Ферменты морских бактерий Pseudoalteromonas citrea, катализирующие деградацию полианионных полисахаридов бурых водорослей

Алексеева, Светлана Анатольевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Ферменты морских бактерий Pseudoalteromonas citrea, катализирующие деградацию полианионных полисахаридов бурых водорослей
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Ферменты морских бактерий Pseudoalteromonas citrea, катализирующие деградацию полианионных полисахаридов бурых водорослей"

Алексеева Светлана Анатольевна

Ферменты морских бактерий РзеийоаНеготопая сНгеа, катализирующие деградацию полианионных полисахаридов бурых водорослей

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой стенени кандидат биологических наук

■ВЛАДИВОСТОК 2003

Алексеева Светлана Анатольевна

Ферменты морских бактерий Р>чеш1оаНеготопа5 сИгеа, катализирующие деградацию полианионных полисахаридов бурых водорослей

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссер гации на соискание ученой степени кандидат биологических наук

.ВЛАДИВОСТОК 2003

Работа выполнена в Тихоокеанском институте биоорганической химии Дальневосточного отделения

Российской академии наук

Научные руководитель:

доктор химических наук Т.Н. Звя1 инцева

Официальные оппоненты:

Ведущая организация.

доююр химических наук Л.И. Усов

кандидат химических наук ЕЛ. Назаренко

Институт ядерной физики РАН

Зашита диссертации состоится « 24 » сентября_2003 г. в 10 часов на заседании

диссертационного совета Д 00S.00S.01 в Тихоокеанском инпи|у|ебиоор1анической химии ДВО РАН по адресу: 690022 ■. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159,1ИБОХ ДВО РАН. Факс: (4232) 314-050, электронная почта: пнк№р1Ьос.(1¥о.ги

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Ценфальиои научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН) Автореферат разослан « 22 » августа 2003 г.

РОС. НАЦИОНАЛЬНА* БИБЛИОТЕКА С. Петербург 0Э 31

30(0 У&Ур ;

Ученый секретарь диссертационного совета, к.х.н.

Г.И. Прокопенко

Общая характеристика работы

Актуальное! ь проблемы. Полианионные полисахариды клеточных стенок бурых водорослей -фукоиданм и алыиновые кислоты обладают разнообразной биологической активностью Наибольший интерес представляет антикоагулянтнос и антивирусное действие фукоиданов, в том числе пропив ВИЧ, вирусов i епатита и герпеса. Алыиновые кислоты давно используются в различных областях промышленности, медицины и сельского хозяйства. Фукоиданм применяют как антиопухолсвые препарат или при получении лечебно-профилактических напитков с ангикоагулянтпыми свойствами.

Фукоиданм бурых водорослей представляю! собой семейство юмо- и терополисахаридов, состоящих преимущественно из останов сульфашрованной фукозы, коюрые связаны в основной цепи либо а-1->3-, либо а-1 —>3-; а-1—>4-0-гликозндмыми связями Помимо фу кош, фуконданы могут содержать как в основной цепи, так и в разветвлениях, минорные моносахариды: машину, галактозу, ксилозу. рамнозу. уроновые кислоты. Алы нновые кислот - линейные полисахариды, построенные и i остатков p-D-маннуроновой и а-Ыулуроновой кисло«, связанных I—>4-Оч ликозидными связями.

Ферменты, катализирующие де1 радацию полианионных полисахаридов, использую1ся для изучения их структуры, биоло!ической активности и получения лекарственных препаратов. Алы инат-лиазы успешно применяются для получения протопластов разнообразных водорослей. Из природных алыинаюв с помощью высокоспецифичных альгина1-лиаз получают ноли-M-, пол и-Г- и полн-МГ-блоки, коюрые необходимы в исследованиях субсфатпой специфичности ферментов Возможно применение алыинат-лиаз в сочеынии с дезоксирибонуклеазой и анжбжпиками в качестве tepancBiH4caot\ нрепараюв для лечения заболеваний, вызванных патогенами. Альгинаг-лиазы найдены не только & Морских макро- и микроорганизмах, но п в почвенных бактериях. Фукоиданазы обнаружены юлько в МН|$Ькнх орижизмах и, как правило, уровень их активности чрезвычайно низок. Эти ферменты, дня которых 1Ыестны в насюяшее время юлько единичные представители, относятся к малоизученный.

В качес!ве источников эжх фермой гон нами используются морские микроорганизмы, коюрые являются исключтелыю блаюприятными объектами для поиска различных биоло! и чески активных веществ, в том числе ферментов Они содержат разнообразные ферменты и JieiKO культивируются в контролируемых условиях.

