол-сернокислотным методом (Dubois et al, 1956)
ДСН-ПААГ-электрофорез проводили в 9-20 %-ном полиакриламидном геле по методу Лэммли (Laemmli, 1970).
Для очистки 1,3-р-й-глюканаз использовали следующие методы' осаждение сульфатом аммония, ультрафильтрацию на мембранах РМ-10, РМ-30 ("Amicon", Голландия), гель-фильтрацию на биогеле Р-200 ("BIO-RAD", США), сефарозе CL-6B ("Pharmacia", Швеция) и Superdex 75 HR 10/30 (АКТА FPLC, "Pharmacia biotech", Швеция), ионообменную хроматографию на КМ-целлюлозе ("Whatman", Англия), на 15 О РЕ и 15 S РЕ (АКТА FPLC, "Pharmacia biotech", Швеция), гидрофобную хроматографию на фенил-сефарозе 6 Fast Flow ("Sigma", США).
Продукты гидролиза ламинарана анализировали на автоматическом анализаторе Jeol-JLC-6AH ("Jeol", Япония) с колонкой биогеля Р-2 (0,9x90 см) в 0,05 М натрий-ацетатном буфере, pH 5,2, содержащем 0,2 М NaCI, со скоростью 7-9 мл/ч. Сахара обнаруживали реакцией с орцин-сернокислотным реагентом (440 нм).
Исследование продуктов трансгликозилироеания осуществляли методом ВЭЖХ на хроматографе Du Pont серии 8800 ("Beckman", США) с колонкой Ultrasit"NH2 (10x250 мм) в системе ацетонитрил:Н20 (80 20).
Молекулярные массы 1,3-/3-0-глюканаз были установлены гель-фильтрацией на колонке с биогелем Р-200 для Ch indicum и на колонке с сефарозой CL-6B для T. aurevinde. В качестве стандартов использовали белки с известными молекулярными массами
Константы Михаэлиса рассчитывали из графиков Лайнуивера-Берка (Диксон, Уэбб, 1961).
Систематический анализ состава и уровня активности О-гликозилгидролаз морских мицелиальных грибов до настоящего времени практически не проводился. Подобные исследования необходимы не только для выбора объекта для углубленного химического изучения, но могут быть полезными при решении вопросов хемотаксономии и экологии микроорганизмов
О-Гликоэил гидролазы были обнаружены в культуральной жидкости 70 штаммов морских грибов из 103 проанализированных. Гликозидазы были представлены: р-Р-глюкозидазы - в 47, Ы-ацетип-р-Б-глюкозаминидазы - в 36, р-О-галактозидазы - в 9, а-О-маннозидазы - в 5 штаммах. Среди ферментов, расщепляющих полисахариды, наиболее распространенными оказались амилазы (найдены в 38 штаммах) и 1,3-р-О-глюканазы (в 33 штаммах), в то время как ферменты, деградирующие пустулам (6 штаммов) и КМ-целлюлозу (4 штамма) встречались редко. Ферменты, гидролизующие агар, галакган и фукоидан в описанных условиях не были обнаружены ни в одном из штаммов
Было подтверждено, что среда обитания оказывает существенное влияние на состав ферментной системы факультативных грибов Выявлены некоторые закономерности в продуцировании 0-гликозилгидролаз морскими грибами (рис 1)
Рис 1. О-Гликозилгидролазы морских грибов из различных мест обитания. Цифры в скобках - число штаммов.
1,3-Р-О-Глюканазы, амилазы и М-ацетил-Р-О-глюкозаминидазы широко представлены в грибах, обитающих в грунте, р-Р-глюкозидазы и Р-О-галактозидазы преимущественно обнаружены в грибах.
2. Результаты и обсуждение 2.1. Распространение О-гликозилгидролаз в морских мицелиальных грибах
N-Ac-p-D-глюкозаминидаза НИ p-D-глюкозвдаза ESS3 p-D-галактозидаза ^Н a-D-маннозидаза ИНИН пустуланаза ШШ целпюлаза
13-Р-Ц-глюканаза амилаза
Беспозвоночные (30) Водоросли (24) Грунт (49)
живущих на поверхности водоросли. Среди О-гликозилгидролаз, присутствующих в грибах, ассоциированных с морскими беспозвоночными, преобладает амилаза.
Можно отметить, что более широкий спектр О-гликозилгидролаз наблюдался у морских грибов, собранных в районе Курильских островов и более обедненный - у обитателей Южно-Китайского моря Распределение ферментов углеводного обмена в грибах различных родов представлено на рис 2.
Проведенные исследования позволили выявить ряд штаммов, представляющих интерес в качестве возможных продуцентов как отдельных О-гликозилгидролаз (Penicillium verrucosum var. verrucosum, Wardomyces inflatus, Chaetomium olivaceum), так и широкого набора ферментов (Cft mdicum, Trichoderma aurevinde, Aspergillus flaws), расщепляющих углеводсодержащие соединения
1,3-р-О-глюканаза амилаза
N-Ac-ß-D-глюкозаминидаза
_____! ß-D-глюкозидаза
Y////A ß-D-галактозидаза Я^Н a-D-маннозидаза К^Я пустуланаза HHI целлюлаза
ьч а о;
•2 ^
С О ¡S
м О
И § 3 § J а
И Hl -
g. « s; о < S ^ Ü
й--8
ч
Рис. 2. Распределение О-гликозилгидролаз среди представителей различных родов морских мицелиальных грибов.
2.2. Влияние источника углерода в питательной среде на синтез 1,3-р-13-глюканазы морским грибом СЬ. iпdlcum
Для углубленного исследования была выбрана 1,3-р-О-глюканаза морского факультативного гриба СЛ. Шюит. С целью выбора оптимальных условий для роста культуры мицелиального гриба С/7. ¡псИсит и синтеза 1,3-Р-О-глюканазы была изучена зависимость синтеза фермента от используемого источника углерода (табл 1). Продуцирование 1,3-р-О-глюканазы происходило при использовании всех изученных Таблица 1. Влияние различных веществ на синтез 1,3-р-О-глюканазы в СЬ mdlcum
Вещества Концентрация Удельная активность 1,3-Р-0-глюканазы
ламинаран 0,5 г/л 0,19 ±0,020
ламинаран 1 г/л 0,58 ±0,018
ламинаран 2 г/л 0,76 ± 0,049
ламинариолигосахариды 2 г/л 0,44 ±0,021
глюкоза 10-гМ 0,41 ± 0,042
агар 2 г/л 0,60 ±0,025
хитозан 2 г/л 0,06 ± 0,007
глицерин 10'М 0,03 ±0,003
* - удельная активность ¡ерментов выражена в мкмоль/мг белка.
источников углерода, что позволяет считать ее конститутивным ферментом. Максимальная удельная активность фермента обнаружена в культуральной жидкости при использовании в качестве источника углерода ламинарана в концентрации 2 г/л Можно предположить, что синтез 1,3-|3-0-глюканазы подвержен катаболической репрессии Свойства репрессоров проявили глицерин и хитозан
2.3. 1,3-р-О-Гпюканаза морского гриба СЬав^тшт 1п<Лсит После центрифугирования культуры гриба были получены две фракции: супернатант (культуральная жидкость) и осадок (мицелий гриба) В культуральной жидкости СЬ тЛсит кроме 1,3-р-О-глюканазы содержалась амилаза, целлюлаза, р-О-глюкозидаза, Р-О-галактозидаза и М-ацетил-р-О-глюкозаминидаза. В мицелии 1,3-р-0-глюканаза не была обнаружена Подобрана комбинация методов-ионообменная хроматография на КМ-целлюлозе, ультрафильтрация и гель-фильтрация на биогеле Р-200, которая позволила выделить из культуральной жидкости морского гриба СЛ. тЛсит с выходом 1,2 % препарат 1,3-Р-Р-глюканазы (2,7 ед активности), не содержащий сопутствующих О-гликозилгидролаз Последовательность стадий очистки представлена на рисунке 3.
Рис. 3 Схема очистки 1,3-р-О-глюканазы морского гриба СП. /лй/сит.
Проведены исследования некоторых свойств, наиболее важных для характеристики фермента. График зависимости активности 1,3-р-О-глюканазы от рН имел два максимума, при рН 4,4 и 5,6 (рис.4). Не исключено, что в препарате 1,3-р-О-глюканазы содержатся 2 формы фермента, имеющие очень близкие значения изоэлектрических точек и молекулярных масс. Температурный оптимум 1,3-р-О-глюканазы составлял 65°С (рис. 5). Фермент обладал достаточно высокой термо- (рис. 6) и рН стабильностью В течение суток при комнатной температуре он не изменял активность в диапазоне рН от 4,5 до 7,5 и только в кислой области (рН 3 и 4) инактивировался за 3 ч.
А
10-| 750 —■—Нативный фермент
- - Фермент после 8 , тепловой обработки при 55° С
в течение 10 минут ■ ■ * - • фермент после
тепловой обработки при 550 С в течение 20 минут
420
3 4 5 6 7
РН
Рис 4 рН-Оптимум 1,3-(3-Р-глюканазы в цитрат-фосфатном буфере. А „,„
0 20 40 60
Рис. 5. Температурный оптимум 1,3-р-О-глюканазы Ch. indicum.
При исследовании тепловой инактивации было замечено, что форма 1,3-р-О-глюканазы, имеющая оптимум рН при 5,6, инакгивируется несколько быстрее (рис. 4).
По данным гель-хроматографии на биогеле Р-200 молекулярная масса фермента составляла около 54 кДа. Согласно данным ДСН-ПААГ-злектрофореза препарат содержал два белка с молекулярными массами 63 и 70 кДа. Более низкие значения молекулярных масс, полученные гель-фильтрацией, объясняют способностью некоторых 1,3-р-О-глюканаз сорбироваться на матрице носителя Величина Km для 1,3-р-О-глюканазы Ch. indicum при использовании ламинарана как субстрата составляла 0,1 мг/мл
Для выяснения роли отдельных функциональных групп для каталитической активности 1,3-р-О-глюканазы применили метод ингибиторного анализа (табл. 2) л-Хлормеркурибензоат - реагент на
Рис. 6. Температурная стабильность 1,3-р-О-глюканазы СЛ. тс11сит.
влияния на активность 1,3-р-О-глюканазы Не изменялась активность фермента как в присутствии одного водорастворимого карбодиимида, активирующего свободные карбоксильные группы, так и при добавлении к нему аминокомпонента (метилового эфира глицина) Ацетилимидазол, взаимодействующий с остатками тирозина и гистидина, вызывал 50 %-ное ингибирование фермента Вероятно, модификация затрагивает важный для активности остаток тирозина, так как реагент на гистидин - диэтилпирокарбонат - не влиял на активность фермента. Ы-Бромсукцинимид, специфически окисляющий остатки триптофана в слабо кислой среде, полностью инактивировал фермент. Этот факт позволяет предположить важную роль остатков триптофана для каталитической активности выделенного фермента.
Таблица 2*. Влияние групп-специфических реагентов и некоторых ингибиторов на активность 1,3-Р-О-
глюканаз С/7. Мсит и Г. аигетШе
Концентрация реагента, М Остаточная активность, %
Реагент Ch. mdicum Т. aureviride Г aureviride
внеклеточная внеклеточная из мицелия
л-Хлормеркурибензоат 5ХЮ 100 34 ± 0,02 86± 0,05
Ы-Бромсукцинимид -2 10 0 0 0
Ы-этилмалеимид -2 10 - 100 98
ЭДТА 5X10 100 - -
Азид натрия -2 10 100 - -
Ацетилимидазол •5 10 50 ± 0,02 0 0
СМЕ-карбодиимид -5 10 100 - -
СМЕ-карбодиимид и метиловый эфир глицина -2 10 100 - -
Диэтилпирокарбонат -а 10 94 + 0,07 100 100
Халистанол сульфат -ь 6X10 100 113 ±0,03 110± 0,02
Ингибитор из ¿..с/с/юл'ойев •1 Зхю 100 100 100
*В таблице приведены данные для всех исследованных 1,3-р-О-глюканаз.
