Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярное клонирование и структурная характеристика эндо-1,3-β-D-глюканаз двустворчатых моллюсков
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Молекулярное клонирование и структурная характеристика эндо-1,3-β-D-глюканаз двустворчатых моллюсков"
На правах рукописм
003067Б81
Ковальчук Светлана Николаевна
молекулярное клонирование и структурная характеристика эндо-1,з-р-о-глюканаз двустворчатых моллюсков
03.00.04 - биохимия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
ВЛАДИВОСТОК - 2006
003067681
Работа выполнена в Тихоокеанском институте биоорганической химии Дальневосточного отделения Российской академии наук
Научные руководители: кандидат биологических наук
Кожемяко В. Б.
доктор химический наук Звягинцева Т. II.
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор
Костецкнй Э. Я.
кандидат химических наук Новикова О. Д.
Ведущая организация: Институт химической биологии и фундаментальной
медицины СО РАН, г. Новосибирск
Защита состоится «_» 2007 г. в 10 часов на заседании
диссертационного совета Д 005.005.01 в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, пр-т 100-летия Владивостока, 159, ТИБОХ. Факс: (4232)31-40-50. E-mail: science@piboc.dvo.ru
С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, пр-т 100-летия Владивостока, 159, ТИБОХ ДВО РАН).
Автореферат разослан « Ь »г.
Ученый секретарь
диссертационного совета, к.х.н Прокопенко Г. И.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. 1,3-р-0-глюканазы (ЕС 3.2.1.39) являются одними из ключевых ферментов метаболизма углеводов, они широко распространены среди представителей всех царств живой природы, от архебактерий до эукариот, и вовлечены в разнообразные физиологические процессы. 1,3-р-0-Глюканазы бактерий расщепляют 1,3-р-О глюканы клеточных стенок грибов и ламинараны бурых водорослей, используемые бактериями в качестве источника глюкозы. В грибах эти ферменты участвуют в расщеплении внеклеточного матрикса при пролиферации клеток, в формировании клеточной стенки, в процессах почкования и споруляции. В растениях 1,3-Р-0-глюканазы вовлечены в процессы клеточной дифференциации, деградации 1,3-р-0-глюканов при прорастании семян и при оплодотворении, а также являются частью механизма защиты растений от патогенных грибов. Эндо-1,3-Р-Ц-глюканазы беспозвоночных животных входят в состав пищеварительных ферментов, а также участвуют в эмбриогенезе.
Эндо-1,3-р-0-глюканазы животных являются одной их самых малоизученных групп О-гликозилгидролаз. На сегодняшний день исследованы физико-химические свойства и установлены аминокислотные последовательности эндо-1,3-р-0-глюканаз лишь из двух видов беспозвоночных животных, из морского ежа 51гоп%у1осегНгош$ ригригашв и из нематоды ВипаркекпсЬия ху\орЫ1из. Вместе с тем исследования показали, что многие виды морских беспозвоночных, и особенно двустворчатые моллюски, являются источниками высокоактивных эндо-1,3-р-0-глюканаз. К настоящему времени достаточно глубоко изучены физико-химические свойства эндо-1,3-Р-0-глюканаз двустворчатых моллюсков 5р1$и1а ьасЬаИпепМз, СЫатуя аШс1из и М1гиИорес1еп уея$оеп$15, накоплены данные о специфичности и механизме действия этих ферментов, определены аминокислотные остатки, имеющие существенное значение для их активности. Особый практический интерес представляет возможность получения с помощью эндо-1,3-Р"0-глюкапазы из С. а1ЬШиз биологически активных 1,3-Р-0-глюканов, оказывающих иммуномодулирующее действие на организмы животных и растений. Для более глубокого понимания функционирования, происхождения и эволюции этой группы ферментов является актуальным установление их структуры с целью изучения структурно-функциональных особенностей этих ферментов.
Цель и задачи исследования. Целью работы является установление и анализ структуры эндо-1,3-р-0-глюканаз двустворчатых моллюсков. Для достижения цели работы были поставлены следующие задачи:
1. Установить полные нуклеотидные последовательности кДНК и определить аминокислотные последовательности эндо-1,3-Р-В-глюканаз двустворчатых
моллюсков Spisula sachalinensis, Mizuhopecten yessoensis, Chlamys albidus и Chlamys rosealbus.
2. Провести филогенетический анализ эндо-1,3-Р-0-глюканаз на основе уже имеющихся
в базах данных и полученных нами аминокислотных последовательностей этих ферментов.
3. Построить теоретические модели пространственных структур эидо-1,3-Р-0-глюканаз двустворчатых моллюсков с целью исследования структурно-функциональных особенностей этих ферментов.
4. Исследовать возможность гетерологической экспрессии эндо-1,3-Р-0-глюканаз двустворчатых моллюсков в клетках Escherichia coli.
2. Научная новизна и праетическая ценность работы. Впервые клонированы и секвенированы кДНК, кодирующие эпдо-1,3-р-П-глюкана1Ы двустворчатых моллюсков Spisula sachalinensis, Mizuhopecten yessoensis, Chlamys albidus и Chlamys rosealbus, и на основании этих данных установлены аминокислотные последовательности этих ферментов. Методом сравнительного моделирования впервые получены теоретические модели пространственных структур эндо-1,3-Р-0-глюканаз из Spisula sachalinensis, Mizuhopecten yessoensis и Chlamys albidus, которые могут быть использованы для исследования молекулярных механизмов взаимодействия этих ферментов с известными субстратами и ингибиторами, а также для поиска in silico новых веществ, способных взаимодействовать с их активными центрами. Проведенные исследования показали возможность гетерологической экспрессии эндо-1,3-р-0-глюканаз двустворчатых моллюсков в E.coli.
Установление первичной структуры эндо-1,3-Р-0-глюканаз двустворчатых моллюсков создает необходимую основу для работы по получению ферментативно активных рекомбинантных эндо-1,3-р-0-глюканаз двустворчатых моллюсков с целью более детального исследования функциональной роли различных аминокислотных остатков в каталитическом процессе методами направленного мутагенеза, а также возможного использования этих рекомбинантных ферментов для биотехнологического производства иммуномодулирующих препаратов нового поколения.
Апробация результатов. Результаты работы были представлены на II Московском международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2003) и IUPAC International Conference on Biodiversity and Natural Products: Chemistry and Medical Application (New Delhi, India, 2004).
Публикации. По теме диссертации опубликовано четыре печатные работы.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Список литературы включает 162 публикации. Диссертационная работа изложена на 111 страницах машинописного текста и содержит 11 таблиц и 39 рисунков.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Выделение РНК. Суммарную РНК выделяли методом кислой экстракции с использованием гуанидинизотиоцианата и кислого фенола (Chomczynski et al., 1987).
Синтез и амплификация кДНК. кДНК-библиотеки были получены методом ОТ-ПЦР (обратная транскрипция-полимеразная цепная реакция) с использованием SMART PCR cDNA Synthesis Kit ("Clontech", США) согласно рекомендациям изготовителя. Клонирование ПЦР-продуктов осуществляли с помощью InsT/Aclone™ PCR Product Cloning Kit (Fermentas, Литва) согласно инструкции изготовителя.
Секвенирование ДНК проводили методом Сэнгера (Sambrook et al. 1989) на автоматическом секвенаторе 310 (ABI PRISM, США).
Трансформацию E.coli плазмидной ДНК проводили с использованием хлористого марганца (Hanahan D., 1983).
Выделение плазмидной ДНК из E.coli осуществляли методом щелочного лизиса (Мазин и др., 1990).
Гель-электрофорез ДНК и РНК проводили в 1-2% горизонтальном агарозном геле в 100 мМ Трис-ацетатном буфере (Маниатис и др., 1984).
ДСН-ПААГэлектрофорез белков осуществляли в 12.5% полиакриламидном геле по методу Лэммли (Laemmli, 1970).
Гетерологическую экспрессию эндо-1,3-р-0-глюканаз из М. yessoensis и S. sachalinensis проводили в штамме E.coli XL-Blue в плазмидных векторах pQE80 и pQE30 ("Clontech", США), соответственно.
Очистку рекомбинантной эндо-1,3-Р-0-глюканазы из S. sachalinensis проводили методом аффинной хроматографии на металлоафшшой смоле TALON ("Clontech", США).
Для получения антисывороток к эндо-1,3-ß'D-r.no камазе из S. sachalinensis проводили трехкратную иммунизацию кроликов гомогенным препаратом эндо-1,3-Р-0-глюканазы из 5. sachalinensis с последующей реиммунизацией через 60 дней. Кровь брали из краевой вены уха на 9 и 11 дни после реиммунизации. Сыворотки тестировали двумерной радиальной им-
мунодиффузией по Оухтерлони в модифицированном варианте (Khramkova and Abelev, 1961).
Иммуиоблоттинг проводили согласно методу (Towbin et al., 1979).
Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей проводили с помощью программ GENERUNNER, CHROMAS и SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/). Поиск гомологичных аминокислотных последовательностей осуществляли с помощью сервера BLAST2 (http://www.ebi.ac.uk/blastall/). Потенциальные сайты N-гликозилирования определяли с помощью сервера NetNGlyc 1.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc). Установление доменной организации белков проводили с помощью сервера SMART (http://smart.embl-heidelberg.de). Множественное выравнивание аминокислотных и нуклеотидных последовательностей проводили с помощью программы Clustal W 1.8 (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/index.html). Филогенетический анализ аминокислотных последовательностей 16 семейства гликозилгидролаз и построение филогенетических деревьев проводили с помощью программ NEIGHBOR и PROTPARS из пакета программ PHYLIP 3.6. Оценку статистической надежности каждого из узлов построенного древа проводили с помощью программы SEQBOOT (PHYLIP 3.6). Графические изображения построенных деревьев получили с помощью программ DRAWTREE и CONSENSE (PHYLIP 3.6).
Компьютерное моделирование пространственной структуры эндо-1,3-Р-0-глюканаз двустворчатых моллюсков проводили с помощью программы МОЕ (http://www.chemcomp.com/) с использованием в качестве прототипа структуры к-каррагеназы из Pseudoalteromonas carrageenovora (код PDB 1DYP). Минимизацию энергии в вакууме полученных моделей и проверку их качества проводили с помощью программ МОЕ и SPDBV (http://tw.expasy.org/spdbv/). Теоретическое предсказание структуры комплексов эпдо-1,3-Р-0-глюканач с ламинаригексаозой и ингибитором халистанолсульфатом проводили с помощью программы GRAMM (Vakser, 1995) с параметрами докинга низкого разрешения. Визуализацию и анализ структуры молекул проводили с помощью программ Rasmol (Sayle and Milner-White, 1995), SPDBV, МОЕ и Molmol
(http://hugin.ethz.ch/wuthrich/software/molmol/).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ II ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
2.1. Установление первичной структуры эидо-1,3-Р-0-глюкапаз двустворчатых
моллюсков
Для установления первичной структуры эндо-1,3-р-0-глгакаиаз двустворчатых моллюсков Spisula sachalinensis, Mizuhopecten yessoensis, Chlamys rosealbus и Chlamys albidus была выбрана стратегия молекулярного клонирования кДНК, кодирующих эти ферменты, так как на сегодняшний день это наиболее эффективный подход для определения аминокислотных последовательностей эукариотических белков. Для амплификации фрагмента кДНК эндо-1,3-Р-П-глюканазы S. sachalinensis методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) была использована пара ген-специфических олигонуклеотидов, созданных на основе установленной методом Эдмана N-концевой последовательности выделенного белка длиной 38 а.о. В результате ПЦР был получен фрагмент кДНК длиной около 90 п.н., который был клонирован и секвенирован. Для амплификации фрагментов кДНК, кодирующих эндо-1,3-р-0-глюканазы из М. yessoensis, С. rosealbus и С. albidus, были использованы вырожденные олигонуклеотидные праймеры, сконструированные на основе консервативных участков аминокислотных последовательностей известных эпдо-1,3-ß-D-глюканаз. В результате ПЦР были получены фрагменты кДНК длиной 320 п.н. На основе установленных нуклеотидных последовательностей были сконструированы олигонуклеотидные праймеры для амплификации концевых фрагметов кДНК эндо-1,3-р-0-глюканаз двустворчатых моллюсков с использованием метода step-out RACE (Matz et al., 1999). В результате ПЦР были получены фрагменты кДНК длиной 600 п.н. и 900 п.н. для эндо-1,3-Р-0-глюканазы S. sachalinensis, и 600 п.н. и 320 п.н. для эндо-1,3-р-П-глюканаз гребешков М. yessoensis, С. rosealbus и С. albidus, которые были клонированы и секвенированы. При сопоставлении установленных нуклеотидных последовательностей трех перекрывающихся фрагментов кДНК эндо-1,3-р-0-глюканаз из S. sachalinensis, М. yessoensis, С. rosealbus и С. albidus были реконструированы их полные нуклеотидные последовательности. Установленные нуклеотидные и выведенные аминокислотные последовательности эндо-1,3-р-0-глюканаз двустворчатых моллюсков были зарегистрированы в базе данных GeneBank под следующими номерами: DQ093347 (эпдо-1,3-ß-D-глюканаза из Chlamys albidus), DQ093348 (эндо-1,3-р-0-глюканаза из Chlamys rosealbus), AY848857 (эндо-1,3-Р-0-глюканаза из Mizuhopecten yessoensis), ААР74223 (эндо-1,3-р-0-глюканаза из Spisula (Pseudocardium) sachalinensis).