Наши исследования расширят представления о механизмах действия ферментов вообще и ферментов морско!Х) происхождения, в частности, коюрые, если судшь но имеющимся немноючнеленным данным, значшельно отличакнея от таких же ферментов из наемных организмов. Обнаружение новых источников-н роду центов фу кон дана i и алыиназ, изучение специфичности 'ггнх ферментов позволит получи! ь достоверную информацию о связи "структура-биолотческаи активность" полисахаридов бурых водорослей Результаты наших исследовании имеют не юлько теоретический, но н практический интерес, так как мшу i использовался для получения новых эффективных медицинских нрепараюв, источником коюрыч янляося JieiKO возобновляема морское сырье.

Цель и задачи исследования. Целью работ является изучение ферменюв морских бактерии, ка! ал тирующих трансформацию полианионных полисахаридов бурых водорослей - фукончана и алы иконой кислоты.

Для достижения ной цели были поставлены следующие задачи*

I Изучение распространения фукондапаз среди морских протеобактерии - обитателей различных акваюрий Thxoi о океана

2. Выбор продуцентов этих ферментов.

3. Подбор оптимальных условий культивирования продуцентов альгинолитических ферментов.

4. Разработка методов выделения фукоиданаз, альгинат-лиаз из морских бактерий Pseudoalteromonas

citrea.

5. Исследование свойств, специфичности, типа действия "альгинат-лиаз морских бактерий P. citrea.

Положения, выносимые на защиту.

1. Среди морских бактерий-эпифитов бурых водорослей Fucus evanescem и Chorda filum и бактерий-изолятов голотурии Apostichopus japomcus имеются продуценты ферментов, деградирующих фукоиданы бурых водорослей, обладающих различной субстратной специфичностью.

2. фуконоаназы морских протеобактерий Pseudoalleromonas citrea КММ 3296, КММ 3297, КММ 3298 катализируют расщепление фукоиданов из бурых водорослей F. evanescens и L. cichorioides по эндо-типу с образованием сульфатированных фукоолигосахаридов. Фукоиданаза из Pseudoalleromonas citrea КММ 32% катализирует гидролиз а-1—*3-фукозндной связи в фукоиданах.

3. Морская бактерия Я. citrea КММ 3297 - ассоциант голотурии A. japomcusy выращенная на среде, содержащей глюкозу, синтезирует два внутриклеточных альгинолитических фермента Ал1, АлП. Фукоидан из бурой водоросли F. evanescens индуцирует появление еще одного альгинолитического фермента АлШ

4. Все исследуемые альгинолитические ферменты Ал1, АлП, АлШ бактерии P. citrea КММ 3297 являются эндо-альгинат-лиазами смешанной специфичности и деградируют как цолигулуроновую, так и полиманнуроновую кислоты до олигоуронидов. Смесь всех трех ферментов альгинолитического комплекса проявляет синергический эффект при действии на полигулуроновую кислоту.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые получены систематические данные по распространению фукоиданаз среди морских бактерий-эпифитов бурых водорослей и бактерий - изолятов голотурии. Изучен состав гликозилгидролаз двенадцати Штаммов P. citrea, в том числе типового АТСС 29719т, выделенных из разных организмов - обитателей различных акваторий Мирового океана. Возможно, фукоиданазы, наряду с другими гликозилгидролазами, могут служить экофнзиологической характеристикой данного вида бактерий. Исследованы физико-химические свойства фукоиданазы морских бактерий P. citrea Установлена структура фукоолигосахаридов - продуктов ферментативной трансформации фукоидана из F. evanescens под действием фукоиданазы морской бактерии P. citrea КММ 3296. Впервые показано, что бактериальная фукоиданаза катализирует гидролиз а-1—>3-0-гликозидных связей в фукоиданах.

Впервые исследовано влияние фукоидана на биосинтез альгинолитических ферментов бактерией Р. citrea КММ 3297. Показано, что фукоидан из F. evanescens индуцирует появление дополнительной формы альгинат-лиазы. Из морской бактерии P. citrea КММ 3297 выделены три внутриклеточные альгннат-лиазы. исследованы их физико-химические свойства и специфичность. Перспективным является использование этих ферментов в хозяйственной деятельности человека для трансформации полисахаридов морских водорослей Возможно практическое использование этих ферментов для деградации высокомолекулярных фукоиданов и альгиновых кислот с целью получения биологически активных препаратов для медицины и пищевой промышленности

Апробация работы. Результаты работы были доложены на различных конференциях;

1. Международный симпозиум «Химия и химическое образование», Владивосток, 2000

2. 2-nd Geiman-Polish-Russian Meeting on Bacterial Carbohydrates. Moscow, 2002 (устный доклад, стендовое сообщение).

Гранты. Работа была поддержана грантом РФФИ № 00-04-48946.