Специфичность 1,3-Р-О-глюканазы была установлена при использовании в качестве субстратов глюканов и гликозидов с различным типом связи Фермент был специфичен к (3-1,3-связям в глюканах Он с
высокой скоростью гидролизовап ламинаран и транслам и со значительно меньшей - ряд других высокомолекулярных глюканов со смешанным типом связи (дрожжевой глюкан, лихенан, зимозан и др.) (табл. 3). Способность гидролизовать гпикозиды практически отсутствовала, что характерно для ферментов экзо-типа действия. Различия в скорости гидролиза ламинарана и транслама связаны с особенностями их структуры. Эти глюканы различаются по молекулярным массам, количеству и расположению (3-1,6-связей, которые в молекуле транслама в виде разветвлений сосредоточены, в основном, на невосстанавливающем конце молекулы. Чувствительность к заместителям у невосстанавливающего конца имеют ферменты экзо-типа действия, которые последовательно отщепляют моно- либо олигосахариды с этого конца полимера
Проведен анализ кинетических данных по накоплению продуктов гидролиза ламинарана 1,3-p-D-глюканазой при рН 4,4 и 5,6. Результаты жидкостной хроматографии, приведенные на рисунке 7, показали, что основным продуктом гидролиза ламинарана в обоих экспериментах является глюкоза Было показано, что 1,3-(3-0-глюканаза Ch. indicum не катализирует реакцию трансгликозилирования Эти результаты дают основание полагать, что 1,3-|3-0-глюканаза (или обе её формы) являются типичными экзо-ферментами (1,3-|3-0-глюкан-глюканогидролазы КФ 3 2 1 58)
Таблица 3*. Субстратная специфичность 1,3-Р-0-глкжаназы Ch. indicum и Т. aurevinde
Субстрат Тип связи, конфигурация Относительная скорость гидролиза, %
Ch. mdicum внеклеточная Т. aurevinde внеклеточная Т. aurevinde из мицелия
ламинаран Р -1,3; Р -1.6 9010 100 100 100
транслам р - 1.3; р -1.6 75 25 80 ± 0,02 69± 0,02 74 ± 0,02
дрожжевой глюкан Р -1,3; р -1,6 90:10 3 3 2
пахиман Р-1,3, р-1,6 98:2 0,02 - -
КМ-пахиман Р-1,3; р-1,6 98-2 0,13 1,2 1,5
зимозан В -1,3; 3-1,6 0,4 - -
аубазидан Р-1,6; р-1,3 75.25 0,08 - -
лихенан Р-1,3, Р-1,4 70 30 1 0 0
пустулан Р-1,6 0 0 0
амилопекгин а-1.4 0 0 0
ксилан Р-1,4 0 - -
КМ-целлюлоза В-1,4 0 0 0
л-нитрофенил-Ы-ацетил-P-D-глюкозамин в 0,05 0 0
л-нитрофенил-P-D-глюкопиранозид В 0,05 0 0
п-нитрофенип-P-D-гапактопиоанозид В 0 0 0
п-нитрофенил-а-О-маннопиранозид а 0 0 0
*В таблице приведены данные для всех- исследованных 1,3-Р-0-глюкаиаз
а)
б)
Л
Г
Л
Г
Рис. 7. Гель-фильтрация продуктов гидролиза ламинарана 1,3-Р-О-глюканазой СЬ тфсит при рН 4,4 (а) и рН 5,6 (б) на биогеле Р-2 (автоматический жидкостной анализатор ^1-Л.С-6АН).
Л - ламинаран; Г - глюкоза,
I -IV - степень расщепления ламинарана 4 %, 10 %, 25 %, 60 %, соответственно.
3
4 5 6
3
4 5 6
Время, *
Еще одним косвенным подтверждением экзо-типа выделенной 1,3-р-О-глюканазы явилось действие природных ингибиторов. Препарат 1,3-р-О-глюканаэы не ингибировался халистанол сульфатом (табл. 2) -сульфатированным полиоксистероидом, который эффективно ингибирует эндо-1,3-|3-0-глюканазы морских моллюсков, но не экзо-1,3-(3-0-глюканэзу наземного молюска Е. тааки. 1,3-р-О-Гпюканаза СЬ Мюит также оказалась устойчивой к действию ингибитора эндо-1,3-р-0-глюканаз морских моллюсков, выделенного из бурой водоросли I. асЬопоШеэ (табл. 2). Это позволило успешно использовать фермент для деградации углеводной компоненты этого ингибитора. 1,3-р-0-Глюканаза применялась для подтверждения структуры 1,3,1,6-р-0-глюкана клеточной стенки морского гриба РЬота д/отега(а Растворимыми продуктами гидролиза глюкана также, как и в случае ламинарана, явились глюкоза и гентиобиоза (О-глюкопиранозил-р-1,6-О-глюкоза)
Нами была исследована 1,3-р-О-глкжаназа факультативного гриба Т. aurevmde - одного из лучших продуцентов данного фермента среди штаммов, собранных в донных осадках Южно-Китайского моря. Присутствие 1,3-р-О-глюканазы и других О-гликозилгидролаз (амилазы, пустуланазы, N-ацетил-р-О-глюкозаминидазы, p-D-глюкозидазы и p-D-галактозидазы) было обнаружено нами как в культуральной жидкости Т. aureviride (внеклеточные или секретируемые ферменты), так и в мицелии (внутриклеточные) этого вида. Однако в мицелии содержалось не более 5-10 % от общего количества единиц активности каждого фермента.
Последовательность стадий очистки 1,3-Р-0-глюканаз морского гриба Т. aurevmde представлена на рисунке 8. Комбинацией методов ультрафильтрации, гидрофобной хроматографии на фенил-сефарозе 6 Fast Flow и ионообменной хроматографии на 15 Q РЕ и 15 S РЕ (FPLC) с выходом 1-2 % были получены
2.4. 1,3-0-О-Глюканаза морского гриба Trichoderma aureviride
препараты 1,3-р-0-гпюканаз, не содержащие сопутствующих О-гликозилгидролаз, из культурапьной жидкости {3 ед. активности) и мицелия (около 0,5 ед активности).
Рис. 8. Схема очистки 1,3-Р-0-глюканаз морского гриба Т. аигеу/лйе.
Выделенные глюканаэы имели различные температурные оптимумы. внеклеточная 1,3-р-О-глюканаза - 40°С, а внутриклеточная - 55°С (рис. 9). Внеклеточная 1,3-р-О-глюканаза была заметно стабильней (рис. 10) по отношению к температуре, хотя рН-стабильность ферментов была одинаковой Как показали исследования зависимости активности внеклеточной и мицелиальной 1,3-р-О- глюканаз Г аигетбе от рН, значения оптимумов рН ферментов лежали в слабо кислой области (рис 11). Особенностью зависимости активности внеклеточной 1,3-р-0-глюканазы от рН явилось наличие двух максимумов: при рН 5,2 и 6,2 (рис. 11а), что, как и в случае с 1,3-р-О-глюканазой СЛ. тбюит, не исключает присутствия в высокоочищенном препарате двух форм фермента. Предварительные эксперименты показали, что характер накопления продуктов при гидролизе ламинарана внеклеточной 1,3-|3-0-глюканазой Т. аигемпйв при рН 5,2 и 6,2 полностью идентичен, поэтому все дальнейшие исследования свойств проводились нами при значениях рН 5,2.
При комнатной температуре 1,3-р-О-глюканазы были стабильны в диапазоне рН от 4,5 до 7,5 в течение суток, при рН 3 и 4 ферменты полностью теряли активность за 6 ч.
из мицелия внеклеточной
Рис. 9. Оптимумы температуры 1,3-р-О-глюканаз Т. зигЫгШв. а - внеклеточной; б - из мицелия.
—■— из мицелия - -о- - внеклеточной
Рис. 10. Температурная стабильность 1,3-р-0-глюканаз Т. аигечтбе. а - внеклеточной; б - из мицелия
Величины Кт для 1,3-р-0-глгаканаз из культуральной жидкости и мицелия Т. аигемпйе при гидролизе ламинарана полностью совпадали (0,3 мг/мл) и были близки полученным для 1,3-р-О-глюканаз других грибов Молекулярные массы 1,3-Р-О-глюканаэ Т. аигешйе, согласно данным гель-хроматографии на сефарозе СЫЗВ, также практически не различались и были равны 56 кДа
1,00,9 ■ 0,8 0,7 0,6 0,5 0/» oj-
3
Рис. 11. Оптимум рН 1,3-р-О-глюканаз Т. aureviride а-внеклеточной, б-из мицелия
Изучение специфичности 1,3-р-О-глюканаз показало (табл. 3), что ферменты катализируют расщепление р-1,3-связи в смешанных 1,3;1,6-р-0-глюканах. Они с высокой скоростью расщепляли растворимые субстраты - ламинаран и транслам, но слабо гидролизовали высокомолекулярные и частично растворимые - дрожжевой глюкан и КМ-пахиман. Выделенные ферменты не гидролизовали пустулан (1,6-3-D-глюкан) и лихенан (1,3,1,4-р-О-глюкан).
Анализ продуктов ферментативного гидролиза ламинарана 1,3-р-О-глюканазами Т. aureviride методом жидкостной хроматографии показал, что основным продуктом является глюкоза, ди- и трисахариды обнаруживаются только при высокой степени гидролиза субстрата (рис 12), что характерно для экзо-1,3-р-0-глюканаз В продуктах исчерпывающего гидролиза ламинарана 1,3-р-О-глкжаназами Т. aureviride бумажной хроматографией была идентифицирована гентиобиоза (0-глюкопиранозил-(5-1,6-0-глкжоза), ламинарибиоза в продуктах реакции отсутствовала (рис.13). Полученные данные подтверждают, что р-1,3-глюканазы Т. aureviride, подобно экзо-глкжаназам наземных организмов, катализируют гидролиз р -1,3-связей в ламинаране (смешанном р-1,3;р-1,6-глюкане), "обходя" р-1,6-связи. Методом ВЭЖХ продукты трансгликозилирования обнаружены не были.
Важность отдельных аминокислотных остатков для каталитической активности 1,3-р-0-гпюканаз оценивали методом ингибиторного анализа (табл. 2) N-Этилмалеимид - реагент на сульфгидрильную группу не оказал существенного влияния на активность 1,3-р-О-глюканазы, но л-хлормеркурибензоат ингибировал фермент из мицелия на 14 %, а внеклеточный - на 66 %. Полученные нами данные позволяют предполагать присутствие в молекуле 1,3-р-0-глюканазы Т. aureviride функционально значимой свободной сульфгидрильной группы. N-Бромсукцинимид полностью инакгивировал 1,3-р-О-глюканазы Т. aureviride, что подтверждает важную роль остатков триптофана для каталитической активности выделенных ферментов
Ацетилимидазол, ацилирующий фенольную группу тирозина, вызывал 100%-ное ингибирование ферментов. Побочной реакцией в этом случае могла быть модификация остатков гисгидина Однако, диэтилпирокарбонат - специфический реагент на гистидин, активность ферментов не понижал Вероятно, модификация ацетилимидазолом затрагивала важный для 1,3-р-0-глюканаз остаток тирозина
0,8 0,7 0,6
0,4
0,2
5 н 6
рН
На активность 1,3-р-О-глюканаэ Т. аитуШбе не действовал белковый ингибитор эндо-1,3-0-0-глюканаз морских моллюсков, выделенный из бурой водоросли 1. сюЬопоШез. Халистанол сульфат обладал слабым активирующим действием (табл. 2), что является ещё одним подтверждением экзо-типа действия исследуемых ферментов.
а)
6)
Л
Г
Л
/чУ
V
5
Время, ч
Рис. 12. Гельфильтрация продуктов гидролиза ламинарана 1,3-{(-0-глюканазами Т. aureviride: внеклеточной (а), из мицелия (б) на биогеле Р-2 (автоматический жидкостной анализатор Jeol-JLC-бАН). Л -ламинаран; Г - глюкоза; степень расщепления ламинарана I - 4 %; II -10 %; III - 55 %.
• • *
• , . *
• » '
1 I
G, G:
О) Рис. 13. Бумажная хроматограмма продуктов гидролиза ламинарана 1,3-Р-О-глюканазами Т. аигемпйе: 2 - внеклеточной; 3 - из мицелия. Стандарты: 1 - гентиобиоза; 4 - смесь ламинариолигосахаридов (в I - глюкоза, в 2 - ламинарибиоза, в з - ламинаритриоза).
12 3 4
2.5. Сравнение трансгликозилирующих свойств 1,3-Р-13-глюканаэ морских и наземных
организмов
Одним из интересных свойств эндо-1,3-р-1Э-глюканаз является способность катализировать не только реакцию гидролиза, но и трансгликозилирования. Способность этих ферментов к переносу гликозильных остатков на гидроксилсодержащие вещества может использоваться для получения новых биологически активных соединений.
Нами проведено сравнительное изучение трансгликозилирующей способности эндо- и экзо-1,3-р-О-глюканаз из различных источников (морской бактерии, морских грибов, морских и наземных беспозвоночных и высших растений), составляющих коллекцию лаборатории химии ферментов В этом эксперименте был использован ламинаран из 1аттапа сюЬопспбев в качестве донора гликозильных остатков и л-нитрофенил-р-О-глкжопиранозид в качестве акцептора В реакционную смесь вносили одинаковое количество гидролитических единиц активности ферментов. Оценивали трансгликозипирующую способность по количеству продуктов трансгликозилирования, содержащих остаток л-нитрофенола В таблице 4 приведены данные, полученные методом ВЭЖХ.