Длина кДНК эндо-1,3-Р-0-глюканазы из S. sachalinensis составила 1500 п.н. Анализ ее нуклеотидной последовательности показал, что она включает одну протяженную открытую
рамку считывания длиной 1332 п.н., кодирующую белок длиной 444 аминокислотных остатка. N-Концевая последовательность выделенного из S. sachalinensis белка начинается с 119 а.о. Вероятно, N-концевой пептидный фрагмент длиной 118 аминокислотных остатков отщепляется в ходе постгрансляционлой модификации предшественника эндо-1,3-р-0-глюканазы. Зрелый белок состоит из 326 а.о. Расчетная молекулярная масса белка 37.5 кДа согласуется с экспериментально установленной величиной. Анализ аминокислотной последовательности с помощью сервера SMART показал, что эндо-1,3-р-0-глюканаза из S. sachalinensis содержит каталитический домен 16-го семейства гликозилгидролаз, включающий 221 а.о. (Asnl79- Туг399).
Нуклеотидные последовательности полноразмерных кДНК, кодирующих эидо-1,3-р-1> глюканазы гребешков М. yessoensis (1115 п.н.), С. albidus (1119 п.н.) и С. rosealbus (1113 п.н.) также включают по одной протяженной открытой рамке считывания длиной 1017 п.н. Зрелые формы эндо-1,3-Р-0-глюканаз этих видов гребешков состоят из 324 а.о. Расчетная молекулярная масса белка из М. yessoensis 36.9 кДа согласуется с экспериментально установленной величиной. Изоэлектрическая точка равна 6.11. Расчетная молекулярная масса эндо-1,3-Р-0-глюканазы из С. albidus составляет 36.9 кДа, изоэлектрическая точка равна 7.0, что также согласуется с экспериментально полученными данными. Расчетная молекулярная масса эндо-1,3-р-0-глюканазы из С. rosealbus составляет 36.9 кДа, изоэлектрическая точка равна 7.0. Анализ аминокислотных последовательностей эндо-1,3-р-D-глюканаз гребешков М. yessoensis, С. albidus и С. rosealbus с помощью сервера SMART показал, что они содержат каталитический домен 16-го семейства гликозилгидролаз, включающий в себя 225 а.о. (Туг80 - Gly304). Таким образом, согласно структурной классификации гликозилгидролаз, эндо-1,3-р-0-глюканазы двустворчатых моллюсков S. sachalinensis, М yessoensis, С. rosealbus и С. albidus следует отнести к 16 семейству гликозилгидролаз.
Эндо-1,3-Р-0-глюканазы являются гликопротеинами (Сова и др., 1987). Анализ полученных аминокислотных последовательностей выявил наличие у них потенциальных сайтов N-гликозилирования. У белка из .S". sachalinensis им является последовательность Asn278 - Тгр279 - Thr280, у эндо-1,3-р-0-глюканаз гребешков - Asn84-Gly85-Cys86. Эндо-1,3-Р-0-глюканаза из С. albidus содержит еще один потенциальный сайт N-гликозилирования - Asn76-Lys77-Cys78.
Сравнение аминокислотных последовательностей эндо-1,3-р-0-глюканаз двустворчатых моллюсков показал, что наибольшую степень гомологии имеют белки из гребешков С. albidus и С. rosealbus (92% идентичности и 95% гомологии) (табл.1). Это отражает близкое филогенетическое родство этих двух видов гребешков, принадлежащих к
одному роду. Степень гомологии эндо-1,3-Р-0-глюканаз из С. albidus и С. rosealbus с белком из гребешка М. yessoensis также высока и составляет 92-93% гомологии (идентичность -86%). Вместе с тем было показано, что эндо-1,3-Р-0-глюканазы из С. albidus и М. yessoensis имеют существенные различия в физико-химических свойствах. В частности, фермент из С. albidus более термолабилен и проявляет максимальную активность при более высокой ионной силе, чем эндо-1,3-0-глюканаза из М. yessoensis (Privalova and Elyakova, 1978; Kovalchuk et al., 2006). Эти два фермента также значительно различаются своими каталитическими свойствами, так эндо-1,3-р-0-глюканаза из С. albidus в отличие от фермента из М. yessoensis проявляет помимо гидролазной и трансгликозилирующей еще и глюканозилтрансферазную активность. Поскольку степень гомологии первичных структур этих ферментов высока, можно предположить, что различия в свойствах этих ферментов обусловлены точечными аминокислотными заменами. Степень гомологии 3imo-l,3-ß-D-глкжаназ из гребешков с белком из S. sachalinensis значительно ниже и находится в пределах 45% идентичности и 57-60% гомологии (табл.1). Эти данные коррелируют с отсутствием перекрестной реакции между эндо-1,3-Р-0-глюканазой из С. albidus с антисывороткой к ферменту из S. sachalinensis (Сова и др., 1987), что свидетельствует о том, что количество аминокислотных замен в этих белках превышает 30-40% (Prager & Wilson, 1971).
Таблица 1. Степень идентичности/гомологии эндо-1,3-Р-0-глюканаз двустворчатых
моллюсков (%)
М. yessoensis С. albidus С. rosealbus S. sachalinensis
М. yessoensis 100 86/93 86/92 45/60
С. albidus 100 92/95 45/58
С. rosealbus 100 44/57
S. sachalinenensis 100
Для эндо-1,3-р-В-глюканаз двустворчатых моллюсков ранее было показано, что они не содержат свободных сульфгидрильных групп. Анализ аминокислотного состава полученных аминокислотных последовательностей выявил, что ферменты из гребешков содержат два остатка цистеина, Сув78 и Суя86, которые, вероятно, образуют дисульфидную связь. Для эндо-1,3-Р-0-глюканазы из & ьасИаИпепь^з характерно наличие четырех остатков цистеина, два из которых (Суэ81 и Сув89) консервативны для зпдо-1,3-р-П-глюканаз всех четырех видов двустворчатых моллюсков. Вероятно, два других остатка цистеина, СувШ и СузЗ 18, также образуют дисульфидную связь. Как было показано, фермент из sachalinensis
5. sioyaensis 0. xanthineol Р.furiosus T.neapolitan R.marinus B. xylophilus
B. circulans
C.rosealbus C.albidus M.yessoensis S.sachakin S.purpuratus
S. sioyaensis O. xanthineol P. furiosus T.neapolitan R.marinus B.xylophilus
B. circulans
C.rosealbus C.albidus
M. yessoensis S.Sachalin S.purpuratus
S.sioyaensis O. xanthineol P. furiosus T.neapolitan R.marinus B.xyiophilus
B.circulans
C.rosealbus C.albidus
M.yessoensis S.Sachalin S.purpuratus
--------------------PAPPSGWSQVFLDr
--------------------AAAPG—DLLSffSDE
CIHHSTNQQLSSKQQVPEVIEIDGKQWKLIJfHDE
-------------DKV--------EDWQLVWSQR
------------------DQPIRLPHWELVtfSlffi
---------------------------GVISfQED
-DAPRPDVNDQEDIPIGTPNDSAIEGMNLIWQfcE
----------------------------AGfRDD
----------------------------AGFRDr
--------------------------GTWrRDt
-SSGGGTSQCSMYPCDAACDMSTPPCNGLIFQEE
DGAAGS SVNTANWQ FDT GTSY PG—GAG1
DGAAGSAPNPAVWNHET--------GAH]
—GSEVNKEYWTFEKGNGIAY —DGVID PNVWNFE1GNGHAK—GI
•YNGLPEPAKWDYDVG--------Ghr!
Я-----SLDTSKVNFETG-------NNNj
M---GTALDQSKKNYETGYYLNDDPNTW
----QWNPNDYQVDVT--------AK]
----TKSPNNYQIGVS-
----TWEPSDiQIEVS
----AFDPAGWNYEVS
----SFNLDIWEKEMT
¡3RIE3TRTDFQ PPAgGKLRVEARbO^
JRMTTQG-KY QPQYg---RI EARI£> I
|SR1KTEG-KVEFSPPV—WEARIKL
M2KHSYGGMSE: »QKKSYGGNSElj SHKQSYGGDSE]
HIRE---GRNGZj
S^RT—GSND1
PCNETSGIGNLTAC PN - -TTC HSGL^T YTMF. -YSGSSGITGMYQHPQG-WSFADTF TFAVD -YSGSKGITRAYTLPEGVPDFTSDF VFGIV -YSGGAS1GVAYHLPEEVPDFSEDI VFSIE -YNHL—LGTQRGGSIRVPTARTDF VYAIE
-NGQHAQYGTNYVAPN---DLTTDF VYKLT
QWPTNRYLSGEYHFPEG-QTFAfJDY VYSVV DSNHNKFQKTHGSKRKSGGDDWHGV,' TYSLD DFNNNRFQKTHGSKRKSGGADWHGW TYSLE AYNHNAFAKTHASKRKYGGDDWHGK TYSLD —QMPVIlDSHRRTGDLDGDWSHAMgriRLr FWPLNGYPKTHATK------------
.tTTEG-KFEIKY .RLVTRG-KASWTY RIH!TRG-KFDFKY GKINTKD-HFSLKY
3KITT---NLAMTY
GKXTT---NFAMTY
GKITt---NFAMTY
GKIKS---KKTIRf
[ARLRTVE-SFSFKY
---KIEIRAKI
---RFE tRARL
---TJEARIKI.