Анализ этих данных показал, что наибольшей трансгликозилирующей способностью обладают эндо-1,3-р-0-глюканазы морских моллюсков Ярки/а яасйа/телв/® и СЛ/ат/Б аЫия. В три раза ниже эта способность у эндо-1.З-Р-И-глюканазы морской бактерии АПвготопаз эр. Наименьшей трансгликозилирующей способностью как в общем ряду, так и среди двух исследованных растительных глкжаназ, обладает эндо-1,3-р-0-глюканаза табака. Отсутствие трансгликозилирующей активности отмечено для экзо-Р-О-глюканаз наземного моллюска ЕиЫа тааки и морских грибов СЛ. тсИсит и Т. аигтпёв.
Таблица 4. Сравнение трансгликозилирующей способности 1,3-р-О-глюканаз
1,3-р-С>-глкжаназа\ Количество включенного в!с-ЫР в продукты трансгликозилирования, % за 1 ч
источник фермента ас-МР2 С1с2-ЫР асз-№ ас,-№ С1С5~ ЫР асе-№ ЫР
Эндо-1,3-р-0-глюканаза морской бактерии АПеготопав ер 97,0 1,5 0,55 0,9 0,05 0 3
Экзо-1,3-Р-0-глкжаназа морского гриба СЛ. ¡пШсит 100 0 0 0 0 0 0
Экзо-1,3-р-О-глюканаза морского гриба Т. аигемпЬе 100 0 0 0 0 0 0
Эндо-1,3-р-О-глюканаза морского моллюска СЬ аЫив 86,35 7,4 4,6 1,2 0,35 0,1 13,65
Эндо-1,3-р-О-глюканаза морского моллюска й засЛэ/отелви 88,5 7,4 2,7 1,1 0,2 0,1 11,5
Экзо-1,3-р-О-глюканаза морского ежа 5 ¡Мегтейша 99,6 0,15 0,22 0,03 0 0 0,4
Экзо-1,3-Р-О-глюканаза наземного моллюска Е. таакн 100 0 0 0 0 0 0
Эндо-1,3-р-О-глюканаза картофеля (листья) Эндо-1,3-р-Э-глюканаза табака (листья) 99,5 99,8 0,45 0,13 0,05 0,04 0,02 0,02 0,01 0,01 0 0 0,53 0,2
1 1,3-р-О-глюканазы 0,5 х 10"* ед /мл (гидролитическая активность), донор - ламинаран из асЬопо^еэ
(2 мг/мл) 2 Фс-ЫР - акцептор (2 мг/мл).
Как видно из данных таблицы 4, экзо-р-О-глюканаза из неоплодотворенных яйцеклеток морского ежа 8Ьъпду1осепШиз Мегте&из в отличие от экзо-р-О-глюканаз морских грибов и наземного моллюска Е тааки, обладала заметной трансгликозилирующей активностью, что ставит ее в ряд необычных
экэогликаназ. Высокомолекулярные фракции, образующиеся с различными выходами в процессе трансформации ламинарана исследуемыми эндо-1,3-р-0-глюканазами, отличаются как молекулярными массами, так и содержанием ß-1,6-связей
2.6. Регуляция активности и состава О-гликозилгидролаз в морских и наземных организмах под
действием различных факторов 2.6.1. Влияние метаболитов морских грибов на активность О-гликозилгидролаз морских
моллюсков
Известно, что ингибиторы и активаторы служат эффективными инструментами для исследования механизма действия ферментов. Природные эффекторы часто выполняют роль регуляторов межвидовых отношений. В последние годы возрастает интерес к изучению морских грибов в связи с обнаружением у них новых метаболитов, отсутствующих у наземных видов. Нами был проведен поиск эффекторов О-гликозипгидролаз среди метаболитов морских грибов Для обнаружения в морских грибах метаболитов, способных влиять на активность пищеварительных ферментов морских моллюсков, были выбраны' эндо-1,3-р-0-глюканаза из кристаллического стебепька двустворчатого моллюска S sachalinensis • катализирующая гидролиз полимерного глюкана ламинарана и ß-D-глюкозидаза из гепатопанкреаса брюхоногого моллюска Littorina kunla - действующая на гликозиды и олигосахариды Проанализированы культуральные жидкости 62 штаммов, принадлежащих к 18 родам морских грибов
Как для эндо-1,3-р-0-глюканазы, так и для ß-D-глюкозидазы получены аналогичные результаты Большая часть образцов культуральной жидкости морских грибов обладала активирующим действием на ферменты- 66 % и 71 % образцов активировали, 18 % и 7 % ингибировали, 16 % и 22 % не влияли на активность эндо-1,3-р-И-глюканазы и ß-D-глюкозидазы, соответственно (рис 14).
Метаболиты грибов из разных мест обитания: из грунта и ассоциированные с морскими беспозвоночными, имели практически одинаковый спектр действия на активность эндо-1,3-р-О-глюканазы S sachalinensis В случае ß-D-глюкоэидазы L. kunla. этот спектр заметно менялся Максимальный ингибирующий эффект около 60 % на 1,3-р-0-глюканазу проявили вещества, продуцируемые грибами Fusarium sp., Cladosponum brevi-compactum и С. sphaerospermum. Наибольшим активирующим действием на 1,3-Р-0-глюканазу обладал культуральный фильтрат морского гриба F. oxysporum var. orthoceras (на 132 %), а на ß-D-глюкозидазу - Oidiodendmn truncatum (на 65 %)
Рис 14. Действие метаболитов морских грибов на активность эндо-1,3-р-О-глюканазы S sachalinensis и ß-D-глюкозидазы L. kunla. >
Было установлено, что практически для всех активных образцов культуральных фильтратов наблюдалась зависимость эффекта действия от концентрации метаболитов в пробе (рис 15) В некоторых случаях максимальный процент ингибирования наблюдался при низких концентрациях, а при более высоких концентрациях, ингибирующий эффект снижался Возможно, это свидетельствует о присутствии в культуральной среде морских грибов как ингибиторов, так и активаторов ферментов, и мы наблюдаем лишь результирующий суммарный эффект.
Й <
Рис. 15 Влияние метаболитов культуральной жидкости морского гриба Ризапит ер на активность 1,3-3-0-глюканазы.
Концентрация метаболитов, мг/мл
Таким образом, некоторые виды морских грибов продуцируют метаболиты, влияющие на активность пищеварительных ферментов морских моллюсков. Возможно использование морских грибов A versicolor, F oxysporum var. orthoceras, 0. truncation, С. sphaerospermum, С. brevt-compactum как источников для выделения и дальнейшего изучения свойств и структуры эффекторов этих ферментов.
2.6.2. Влияние ингибитора 1,3-р-О-глюканаз морских моллюсков, выделенного из бурой водоросли L cichorioides, на синтез 0-гликозилгидролаз морскими грибами
Было исследовано влияние ингибитора, выделенного из бурой водоросли и специфичного к эндо-1,3-р-О-глюканазам морских моллюсков, на способность морских грибов продуцировать О-гликозилгидролазы. Предварительно показано, что ингибитор не действовал на активность О-гликозилгидролаз, секретируемых этими морскими грибами, выращенными на контрольной среде. Ингибитор, добавленный в среду в концентрации 4 мкг/мл, не влиял на процесс роста мицелия грибов, но практически полностью блокировал синтез грибами исследуемых ферментов (табл 5)
Таблица 5. Влияние ингибитора из бурой водоросли на синтез О-гликозилгидролаз морскими грибами
Источник фермента Активность ферментов, ед /мг белка
1,3-р-О-Глюканаза Амилаза N-Ацетил-р-О-глюкозаминидаза p-D-Глюкозидаза
К И К И К и К И
A album 0 0 0 0 3,0 0,4 0 0
Ch indicum 7,8 0 11.1 0 0 0 2,2 2,3
A fumigatus var. ellipticus 0 0 0 0 1.1 0 0 0
Geomyces p annorus 28 1,0 2,8 0 0 0 11,2 0
F. oxysporum var orthoceras 22,0 0 2,2 0 0 0 11,0 0
О truncatum 5,5 0 10,0 0 0,3 0 1,1 0
T. aurevinde 25 0 0,5 12.7 1,6 0 0.4 0
К - контрольная среда. И - среда с добавлением ингибитора
Заметным исключением явился штамм Т. аиге\/Ше, который в присутствии ингибитора продуцировал активную амилазу. Синтез других О-гликозилпщролаз у этого гриба был также подавлен. Результаты гель-хроматографии культурального фильтрата Т. аигвулпбе на колонке Эирегёех 75 № 10/30 (РР1.С) свидетельствовали о том, что штамм, выращенный на контрольной среде и на среде с добавлением ингибитора, синтезирует различные молекулярные формы амилазы (рис 16) Амилолитический комплекс на среде без ингибитора представляет собой две формы фермента с рН оптимумами 5,4 (2а) и 6,4 (26), в то время как на среде с ингибитором - смесь трех молекулярных форм с оптимумами рН 5,0 (2в); 6,0 (2г); 6,4 (26).
На основании полученных данных можно предположить, что метаболиты грибов и водорослей, обладающие способностью влиять на пищеварительные ферменты морских беспозвоночных, являются регуляторами межвидовых отношений макро- и микроорганизмов одного места обитания. Показана возможность использования метаболитов бурых водорослей для направленного регулирования процессов синтеза ферментов морскими грибами.
А750
2,0 --
1,0 --
5,0
А750
2,0
1,0
5,0
26
V \
Л 1
10,0 15,0
Объем элюции, мл
10,0
15,0
Объем элюции, мл
20,0
20,0
Рис 16 Гель-хроматография на колонке с 5ирегс!ех 75 НЯ 10/30 (РР1_С) культурального фильтрата морского гриба Т. аиге\ппйе, выращенного на контрольной среде (А) и с добавлением ингибитора из бурой водоросли (Б). 1 - М-ацетил-р-О-глюкозаминидаза; 2 - различные формы амилазы; 3 - 1,3-р-О-глюканаза
2.6.3. Влияние вируса мозаики сои на активность 0-гликозилгидролаз в листьях сои разных по устойчивости сортов
В лаборатории химии ферментов при исследовании биологической активности продуктов ферментативной трансформации ламинарана в качестве модели были успешно использованы растения табака. Один из препаратов (1,3,1,6-Р-О-глюкан), названный антивиром, обнаружил высокую активность против вируса табачной мозаики.
В продолжение данных исследований совместно с сотрудниками Биолого-почвенного института ДВО РАН проведен анализ изменения активности 1,3-р-О-глюканазы, а-О-маннозидазы, р-О-галактозидазы и р-О-глюкозидазы в листьях сои разных по устойчивости сортов при инфицировании их вирусом мозаики сои (ВМС) В здоровых растениях устойчивого сорта Оехуативите обнаружен гораздо более высокий уровень активности 1,3-р-О-глюканазы (в 2-4 раза) по сравнению с восприимчивым сортом сои Приморская 529 Заражение ВМС устойчивого сорта не вызывает в нем достоверных изменений в величине активности 1,3-р-О-глюканазы Возможно, имеющийся уровень активности вполне достаточен для защиты растения от вируса Заражение вирусом восприимчивого сорта сои приводит к возрастанию удельной активности 1,3-р-О-глюканазы в листьях в 3 раза Не было выявлено различий в уровне активности гпикозидаз между сортами после инфицирования Следует отметить, что в нашем случае ВМС вызывал мозаичные симптомы заболевания и деформацию листовой пластинки восприимчивого сорта сои
Анализ активности исследуемых ферментов в процессе роста и развития растений сои показал следующее. Независимо от устойчивости сорта по мере роста листьев выявлен и рост активности 1,3-р-0-глюканазы (более чем в 3 раза), что подтверждает важную роль этого фермента в развитии растения По сравнению с 1,3-р-0-глюканазой гликозидазы в листьях сои значительно менее активны (рис 17)
Рис. 17. Активность 0-гликозилгидролаз в листьях здоровых и инфицированных растений сои.