—RVDFRAKL —RVMVRAKI
---RVNVRAKI
---RWVRAK2
---KVEARCRI
—PXEVEAKL
,SSTSNVSI DGNfiD .SRANSAI DGQ
[ENNTYIVN---
¡DKNAFVEN---
Irarienarvgg |tssnnvrve-n
IDRAQNVFVQ-E , ¡PGPSNLFVR-C S0 IPEPSNLFVR-Г iFQVlflPEPSNLFVR-N VQABvPDARNI FTR-N
¡feyEnnrsnsyvr-г
rPRRD-------------ASGNWT------
TARRE--------------GDGSYT------
EARKEI------ITDPNEGTFLYT------
EÄRKEQ-------VSDEYGTYDYT------
EARRE-----------SYEGREYT------
EftRRE-----------NVDGCS FT------
KALNEPK----SFPQDPSRYAQYS------
KPTFTRDSRHFTDGNLY YGTMDLY—QLWH 76 KPTFTRDSRHFTDGNLYYGTMDLY—HLWN 76 KPTETRDSAHFNDG SLYYGTMDVN— SLWH 76 KPTLTTDHPNYNDGNLNSATHDLT —ALYG 79 KPTLTTD—KLGEGSLSSGTLDLWGSSPAN
-GSFPG—TEffiPScj ¡SN IRE—VGaPNcj jlGNNIGE—Vi ~PDRQTYGSAY
;aesn—•
PQDNVY—GT jlPRDWSY— '.5RDRSY—CG PRDWSY—GG ¡PRDSVY—GG PKHNGY—GE
LNK----
FEPHR-HEPRT-riDTRT-FNPDV-
-TWATK -VHGTV -IHGTV -VLRTA -VHGTV
VADAIAAGNVNKE---ILGTi
RLPGS-----------TSGAV
STKAVLW—QNSGVNYVASTL OTKAVLW-GQNSGVNYVASTt >JT KAI LG-GQNS GVNY VASTI. MTVARDGSGHNHGVNEVG-HI ¡NADIKDADGLSAGVDQMG STK
IGTSPGG iPGYSGG PGYSGS
3PG----
ГКА----
WSN----
FGG----
WGP----182
WGP----182
'WGP----182
-----181
ЛСР----
3VTYQTVTANHMD----
3QQFHRVTRASVG----
3TFYHEVTKEQVE----
3QLY HVXiSKDELA----
¡DSLYYRFPNERLTNPE-
IdrsvspeairfsvJ
К----PGEITWfVg
---PDKIKVm
D----ENEVEWYVC
T----PEEIRWFvf
----qseikmfiSdiqymvfditplp—
■----ECWIKWY'.WGKFFFKVTRDQWYSAAA—
1----AGHIOTYVHttVEIMGlNTPSQSF WGWGAFSG-
1----AGHIVTY^'gNVEIMRITTPSQSF WGWGAFSG-
T----ADHIITVV«NVEMMRJNTPSQSF WGWGGFDG-
Г----IDHIQVFVKNRHIMNIPCSRKVF GSLEDLVD-
--------AVTWTNATKKG
----------ANAWVFDQF
--------AMGY EWV FD KP
--------elglewvfphf
--------ADWRHWPFDQP
--------------VFQKK
--------PNNPNAPFDQp
-NNIWASGG-KNAPFpKr -NNIWASGG-KNAPFDKP -NNIWASGG-KNAPFDKF -PIFGAVEP-KAAProKQ gtiELLLNVD-PATGF WDLGEFENDAPGIDNPWAYNPNKLTPFDQE
---GFPGAFGGGPTGATEP
---QSJP----GYPDGTTQL
---YWP----GNPDATTPF
g---YWP----GYPDETTQF
g---TWGG---QQGVD PEA F
---NFPN-1HDAGAVTAPL
—1Г DG---GRTPDPSDI
g—DYjFAD---GDYDVPKPW 287
—DFFAD---GDYDVPKPW 287
-DYFGN——GEYDVPKPW 287 jTNGErPDN—WTYDQQKPW 287 Й-VNYF.GDG—LTYTPAKPW
S.sioyaensis O. xanthineol P. furiosus T. neapolitan R.marinus B.xylophilus
B.circulans
C.rosealbus C. albidus M.yessoensis S.Sachalin S.purpuratus
Рис. 1. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей эадо-1,3-р-Б-глюканаз 16 семейства гликозилгидролаз.
GKP-PQQ-РАК-PCR-PAQ-PGQ-РАТ GGHi>ß—MRS GGHMj—MRS GNHNra—MRS FSNSSTELQ! SNDSHTASKE
70VLQS 7RVYDN VRVYSF 1RVYKD VR.VYRW IKVTQ-VR.VYKE IEMIPH 324 IEMIPH 324 XEHIPH 324 VEMTQY 326 7RVYXE
является более термостабильным, чем эндо-1,3-р-0-глюканаза из С. albidus (Сова и др., 1987). Возможно, одной из причин различий в термостабильности этих ферментов является различие в содержании дисульфидных связей.
Сравнение каталитических доменов эндо-1,3-р-0-глюканаз с установленной первичной структурой выявило их большое структурное разнообразие (рис.1). Аминокислотные последовательности эндо-1,3-р-0-глюканаз прокариот и эукариот идентичны всего лишь на 15-27%. Степень структурной идентичности эндо-1,3-Р-0-глюканаз прокариот составляет 43-63%, беспозвоночных животных - 25-45%. Наиболее консервативным является фрагмент с 149 по 155 а.о.: Gly-Glu-Xxx-Asp-Xxx-Met/Val-Glu, (Ххх- гидрофобный а.о.), являющийся активным центром гликозилгидролаз 16 семейства. Особенностью структуры активного центра эндо-1,3-р-0-глюканаз двустворчатых моллюсков, как и других известных на сегодняшний день ламинариназ, является наличие остатка метионина Met 154 (валин у фермента из S. purpuratus) и дополнительных трех аминокислотных остатков перед каталитическим остатком Glul50 (остатков аргинина, серина и глицина), что отличает их от 1,3;1,4-Р-0-глюканаз 16-го семейства гликозилгидролаз. При этом консервативным из этих трех аминокислотных остатков является остаток глицина Glyl49. Консервативными для эндо-1,3-р-0-глюканаз являются также остатки глицина Gly23, Gly25, Gly44, Glyll5, GIyl58, Gly272 и Gly273, и остатки пролина PI24 и P131. Благодаря своей структуре остатки глицина играют важную роль в пространственной укладке молекул белка и конформационной подвижности активных центров ферментов. Остатки пролина также играют важную роль в характере укладки полипептидной цепи, стабилизируя полипептидную цепь благодаря особенностям своей структуры.
Помимо аминокислотных остатков активного центра консервативным является фрагмент с 130 по 136 а.о., Trp-Pro-Ala-Xxx-Trp-Met-Leu (Ххх - гидрофобный аминокислотный остаток), являющийся предположительно сайтом связывания субстрата (Ferrer et al., 1996). Инвариантными для эндо-1,3-р-0-глюканаз являются остатки триптофана Тгр130, Тгр134 и Тгр145. Ранее методами химической модификации было показано участие остатков триптофана в фермент-субстратном взаимодействии (Лакизова и Елякова, 1983).
Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей эндо-1,3-[1-0-глюканаз (рис.1) выявило наличие двух консервативных остатков гистидина - His 179 и His208 у эндо-1,3-Р-0-глюканаз морских гребешков, Hisl79 и His205 у фермента из S sachalinensis. Для к-каррагеназы из P. carrageenovora, также относящейся к 16 семейству гликозилгидролаз, было показано, что Hisl83 образует водородную связь с Aspl65, локализованным в области активного центра, и авторами было выдвинуто предположение,
что Aspl65 и Hisl83 вовлечены в перемещение протона во время катализа (Michelet а!., 2001). Возможно, один из консервативных остатков гистидина эндо-1,3-р-0-глюканаз является функциональным гомологом остатка Hisl83 к-каррагеназы из P. carrageenovora. Результаты химической модификации остатков гистидина эндо-1,3-р-0-глюканаз двустворчатых моллюсков, приводящей к существенному, падению активности этих ферментов, также свидетельствуют о важной роли остатков гистидина в функционировании этих ферментов (Елякова и др., 1984). На сегодняшний день нет рентгеноструктурных данных ни для одной из эндо-1,3-Р-В-глюканаз 16 семейства гликозилгидролаз, поэтому пространственная локализация консервативных остатков гистидина в молекулах эндо-1,3-р-D-глюканаз и их функциональная роль остаются невыясненными. Вместе с тем были получены экспериментальные данные, показывающие, что в присутствии ламинарана происходит защита эндо-1,3-р-0-глюканазы из S. sachalinensis от фотоинактивации, вызывающей модификацию остатков гистидина. Это дает основание предполагать локализацию функционально значимых остатков/остатка гистидина в районе активного центра эндо-1,3-р-0-глюканазы из S. sachalinensis.
Сравнительный анализ аминокислотных остатков, расположенных в непосредственной близости к активному центру эндо-1,3-Р-0-глюканаз двустворчатых моллюсков, показал, что для этих ферментов характерно наличие консервативного глицинового кластера Glyl43-Glyl44, отсутствующего у остальных известных эндо-1,3-р-0-глюканаз. Экдо-1,3-р-0-глюкашпы из гребешков М. yessoensis, С. rosealbus и С. albidus, в отличие от фермента из S. sachalinensis и остальных эцдо-1,3-р-П-глюканаз, содержат еще три глициновых кластера - Gly92-Gly93, Gly23-Gly24-Gly25, Glyl97-Glyl98, а в ферментах из С. rosealbus и С. albidus присутствует еще один дополнитеотный кластер - Gly288-Gly289 (рис.1). Исследования аминокислотных последовательностей ферментов психрофильных и мезофильных организмов показали, что большее количество остатков глицина и наличие глициновых кластеров в молекулах ферментов психрофильных организмов связано с их адаптацией к низким температурам окружающей среды (Feller & Gerday, 1997). Высокое содержание остатков глицина приводит к большей конформационной подвижности либо всего фермента, либо определенного домена мультидоменных белков, уменьшению энергии активации фермента и, как следствие, - к увеличению ферментативной активности фермента (Fields & Somero, 1998). При этом результатом увеличения конформационной подвижности белков психрофильных организмов является уменьшение их термостабилыюсти (Georlette et al., 2003). Эндо-1,3-р-1)-глюканазы двустворчатых моллюсков являются на сегодняшний день наименее термостабильными из известных эндо-1,3-р-0-глюканаз и характеризуются невысоким температурным оптимумом (45 °С для эндо-1,3-р-0-глюканаз из S. sachalinensis и
M. yessoensis, 25°C для фермента из C.albidus), в то время как для бактериальных эндо-1,3-Р-D-глюканаз этот показатель находится в пределах 65-100°С. Вероятно, наличие глициновых кластеров является одним из молекулярных механизмов адаптации эндо-1,3-р-0-глюканаз двустворчатых моллюсков к низким температурам обитания этих видов беспозвоночных. Другими факторами, обуславливающими возможность эффективного функционирования ферментов в условиях низких температур, могут быть уменьшение остатков пролина и увеличение количества остатков глицина и/или метионина (Gerday et al., 2000), уменьшение остатков аргининов (Arg/(Arg+Lys)) (Smalas et al., 2000), увеличение соотношения заряженных и полярных а.о. и уменьшение количеством гидрофобных а.о. (Leiros et al., 2000), уменьшение внутримолекулярных взаимодействий, таких как водородные связи (Tanner et al., 1996), ионные (Perl et al., 2000) и гидрофобные взаимодействия (Criswell et al., 2003). При этом не обнаружено общей закономерности, характерной для всех психрофильных ферментов. Каждый фермент «выбирает» свою стратегию холодовой адаптации. Сравнение аминокислотного состава эпдо-1,3-(№-глюканаз двустворчатых моллюсков S. sachalinensis, M. yessoensis и С. albidus, морского ежа S. purpuratus, нематоды В. xylophilus и бактерий О. Xantoneolitica, P.furiosus и R. marinus выявило корреляцию между процентным содержанием остатков пролина, метионина, полярных и неполярных аминокислотных остатков и термостабилыюстью эндо-1,3-Р-0-глюканаз. Большее по сравнению с другими эндо-1,3-р-0-глюканазами относительное количество остатков метионина и полярных аминокислотных остатков, меньшее содержание неполярных аминокислотных остатков и пролина, а также наличие глициновых кластеров в молекулах эндо-1,3-Р-0-глюканаз двустворчатых моллюсков являются, вероятно, молекулярными механизмами адаптации этих ферментов к низким температурам окружающей среды.
Филогенетический анализ эндо-13-Р-П-глюканаз 16 семейства гликозилгидролаз
Результаты проведенного нами поиска гомологов эндо-1,3-р-0-глюканаз двустворчатых моллюсков в базах данных с помощью программы BLAST2 показали, что их аминокислотные последовательности имеют наибольшее сходство с первичными структурами белков иммунной системы беспозвоночных животных (около 40% идентичности и 55% гомологии), а именно: липополисахарид- и 1,3-р-0-глюкан-связывающих белков из ракообразных Pacifastacus leniusculus (GenBank код JC6141), Penaeus monodon (GenBank код AF368168), Fenneropenaeus chinensis (GenBank код DQ091256), Litopenaeus stylirostris (GenBank код AF473579), Homarus gammarus (GenBank код AJ583519) и морского гребешка Chlamys farreri (GenBank код AY259542); целомических цитолитических факторов кольчатых червей Aporrectodea rosea (DQO18723), Eisenia fétida
(GenBank код AAC35887), Lumbricus terrestñs (GenBank код AAL09587) и белков иммунной системы насекомых Bombyx morí (GenBank код АВ026441), Anopheles gambiae (GenBank код CAA04496), Drosophila melanogaster (GenBank код AAF338S1) и Manduca sexta (GenBank код AF177982), И лишь 15-27% идентичности и 40% гомологии проявляют аминокислотные последовательности эндо-1,3-р-0-глюканаз двустворчатых моллюсков с бактериальными эндо-1,3-р-1>глюканазами.
Домены 16 семейства эндо-1,3-Р-0-глюканаз бактерий и беспозвоночных, а также гомологичных им липополисахарид- и 1,3-Р-0-глюкан-связывающих белков беспозвоночных были выявлены с помощью сервера SMART. Множественное выравнивание этих последовательностей было использовано нами для филогенетического анализа эндо-1,3-рЛЭ-глюканаз 16 семейства гликозилгидролаз и гомологичных им белков с помощью пакета программ PHYLIP 3.6.
Эндо-1,3-Р-0-глюканазы 16 семейства гликозилгидролаз являются древним семейством гликозилгидролаз, возникшем на заре эволюции органического мира. Об этом свидетельствует тот факт, что они были обнаружены у таких эволюционно древних форм жизни, как морские архебакгерии P. furiosus и эубактерии рода Thermologa. Анализ полученного нами филогенетического дерева (рис.2) показал, что эндо-1,3-р-Б-глюканазы 16 семейства и гомологичные им белки по степени гомологии первичных структур формируют две ветви. Одна их них образована преимущественно бактериальными 3mo-l,3-ß-D-глюканазами, вторая объединила эндо-1,3-Р-0-глюканазы и гомологичные им белки иммунной системы беспозвоночных животных. При этом эндо-1,3-р-0-глюканазы двустворчатых моллюсков формируют отдельную группу со значимым бутстреп индексом (99%). Интересен тот факт, что геномы грибов Neurospora crassa и Magnaporthe grísea содержат гены, кодирующие два белка, относящихся к 16 семейству гликозилгидролаз. К сожалению, эти белки пока не охарактеризованы. Один из этих белков имеет большую гомологию с эндо-1,3-р-П-глюканаза.ми бактерий, другой - с липополисахарид- и 1,3-p-D-глюкан-связывающими белками беспозвоночных. Эти белки имеют невысокую степень гомологии друг с другом (42% идентичности и 56% гомологии), что указывает на древнюю дивергенцию соответствующих генов, возникших, вероятно, в результате дупликации гена эндо-1,3 -p-D-глюканазы.
Помимо установленных нами аминокислотных последовательностей эндо-1,3-p-D-глюканаз из морских гребешков рода Chlamys - С. albidus и С. rosealbus, была определена первичная структура липополисахарид- и 1,3-р-0-глюкан-связывающего белка из другого вида гребешка, относящегося в этому же роду - Chlamys farreri.
АЛ С2 5554 Pyrococras furjosus J Архебактсрии
СЛЛ88008 Theiniotoga neapoiitana —• AAC38290 Oevukovia »unthincolytica
\A.N77S03 I vsobactcr «nzjuiogenes ЛЛ04044 Tachypleus tridentatus
EAA28272 N eu ros pora crass«
......- КЛАДЯ 149 Aspergillus nid ui ans
—-AAF3I438 Strcptomyce« sloyaensis »АВ194803 Bursrtphelcnchus xylophilua I ЛВ194804 Purs»phcleMchus mucrnnatris ¡ АЛМ36156 Xanthonionas axonopodls ВЛCI 6331 Pscudoinonas sp.
AAC69707 Hhodoîherniu.s marin и*
K*cnotaoHB4H;
-AAC60453 Bacillus circulars
Виктсрии Беспо ¡ноночные Грибы
Бактерии
' «
—АВС25063 Glossin» morsltans
-ЛАМ 0131 Manduca sexta
•AAB40946 Bombyx morí
■»UAC99308 Tencbrio molitor ■AAF33851 Drosophila nielunogaster
esr-AA>
''iJ-AA/
rid 1-ЛАР
^J I-САК
I-CAB653
s.
" АЛ1.-76017 Aedex aegypril>eta » CAA04496 Anophvlc» g-.imbiae АЛМ21213 Ftnitu» munixlon AAZ41363 Fenneropenneus citinensis AAM73871 Mtopcnaeus stylirostiis ■САК474Я5 Ilou» a rue gamma rus "AB65353 Pa ci fas ta eus Icniusculus —AAC47235 Stronplocentrotua purpura fus
AJ606470 Suberites domuncula -AA1>82240 Chlaniys farreri
■ СЛВ70460 Eiscnia fetida 1AAC35887 Eiscnia fetidu ^AAY85745 Dendrobaena ve ne ta "AAV85744 Aporrectodca rosea ' AAY85746 Luntbricus rubcDus 'АЛLO9587 Lunibricus terrestm
-EAQ70879 Magnapoithc grisea
€
- KAA7J7-I9 Cibbervlta «e»e
— CAC28724 JVrui ospora craSM
Грииы I
■I>Q093348 Chhmiys гозс»|Ьи» DQ093347 OJamy« aUiidm AAW34372 Mb.uhnpecten msntmU
AAP74223 Spisula sachalincnsis
"■АЛС96462 i'.irunit'CÍnm burearla Clüorclla vlrusj Вирус
Рис. 2. Филогенетическое дерево, построенное на основе аминокислотных последовательностей доменов 16 семейства гликозилгидролаз - эндо-1,3-р-0-глюканаз и гомологичных им белков. Подчеркнуты виды беспозвоночных животных, из которых были выделены и охарактеризованы эндо-1,3-р-Б глюканазы. Филогенетическое древо построено с помощью neighbor-joining алгоритма пакета программ PHYLIP 3.6. Перед видовыми названиями указаны коды соответствующих белков в базе GeneBank.
Было показано, что этот белок играет важную роль в иммунном ответе гребешка С. farreri при внедрении патогенов (Su et al., 2004), Эндо-1,3-р-0-глюканазы из С. albidus и С. rosealbus и липополисахарид- и 1,3-Р-0-глюкан-евязываюший белок из С. farreri имеют невысокий уровень структурной гомологии между собой - 38% идентичности и 54% гомологии. При этом было показано, что липополисахарид- и 1,3-р-0-глюкан-связывающие белки иммунной системы беспозвоночных животных не проявляют эндо-1,3-Р-П-глюканазной активности (Sritunyalucksana and Soderhall, 2000). Эти факты также свидетельствует в пользу идеи дупликации гена эндо-1,3-р-0-глюканазы у эукариот. Вероятно, в ходе эволюции одна из копий гена эндо-1,3-р-0-глюкалазы эволюционировала в направлении специализации кодируемого белка исключительно на связывании с липополисахаридами и 1,3-р-0-глгоканами как пускового механизма защитной реакции организма на внедрение патогенных микроорганизмов. При этом белок утратил эндо-1,3-Р-D-глюканазную активность. Белок, специфично связывающий 1,3-р-0-глюканы был обнаружен также и у губок (GenBank код AJ606470). Таким образом, 1,3-Р-0-глюкан-связывающие белки являются древним эволюционным «приобретением» иммунной системы животных. Дупликация гена эндо-1,3-р-В-глгоканазьг у беспозвоночных животных с последующей дивергенцией кодируемых копиями глюканазного гена белков в направлении выполнения различных функций - пищеварительной в случае эндо-1,3-р-0-глюканаз и защитной в случае липополисахарид- и 1,3-Р-0-глюкан-связывающих белков - произошла уже на этапе возникновения многоклеточных животных.
Анализ полученного филогенетического дерева показал, что эндо-1,3-Р-В-глюканазы из двух видов нематод, В. jylophilus и В. mucronatus, попали в одну кладу с бактериальными эндо-1,3-Р-0-глюканазами. Кикучи с соавторами, на основе проведенного ими филогенетического анализа, выдвинул предположение, что в данном случае произошел горизонтальный перенос бактериального гена, кодирующего эндо-1,3-Р-0-глюканазу. Это позволило данным видам круглых червей освоить новый пищевой ресурс - грибы, паразитирующие на соснах (Kikuchi et al., 2005). На сегодняшний день это единственный факт наличия эндо-1,3-Р-0-глюканаз 16 семейства гликозилгидролаз у наземных животных.
Таким образом, результаты проведенного нами филогенетического анализа эндо-1,3-P-D-глюканаз 16 семейства гликозилгидролаз и гомологичных им белков свидетельствуют о древней дупликации гена эндо-1,3-р-Г} глюканаз у беспозвоночных животных и дивергенции копий гена в направлении специализации кодируемых ими белков на выполнение разных функций - пищеварительной и защитной. При этом вероятна элиминация эндо-1,3-Р-П-глюканазного гена у наземных животных и его повторное появление у некоторых видов наземных беспозвоночных путем горизонтального переноса от бактерий.
2.2. Компьютерное моделирование пространственной структуры >ндо-1,3-р-1) глюки nai двустворчатых моллюсков.
Аминокислотные последовательности зрелых белков эндо-1 Д-р-О-глюканаз двустворчатых моллюсков С. albidus. М yessoensls и S. sachalinensis были проанализированы с помощью серверов 3D-PSSM, FUGUE, СР11 то deis, PHYRE с Целью поиска гомологов с установленной трехмерной структурой. По данным серверов FUGUE, CPHmodels и Pl! YRE лучшим на сегодняшний день прототипом для эндо-^З^р-О-глюканаз этих видов двустворчатых моллюсков является к-каррагеназа из Pseudoalleromonas cafrageettovora (код PDB 1DYP).
Рис. 3. Теоретическая модель пространственной структуры ЭНДО-1,3 -p-D-глю каназ ы из С. albidus. Отмечены аминокислотные остатки активного центра п остатки цистеина, образующие дисульфидцуЮ связь.
Модели пространственных структур эндо-1,3-p-D-глюканаз из S sachalinensis, С, albidus и M .yessoensis были получены с помощью программы МОЕ методом сравнительного моделирования с учетом наличия дисульфидной связи между Cys78 и Çys86 у эшю-1,3-|!-0-глюканаз из С. albidus и Ы. yessoensis, и между CysSl и Cys89 у эндо-î -р-D-гяюканазы из 5. sachalinensis (рис.3), В качестве прототипа была использована пространственная структура к-каррагеназы из P. carrageenovçra, установленная ¡¡а основании данных рентгенострукгурного анализа с разрешением 1.54 Â (Michel et al., 2001). Идентичность аминокислотных последовательностей ЭндО-1.3-р-ЗЭ-глюканаз из гребешков с к-каррагеназой составила 22% (36% гомологии). Степень идентичности эндо-1,3-р-0-глюканазы из S .sachalinensis и к-каррагеназы составила 23% (37% гомологии). 1[осле минимизации энергии с помощью программы программ МОЕ значения энергии молекул эпдо-1,3-р-П-глюкапаз из
M. yessoensis, С. albidus и S. sachalinensis составили -16045 кДж/моль, -12593 кДж/моль и -14699 кДж/моль, соответственно.
С помощью программы МОЕ была проведена суперпозиции Са атомов полученных моделей эндо-1,3-Р-0-глюканаз и к-каррагеназы. С помощью сервера DALI были установлены величины среднеквадратичного отклонения (RSMD) для Са атомов теоретических моделей и прототипа. Величины RSMD для всех Са-атомов к-каррагеназы и эндо-1,3-р-0-глюканаз из M. yessoensis, С. albidus и S. sachalinensis равны 1.4 Â, 1.9 Â и 1.6 Â, соответственно. Наиболее консервативной является структура активного центра молекул этих ферментов, о чем свидетельствуют низкие значения RMSD положения атомов углерода Са. Для шести Са атомов активного центра величины RSMD для к-каррагеназы и эндо-1,3-Р-D-глюканаз из С. albidus, M. yessoensis и S. sachalinensis составили 0,29 Â, 0.48 Â и 0.61 Â, соответственно.
Пространственная структура эндо-1,3-р-0-глюканаз двустворчатых моллюсков имеет характерную для семейства 16 гликозилгидролаз упаковку в виде Р-сэндвича. Консервативным элементом структур глюканаз является кор, состоящий из двух Р-слоев, образованных 6 и 7 антипараллельными р-тяжами, которые формируют полость активного центра, р-слои являются наиболее консервативными элементами вторичной структуры гликозилгидролаз 16-го семейства.
С помощью программы МОЕ была установлена локализация консервативных аминокислотных остатков триптофана и гистидина в полученных нами моделях пространственных структур эндо-1,3-Р-0-глюканаз двустворчатых моллюсков (рис.4). Показано, что Тгр134, инвариантный для всех эндо-1,3-р-0-глюканаз, и Тгр128, консервативный для эндо-1,3-р-0-глюканаз морских беспозвоночных, ориентированы боковыми цепями в полость активного центра эндо-1,3-р-0-глюканаз двустворчатых моллюсков. Как известно, основными сайтами связывания моносахаридных звеньев в активном центре гликозилгидролаз являются остатки триптофана, фенилаланина и тирозина (Рабинович и др., 2002). Вероятно, в случае эндо-1,3-Р-П-глюканаз двустворчатых моллюсков остатки триптофана Тгр134 и Тгр128 принимают непосредственное участие в связывании моносахаридных звеньев субстрата во время катализа в полости активного центра. Локализация остатка гистидина Hisl93 на расстоянии до 5 Л от Aspl52 позволяет предположить, что именно он вовлечен в перемещение протона во время катализа.
albidus. Обозначены аминокислотные остатки активного центра и консервативные остатки триптофана (А) и гнети дина (Б).