ПРк - Приморская 529 (контрольные), ПРи - Приморская 529 (инфицированные), Дк- Оежатиэите (контрольные), Ди - Оеууатиэите (инфицированные)
В порядке увеличения активности ферменты могут быть выстроены следующим образом р-О-глюкозидаза < Р-0-галактозидаза < а-О-маннозидаза Установлена тенденция уменьшения активности этих ферментов с ростом и развитием листа независимо от сорта Такой характер изменения активности Р-О-глюкозидазы, р-О-галактозидазы и а-О-маннозидазы показывает, что исследуемые О-гликозилгидролазы активно участвуют в процессах роста на ранних этапах развития листьев сои, когда происходит интенсивное деление и рост клеток, в то время как 1,3-р-О-глюканаза участвует как в защите, так и в процессе роста и развития растения Таким образом, 1,3-р-О-глюканаза может быть маркером устойчивости
сорта, а восприимчивые сорта сои служить моделью для изучения защитных свойств природных глюканов и продуктов их ферментативной трансформации.
ВЫВОДЫ
1. Изучено распространение некоторых О-гликозилгидролаз среди 103 штаммов морских мицелиальных грибов, собранных в различных регионах Тихого океана. Выявлен ряд штаммов, представляющих интерес в качестве возможных продуцентов как отдельных О-гликозилгидролаз, так и широкого набора ферментов.
2 Разработаны схемы очистки 1,3-р-О-глюканаз из морских мицелиальных грибов СЬзеЬтшт Ыюит и ТпсЬойегта аигеу/лс/е. Выделены высокоочищенные 1,3-р-0-глюканазы: две внеклеточные (из культуральных жидкостей С/1. тЛсит и Т. аилэмлс/е) и 1,3-Р-П)-глюканаза из мицелия Т. аигеуЫе.
3. Показано, что исследуемые ферменты имеют оптимум действия в слабокислой области рН (от 4,4 до 6,2) и диапазоне температуры от 40'С до 65'С. Константы Михаэлиса по ламинарану равны 0,3 мг/мл для 1,3-р-й-глюканаз Т. аигеувпбе и 0,1 мг/мл для 1,3-р-О-глюканазы СИ Ыюит Молекулярные массы по данным гель-хроматографии близки и составляют 54-56 кДа.
4. Методом ингибиторного анализа выявлена важная роль остатков триптофана и тирозина для активности исследуемых 1,3-(3-0-глюканаз из морских грибов Инактивация 1,3-Р-О-глюканаз Т. аигетбе реагентом на сульфгидрильную группу позволяет предположить ее участие в процессе катализа.
5. Найдено, что 1,3-р-1Э-гпюкзназы морских грибов С/7. /псИсит и Т. аигеУ1П(1с устойчивы к действию природных ингибиторов эндо-1,3-р-0-глюканаз: белкового ингибитора из бурой водоросли и сульфатированного полиоксистероида - халистанол сульфата
6 Проведена сравнительная оценка способности 1,3-р-О-глюканаз различного типа действия из морских и наземных источников катализировать реакцию трансгликозилирования. Показано, что среди ферментов, проявивших трансгликозилирующую активность, самой высокой активностью обладали эндо-1,3-р-0-глюканазы морских моллюсков, наименьшей- эндо-1,3-р-0-глюканазы растений Экзо-1,3-р-О-глюканазы морских грибов и наземного моллюска Еи1о1а тааки не катализировали реакцию трансгликозилирования.
7. Установлено, что 1,3-р-О-глюканазы морских грибов, обладают специфичностью к р-1,3-связям в глюканах, гидролизуют ламинаран с образованием глюкозы как основного продукта гидролиза и не катализируют реакцию трансгликозилирования. На основании этих данных ферменты отнесены к экзо-1,3-Р-0-глюкан-глюканогидролазам (КФ 3 2.1.58).
8. Показано, что вещества, продуцируемые некоторыми видами морских грибов, влияют на активность пищеварительных ферментов морских беспозвоночных. Присутствие в питательной среде ингибитора
эндо-1,3-р-О-глюканаз из бурой водоросли Laminaria cichonoides приводит в большинстве случаев к блокированию синтеза О-гликозилгидролаз морскими грибами.
9. 1,3-р-О-Глюканаза СЛ. indicum успешно использовалась для деградации углеводной компоненты при установлении природы ингибитора из бурой водоросли L. cichonoides и для подтверждения структуры глюкана клеточной стенки морского гриба Phoma glomerata
Список основных публикаций по теме диссертации
1. Сова В.В, Звягинцева T.H, Бурцева ЮВ, Елякова Л А. Сравнительное изучение совместного протекания реакций гидролиза и трансгликозилирования, катализируемых р-1,3-глюканазами из различных источников II 2-й Всерос. биохим съезд. Москва 1997. С. 69.
2. Сова ВВ., Звягинцева Т.Н, Светашева ТГ., Бурцева Ю В., Елякова Л.А. Сравнительное изучение особенностей реакций гидролиза и трансгликозилирования, катализируемых р-1,3-глюканазами из различных источников II Биохимия. 1997. Т. 62. № 10. С. 1300-1306.
3. Sundukova Ye.V., Burtseva Yu.V., Popivnich I.B, Pivkin M.V., Sova V.V., Zvyagintseva T.N. Carbohydrate Metabolism Enzymes of Micelial Fungí p-1,3-Glucanase from Fungus Chaetomium indicum // ZM IUPAC Intern. Conf. on biodiverslty. Belo Horizonte MG Brazil 1999 P 237.
4. Бурцева Ю.В, Сова B.B., Пивкин M В., Звягинцева Т Н. Ферменты углеводного обмена мицелиапьных грибов, обитающих в морской среде. р-1,3-Глюканаза морского гриба Chaetomium indicum II Биохимия 2000 Т 65 №10 С 1175-1183
5 Burtseva Yu V, Sova V.V., Zvyagintseva T.N Enzymatic transformation of brown seaweed polysaccharides II Europe symp. future trends ¡n phytochemistry. Rolduc Netherlands 2000. P. 22.
6. Андреева И.В , Бурцева Ю В., Сова В.В , Звягинцева T Н , Малиновский В.И Ферменты углеводного обмена сои различных по устойчивости сортов // Всерос конф. "Химия и технология растительных веществ". Сыктывкар. 2000 С. 20.
7. Бакунина И. Ю., Бурцева Ю.В., Сова В В., Шевченко Н М , Недашковская О.И , Алексеева С.А, Кусайкин М П., Урванцева А.М., Михайлов В.В., Звягинцева Т.Н. Распределение фукоидангидролаз в морских беспозвоночных и микроорганизмах II 2-й Международ симп «Химия и химическое образование». Владивосток. 2000 С 206.
8 Ермакова С П , Звягинцева T Н , Бурцева Ю В , Крачун В В Белки бурых водорослей - ингибиторы эндо-1->3-р-0-глюканаз морских беспозвоночных// Биохимия. 2001. Т. 66. № 2 С 234-241
9 Pivkin M V., Khudyakova Yu V., Burtseva Yu V , Zhuravleva N V., Frolova G M Re-adaptation of Fungi In The Sea II 8th Intern marine and freshwater mycology symp. Hurghada Egypt 2001 P. 66
10. Пивкин М.В., Худякова Ю В, Бурцева Ю.В, Журавлёва Н.В., Фролова Г.М. Вторичная адаптация грибов в море // I съезд микологов России. Москва. 2002. С. 77.
11. Andreeva I.V., Burtseva Yu. V„ Malinovsky V.I., Zvyagintseva T.N. The effect of soybean mosaic virus on the activity of carbohydrases in leaves of sensitive and resistant soybean plants II Acta Phytopathologica et Entomológica Hungarica. 2002. Vol 37. № 4. P. 335-345.
12. Burtseva Yu.V, Verigina NS., Sova V.V., Pivkin MV., Zvyagintseva T.N Filamentous marine fungi as producers of O-glycosyihydrolases |3-1,3-Glucanase from Chaetomium indicum // Mar. Biothechnol 2003 Vol.5. P. 1-11.
13. Бурцева ЮВ., Веригина H.C., Сова B.B, Пивкин М.В., Звягинцева ТН. О-Гликозилгидролазы морских мицелиальных фибов р-1,3-Глюканазы морского фиба Trichoderma aureviride II Прикл. биохимия и микробиол. 2003. Т. 39. № 5. С. 550-556.
Соискатель Бурцева Ю.В.
í
Бурцева Юлия Валериевна О-ГЛИКОЗИЛГИДРОЛАЗЫ МОРСКИХ МИЦЕЛИАЛЬНЫХ ГРИБОВ
АВТОРЕФЕРАТ
Подписано в печать с готовых диапозитивов 28 04 2003. Формат 60x84/1 б Печать офсетная Усл.печ л. 0,87. Тираж 100 экз. Заказ 288.
Отпечатано в типографии «Анастасия» 690041, г. Владивосток, ул. Бородинская, 20
P-888 3
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бурцева, Юлия Валериевна
Список сокращений 4 1. ВВЕДЕНИЕ.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
2.1. Распространение 1,3-р-0-глюканаз, их роль в природе.
2.2. Субстраты 1,3-Р-О-глюканаз.
2.3. Представления о механизмах действия О-гликозилгидролаз. f 2.4. Классификация О-гликозилгидролаз.
2.5. Сведения о структуре 1,3-Р-0-глюканаз.
2.6.1,3-Р-О-Глюканазы грибов.
2.6.1. Морские грибы как продуценты ферментов.
2.6.2. Локализация глюканаз в грибах и их роль в образовании клеточной стенки.
2.6.3. Культивирование грибов, выделение и очистка 1,3-Р-О-глюканаз.
2.6.4. Свойства 1,3-Р-0-глюканаз грибов.
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
3.1. Объекты исследования.
3.2. Реагенты.
3.3. Аналитические методы.
3.4. Определение активности О-гликозилгидролаз.
3.5. Выделение и очистка 1,3-р-О-глюканаз.
3.5.1.1,3-Р-0-Глюканаза Chaetomium indicum.
3.5.2. 1,3-Р-О-Глюканаза Trichoderma aureviride.
3.6. Исследования свойств.
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
4.1. Распространение О-гликозилгидролаз в морских мицелиальных грибах.
4 4.2. Влияние источника углерода в питательной среде на синтез
1,3-Р-0-глюканазы морским грибом Ch. indicum.
4.3. 1,3-р-О-Глюканаза морского гриба Ch. indicum.
4.3.1. Выделение и очистка фермента.
4.3.2. Свойства 1,3-Р-0-глюканазы Ch. indicum.
4.4. 1,3-Р-О-глюканаза морского гриба Т. aureviride.
4.4.1. Выделение и очистка фермента.
4.4.2. Свойства 1,3-р-0-глюканаз Т. aureviride.
4.5. Сравнение свойств 1,3-Р-О-глюканаз Ch. indicum и Т. aureviride.
Сравнительная оценка трансгликозилирующей активности
1,3-Р-Б-глюканаз морских и наземных организмов.
4.6. Регуляция активности и состава О-гликозилгидролаз в морских и наземных организмах под действием различных факторов.
4.6.1. Влияние метаболитов морских грибов на активность О-гликозилгидролаз морских моллюсков.
4.6.2. Влияние белкового ингибитора 1,3-Р-0-глюканаз морских моллюсков, выделенного из бурой водоросли L. cichorioides, на синтез О-гликозилгидролаз морскими грибами.
4.6.3. Влияние вируса мозаики сои на активность О-гликозилгидролаз в листьях сои разных по устойчивости сортов.
5. ВЫВОДЫ.
Введение Диссертация по биологии, на тему "О-гликозилгидролазы морских мицелиальных грибов"
Значительный интерес к О-гликозилгидролазам и, в частности, к 1,3-P-D-глюканазам связан с их важной ролью в жизнедеятельности микро- и макроорганизмов. 1,3-Р-0-Глюканазы входят в состав пищеварительных ферментов морских и наземных беспозвоночных, PR-белков высших растений, участвуют в репродуктивных процессах и защитных реакциях различных организмов. Способность этих ферментов расщеплять клеточные глюканы определяет не только их прямое участие в утилизации углеводсодержащих биополимеров различными организмами, но и регуляторную функцию в клетке. Еще одной важной причиной внимания к 1,3-Р-0-глюканазам является возможность их применения в качестве новых катализаторов для различных биотехнологических процессов. Расширение общих знаний о глюканазах и, особенно, получение новых ценных препаратов для биотехнологии может дать изучение ферментных систем морских мицелиальных грибов.
Обитатели моря являются самой мало изученной среди экологических групп грибов. Морфологические признаки и биохимические свойства морских грибов обусловлены влиянием таких специфических факторов среды обитания, как высокая концентрация солей, относительная гипоксия, гидростатическое давление, слабо щелочное рН, низкие температуры. Исследованиями микологов показано, что основная численность экологической группы грибов моря представлена вторичными морскими грибами. Адаптацию грибов в море, в первую очередь, обеспечивают ферментные системы, свойства которых могут отличаться от ферментных систем наземных видов. Морские грибы, обладающие эффективным и разносторонним ферментным аппаратом, активно участвуют в жизни моря и являются одним из звеньев пищевых цепей. Большая часть работ по ферментам морских грибов традиционно посвящена целлюлазам. Однако показано, что грибы, обитающие в морской среде, способны продуцировать и другие О-гликозилгидролазы: 1,3-Р-0-глюканазы, амилазы, гликозидазы. Исследования, касающиеся распространения О-гликозилгидролаз в морских грибах, их свойств, структуры, специфичности, механизма действия, практически не проводились.