С помощью программы МОЕ был изучен характер распределения поверхностного электростатического потенциала для эндо-1,3 -p-D-глнмеаназ двустворчатых моллюсков и к-кар р a ret ¡азы из P. carrageenovora. Область поверхности молекулы к-каррагеназы, Примыкающая к активному центру, заряжена преимущественно положительно. Это обуславливает образование фермент-субстратного комплекса к-каррагеиззы и квррагенанов за счет электростатического взаимодействия положительно заряженной полости активного Центра белка и отрицательно заряженного каррагенана. Для эндо-1,3-[!-Г>-глюкнназ двустворчатых моллюсков характерна локализация в районе их активного центра гидрофобных аминокислотных остатков. Вероятно,* связываний субстрата происходит преимущественно за счет гидрофобный взаимодействий между алифатическими атомами водорода в молекуле субстрата и гидрофобными аминокислотными остатками полости активного центра этих ферментов. Это согласуется с механизмом действия эндо-] ,3-p-D-гяюканаз по типу множественной атаки субстрата, согласно которой субстрат сдвигается в активном центре фермента, вследствие чего возникает возможность для расщепления еще одной связи. Подобное перемещение представляется возможным в случае образования фермент-субстратного комплекса за счет гидрофобных взаимодействий, поскольку они малочувствительны к изменению положения отдельных мономернух звеньев субстрата,
С помощью программы МОЕ был проведен анализ вероятных внутримолекулярных контактов эндо- 1,3-р-0-глюканаз двустворчатых моллюсков (табл.2). Существенные различия обнаружены в количестве внутримолекулярных ионных связей: наибольшее их количество содержится н молекуле эидо-1,3-|i-D-глю кап азы из S. sachatinensis, наименьшее -в молекуле фермента из C.alhidus. Это коррелирует с данными о различии в
термостабильности эндо-1,3-Р-0-глюканаз из С. а!Ыс1из, М. уе!5оет15 и 5". яасйа/ше/ш'х. Наименьшую термостабилыюсть проявляет фермент из морского гребешка С. а1Ы(1из, обитающего при более низких температурах, чем М. уеззоетгз и Б. яасйа/ше/им.
Таблица 2. Внутримолекулярные контакты эндо-1,3-р-0-пиоканаз двустворчатых моллюсков
Фермент Водородные Гидрофобные Ионные Дисульфидные
связи контакты связи связи
Ло 80 38 6 1
{С. albidus)
ЛУ 65 45 11 1
(М. yessoensis)
mv 85 41 15 2
(' S.sachalinensis)
Как показало сравнение количества и типов внутримолекулярных связей у а-амилаз из психрофильных и термофильных организмов, уменьшение их количества и силы, и как следствие, увеличение конформационной подвижности белковых молекул, является одним из механизмов адаптации ферментов к функционированию в условиях низких температур (Feller et al., 1994; Aghajari et al., 1998; Fields & Somero, 1998). В связи с этим представлялось интересным сравнить степень конформационной подвижности полученных нами пространственных моделей эидо-1,3-р-0-глюканаз го С. albidus, М. yessoensis и S. sachalinensis с помощью сервера elNEMO. Результаты показали, что кор молекул, образованный Р-слоями, обладает наименьшей конформационной подвижностью. Наибольшей конформационной подвижностью характеризуются петли, расположенные у входа в полость активного центра, при этом амплитуда колебаний этих петель для эндо-1,3-p-D-глюканаз из S. sachalinensis, М. yessoensis и С. albidus различаются. Наибольшая конформационная подвижность обнаружена у эндо-1,3-р-0-глюканазы из С. albidus, наименьшая - у фермента из S. sachalinensis. При этом наблюдается корреляция между амплитудой колебаний петель и различиями в их первичной структуре, а именно делеция трех аминокислотных остатков (Ser90, Туг91 и Gly92) у фермента из S. sachalinensis, в результате которой у этого фермента отсутствует один из глициновых кластеров, характерных для эндо-1,3-р-0-глюканаз гребешков (рис.1).
Точность полученных моделей эндо-1,3-р-0-глюканаз двустворчатых моллюсков позволяет использовать их для изучения комплексов этих ферментов с субстратами и ингибиторами. Моделирование структур комплексов эндо-1,3-р-0-глюканаз из М. yessoensis и С. albidus с ламинаригексаозой и ингибитором халистанолсульфатом проводили с помощью программы GRAMM с параметрами докинга низкого разрешения
(рис.5, 6). 3D-Структура ламинаригекоаозы была взята из базы данных I'DIB (код LWGW), структура xi'i и ста! юл сульфата была смоделирован!} на основе структуры холестеролсульфага, взятой из Кембриджский базы рентгеноструктурньк данньи низко молекулярных соединений (hup://ww w.ccdc.cam.ac.uk/),
э г
Рнс. 5. Пространственная структура комплекса эвдо-^З-р-Р-глюканазы ич Ы, yessoensis с л ам и нариге ксаозой (А, Б) и хал и erat юл сульфатом (В, Г). Указаны аминокислотные остатки их активных центров.
Согласно полученным результатам ламинаригскеаоза образует комплекс с эндо-1,3-|)-D-глюканазоЙ из М. yessoensis и полости активной* центра фермента и взаимодействует с каталитическим остатком глут ямина Glul 50 в области »ос стапавл и чающего конца (рнс, 5 А, Б), Хали ста пол сульфат образует комплекс с эпдо-],3-|И>гд(оканаздп ю М. yessoensis также н полости активного центра (рис, 5 13, Г). Эндо-1,3-ß-D-ni¡оканаза из С. blbidus имеет два сай га связывания с халистанолсульфйГом, также расположенные в полости активного центра фермента (рнс.6). Полученные результаты согласуются с экспериментально установленными данными (Звягинцева и др., I9K6; Бакунина и др., 1991).
!'ис. 6. Пространственная структура комплекса опдо-1 ,3 -ß -D-глюканаз ы нч С. albidtis с ингибитором хали от анол сульфатом. Отмечены аминокислотные остатки активного центра.
2.4. Г*теропогическйя экспрессия эндо-14-|!-0-глшкаи« лвуствйрчаты* моллюсков Иа основе плазмид pQR80 и pQlI30 были сконструированы экспрессируюпще векторы Ly-pQESO и Liv- pQE30, содержащие кодирующие последовательности кДНК эндо-1,3-р-В-ГЛЮканаз из M, yessoensis и S. sachalinensis длиной около 1000 и.н. Полученными плаамидами трансформировали компетентные клетки Ex'ofi XLI HI не.
Рис. 7. ДСН-ПААГ электрофореграмма клеточных лиэатов культур E.coli XLlBlue, содержащих плазмиды Lv-pQE80 и Ltv-pQE^Q. К - контроль. М15, MI6, М18 - лизаты с экспрессированной рекомбинантной in до-1.З-Р-й-г.поканазой из M.yessoensis. 1 - лнзат с экспрессировашгои рекомбинантной эпдо-1.3-(1-и-глюканазой из S.sachalinensis. 2 - эндо-1,3-(i-lî-i люканаза, вы деленная из S. sachalinensis. 3 - белковый маркер молекулярного веса.
Язя оценки уровня экспрессии генов э и до-1,3-ß- D-глюканаз из M. yessoensis и S. sachalinensis клеточные лизахы анализировали методом Электрофореза в ДСН-ПААГ (рис.7). Анализ полученных электрофореграмм показал, что клетки E.coli XLIBluè, содержащие плазмиды Lu- p(Jü30 п Lv-pQK80. синтезируют дополнительные белки, подвижность которых близка к ожидаемой - 38 кДа и 39 кДа Для рекомбинантных эндо-1,3-р-и-г;ноканаз из M. yessoensis и S. Sachalinensis. соответственно.
В качестве контроля использовали штамм E.coli XL 1 Blue без вставки. Анализ растворимой и нерастворимой фракций бактериальных лизатов показал, что рекомбинантный белок находится в составе зелен включения » нерастворимой форме.
1 JO
1 J<J
1 по
ТтсГ Рис.8. А- электрофореграмма очищенной рекомбинантной эндо-1,3-jí-D-i лкжапазы из S. sachaltttgnsis (1), 4Q 2 - белковый маркер
1 зо
I ОО ■71л
молекулярного веса.
Б - веспгерн-блоттинг рекомбинантной эцдо-1,3-р-D-глюканаЗЫ S.sachalineniis
I' В
Б
(I), 2 - белковый маркер
а молекулярного веса.
Рекомбинангная эндо-1,3-р-р-глюкаиаза из S. sachalinertíli был» выделена методом аффинной хроматографии с помощью метаялоафинной смолы TALON ("Clontech", CHIA) (рис.8, А). Для идентификации реком б и н антногй белка иммунизацией кроликов была получена анги сыворотка к нативной эндо-1,3-р-П-глкжаназе из S. sadhalinenitft.
Рис, 9. Двойная нмуннодиффузия 1 - эн до-1,3-р-D-rii юканаза из S. sachatínensis.
й, 2 - двукратные разведения лизата культуры E.cüli XL! Шие, Содержащей рекомбинаптный белок. 3, 4, 5 - двукратные разведения лизата культуры Е. со!i XL1 Blue, не содержащей рскимбининтнмй белок. 7 - антисыворотка к эндо-1,3-P-D-ппоканазе из .У, sachalinensis.
Методами весгерн-блоттинга (рис. 8, Б) и двойной иммунодиффузии (рис. 9) было показано, что йоноспецифические антитела, полученные к нативной эндо-1,глюка и азе из
взаимодействуют с рекомбннантиым белком, что свидетельствует об иммуннохимичеекой идентичности этих белков.
Таким образом, показана возможность гетерологической экспрессии эндо-1,З-р-Б-глюкаиаз М. уехюети и Л". хасИвНпепз/з в Е.соИ Х1.1 В1ие.
выводы
1. Впервые установлены нуклеотидные последовательности полноразмерных кДНК, кодирующих эндо-1,3-Р-0-глюканазы двустворчатых моллюсков S. sachalinensis, M. yessoensis, C.rosealbus и C.albidus, и на основании этих данных определены полные аминокислотные последовательности этих ферментов.
2. Установлено, что согласно современной классификации гликозилгидролаз, основанной на структурной гомологии, эндо-1,3-Р-0-глгаканазм двустворчатых моллюсков следует отнести к 16 семейству гликозилгидролаз.
3. Проведен филогенетический анализ эидо-1,3-р-0 глкжаназ 16 семейства гликозилгидролаз и гомологичных им белков. Показано, что вероятны дупликация гена эндо-1,3-Р-0-глюкапаз у беспозвоночных животных уже на этапе их возникновения, ранняя дивергенция копий этого гена в направлении специализации кодируемых ими белков на выполнение пищеварительной и защитной функций, элиминация эндо-1,3-р-0-глюканазного гена у наземных беспозвоночных животных и его повторное возникновение путем горизонтального переноса от бактерий.
4. Впервые построены теоретические модели пространственной структуры эндо-1,3-р-0-глюканаз из M. yessoensis, С. albidus и S. sachalinensis с использованием в качестве прототипа пространственной структуры к-каррагеназы из Pseudoalteromonas carrageenovora. Точность полученных теоретических моделей для всех Са-атомов М. yessoensis, С. albidus и S. sachalinensis составляет 1.4 А, 1.9 А и 1.6 А, для Са-атомов активного центра - 0.48 А, 0,29 А, 0.61 À, соответственно. Показано, что полость активного центра эндо-1,3-Р-П-глюканаз двустворчатых моллюсков в отличие от прототипа образована гидрофобными аминокислотными остатками, что согласуется с установленным механизмом действия эндо-1,3-р-0-глюканаз двустворчатых моллюсков по типу множественной атаки.