Нами проведены систематические исследования распространенности О-гликозилгидролаз в морских грибах, собранных в различных регионах Тихого океана, выделены и охарактеризованы 1,3-р-0-глюканазы из двух видов морских мицелиальных грибов, исследованы некоторые аспекты взаимного влияния метаболитов водорослей, морских грибов и беспозвоночных.
Так как изучены 1,3-Р-0-глюканазы (и особенно продуцируемые морскими грибами) значительно меньше, чем целлюлазы, амилазы, лизоцимы, в обзоре литературы некоторые вопросы рассмотрены на примере наиболее близких к 1,3-0-D-глюканазам ферментов - целлюлаз, даются общие представления о классификации и механизме действие всей группы О-гликозилгидролаз.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Бурцева, Юлия Валериевна
5. выводы
1. Изучено распространение некоторых О-гликозилгидролаз среди 103 штаммов морских мицелиальных грибов, собранных в различных регионах
Тихого океана. Выявлен ряд штаммов, представляющих интерес в качестве возможных продуцентов как отдельных О-гликозилгидролаз, так и широкого набора ферментов.
2. Разработаны схемы очистки 1,3-Р-0-глюканаз из морских мицелиальных грибов Chaetomium indicum и Trichoderma aureviride. Выделены
• высокоочищенные 1,3-р-Р-глюканазы: две внеклеточные (из культуральных жидкостей Ch. indicum и Т. aureviride) и 1,3-Р-О-глюканаза из мицелия Т. aureviride.
3. Показано, что исследуемые ферменты имеют оптимум действия в слабокислой области рН (от 4,4 до 6,2) и диапазоне температуры от 40°С до 65°С. Константы Михаэлиса по ламинарану равны 0,3 мг/мл для 1,3-P-D-глюканаз Т. aureveride и 0,1 мг/мл для 1,3-р-О-глюканазы Ch. indicum. Молекулярные массы по данным гель-хроматографии близки и составляют 54-56 кДа.
4. Методом ингибиторного анализа выявлена важная роль остатков триптофана и тирозина для активности исследуемых 1,3-Р-О-глюканаз из морских грибов. Инактивация 1,3-Р-Б-глюканаз Т. aureviride реагентом на сульфгидрильную группу позволяет предположить ее участие в процессе катализа.
5. Найдено, что 1,3-р-0-глюканазы морских грибов Ch. indicum и Т. aureviride устойчивы к действию природных ингибиторов эндо-1,3-р-0-глюканаз: белкового ингибитора из бурой водоросли и сульфатированного полиоксистероида - халистанол сульфата.
Проведена сравнительная оценка способности 1,3-р-О-глюканаз различного типа действия из морских и наземных источников катализировать реакцию трансгликозилирования. Показано, что среди ферментов, проявивших трансгликозилирующую активность, самой высокой активностью обладали эндо-1,3-р-0-глюканазы морских моллюсков, наименьшей - эндо-1,3-Р-0-глюканазы растений. Экзо-1,3-р-0-глюканазы морских грибов и наземного моллюска Eulota maakii не катализировали реакцию трансгликозилирования.
Установлено, что 1,3-Р-0-глюканазы морских грибов, обладают специфичностью к Р-1,3-связям в глюканах, гидролизуют ламинаран с образованием глюкозы как основного продукта гидролиза и не катализируют реакцию трансгликозилирования. На основании этих данных ферменты отнесены к экзо-1,3-Р-0-глюкан-глюканогидролазам (КФ 3.2.1.58).
Показано, что вещества, продуцируемые некоторыми видами морских грибов, влияют на активность пищеварительных ферментов морских беспозвоночных. Присутствие в питательной среде ингибитора эндо-1,3-Р-D-глюканаз из бурой водоросли Laminaria cichorioides приводит в большинстве случаев к блокированию синтеза О-гликозилгидролаз морскими грибами.
1,3-р-0-Глюканаза Ch. indicum успешно использовалась для деградации углеводной компоненты при установлении природы ингибитора из бурой водоросли L. cichorioides и для подтверждения структуры глюкана клеточной стенки морского гриба Phoma glomerata.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бурцева, Юлия Валериевна, Владивосток
1. Бакунина И.Ю., Шевченко Л.С., Недашковская О.И., Шевченко Н.М., Алексеева С.А., Михайлов В.В., Звягинцева Т.Н. Поиск фукоидан-гидролаз среди морских микроорганизмов // Микробиология. 2000. Т. 69. № 3. С. 370-376.
2. Безбородое А.М, Астапович Н.И. Секреция ферментов ирмикроорганизмов. М.: Наука, 1984. 69 с.
3. Беленький Д.М. Особенности ферментативного гидролиза а-1,4-глюкозидных связей // Успехи биологической химии. М.: Наука, 1971. Т. 12. С. 164-181.
4. Бурцева Ю.В., Сова В.В., Пивкин М.В., Звягинцева Т.Н. Ферменты углеводного обмена мицелиальных грибов, обитающих в морской среде. (5-1,3-Глюканаза морского гриба Chaetomium indicum II Биохимия. 2000. Т. 65. № 10. С. 1175-1183.
5. Бурцева Ю.В., Веригина Н.С., Сова В.В., Пивкин М.В., Звягинцева Т.Н О-Гликозилгидролазы морских мицелиальных грибов. р-1,3-Глюканазы морского гриба Trichoderma aureviride II Прикл. биохимия и микробиол. 2003. Т.39. № 5. С. 550-556.
6. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Активные центры ферментов: биоинформатика, архитектура, механизмы действия // Изв. АН СССР. Сер. хим. 2001. № 10. С. 1629-1637.
7. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. М.: Изд-во иностр. литер., 1961. 728 с.
8. Блинов Н.П. Некоторые микробные полисахариды и их применение //Успехи микробиол. 1982. № 7. С. 158-177.
9. Елякова J1.A., Широкова Н.И. Экзо-Р-1,3-глюканаза из улитки Eulota maakii II Биоорган, химия. 1977. Т. 3. № 12. С. 1656-1662.
10. Елякова JT.A. Регуляция Р-1,3;1,6-глюканами растительного и животного иммунитетов. Энзиматический синтез новых иммуностимуляторов // Вестник ДВО. 1995. № 2. С.74-85.
11. Ермакова С.П., Звягинцева Т.Н., Бурцева Ю.В., Крачун В.В. Белки бурых водорослей ингибиторы эндо-1-»3-Р-0-глюканаз морских беспозвоночных // Биохимия. 2001. Т. 66. № 2. С. 234-241.
12. Ермакова С.П. Белки бурых водорослей ингибиторы 1->3-Р-0-глюканаз морских моллюсков: Автореф. Дис.канд. хим. наук. Владивосток, 2002. 26 с.
13. Звягинцева Т.Н., Евтушенко Е.Е., Елякова JI.A. Исследование трансгликозилирующей способности эндо-1,3-Р-0-глюканаз // Биоорган, химия. 1989. Т. 15. №9. С. 1206-1214.
14. Звягинцева Т.Н., Елякова JI.A. Специфичность и механизм действия эндо-1,.3- P-D-глюканаз из морских моллюсков // Биоорган, химия. 1994. Т. 20. С. 453474.
15. Звягинцева Т.Н., Елякова Л.А., Исаков В.В. Ферментативное превращение ламинаранов в 1 —>3; 1 —>6-Р-0-глюканы, обладающие иммуностимулирующим действием //Биоорган, химия. 1995. Т. 21. № 3. С. 218-225.
16. Звягинцева Т.Н., Беседнова Н.Н., Елякова JI.A. Структура и иммунотропное действие 1,3;1,6-Р-0-глюканов. Владивосток: Дальнаука, 2002. 159 с.
17. Зигель М., Кобзева Н.Я. Получение протопластов и локализация рибонуклеазы, 1,3-глюканазы и глюкоизомеразы в мицелии гриба Penicillium brevi-compactum // Прикл. биохим. и микробиол. 1980. Т. 16. № 2. С. 245-248.
18. Катаева И.А., Чувильская Н.А., Головченко Н.П., Акименко В.К. Две Р-глюкозидазы Glostridum thermocelum: выделение и свойства // Биохимия. 1991. Т. 56. №8. С. 1429-1437.
19. Кравченко И.А., Максимов В.И. О синтетической активности лизоцима куриного яичного белка // Изв. АН СССР. Сер. хим. 1964. № 3. С. 584.
20. Максимов В.И. Роль трансгликозилирования в деградации олиго- и полисахаридов //Успехи соврем, биол. 1980. Т. 89. С. 41-57.
21. Методы экспериментальной микологии. Киев: Наукова Думка, 1982. 550 с.
22. Рабинович М.Л., Мельник М.С. Прогресс в изучении целлюлолитических ферментов и механизм биодеградации высокоупорядоченных форм целллюлозы // Успехи биол. химии. 2000. Т. 40. С. 205-266.
23. Светашева Т.Г., Сова В.В., Шевченко Н.М., Елякова Л.А. Исследование функциональных групп, существенных для каталитической активности Р-1,3-глюканазы из Chlamys albidus, методом химической модификации // Биохимия. 1984. Т. 49. № 11. С. 1762-1768.
24. Сова В.В., Светашева Т.Г., Костюк И.О. Молекулярная масса Р-1,3-глюканазы из морского моллюска Spisula sachalinensis II Биохимия. 1992. Т. 57. № 12. С. 1930-1934.
25. Сова В.В., Елякова JT.A., Иванова Е.П., Федосов Ю.В., Михайлов В.В. Индуцированная р-1,3-глюканаза из морской бактерии Alteromonas sp. II Биохимия. 1994. Т. 59. № 9. С. 1369-1377.
26. Сова В.В., Светашева Т.Г., Елякова JI.A., Иванова Е.П., Федосов Ю.В. Индуцированная Р-1,3-глюканаза из морской бактерии КММ 40 МС // Морская микробиология. Владивосток: Изд-во Дальневост. ун-та, 1995. С. 36-48.
27. Сова В.В., Елякова Л.А., Светашева Т.Г. Изучение р-1,3-глюканаз картофеля возможных участников защиты растений от патогена // Биохимия. 1996. Т. 61. № 3. С. 525-535.
28. Сова В.В., Звягинцева Т.Н., Светашева Т.Г., Бурцева Ю.В., Елякова JI.A. Изучение особенностей реакции гидролиза и трансгликозилирования, катализируемых р-1,3-глюканазами из различных источников // Биохимия. 1997. Т. 62. № 10. С. 1300-1306.
29. Стейнер Р., Эдельберг Э., Ингрэм Дж. Мир микробов. М.: Мир, 1979. Т. 3.486 с.
30. Тиунова Н.А., Зайкина И.В., Участнова Л.Н., Кобзева Н.Я. Загустина Н.А. Р-Глюканазы Geotrichum candidum // Микробиология. 1982. Т. 51. С. 510-514.
31. Тиунова Н.А., Кобзева Н.Я. Зайкина И.В., Елякова JI.A., Назарова Н.И. 1,3-Р-Глюканазы актиномицетов // Микробиология. 1983. Т. 52. № 4. С. 586-589.
32. Усов А.И., Чижов А.О. Полисахариды водорослей. XL. Углеводный состав бурой водоросли Chorda filum // Биоорган, химия. 1989. Т. 15. С. 208-216.
33. Фролова Г.М., Сильченко А.С., Пивкин М.В., Михайлов В.В. Амилазы гриба Aspergillus flavipes, ассоциированного с Fucus evanescens // Прикл. биохим. и микробиол. 2002. Т. 38. № 2. С. 155-160.
34. Халмуратов А.Г., Сатарова Р.С., Коннова Э.В. Выделение (3-1,3-глюканазы из гриба Verticillium dahliae и некоторые её свойства // Биохимия. 1996. Т. 61. № 4. С. 643-647.
35. Хорлин АЛ. Структура и функции активных центров ферментов // Активные центры карбогидраз. М.: Наука, 1974. С. 39-68.
36. Широкова Н.И., Елякова JI.A. Механизм действия и специфичность экзо-р-1,3-глюканазы из моллюска Eulota maakii И Биохимия. 1983. Т. 48. № 1. С. 83-91.
37. Abd-el-al А.Т.Н., Paff H.J. Purification and properties of endo-p-glucanase in the yeast Hanseniaspora valbyensis // Can. J. Microbiol. 1969. Vol. 15. P. 697-701.