5. Впервые построены теоретические модели комплексов эндо-1,3-р-0-глюканаз из С. albidus и M, yessoensis с ламинаригексаозой и природным ингибитором халистанолсульфатом. Показано, что ламинаригексаоза образует комплекс с эндо-1,3-P-D-глюканазой из M. yessoensis в полости активного центра фермента и взаимодействует с каталитическим остатком глутамина Glul50 в области восстанавливающего конца. Эндо-1,3-р-0-глюканаза из M. yessoensis образует комплекс с одной молекулой халистанолсульфата в полости активного центра. Эндо-1,3-р-П-глюканаза из С. albidus имеет два сайта связывания с халистанолсульфатом в
полости активного центра фермента, что согласуется с экспериментальными данными.
6. Показана корреляция между термостабилыюстью и конформационной подвижностью эндо-1,3-Р-0-глюканаз двустворчатых моллюсков S. sachalinensis, М. yessoensis и С. albidus и содержанием в этих ферментах остатков метионина и пролина, глициновых кластеров, дисульфидных и ионных связей.
7. Показана возможность гетерологической экспрессии эндо-1,3-р-0-глюканаз двустворчатых моллюсков М. yessoensis и S. sachalinensis в E.coli.
Работа поддержана грантами РФФИ № 05-04-49981 и № 06-04-48540, ДВО РАН № 06-III- А-
05-123 и № 04-Ш-Г-05-026 и Программы фундаментальных исследований Президиума РАН
«Молекулярная и клеточная биология».
1. Ковальчук С.Н., Кожемяко В.Б., Бурцева Ю.В., Рассказов В.А. Клонирование и молекулярная характеристика эндо-1,3-р-В-глюканазы из моллюска Spisula sachalinensis// II Московский международный Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития»: материалы конгресса. - Москва. 2003. Часть1. С.147.
2. Kozhemyako V. В., Rebrikov D.V., Lukyanov S. A., Bogdanova Е.А., Marin A., Mazur A.K., Kovalchuk S.N., Agafonova E.V., Sova V.V., Elyakova L.A., Rasskazov V.A. Molecular cloning and characterization of an endo-1, 3-p-D-glucanase from the mollusk Spisula sachalinensis // Сотр. Biochem. Physiol. 2004. Vol. 137, № 2. P. 169-178.
3. Kovalchuk S.N., Sundukova E.V., Burtseva Yu.V., Guzev K.V., Kozhemyako V.B., Rasskazov V.A. Molecular cloning and characterization of endo-1,3-p-D-glucanases from marine mollusks // IUPAC International Conference on Biodiversity and Natural Products: Chemistry and Medical Application. New Delhi. India: abstracts. 2004. P.154.
4. Kovalchuk S.N., Sundukova E.V., Kusaykin M.I., Guzev K.V., Anastyuk S.D., Likhatskaya G.N., Trifonov E.V.,Nurminski E.A., Kozhemyako V.B., Zvyagintseva T.N., Rasskazov V.A. Purification, cDNA cloning and homology modeling of endo-1,3-p-D-glucanase from scallop Mizuhopectenyessoensis //Сотр. Biochem. Physiol. 2006. Vol. 143. P. 473 -485.
Список работ, опубликованных no теме диссертации
Соискатель
Ковальчук С. Н.
Ковалъчук Светлана Николаевна
МОЛЕКУЛЯРНОЕ КЛОНИРОВАНИЕ И СТРУКТУРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЭНД0-1,3-р-0-ГЛЮКАНАЗ ДВУСТВОРЧАТЫХ МОЛЛЮСКОВ
АВТОРЕФЕРАТ
ЗАО «Фартоп» Г. Владивосток, ул., Адм. Фокина, 31 Тираж 100 экз. Отпечатано 30 ноября 2006 г. .
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ковальчук, Светлана Николаевна
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
1, ВЕДЕНИЕ.
2.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. КЛАССИФИКАЦИЯГЛИКОЗИЛГИДРОЛАЗ.
2.2. ГЛИКОЗИЛГИДРОЛАЗЫ16 СЕМЕЙСТВА ГЛИКОЗИЛГИДРОЛАЗ.
2.2.1. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ И ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ СВОЙСТВА ЭНДО-1,3-f3-D- ГЛЮКАНАЗ 16 СЕМЕЙСТВА ГЛИКОЗИЛГИДРОЛАЗ.
2.2.2. СТРУКТУРА ГЛИКОЗИЛГИДРОЛАЗ 16 СЕМЕЙСТВА.
2.3. КОМПЬЮТЕРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ СТРУКТУРЫ БЕЛКОВ.
2.4. ЭНДО-1,3- /? -D-ГЛЮКАНАЗЫ ДВУСТВОРЧАТЫХ
МОЛЛЮСКОВ.
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
4.1. УСТАНОВЛЕНИЕ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ
ЭНДО-1,3-/?-D-ГЛЮКАНА3 ДВУСТВОРЧА ТЫХ МОЛЛЮСКОВ.
4.2. ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЭНДО-1,3-/3 -D-ГЛЮКАНA
16 СЕМЕЙСТВА ГЛИКОЗИЛГИДРОЛАЗ.
4.3. КОМПЬЮТЕРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ СТРУКТУРЫ ЭНДО-1,3-Р-В-ГЛЮКАНАЗ ДВУСТВОРЧАТЫХ МОЛЛЮСКОВ.
4.4. ГЕТЕРОЛОГИЧЕСКАЯ ЭКСПРЕССИЯ ЭНДО-1,3-(3-D- ГЛЮКАНАЗ
ДВУСТВОРЧАТЫХ МОЛЛЮСКОВ.
5. ВЫВОДЫ.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярное клонирование и структурная характеристика эндо-1,3-β-D-глюканаз двустворчатых моллюсков"
1,3-р-В-глюканазы (ЕС 3.2.1.39) отаосятся к 0-гликозилгидролазам,ключевым ферментам метаболизма углеводов. Они раещепляют р-1,3гликозидные связи в P-D-глюканах. Эти ферменты широко распроетраненысреди представителей всех царств живой природы, от архебактерий до эукариот,и вовлечены в разнообразные физиологические процессы (Маскау et al., 1985). Вчастности, 1,3-|3-В-глюканазы бактерий расщепляют 1,3-p-D глюканы клеточныхстенок грибов (Wanabe et al., 1992) и ламинараны бурых водорослей (ICrah et al.,1998; Dakhova et al., 1993), используемые бактериями в качестве источникаглюкозы. В грибах эти ферменты участвуют в расщеплении внеклеточногоматрикса при пролиферации клеток, в формировании клеточной стенки, впроцессах почкования и споруляции (Pitson et al., 1993). В растениях 1,3-p-Dглюканазы вовлечены в процессы клеточной дифференциации, де1радации 1,3-РD-глюканов при прорастании семян и при оплодотворении, а также являютсячастью механизма защиты растений от патогенных грибов (Jutidamrongphan etal, 1991; Grenier et al., 1993). Эндо-1,3-Р-В-глюканазы беспозвоночныхживотных расщепляют ламинаран (Sova et al., 1970) и клеточные стенки грибов(Kikuchi et al., 2005) в процессе пищеварения, а также участвуют в эмбриогенезе(Bachmanetal.,1996).На сегодняшний день изучены свойства, клонированы гены и определеныаминокислотные последовательности 1,3-р-О-глюканаз бактерий, грибов ирастений, в то время как данные о структуре 1,3-р-В-глюканаз животных крайнескудны. К настоящему моменту определены первичные структуры 1,3-P-Dглюканаз из яйцеклеток морского ежа Stronylocentrotus purpuratus (Bachman etal.,1996) и из нематод Bursaphelenchus xylophilus и Bursaphelenchns mucronatus(Kikuchi et al., 2005). Вместе с тем было показано, что многие виды морскихбеспозвоночных, особенно двустворчатые моллюски, являются источникамивысокоактивных эндо-1,3-р -D-глюканаз (Sova et al., 1970). К настоящемувремени достаточно глубоко изучены физико-химические свойства эндо-1,3-Р-Вглюканаз некоторых видов двустворчатых моллюсков, таких как Spisulasachalinensis, Chlamys albidus и Mizuhopecten yessoensis, накоплены данные по6специфичности и механизму действия этих ферментов, определеныаминокислотные остатки, имеющие существенное значение для активности эндо1,3-Р-О-глюканаз двустворчатых моллюсков (Звягинцева и Елякова, 1994).Особый практический интерес представляет получение с помощью эндо-1,3-Р-Вглюканаз двустворчатых моллюсков S.sachalinensis и C.albidus 1,3- и 1,3;1,6-P-Dглюкоолигосахаридов, гликозидов и биологически активных 1,3-Р-В-глюканов,оказывающих иммуномодулирующее действие на организмы животных ирастений (Звягинцева и др., 1995). Поэтому для более детального изучения эндо1,3-Р-В-глюканаз двустворчатых моллюсков становится актуальнымустановление их структуры, что необходимо для более глубокого попиманияфункционирования, происхождения и эволюции этой группы ферментов.Установление первичной структуры эндо-1,3-Р-В-глюканаз двустворчатыхмоллюсков также создаст необходим>1о основу для работы по получениюферментативно активных рекомбинантных эндо-1,3-Р-О-глюканаздвустворчатых моллюсков с целью более детального исследованияфункциональной роли различных аминокислотных остатков в каталитическомпроцессе методами направленного мутагенеза, а также возможногоиснользования этих рекомбинантных ферментов для биотехнологаческогопроизводства иммуномодулирующих нрепаратов нового поколепия.Таким образом, глубокое изучение физико-химических свойств и механизмадействия эндо-1,3-Р-В-глюканаз двустворчатых моллюсков и отсутствиеинформации о структуре этих ферментов определили цель данной работы установление и анализ структуры эндо-1,3-Р-О-глюканаз двустворчатыхмоллюсков.В соответствии с заявленной целью работы были ноставлены следующиезадачи:1. Установить полные нуклеотидные последовательпости кДНК иопределить аминокислотные последовательности эндо-1,3-р-0-глюканаздвустворчатых моллюсков Spisula sachalinensis, Mizuhopecten yessoensis,Chlamys albidus и Chlamys rosealbus.72. Провести филогенетический анализ эндо-1,3-Р-В-глюканаз на основе ужеимеющихся в базах данных и полученных нами аминокислотныхпоследовательностей этих ферментов.3. Построить теоретические модели пространственных структур эндо-1,3-РD-глюканаз двустворчатых моллюсков с целью исследования структурнофункциональных особенностей этих ферментов.4. Исследовать возможность гетерологической экспрессии эндо-1,3-р-Вглюканаз двустворчатых моллюсков в клетках Escherichia соИ.8
Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Ковальчук, Светлана Николаевна
ВЫВОДЫ
1. Впервые установлены нуклеотидные последовательности полноразмерных кДНК, кодирующих эндо-1,3-р-0-глюканазы двустворчатых моллюсков S. sachalinensis, М. yessoensis, С. rosealbus и С. albidus, и на основании этих данных определены полные аминокислотные последовательности этих ферментов.
2. Установлено, что согласно современной классификации гликозилгидролаз, основанной на структурной гомологии, эндо-1,3-p-D-глюканазы двустворчатых моллюсков следует отнести к 16 семейству гликозилгидролаз.
3. Проведен филогенетический анализ эндо-1,3-Р-0 глюканаз 16 семейства гликозилгидролаз и гомологичных им белков. Показано, что вероятны дупликация гена эндо-1,3-Р-О-глюканаз у беспозвоночных животных уже на этапе их возникновения, ранняя дивергенция копий этого гена в направлении специализации кодируемых ими белков на выполнение пищеварительной и защитной функций, элиминация эндо-1,3-Р-0-глюканазного гена у наземных беспозвоночных животных и его повторное возникновение путем горизонтального переноса от бактерий.
4. Впервые построены теоретические модели пространственной структуры эндо-1,3-Р-О-глюканаз из М. yessoensis, С. albidus и S. sachalinensis с использованием в качестве прототипа пространственной структуры к-каррагеназы из Pseudoalteromonas carrageenovora. Точность полученных теоретических моделей для всех Са-атомов М. yessoensis, С. albidus и S. sachalinensis составляет 1.4 А, 1.9 А и 1.6 А, для Са-атомов активного центра - 0.48 А, 0,29 А, 0.61 А, соответственно. Показано, что полость активного центра эндо-1,3-Р-О-глюканаз двустворчатых моллюсков в отличие от прототипа образована гидрофобными аминокислотными остатками, что согласуется с установленным механизмом действия эндо-1,3-Р-О-глюканаз двустворчатых моллюсков по типу множественной атаки.
Впервые построены теоретические модели комплексов эндо-1,3-|3-0-глюканаз из С. albidus и М. yessoensis с ламинаригексаозой и природным ингибитором халистанолсульфатом. Показано, что ламинаригексаоза образует комплекс с эндо-1,3-р-0-глюканазой из М. yessoensis в полости активного центра фермента и взаимодействует с каталитическим остатком глутамина Glul50 в области восстанавливающего конца. Эндо-1,3-р-0-глюканаза из М. yessoensis образует комплекс с одной молекулой халистанолсульфата в полости активного центра. Эндо-1,3-р-0-глюканаза из С. albidus имеет два сайта связывания с халистанолсульфатом в полости активного центра фермента, что согласуется с экспериментальными данными.
Показана корреляция между термостабильностью и конформационной подвижностью эндо-1,3-р-О-глюканаз двустворчатых моллюсков S. sachalinensis, М. yessoensis и С. albidus и содержанием в этих ферментах остатков метионина и пролина, глициновых кластеров, дисульфидных и ионных связей.
Показана возможность гетерологической экспрессии эндо-1,3-Р-Б-глюканаз двустворчатых моллюсков М. yessoensis и S. sachalinensis в E.coli.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ковальчук, Светлана Николаевна, Владивосток
1. Бакунина И.Ю., Сова В.В., Елякова JI.A., Макарьева Т.Н., Стоник В.А., Пермяков Е.А., Емельяненко В.И. Влияние сульфатов полиоксистероидов на экзо- и эндоглюканазы // Биохимия. 1991. Т. 56. С. 1397-1405.
2. Брауннггейн А.Е Классификация и номенклатура ферментов. Отчет Комиссии по ферментам Международного биохимического союза 1961. Москва, 1962. 198 с.
3. Варфоламеев С.Д., Упоров И.В., Федоров Е.В. Биоинформатика и молекулярное моделирование в химической энзимологии. Активные центры гидролаз // Биохимия. 2002. Т. 76. С. 1328-1340.
4. Евсеев Г .А., Яковлев Ю.М. Двустворчатые моллюски дальневосточных морей России. Владивосток: ПК Поликон. 2006.- 120 с.
5. Елякова JI.A., Звягинцева Т.Н. Кинетические особенности действия Р-1,3-глюканаз из различных источников // Биоорган, химия. 1981. Т. 7. С 680685.
6. Елякова JI.A., Звягинцева Т.Н., Привалова Н.М. Сравнительная характеристика и изучение сорбционных свойств активных центров Р-1,3-глюканаз из морских беспозвоночных // Биоорган, химия. 1978. Т. 4. С. 1553-1559.
7. Елякова JI.A., Светашева Т.Г., Сова В.В., Шевченко Н.М. Исследование функциональных групп, существенных для каталитической активности эндо-Р" 1,3-глюканазы из Chlamys albidus // Биохимия. 1984. Т. 49. С. 17621768.
8. Ермакова С.П., Бурцева Ю.В., Сова В.В., Звягинцева Т.Н. Белки бурых водорослей как игибиторы морских беспозвоночных // Биохимия. 2001. Т. 66, №2. С. 188-194.
9. Звягинцева Т.Н., Елякова JI.A., Исаков В.В. Ферментативное превращение ламинаранов в 1,3;1,6-Р-0-глюканы, обладающиеиммуностимулирующей активностью // Биоорган, химия. 1995. Т. 21. С. 218-225.
10. Звягинцева Т.Н., Елякова Л.А. Зависимость кинетических параметров М,3-глюканазы из Spisula sachalinensis от рН // Биоорган, химия. 1975. Т.1.С. 1470-1473.
11. Звягинцева Т.Н.,.Елякова Л.А. Механизм действия и специфичность эндо-1,3- (3-D-глюканаз морских моллюсков // Биоорган, химия. 1994. Т. 20, №5. С. 453-473.
12. Звягинцева Т.Н., Макарьева Т.Н., Стоник В.А., Елякова Л.А. Сульфатированные стероиды губок семейства Halichondriidae как природные ингибиторы эндо-1,3-Р-О-глюканаз //Химия природн. соедин. 1986. №. 1. С. 71-77.
13. Иванов А.С. Основы вычислительной химии для медико-биологов // Биомедицинская химия. 2005. Т. 51, №2. С. 152-169.
14. Лакизова И.Ю. Елякова Л.А., Емельяненко В.И., Пермяков Е.А., Бурштейн Э.А. Сравнительное изучение р-1,3-глюканаз морских моллюсков по флуоресценции триптофана // Биофизика. 1988. Т. 33. С. 31-35.
15. Лакизова И.Ю., Елякова Л.А. Сравнительное изучение ламинариназ из морских моллюсков методом разностной УФ-спектрофотометрии // Биохимия. 1983. Т. 48. С. 1654-1660.
16. Лукьянов К.А., Гурская Н.Г., Богданова Е.А., Лукьянов С.А. Селективная супрессия полимеразной цепной реакции // Биоорг. химия. 1999. Т. 25. С. 163 170.
17. Мазин А.В., Кузнецов К.Д., Краув А.С. и др. Методы молекулярной генетики и генной инженерии. Новосибирск: Наука. 1990. - 288 с.
18. Мазур А.К., Елякова Л.А. Кинетика образования глюкозы при деполимеризации полисахаридов ферментами с различным механизмом действия // Мол. биол. 1983. Т. 17. С. 101-111.
19. Маниатис Т, Э.Фрич, Дж.Сэмбрук. Методы генной инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. - 480 с.
20. Назарова Н.И., Елякова Л.А. Исследование трансгликозилирующей способности эндо- р-1,3-глюканаз //Биоорган, химия. 1989. Т.15. С. 1215-1223.
21. Назарова Н.И., Мазур А.Л., Елякова Л.А. Активные центры эндо-Р-1,3-глюканаз из Spisula sachalinensis и Chlamys albidus II Биоорган, химия. 1986. Т. 12. С. 1478-1483.
22. Наумов Д.Г. Филогенетический анализ а-галактозидаз семейства GH2 // Молекулярная биология. 2004. Т 38. С. 463-476.
23. Рабинович М.Л., Мельник М.С., Болобова А.В. Структура и механизм действия целлюлолитических ферментов // Биохимия. 2002. Т. 8. С. 1026-1050.
24. Сова В.В., Левина Э.В., Андриященко П.В., Федоров С.Н., Елякова Л.А. Действие полиоксистероидов из морских звезд и офиур на активность Р-1,3-глюканаз//Химия природ, соедин. 1994. № 5. С. 647-651.
25. Сова В.В., Мястовская О.М., Светашева Т.Г., Филитова М.Б., Елякова Л.А. Сравнение энзиматических и структурных характеристик Р-1,3-глюканаз из морских моллюсков // Химия природа. Соедин. 1987. № 4. С. 577-581.
26. Сова В.В., Федореев С.А. Метаболиты из губок ингибиторы Р-1,3-глюканаз // Химия природ, соедин. 1991. С. 497-500.
27. Aghajari N., Feller G., Gerday С., Haser R. Structures of the psychrophilic Alteromonas haloplanctis alpha-amylase give insights into cold adaptation at a molecular level // Structure. 1998. Vol. 6. P. 503-516.
28. Aghajari N, Feller G, Gerday C,Haser R. Crystal structures of the psychrophilic alpha-amylase from Alteromonas haloplanctis in its native form and complexed with an inhibitor // Protein Sci. 1998. Vol. 7. P. 564-572.
29. Alfredsson G.A., Kristjansson J.K., Hjorleifsdottir S. & Stetter K.O. Rhodothermus marinus, gen. nov., sp. nov., a thermophilic,halophilic bacterium from submarine hot springs in Iceland // J. Gen.Microbiol. 1988. Vol. 134. P. 299-306.
30. Allouch J, Jam M., Helbert W, Baibeyron T, Kloareg B, Henrissat В and Czjzek МЦ The Three-dimensional Structures of Two P-Agarases // Journal of Biological Chemistry. 2003. Vol. 278, № 47. P. 47171^17180.
31. Asgeirsson В., Nielsen B.N., Hojrup P. Amino acid sequence of the cold-active alkaline phosphatase from Atlantic cod (Gadus morhua) // Сотр. Biochem. Physiol. 2003/ Vol. 136/ P. 45-60.
32. Ashida H., Maskos K., Li S.C. and Li Y.T. Characterization of a novel endo-beta-galactosidase specific for releasing the disaccharide GlcNAc alpha l-->4Gal from glycoconjugates // Biochemistry. 2002. Vol. 41. P. 2388-2395.
33. Bachman E.S., McClay D.R. Molecular cloning of the first metazoan P-l,3-glucanase from eggs of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus // Proc. Natl. Acad. Sci. 1996. Vol. 93. P. 6808-6813.
34. Bartlett GJ, Porter CT, Borkakoti N, Thornton JM. Analysis of catalytic residues in enzyme active sites // J Mol. Biol. 2002. Vol. 324, №1. P. 105-121.
35. Bent O. Petersen, Martin Krah, Jens e. Duus and Karl K. Thomsen. A transglycosylating l,3(4)-b-glucanase from Rhodothermus marinus NMR analysis of enzyme reactions // Eur. J. Biochem. 2000. Vol. 267. P. 361-369.
36. Berman H. M., Westbrook J., Feng Z., Gilliland G„ Bhat T. N., Weissig H., Shindyalovl. N., Bourne P. E. The Protein Data Bank // Nucleic. Acids Res. 2000. Vol. 28. P. 235-242.
37. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chlorophorm extraction // Anal.Biochem. 1987. Vol. 162. P. 156-159.
38. Criswell A. R., Bae E., Stec В., Konisky J., Phillips G. N. Jr. Structures of thermophilic and mesophilic adenylate kinases from the genus Methanococcus// J. Mol. Biol. 2003. Vol. 330. P. 1087-1099.
39. Feller G., Gerday C. Psychrophilic enzymes: molecular basis of cold adaptation // Cell Mol. Life Sci. 1997. Vol. 53. P.830-841.
40. Feller G., Payan F., Theys F., Qian M., Haser R., Gerday C. Stability and structural analysis of alpha-amylase from the antarctic psychrophile Alteromonas haloplanctis A23 //Eur. J. Biochem. 1994. Vol. 222. P. 441-447.
41. Fields P.A., Somero G.N. Hot spots in cold adaptation: localized increases in conformational flexibility in lactate dehydrogenase A4 orthologs of Antarctic notothenioid fishes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. Vol. 95. P. 1147611481.
42. Frohman M.A. Rapid amplification of complementary DNA ends for generation of full-length complementary DNAs: thermal RACE // Methods Enzymol. 1993. Vol. 218. P. 340-356.
43. Fusetani N., Matsunaga S., Konosu S. Bioactive marine metabolites II. Halistanol sulfate, an antimicrobial novel steroid sulfate from the marine sponge halichondria cf. moorei bergquist // Tetrahedron Lett. 1981. Vol. 22. P. 19851988.
44. Georlette D., Damien В., Blaise V., Depiereux E., Uversky V.N., Gerday C., Feller G. Structural and functional adaptations to extreme temperatures in psychrophilic, mesophilic, and thermophilic DNA ligases // J Biol Chem. 2003. Vol. 278. P. 37015-37023.
45. Gilkes N.R., Henrissat В., and Kilburn D.G. Domains in microbial beta-1, 4-glycanases: sequence conservation, function, and enzyme families // Microbiol. Rev. 1991. Vol. 55. P. 303-315.
46. Grenier J., Potvin, C., and Asselin, A. Barley pathogenesis-related proteins with fungal cell wall lytic activity inhibit the growth of yeasts // Plant Physiol. 1993. Vol. 103. P. 1277-1283.
47. Gueguen Y., Voorhorst W.G., van der Oost J., and de Vos W.M. Molecular and biochemical characterization of an endo-P-l,3-glucanase of the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus //J. Biol. Chem. 1997. Vol. 272. P. 31258-31264.
48. Guex N., Peitsch M.C. SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: An environment for comparative protein modeling // Electrophoresis. 1997. Vol. 18. P. 27142723.
49. Hahn M., Olsen 0., Politz 0., Borriss R., Heinemann U. Crystal structure and site-directed mutagenesis of Bacillus macerans endo-l,3-l,4-beta-glucanase // J. Biol. Chem. 1995. Vol. 270. P. 3081-3088.