38. Abeles F.B., Bosshart R.P., Forrence L.E., Habig W.H. Preparation and purification of glucanase and chitinase from bean leaves // Plant Phisiol. 1970. Vol. 47. P.129-134.
39. Adachi K., Nanba H., Kuroda H. Potentiation of host-mediated antitumor activity in mice by P-glucan obtained from Grifola frondosa (Maitake) // Chem. Pharm. Bull. 1987. Vol. 35. P. 262-270.
40. Ainsworth and Bisby's Dictionary of the Fungi / Edited by Kirk P.M., Cannon P.F.,David J.C. Utrecht, Netherlands, 2001. 624 p.
41. Alexopoulos C.J., Mims S.W., В lack well M. Introductory Mycology. New York, Chichester, Brisbane, Toronto, Singapore: John Wiley Sons: Inc, 1996. 869 p.
42. Arase A. Yomo Т., Urabe I., Hata Y., Katsube Y., Okada H. Stabilization of xylanase by random mutagenesis // FEBS Lett. 1993. Vol. 316. P. 123-127.
43. Bachman E.S., McClay D.R. Molecula cloning of the first metazoan beta-1,3-glucanase from eggs of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus // Proc. Natl. Acad. Sci. 1996. Vol. 93. № 13. P. 6808-6813.
44. Bacic A. Stone B. A (l-»3),(l-»4)-linked p-D-glucan in the endosperm cell-walls of wheat // Carbohydr. Res. 1980. Vol. 82. P. 372-377.
45. Ballance G.M., Manners DJ. Particial purification and properties of an endo-1,3-p-D-glucanase from germinated rye // Phytochemistry. 1978. Vol. 17. № 9. P. 15391543.
46. Bamforth W.C. The adaptability, purification and properties of exo-beta 1,3-glucanase from the fungus Trichoderma reeseill Biochem. J. 1980. Vol. 191. P. 863-866.
47. Banks W., Greenwood C.T. Mathematical models for the action of a-amylase on amylose // Carbohydr. Res. 1977. Vol. 57. P. 301-305.
48. Bartnicki-Garcia S. Role of vesicles in apical growth and a new mathematical model of hyphal morphogenesis // Tip Growth of plant and fungal cells. San Diego: Acad. Press, 1990. P. 211-232.
49. Beattie A., Hirst E.L., Percival E. Studies on the metabolism of the Chrysophyceae. Comparative structural investigations leucosin (Chrysolaminarin) separated from diatoms and laminarin from the brown algae // Biochem. J. 1961. Vol. 79. P. 531-537.
50. Beerhues L., Kombink E. Primary structure and expression of messenger RNAs encoding basic chitinase and 1,3-beta-glucanase // Plant Mol. Biol. 1994. Vol. 24. № 2. P. 353-367.
51. Beffa R., Meins F. Pathogenesis-related functions of plant beta-l,3-glucanases investigated by antisense transformation // Gene. 1996. Vol. 179. № 1. P. 97-103.
52. Biely P., Kratky Z., Bauer S. Interection of concavalin A with external mannanproteins of Saccharomyces cerevisiae. Glycoprotein nature of P-glucanases // Eur. J. Biochem. 1976. Vol. 70. P. 75-81.
53. Blaschek W., Schutz M., Kraus J., Franz G. In vitro production of specific polysaccharides: isolation and structure of an antitumor active P-glucan from Phytophthoraparasitica // Food Hydrocoll. 1987. Vol. 1. P. 371-380.
54. Bochkov A.F., Sova V.V., Kirkwood S. The study of the action pattern of an exo-P-(l—»3)-D-glucanase // Biochim. et Biophys. Acta. 1972. Vol. 258. P. 531-540.
55. Bodenmann J., Heiniger U., Hohl H.R. Extracellular enzymes of the Phytophtora infestans: endo-cellulase, P-glucosidases, and 1,3-P-glucanases // Can. J. Microbiol. 1985. Vol. 31. P. 75-82.
56. Borris R. Excenzymbildung von Mikroorganismen // Biol. Rundschau. 1981. Vol. 19. №4. P. 204.
57. Brock T.D. P-Glucanase of yeasts // Biochem. 1965. Vol. 19. P. 623-629.
58. Brown R., Embil J.M. p-GIucanases // Handbook of Microbiology. Boca Raton: CRC Press, Inc, 1987. Т. VIII. P. 301-315.
59. Burtseva Yu.V., Verigina N.S., Sova V.V., Pivkin M.V., Zvyagintseva T.N. Filamentous marine fungi as producers of O-glycosylhydrolases. P-1,3-Glucanase from Chaetomium indicum //Mar. Biothechnol. 2003. Vol. 5. P. 1-11.
60. Byrne P.J., Jones E.G. Effect of salinity on the reproduction of terrestrial and marine fungi // Trans. Br. Mycol. Soc. 1975. Vol. 65. P. 185-200.
61. Cabib E., Roberts R., Bowers B. Synthesis of the yeast cell wall and its regulation // Annu Rev. Biochem. 1982. Vol. 51. P. 763-793.
62. Cabib E., Bowers B. Shurlati A., Silverman S.J. Fungal cell wall synthesis: the construction of a biological structure // Microbiol. Sci. 1988. Vol. 5. P. 370-375.
63. Chesters C.G.C., Bull A. T. The enzymic degradation of laminarin. // Biochem. J. 1963. Vol. 86. P. 28-45.
64. Chipman D.M., Sharon N. Mechanism of lysozyme action // Science. 1969. Vol. 165. P. 454-465.
65. Chipman D.M. A kinetic analysis of the reaction of lysozyme with oligosaccharides from bacterial cell walls // J. Biochemistiy. 1971. Vol. 10. P. 1714-1722.
66. Chothia C., Lesk A.M. The relation between the divergence of sequence and structure in proteins // EMBO J. 1986. Vol. 5. № 4. P. 823-826.
67. Cline K., Albersheim P. Host-pathogen interaction XVI. Purification and characterization of a p-glucosyl hydrolase/transferase present in the walls of soybean cell // Plant. Physiol. 1981. Vol. 68. P. 207-220.
68. Copa-Patino J.L., Reys F., Perez-Leblic M.I. Effect of beta-glucanases on Penicillium J. Gen. oxalicum cell wall fraction // FEMS Microbiol. Lett. 1990. Vol. 58. № 3. P. 233-239.
69. Cortat M., Matile P., Wiemken A. Isolation of glucnase containing vesicles from budding yeast // Arch. Microbiol. 1972. Vol. 82. P. 189-205.
70. Del Rey F., Villa T.G., Santos Т., Garcii-Acha I., NombelaC. Purification and partial characterization of a new sporulation specific exo-P-glucanase form Saccharomyces cerevisiae И Biochem. Biophys. Res. Commun. 1982. Vol. 105. P. 13471353.
71. DiLuzio N.R., Williams D.L., McNamee R.B. Comparative tumor-inhibitory and antibacterial activity of soluble and particulated glucan //J. Nat. Cancer Inst. 1979. Vol. 24. P. 773-779.
72. Ding S-J., Ge W., Buswell J.A. Endoglucanase I from the edible straw mushroom , Volvariella volvacea. Purification, characterization, cloning and expression // Eur. J. Biochem. 2001. Vol. 268. P. 5687-5695.
73. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J., Robers P.A., Smith F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances//Anal. Chem. 1956. Vol. 28. P. 350-356.
74. Dubourdieu D., Ribereau-Gayon P., Fournet B. Structure of the extracellular P-D-glucan from Botrytis cinerea II Carbohydr. Res. 1981. Vol. 93. P. 294-299.
75. Duncan W.A.P., Manners D.J., Ross A.G. Enzyme systems in marine algae. The carbohydrase activities о unfzuctionated extracts of Cladofora rupestris, Laminaria digitata, Rhodymenipalmate and Veva lactuca II Biochem. J. 1956. Vol. 63. P. 44.
76. El-Katatny M.N., Somitsch W., Robra K.H., El-Katatny M.S., Gubitz G.M.
77. Production of chitinase and beta-l,3-glucanase by Trichoderma harzianum for control of the phytopathogenic fungus Sclerotium rolfsii II Food Thechnol. and Biothechnol. 2000. Vol. 38. №3. P. 173-180.
78. Falch B.H., Stokke B.T. Structural stability of (l-»3)-p-D-glucan macrocycles // Carbohydr. Polymers. 2001. Vol. 44. P. 113-121.
79. Fevre M. Subcellular localization of glucanase and cellulase in Saprolegnia щ monoica Pringsheim // J. Gen. Microbiol. 1977. Vol. 103. P. 287-295.
80. Fiske M.J., Tobeyfincher K.L., Fuchs R.L. Cloning o£2 genes from Bacillus circulans Wl-12 which encode 1,3-Beta-glucanase activity // J. Gen. Microbiol. 1990. Vol. 136. P. 2377-2383.
81. Fleet G.H., Phaff H.J. Glucanase in Schizosaccharomeces. Isolation and properties of the cell wall-associated p-l,3-glucanases // J. Biol. Chem. 1974. Vol. 249. P. 17171728.
82. Fleet G.H., Phaff H.J. Glucanase in Schizosaccharomeces. Isolation and properties of an exo-p-glucanase from the cell extracts and culture fluid of Schizosaccharomeces japonicus var versatilis II Biochim. et Biophys. Acta. 1975. Vol. 401. P. 318-332.
83. Fleet G. H. Cell walls // The yeast. New York: Acad. Press, 1991. Vol. 4. P. 199277.
84. Fredrick J.F. The b.e. and Q types of a-l,4-D-glucan:a-l,4-D-glucan-6-glycosyltransferase isozymes in algae // Phytochemistry. 1980. Vol. 19. P. 539-542.
85. Galan В., Garcia M.C., Calonje M., Novaes-Ledieu M. New notes: production, purification, and properties of an endo-1,3-beta-glucanase from the basidomycete Agaricus bisporus II Curr. Microbiol. 1999. Vol. 38. № 3. P. 190-193.
86. Gilkes N.R., Henrissat В., Kilburn D.G., Miller JR.R.C., Warren R.A.J. Domain in microbial P-l,4-glucanases: sequence conservation, function, and enzyme families // Microbiol. Rev. 1991. Vol. 55. P. 303-315.
87. Goldman R.C., Sullivan P.A., Zakula D., Capobianco J.O. Kinetics of P-1,3 glucan interaction at the donor and acceptor sites of the fungal glucosyltransferase encoded by the BGL2 gene // Eur. J. Biochem. 1995. Vol. 227. P. 372-378.
88. Grant W.D., Rhodes L.L. Cell-bound and extracellular laminarinase activity in Dendryphiella Salina and 5 other marine fungi II Bot. Marina. 1992. Vol. 35. № 6. P. 503-511.
89. Grant W.D., Atkinson M., Burke В., Molloy C. Chitinolysis by the marine ascomycete Corollospora maritima Werdermann: purification and properties of a chitobiosidase // Bot. Marina. 1996. Vol. 39. № 2. P. 177-186.
90. Greenwood C.T., Milne E.A. Starch degrading and synthesizing enzymes a discussion on their properties and action pattern // Advan. Carb. Chem. 1968. Vol. 23. P. 281-366.
91. Grenier J., Potvin C., Asselin A. Some fungi express beta-l,3-glucanases similarto thaumatin-like proteins // Mycologia. 2000. Vol. 92. № 5. P. 841-848.
92. Нага. C., Kiho Т., Ukai S. A branched (l-»3)-(5-D-glucan from a water extract of Dictyophora indusiuta Fisch // Carbohydr. Res. 1986. Vol. 145. P. 237-246.
93. Harada Т., Masada M., Fujimori K., Maeda J. Production of a firm resilient gel-forming polysaccharide by a mutant of Alcaligenes faecalis var. myxogenes 10C3 //Agric. Biol. Chem. 1966. Vol. 30. P. 196-198.
94. Hartland R.P., Emerson G.W., Sullivan P.A. A secreted p-glucan-branching enzyme from Candida albicans II Proc. R. Soc. Lond. В Biol. Sci. 1991. Vol. 246. P. 155-160.
95. Henrissat B. A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequencesimilarities //Biochem. J. 1991. Vol. 280. № 2. P. 309-316.
96. Henrissat В., Callebaut I., Fabrega S., Lehn P., Mornom J.P., Davies G. Conservedcatalytic machinery and the prediction of a common fold for several families of glycosylhydrolases // Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1995. Vol. 92. №> 15. P. 7090-7094.
97. Himmel M.E., Karplus P.A., Sakon J., Adney W.S., Baker J.O., Thomas S.R. Polysaccharide hydrolase folds diversity of structure and convergence of function // Appl. Biochem. and Biothechnol. 1997. Vol. 63. № 5. P. 315-325.