50. Hahn M., Pons J., Planas A., Querol E., Heinemann U. Crystal structure of Bacillus licheniformis 1,3-1,4-beta-D-glucan 4-glucanohydrolase at 1.8 A resolution // FEBS Lett. 1995. Vol. 374. P. 221-224.
51. Hauton C., Hammond J.A. and Smith V.J. Real-time PCR quantification of the in vitro effects of crustacean immunostimulants on gene expression in lobster (Homarus gammarus) granular haemocytes // Dev. Сотр. Immunol. 2005. Vol. 29. P. 3342.
52. Henrissat В., Bairoch A. Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases // Biochem. J. 1996. Vol. 316. P. 695-696.
53. Henrissat B, Davies G: Structural and sequence-based classification of glycoside hydrolases. Curr Opin Struct Biol 1997, 7:637-644.
54. Henrissat B. Weak sequence homologies among chitinases detected by clustering analysis // Protein Seq. Data Anal. 1990. Vol. 6. P. 523-526.
55. Henrissat B. Glycosidase families // Biochem. Soc. Trans. 1998. Vol. 26. P.153-156.
56. Henrissat, B. Sequence homology between a beta-galactosidase and some beta-glucosidases//Biochem. J. 1991. Vol. 280. P. 309-316.
57. Henrissat В., Teeri T.T., Warren R.A.J. A scheme for designating enzymes that hydrolyse the polysaccharides in the cell walls of plants // FEBS Letters. 1998. Vol. 425. P. 352-354.
58. Jannick Dyrlov Bendtsen, Henrik Nielsen, Gunnar von Heijne and Soren Brunak. Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0. // J. Mol. Biol. 2004. Vol. 340. P. 783-795.
59. Johnson M.S., Srinivasan N., Sowdhamini R. Knowledge-based protein modeling // Crit. Rov. Biochem. Mol.Biol., 1994. Vol. 29. P. 1-68.
60. Jones G., Willett P., Glen R.C., Leach A.R., Taylor R. Development and validation of a genetic algorithm for flexible docking // J. Mol. Biol. 1997. Vol. 267. P. 727748.
61. Juncosa M., Pons J., Dot Т., Querol E., Planas A. Identification of active site carboxylic residues in Bacillus licheniformis 1,3-1,4-beta-D-glucan 4-glucanohydrolase by site-directed mutagenesis // Biol.Chem. 1994. Vol. 269. P. 14530-14535.
62. Kozak, M. Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes // Cell. 1986. Vol. 44. P. 283292.
63. Kozak M. An analysis of 5r-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs // Nucl. Acids Res. 1987. Vol. 15. P. 8125-8148.
64. Kozak M. At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells // J. Mol. Biol. 1987. Vol. 196. P. 947-950.
65. Ma C., and Kanost M.R. A beta 1,3-glucan recognition protein from an insect, Manduca sexta, agglutinates microorganisms and activates the phenoloxidase cascade// J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275. P. 7505-7514.
66. Mackay R.M., Baird S., Dove M.J., Erratt J.A., Gines M., Moranelli F., Nasim A., Yaguchi M., and Seligy V.L. Glucanase gene diversity in prokaryotic and eukaryotic organisms // Biosystems. 1985. Vol. 18. P. 279-292.
67. Makarieva T.N., Stonik V.A., D'yachuk O.G., Dmitrenok A.S. Annasterol sulfate, a novel marine sulfated steroid inhibitor og glucanase activity from the deep water sponge Poecillastra laminaris // Tetrahedron Letters. 1995. Vol. 36. P. 129-132.
68. Marti-Renom M. A., Madhusudhan M.S., Fiser A., Rost В., and Sali A. Reliability of assessment of protein structure prediction methods // Structure. 2002. Vol. 10. P. 435-440.
69. Marti-Renom M. A., Stuart A., Fiser A., Sanchez R., Melo F., and Sali A. Comparative protein structure modeling of genes and genomes // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 2000. Vol. 29. P. 291-325.
70. D-xylosidases//Proteins. 2001. Vol. 42. P. 66-76. Naumoff D.G. Phylogenetic analysis of a-galactosidases from GH27 family // Mol.
71. Pieper U., Eswar N., Ilyin V.A., Stuart A., and Sali A. ModBase, a database of annotated comparative protein structure models // Nucleic Acids Res. 2002. Vol. 30. P. 255-259.
72. Pitson S.M., Seviour R.J., McDougall B.M. Noncellulolytic fungal beta-glucanases: their physiology and regulation // Enzyme Microb. Technol. 1993. Vol. 15. P. 178-192.
73. Planas A. Bacterial 1,3-1,4-L-glucanases: structure, function and protein engineering // BiochimicaetBiophysica Acta. 2000. Vol. 1543. P. 361-382.
74. Prager E.M., Wilson A.C. The dependence of immunological cross-reactivity upon sequence resemblance among lysozymes. II. Comparison of precipitin and micro-complement fixation results // J. Biol. Chem. 1971. Vo. 246. P. 70107017.
75. Privalova N.M., Elyakova L.A. Purification and some properties of endo-p-(l->3)-glucanase from the marine bivalve Chlamys albidus // Comp.Biochem.Physiol. 1978. Vol. 60B. P. 225-228.
76. Py В., Bortoli-German I., Haiech J., Chippaux M., Barras F. Cellulase EGZ of Erwinia chrysanthemi: structural organization and importance of His98 and Glul33 residues for catalysis // Protein Eng. 1991. Vol. 4. P. 325-333.
77. Retief J.D. Phylogenetic analysis using PHYLIP //Methods Mol. Biol. 2000. Vol. 132. P. 243-258.
78. Rigden D.J., Jedrzejas M.J., de Mello L.V. Identification and analysis of catalytic TIM barrel domains in seven further glycoside hydrolase families // FEBS Lett. 2003. Vol. 544. P. 103-111.
79. Rigden D.J. Iterative database searches demonstrate that glycoside hydrolase families 27, 31, 36 and 66 share a common evolutionary origin with family 13 // FEBS Lett 2002. Vol. 523. P. 17-22.
80. Robyt J.F., French D. Multiple attack hypotesis of a-amylase action. Action of porcine pancreatic, human salivary and A. orizae a-amylases // Arch.Biochem.Biophys. 1967. Vol. 122. P. 8-16.
81. Robyt J.F., French D. Multiple attack and polarity of action of PPA // Arch.Biochem.Biophys. 1970. Vol. 138. P. 662-670.
82. Roux M.M., Pain A., Klimpel K.R. and Dhar A.K. The Lipopolysaccharide and beta-1,3-Glucan Binding Protein Gene Is Upregulated in White Spot Virus-Infected Shrimp (Penaeus stylirostris) // J. Virol. 2002. Vol. 76. P. 7140-7149.
83. Saitou N., Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing hylogenetic trees // Mol. Biol. Evol. 1987. Vol. 4. P. 406-425.
84. Sali A., Overington J.P. Derivation of rules for comparative protein modeling from a database of protein structure alignments // Protein Sci. 1994. Vol 3. P. 15821596.
85. Sanchez R., Pieper U., Melo F., Eswar N., Marti-Renom M.A., Madhusudhan M.S., Mirkovic N., and Sali A. Protein structure modeling for structural genomics // Nat. Struct.Biol. 2000. Vol.7. P. 986-990.
86. Sanchez R., Sali A. Advances in comparative protein-structure modelling // Curr. Opin. Struct. Biol. 1997. Vol. 7. P. 206-214.
87. Sanchez R., Sali A. Large-scale protein structure modeling of the Saccharomyces cerevisiae genome // Proc. Natl. Acad. Sc.i USA. 1998. Vol. 95. P. 1359713602.
88. Sayle R.A., Milner-White J.E. RASMOL: biomolecular graphics for all // Trends in Biochemical Sciences. 1995. Vol. 20. P. 374-376.
89. Schultz J., Copley R.R., Doerks Т., Ponting C.P., Bork P. SMART: a web-based tool for the study of genetically mobile domains // Nucleic Acids Res. 2000. Vol 28. P. 231-234.
90. Smalas A.O., Leiros H.K., Os V., Willassen N.P. Cold adapted enzymes // Biotechnol.
91. Annu. Rev. 2000. Vol. 6. P. 1-57.
92. Smith T.F. Smith T.F. The art of matchmaking: sequence alignment methods and their structural implications // Structure Fold Des. 1999. Vol. 7. P. 7-12.
93. Somogyi M. Notes on sugar determination // J. Biol. Chem. 1952. Vol. 195. P. 19-23.
94. Sova V.V., Elyakova L.A., and Vaskovsky V.E. Purification and some properties of (1—>3)-glucan glucanohydrolase from the crystalline style of bivalvia, Spisula sachalinensis II Biochme.Biophys.Acta. 1970. Vol. 212. P. 111-115.
95. Sova V.V., Elyakova L.A., Vaskovsky V.E. 1970. The distribution of laminarinases in marine invertabrates // Comp.Biochem.Physiol. Vol. 32. P. 459-464.
96. Sova V.V., ElyakovaT.N. Some aspects of the specificity and action pattern of P-1,3-glucan glucanohydrolase from Spisula sachalinensis // Biochem. Biophys. Acta. 1972. Vol. 258. P. 219-227.
97. Srinivasan N., Bax В., Blundell T.L., Parker P.J. Structural aspects of the functional modules in human protein kinase-C alpha deduced from comparative analyses // Proteins. 1996. Vol. 26. P. 217-235.
98. Sritunyalucksana K., Soderhall K. The proPO and clotting system in crustaceans. Aquaculture. 2000. Vol. 191. P. 53-69.
99. Su J.G., Song L.S., Xu W., Wu L.T., Li H.L. and Xiang J.H. cDNA cloning and mRNA expression of the lipopolysaccharide- and beta-1,3- glucan-binding protein gene from scallop Chlamys farreri // Aquaculture. 2004. Vol. 239. P. 6980.
100. Suhre K., Sanejouand Y.H. EINemo: a normal mode web server for protein movement analysis and the generation of templates for molecular replacement // Nucleic Acids Res. 2004. Vol. 32. P. 610-614.
101. Sun L., Gurnon J.R., Adams B.J., Graves M.V., Van Etten J.L. Characterization of a beta-l,3-glucanase encoded by chlorella virus PBCV-1 //Virology. 2000. Vol. 276. P. 27-36.
102. Teather R.M. and Erfle J.D. DNA sequence of a Fibrobacter succinogenes mixed-linkage beta-glucanase (1,3-1,4-beta-D-glucan 4-glucanohydrolase) gene // J. Bacteriol. 1990. Vol. 172. P. 3837-3841.
103. Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications// Proc Natl Acad Sci USA. 1979/ Vol. 76. P. 4350-4354.
104. Tran V., Buleon A., Imberty A., Perez. Relaxed potential energy surface of maltose // Biopolymers. 1989. Vol. 28. P.679-685.
105. Vakser I.A. Protein doking for low-resolution structures // Protein Eng. 1995. Vol. 8. P. 371-377.
106. Watanabe Т., Kasahara N., Aida K. and Tanaka H. Three N-terminal domains of beta-1,3-glucanase Al are involved in binding to insoluble beta-l,3-glucan // J. Bacteriol. 1992. Vol. 174. P. 186-190.
107. Withers S.G. Mechanism of glycosyl transferases and hydrolases // Carbohydrate Polymers. 2001. Vol. 44. P. 325-337.
108. Yahata N., Watanabe Т., Nakamura Y., Yamamoto Y., Kamimiya S. and Tanaka H.Structure of the gene encoding beta-l,3-glucanase Al of Bacillus circulans WL-12 // Gene. 1990. Vol. 86. P. 113-117.
109. Zvelebil M.J., Sternberg M.J. Analysis and prediction of the location of catalytic residues in enzymes // Protein Eng. 1988. Vol. 2. P. 127-138.
-
Ковальчук, Светлана Николаевна
-
кандидата биологических наук
-
Владивосток, 2006
-
ВАК 03.00.04
- Сравнительное исследование экспрессии бактериальных генов полиглюкангидролаз в растениях
- Изучение структуры гена лихеназы CLOSTRIDIUM THERMOCELLUM Ф7 и характеристика продукта данного гена
- Изучение экспрессии генов термостабильных ферментов бета-гликозидазы и бета-1,3 глюканазы из Clostridium thermocellum в клетках Escherichia coli
- О-гликозилгидролазы морских мицелиальных грибов
- Биоразнообразие мицелиальных грибов - ассоциантов двустворчатых моллюсков залива Петра Великого Японского моря