98. Hiura N., Kobayashi M., Nakajima Т., Matsuda K. Purification and someproperties of two wall-associated (pi,3)glucanases from Neurospora crassa cells // Agric. Biol. Chem. 1986. Vol. 50. № 10. P. 2461-2467.
99. Hoj P.B., Fincher GB. Molecular evolution of plant beta-glucan endohydrolases // Plant. J. 1995. Vol. 7. № 3. P. 367-379.
100. Holten V. Z., Bartnicki-Garcia S. Extracellular p-glucanase activity of
101. Phytophtorapalmivora // Biochim. et Biophys. Acta. 1972. Vol. 276. P. 221-227.
102. Horitsu H., Satake Т., Tomogeda M. Purification of an P-D-(l—>3)-Glucanase from Rhizopus niveus //Agric. Biol. Chem. 1973. Vol. 35. № 5. P. 1007-1012.
103. Hranisavljevic-Jakovljevic M., Miljkovii-Stojanovich J., Dimitrijevich R., Micovic V.M. An alkali-soluble polysaccharide from the oak lichen Cetraria islandica (L.) Ach I I Carbohydr. Res. 1980. Vol. 80. P. 291-295.
104. Hughes G.C. Studies of fungi in oceans and estuaries since 1961. I. Lignicolous, caulicolous and foliicolous species // Oceanogr. Mar. Biol. A. Rev. 1975. Vol. 13. P. 69180.
105. Huotari F.I., Nelson Т.Е., Smith F., Kirkwood S. Purification of an Exo-P-D-(1—>3)- glucanase from Basidiomycete species QM 806 // 1968. J. Biol. Chem. Vol. 243. P.952-956.
106. Hyde K.D., Jones E.B.J., Leano E., Pointing S.B., Poonyth A.D., Vrijmoed L.L.P. Role of fungi in marine ecosystems // Biodiversity and conservation. 1998. Vol. 7. № 9. P. 1147-1161.
107. Jayus, McDougall B.M., Seviour R.J. Purification and properties of a (l-»6)-P-glucanase from Acremonium sp. IMI 383068 // Enzyme and Microbial Technol. 2001. Vol. 29. P. 194-200.
108. Jenkins K.M., Toske S.G., Jensen P.R., Fenical W. Solanapyrones E-G, antialgalmetabolites produced by a marine fungus // Phytochemistry. 1998. Vol. 49. № 8. P. 22992304.
109. Johnson T.W., Sparrow F.K. Fungi in oceans and estuaries. Weinheim: J. Gramer, 1961.668 р.
110. Johnson B.F. Lysis of yeast cell wall induced by 2-deoxyglucose at their sites of glucan synthesis // J. Bacteriol. 1968. Vol. 95. P. 1169-1172.
111. Johnston J.R. The composition of the cell wall of Aspergillus niger II Biochem. J. 1965. Vol. 96. P. 651-658.
112. Jones E.B.G. Topics of further interest // Resent advances in quatic fungi. London: Elek Science, 1976. P. 707-724. i
113. Dimensional structure of a thermostable bacterial cellulase // Nature. 1992. Vol. 357. №6373. P. 89-91.
114. Kasahara S., Nakajima Т., Miyamoto C., Wada K., Furuichi Y., Ichishima E. Characterization and mode of action of exo-l,3-beta-D-glucanase from Aspergillus saitoi II J. Ferment, and Bioeng. 1992. Vol. 74. № 4. P. 238-240.
115. Katz D., Rosenberger R.F. Hyphal wall synthesis in Aspergillus nidulans: effects of protein synthesis inhibition and osmotic shock on chitin insertion and morphogenesis I I J. Bacteriol. 1971. Vol. 108. P. 184-190.
116. Kery V., Kogan G., Zajacova K., Slamova K., Masler L., Alfoldi J. Hydrolysis of yeast cell-wall glucan by extracellular (1—*3)-beta-glucanases from Aspergillus niger H Enzyme and Microbial Technol. 1991. Vol. 13, iss. 1. P. 87-90.
117. Kishida E., Sone Y., Misaki A. Purification of an antitumor-active, branchedl->3)-P-D-glucan from Volvariella volvacea, and elucidation of its tine structure // Carbohydr. Res. 1989. Vol. 193. P. 227-239.
118. Kitamura K. and Yamamoto Y. Purification and properties of an enzyme zymolase, which lyses viable yeast cells // Arch. Biochem. Biophys. 1972. Vol. 153. P. 403-406.
119. Kitamura S., Hori Т., Kurita, К., Takeo К., Нага C., Iton W., Tabata K., ElgsaeterЩ
120. A., Stokke B.T. An antitumor, branched (l->3)-P-D-glucan from a water extract of fruiting bodies of Cryptoporus volvatus II Carbohydr. Res. 1994. Vol. 263. № 1. P. 111-121.
121. Klarzynski O., Plesse В., Joubert J.M., Yvin J.C, Kopp M., Kloareg В., Fritig B. Linear beta-1,3 glucans are elicitors of defense responses in tobacco // Plant Physiol. 2000. Vol. 124. № 3. P. 1027-38.
122. Knuckles B.E., Chiu M.C.M. beta-GIucanase activity and molecular weitght ofibeta-glucans in barley after various treatments // Cereal. Chem. 1999. Vol. 76. № 1. P. 92-95.
123. Kohlmeyer J. On the definition and taxonomy of higher marine fungi // Veroff. Inst. Meeresforsch. Breroerh., Suppl. 1974. Vol. 5. P. 263-286.щ Kohlmeyer J., Kohlmeyer' E. Marine mycology. The Higher Fungi. New York:1. Acad. Press, 1979. 690 p.
124. Koshland D.E. Stereochemistry and the mechanism of enzymatic reactions // Biol. Rev. 1953. Vol. 28. P. 416-433.
125. MacDonald M.J., Speedie M.K. Cell-associated and extracellular cellulolytic enzyme activity in the marine fungus Dedryphiella arenaria II Can. J. Bot. 1982. Vol. 60. P. 838-844.
126. Maeda M., Nisizawa K. Laminaran from Ishige okamurae 11 Carbohydr. Res. 1968. Vol. 7. P. 97-99.• Manners D.I., Ryley I.F., Stark I.R. Studies of the metabolism of the Protozoa.
127. The molecular structure of the reserve polysaccharide from Astasia acellata II J. Biochem. 1966. Vol. 101. P. 323-327.
128. Manners D. J., Stark J. R., Wilson G., Brodie J. Y. Some properties of a fungal p-D-glucanase preparation // Carbohydr. Res. 1976. Vol. 49. P. 383-388.
129. Marshall J.J., Grand R.J.A. Comparative studies on P-glucan hydrolases. Isolation and characterization of an exo-(l-3)-P-glucanase from snail, Helix pomatia И Arch. Biochem. and Biophys. 1975. Vol. 167. № 1. P. 165-175.
130. Masuma R., Yamaguchi Y., Noumi M., Omura S., Namikoshi M. Effect of sea water concentration on hyphal growth and antimicrobial metabolite production in marine fungi // Mycoscience. 2001. Vol. 42. P. 455-459.
131. Matsuno R., Suganuma Т., Fujimori H., et al. Rate Equation for amylase « catalysed hydrolysis, transglycosylation and condensation of linear oligosaccharides andamylase//J. Biochem. 1978. Vol. 83. P. 385-394.
132. Mclntire Т. M., Brant D. A. Observations of the (l->3)-p-D-glucan linear triple helix to macrocycle interconversion using noncontact atomic force microscopy // J. Am. Chem. Soc. 1998. Vol. 120. P. 6909-6919.
133. Molina M., Cenamor R., Sanchez M., Nombela C. Purification and some properties of Candida albicans exo-l,3-P-glucanase //J. Gen. Microbiol. 1989. Vol. 135. P. 309-314.
134. Molitoris H.P., Schaumann K. Physiology of marine fungi: a screening programme for growth and enzyme production // The biology of marine fungi. Cambridge: Cambridge University Press, 1986. P. 34-47.
135. Moore A.E., Stone B.A. A P-l,3-glucan hydrolase from Nicotiana glutinosa. I Extraction, purification, and physical properties // Bhiochim. et Biophys. Acta. 1972. Vol. 258. P. 238-247.1.• !
136. Mori H., Yamamoto S., Nagasaki S. Multiple forms of the lytic glucanase of
137. Flavobacterium dormitator var. glucanolyticae and the properties of the main componentenzyme// Agric. Biol. Chem. 1977. Vol. 41. P. 611-613.
138. Morrison E.Y.S., Wright-Pascoe R., Aquart A., Robinson H., Babury M., Whitbourne F., Callender J., Less L., Bailey S. The efficacy of acarbose in type 2 diabetes mellitus in Jamaica // West. Ind. Med. J. 2000. Vol. 49. № 4. p. 285-289.
139. Mrsa V., Klebl F., Tanner W. Purification and characterization of the Saccharomyces cerevisiae Bgl2 gene-product, a cell-wall endo-beta-l,3-glucanase // J. Bacteriol. 1993. Vol. 175. № 7. P. 2102-2106.
140. Myklestad S., Djurhuus R., Mohus A. Demonstration of exo-(beta-l,3)-D-glucanase activity in some planktonic diatoms. J. Exp. Marine Biol, and Ecology. 1981. Vol. 56. №2-3. P. 205-211.
141. Structure of the gene encoding laminaripentaose-producing beta-l,3-glucanase (LPHase) of Streptomyces matensis DIC-108 I I J. Ferment, and Bioeng. 1998. Vol. 85. № 5. P. 459-464.
142. Nanba IL, Hamaguchi A., Kuroda H. The chemical structure of an antitumor polysaccharide in fruit bodies of Grifola frondosa (maitake) //Chem. Pharm. Bull. 1987. Vol. 35. P. 1162-1168.
143. Nanba II., Kuroda H. The chemical structure of an antitumor polysaccharide in mycelia of Cochliobolus miyabeanus II Chem. Pharm. Bull. 1987. Vol. 35. P. 1285-1288.
144. Nelson N. A photometric adaptation of the Somogyi method of determination of glucose//J. Chem. 1944. Vol. 153. P. 375-381.
145. Nelson Т. E., Johnson J., Jantzen E., Kirkwood S. Action pattern and specificity of an exo-P" (1—>3)-D-glucanase from Basidiomycetes species QM 806 // J. Biol. Chem.1969. Vol. 244. №21. P. 5972-5980.
146. Nelson Т.Е., Lewis B.Ai Separation and characterization of the soluble; and insoluble components of insoluble laminaran //Carbohydr. Res. 1974. Vol. 33. P. 63-74.
147. Nishimura Т., Bignon C., Allouch J., Czjzek M., Darbon H., Watanabe Т., Henrissat B. Streptomyces matensis laminaripentaose hydrolase is an 'inverting' P-1,3-glucanase // FEBS Lett. 2001. Vol. 499. P. 187-190.
148. Noronha E.F., Kipnis A., Junqueira-Kipnis A.P., Ulhoa C.J. Regulation of 36 kDa beta-l,3-glucanase synthesis in Trichoderma harzianum II FEMS Microbiol. Lett. 2000. Vol. 188.№ l.P. 19-22.
149. Noronha E.F., Ulhoa C.J. Characterization of a 29-kDa beta-l,3-glucanase from Trichoderma harzianum // FEMS Microbiol. Lett. 2000. Vol. 183. № 1. P. 119-123.
150. Notario V., Villa T. G., Villanueva J. R. Purification of an exo-P-D-glucanase from cell-free extracts of Candida utilis И Biochem. J. 1976. Vol. 159. P. 555-562.
151. Notario V. beta-Glucanases from Candida albicans: purification, characterization and the nature of their attachment to cell wall components // J. Gen. Microhiol. 1982. Vol. 128. P. 747-759.
152. Ogawa K., Watanabe Т., Tsurugi Y., Ohno S. Conformational behavior of a gel-forming (l-»3)-P-D-glucan in alkaline solution // Carbohydr. Res. 1972. Vol. 23. P. 399-405.
153. Okinaka Y., Mimori К., Takeo K., Kutamura S., Takeuchi Y., Yamaoka N., Yoshikawa M. A structural model for the mechanisms of elicitor release from fungal cell walls by plant beta-l,3-endoglucanase // Plant, physiol. 1995. Vol. 109. № 3.P. 839-845.
154. Painter T.J. Structural evolution of glycans in algae // Pure Appl. Chem. 1983. Vol. 55. P. 677-694.
155. Peeles M.T., Chambers S.A., Wang C.Y., McClay D.R. Stage-specific expression of p-l,3-glucanase in sea urchin embryos and hybrids // J. Exp. Zool.1987. Vol. 244. P. 215-222.
156. Percival E, Algal polysaccharides // The Carbohydrates. (Chemistry and biochemistry). New York: Acad. Press, 1970. Vol. IIB. P. 541-544.
157. Perez P., Garcia-Acha I., Duran A. P-1,3-Glucanases from Geotrichum lactis activity on its own nascent and perfomed P-l,3-glucan // FEMS Microbiol. Lett. 1984. Vol. 23. P. 233-238.
158. Perlin A.S., Taber W.A. A glucan produced by Claviceps purpurea // Can. J. Chem. 1963. Vol. 41. № 9. P. 2278-2282.
159. Piavaux A. Distribution and localization of the digestive laminarinases in animals //Biochem. System, and Ecol. 1977. Vol. 5. P. 231-239.
160. Pitson S., Seviour R.J., Bott J., Stasinopoulos S.J. Production and regulation of beta-glucanases in Acremonium and Cephalosporium isolates // Mycol. Res. 1991. Vol. 95. P. 352-356.
161. Pitson S.M., Seviour R.J., Mcdougall B.M. Noncellulolytic fungal beta-glucanases their physiology and regulation // Enzyme and Microbiol. Thechnol. 1993. Vol. 15. № 3.P. 178-192.
162. Pitson S.M., Seviour R.J., Mcdougall B.M. Effect of carbon source on extracellular (1—>3)- and (1—>6)- beta-glucanase production by Acremonium persicinum //Can. J. Microbiol. 1997. Vol. 43. № 5. P. 432-439.
163. Pivkin M.V., Afiyatullov Sh.Sh., Elyakov G.B. Biodiversity of marine fungi and new biologically active substances from them // Biodiversity and allelopathy: from organisms to ecosystems in the Pacific. Taipei: Academia Sinica. 1999. P. 91-99.
164. Pointing S.B., Vrijmoed L.L.P., Jones E.B.G. A qualitative assessment of lignocellulose degrading enzyme activity in marine fungi // Bot. Marina. 1998. Vol. 41. № 3. P. 293-298.
165. Pointing S.B., Buswell J.A., Jones E.B.G., Vrijmoed L.L.P. Extracellular cellulolytic enzyme profiles of five lignicolous mangrove fungi // Mycol. Res. 1999. Vol. 103. P. 696-700.
166. Polacheck Y., Rosenberger R.F. Autolytic enzymes in hyphae of Aspergillus nidulans: their action on old and newly formed walls // J. Bacteriol. 1975. Vol. 120. P. 332-337.
167. Post C.B., Karplus M. Does lysozyme follow the lysozyme pathway. An alternative based on dynamic structural and stereoelectronic considerations // J. Amer. Chem. Soc. 1986. Vol. 108. P. 1317-1319.
168. Privalova N.M., Elyakova L.A. Purification and some properties of endo-p-1,3-glucanase from the marine bivalvia Chlamys albidus // Compar. Biochem. and Physiol. 1978. Vol. 6IB. P. 225-228.
169. Raghukumar C., Raghukumar S., Chinnaraj A., Chandramohan D., Dsouza T.M., Reddy C.A. Laccase and other lignocellulose modifying enzymes of marine fungi isolated from the coast of India // Bot. Marina. 1994. Vol. 37. № 6. P. 515-523.
170. Ramot O., Cohen-Kupiec R., Chet I. Regulation of beta-l,3-glucanase by carbon starvation in the mycoparasite Trichoderma harzianum // Mycol. Res. 2000. Vol. 104. P. 415-420.
171. Rapp P. Formation, separation and characterization of 3 beta-l,3-glucanases from Sclerotium glucanicum II Biochim. et Biophys. Acta. 1992. Vol. 1117. № 1. P. 7-14.
172. Reyes F., Lahoz R., Vazques C. Lytic enzymes in the autolysis of Schizophyllum commune with special reference to 1,3-a-glucanase I I Can. J. Microbiol. 1980. Vol. 26. P. 1120-1125.
173. Robyt J.F., French D. Multiple attack and polarity of action of PPA // Arch. Biochem. Biophys. 1970. Vol. 138. P. 662-670.
174. Rohrmann S., Molitoris H.P. Screening for wood-degrading enzymes in marine fungi I I Can. J. OF Botany-revue Canadienne de Botanique. 1992. Vol. 70. № 10. P. 2116-2123.
175. Rombouts F. M., Fleet G. H., Manners D. J., and Phaff H. Lysis of yeast cell walls non-lytic and lytic (3-1,3-glucanases from Bacillus circulans WL-12 // J. Carbohydr. 1978. Vol. 64. № 1. P. 237-248.
176. Rouvinen J., Bergfors Т., Teeri Т., Knowles J.K., Jones T.A. The three-dimensional crystal structure of the catalytic core of cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei II Science. 1990. Vol. 249. P. 325-330.
177. Rubinstein B. Similarities between plants and animals for avoiding predation and disease II Physiol. Zool. 1992. Vol. 65. P. 573-492.
178. Santos Т., Sanchez M., Villanueva J. R., Nombela C. Regulation of the P-1,3-glucanase system in Penicillium italicum: glucose repression of the various enzymes // J. Bacterial. 1978. Vol. 133. № 2. P. 465-471.
179. Sasaki Т., Takasaka N. Further study of the structure of lentinan, an anti-tumor polysaccharide from Lentinus edodes I I Carbohydr. Res. 1976. Vol. 47. P. 99-104.
180. Sasaki Т., Takasaka N., Chihara G., Maeda Y. Antitumor activity of degraded products of lentinan: its correlation with molecular weight // Gann. 1976. Vol. 67. P. 191-195.
181. Sato Т., Norisuye Т., Fujita H. Melting behavior of Schizophyllum commune polysaccharides in mixtures of water and dimethyl sulfoxide // Carbohydr. Res. 1981. Vol. 95. P. 195-204.
182. Schaumann К., Mulach H.P., Molitoris H.P. Comparative studies on growth and exoenzyme production of different Lulworthia isolates // The biology of marine fungi. Cambridge: Cambridge University Press, 1986. P. 48-60.
183. Scheberger G.L., Luchsinger W. Beta-(1—»3)- and beta-(l—>4)-D-glucanase production by three fungi // Can. J. Microbiol. 1967. Vol. 13. P. 901-906.
184. Sharon N., Seifter S. Transglycosylation reaction catalysed by lysozyme // J. Biol. Chem. 1964. Vol. 239. P. 2398-2399.
185. Shida M., Ushioda Y., Nakajima Т., Matsuda K. Structure of the alkali-insoluble skeletal glucan ofLentinus edodeslll. Biochem. 1981. Vol. 90. P. 1093-1100.
186. Shimoda C., Yanagishima N. Role of cell wall-degrading enzymes in auxin-induced cell expansion in yeast // Physiol. Plant. 1971. Vol. 24. P. 46-50.
187. Sietsma J.H., Wessels J.G.H. Chemical analysis of the hyphal wall of Schizophyllum commune II Biochim. et Biophys. Acta. 1977. Vol. 496. P. 225-239.
188. Singh T.P., Whistler R.L., Tokuzen R., Nakahara W. Scleroglucan, an antitumor polysaccharide from Sclerotium glucanicum II Carbohydr. Res. 1974. Vol. 37. P. 245-247.
189. Sova V. V., Elyakova L. A. Some aspects of the specificity and action pattern of P-1,3-glucan glucanohydrolase from Spisula sachalinensis // Biochim. et Biophys. Acta. 1972. Vol. 258. P. 219-227.
190. Stahmann K.P., Schimz K.L., Sahm H. Purification and characterization of 4 extracellular 1,3-beta-glucanases of Botrytis cinerea // J. Gen. Microbiol. 1993. Vol. 139. № 11. P. 2833-2840.
191. Stubbs H.J., Brasch DJ., Emerson G.W., Sullivan P.A. Hydrolase and transferase activities of the p-l,3-exoglucanase of Candida albicans И Eur. J. Biochem. 1999. Vol. 263. P. 889-895.
192. Suzuki M., Yoshida K., Hamano K., Ashida K. Substrate-specificity of endo-1,3-beta-glucanase from antarctic krill Euphausia superba // Nippon Suisan Gakkaishi-Bull. of the Japanese Society of Sci. Fisheries. 1992. Vol. 58. № 9. P. 1693-1698.
193. Takahushi M., Komuro M., Soutome S.I. Purification and properties of p-1,3-glucanase from Lentinus lepideus II J. Ferment. Technol. 1978. Vol. 56. P. 499-505.
194. Tingle M.A., Halvorson H. A comparison of P-glucanase and P-glucosidase in Saccharomyces lactis //Biochim. et Biophys. Acta. 1971. Vol. 250. P. 165-171.
195. Torronen A., Rouvinen J. Structural comparison of two major endo-l,4-xylanases from Trichoderma reeseiИ Biochemistiy. 1995. Vol. 34. № 3. P. 847-56.
196. Totsuka A., Usui T. Separation and characterization of the endo-p-(l—*3)-D-i . ! Glucanase from Rizoctonia solani I I Agric. Biol. Chem. 1986. Vol. 50. № 3. P. 543-550.
197. Ueno Y., Hachisuka Y., Esaki H., Kato K., Yamauchi R. Structural analysis of extracellular polysaccharide of Sclerotinia libertiana //Agric. Biol. Chem. 1980. Vol. 44. №2. P. 353- 359.
198. Usui Т., Topiyama Т., Mizuno T. Structural investigation of laminaran of Eisenia bicyclis II Agric. Biol. Chem. 1979. Vol. 43. P. 603-611.
199. Varum K.M., Kvam B.J., Myklestad S., Paulsen B.S. Structure of a food-reserve P-D-glucan produced by the haptophyte alga Emiliania huxleyi II Carbohydr. Res. 1986. Vol. 152. P.243-248.
200. Varum К. M., Smidsrod О. Partial chemical and physical characterization of (1 —>3),( 1 ->4)-p-D-glucans from oat (Avena sativa, L.) aleurone // Carbohydr. Polymers. 1988. Vol. 9. P. 103-117.
201. Vazquez-Garciduenas S., Leal-Morales C.A., Herrera-Estrella A. Analysis of the ^ ' P-l,3-glucanolytic system of the biocontrol agent Trichoderma harzianum H Appl. Environ. Microbiol. 1998. Vol. 64. P. 1442-1446.
202. Villa T. G., Notario V., Villanueva J. R. p-Glucanases of the yeast Pichia // Arch. Microbiol. 1975. Vol. 104. P. 201-206.
203. Villa T. G., Notario V., Benitez Т., and Villanueva J. R. Purification of an exo-1,3-^ p-glucanase // Can. J. Biochem. 1976. Vol. 54. P. 927-934.
204. Villa T.G., Lachance M., Phaff H. P-Glucanases of the yeast Kluyveromyces phaseolosporus: partial purification and characterization // Exp. Mycol. 1978. Vol. 2. P 12-25.
205. Wessels J.G.I I. A steady-state model for apical wall groth in fungi // Acta Bot. ф Neerl. 1988. Vol. 37. P. 3-16.
206. Winchester В., Fleet G.W.J. Amino-sugar glycosidase inhibitors versatile tools for glycobiologists // Glycobiology. 1992. Vol. 2. P. 199-210.
207. Woodward J.R., Fincher G.B., Stone B.A. Water-soluble 1—>3;l->4-p-D-glucansifrom barley (Hordeum vulgare) endosperm // Carbohydr. Polymers. 1983. Vol. 3. P.f 207-225.1 v
208. X Yamaguchi Т., Nakayama K., Hayashi Т., Tanaka Y., Koike S. Molecular Cloning1 and characterization of a novel P-l,3-glucanase gene from rice // Biosci. Biotechnol.
209. Biochem. 2002. Vol. 66. № 6. P. 1403-1406.I
-
Бурцева, Юлия Валериевна
-
кандидата биологических наук
-
Владивосток, 2003
-
ВАК 03.00.04
- Биоразнообразие мицелиальных грибов - ассоциантов двустворчатых моллюсков залива Петра Великого Японского моря
- Биокатализаторы в виде иммобилизованных в криогель поливинилового спирта клеток мицелиальных грибов в процессах получения органических кислот, биоэтанола, гидролитических ферментов и разложения фосфорорганических пестицидов
- Ферменты морских бактерий Pseudoalteromonas citrea, катализирующие деградацию полианионных полисахаридов бурых водорослей
- Микобиота водоросли Ascophyllum nodosum (Phaeophyceae, Fucaceae) в Белом и Баренцевом морях
- Молекулярное клонирование и структурная характеристика эндо-1,3-β-D-глюканаз двустворчатых моллюсков