Публикации. По материалам исследования опубликовано 2 статьи, I статья принята к публикации, тезисов докладов - I.

•f t*

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и 'методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Список литературы. включает 3 публикации. Диссертация изложена на 104 стр. машинописного текста, содержит_20_ таблиц и 3 i рисунок.

Работа выполнена в лаборатории химии ферментов ТИБОХ ДВО РАН.

Благодарность. Выражаю искреннюю благодарность моим научным руководителям д.х.н. Т.Н. Звягинцевой и к.х.н. И.Ю. Бакуниной за неоценимую помощь на всех этапах выполнения и написания данной работы, а также всем сотрудникам лаборатории химии ферментов.

Не в меньшей степени я благодарна сотрудникам ТИБОХ ДВО РАН: к.б н. О.И. Недашковской, д.б.н. В.В. Михайлову, к.х.н. В.В. Исакову, чд.-к. В Е. Васьковскому, академику В А. Стоиику за помощь на отдельных этапах работы.

(.СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объектами исследования служили 25 штаммов морских бактерий ассоциантов бурых водорослей Fucus evanescent и Chorda filum и 53 штамма, изолированных из ixuioiypHH Apostichnpus japonicus. Морские бактерии были собраны во время экспедиций на НИС «Академик Онарин» в Охотском море у островов Курильской гряды Парамушир, Онекотан, Итуруп, а также в заливе Пегра Вели кош на Морской экспериментальной станции (МЭС) ТИЬОХ ДВО РАН. В настоящее время они хранятся в Коллекции морских микроорганизмов (КММ) ТИБОХ ДВО РАН. Для первичного скрининга фу кон дан-деградирующих ферментов штаммы бактерий выращивали на питательной среде следующего состава (г/л): бакго-пептон-5; дрожжевой экстракт-2; фукоидан-1; КтНРО^-ОЛ; MgS04-0,05; морская вода-500 мл, дистиллированная вода-500 мл, рН=7,5-7,8 на термостатированной качалке (160 об/мин) при 28°С в течение 24 ч Для исследования алый политических ферментов морской бактерии P. ah со КММ 3297 культивирование штамма проводили на средах различного состава (i/л): среда А - пентон-5,0, дрожжевой экстракт-2,0; i ид рол и ит казеина-2,0; MgS04-0.05; глюкоза-1,0, морская вода-500 мл, дистиллированная вода-500 мл, рН 7.8; в средах Б и В i люкоза заменена на ксилозу-2,0 и фукоидан-i,0 соо1ветственно.

2. Результат ы и обсуждение 2.1. Распространение О-гликозилгидролаз в морских бактериях

Значительный интерес к 0-1ликозилгидролазам связан с их важной ролью в жизнедеятельности макро- и микроорганизмов. В последнее время возрос интерес к ферментам, способным катализировать де1радацию сульфатироваиных полисахаридов бурых водорослей - фу кои да нов. Известно, чго морские микроорганизмы учаезвунл в )ффекчинной десфуккии полисахаридов клеточных сченок водорослей и являются перспективными объектами для поиска различных биологически аюивныч веществ, в юм числе ферменюв, как с обычной, так и с редко встречающейся специфичное!ью.

Нас интересовали, прежде всею, О-гликожл гидролазы морских бактерий, которые способны катализировать деградацию иол иа и ионных полисахаридов бурых водорослей - фукоидаиов, альгииовых кислот. Известно, что продуценты гликозил гидрол аз наиболее часто встречаются среди бактерий-симбиотрофов, поэтому для поиска ферментов, способных деградировать фукоидаи, нами были выбраны морские бактерии, изолированные из источников, богатых фукоиданами - бурых водорослей Fucus evonescens

и Chorda Jllum парамуширской популяции, а также голотурии Apostichopus japonicus, обитающей в заливе Посьета Японского моря.

Для изучения альгинолитических ферментов были использованы полигулуроновая, н полиманнуроновая кислоты, а для других глнканаз - КМ-целлюлоза, ламинаран, пустулан, амилопектин. Гликозидазы исследовали, используя синтетические субстраты - производные пара-нитрофенола. В качестве субстратов для поиска фукоиданаз в работе использовались фукоиданы трех бурых водорослей: F. evanescens, L. cichorioides. L japomca, значительно различающиеся структурными характеристиками (табл. 1).

Таблица 1.

Структурные характеристики фукоиданов

Водоросль, место сбора Интервал молекулярных масс, кДа Моносахаридный состав, % Тип фукозидной связи Fuc/SO*4, моль/моль ИК (SO'",) шах, см"1

F. evanescens о. Итуруп 60-80 Fue: GlcGal: Man:Xyl:Rha 81 -.3:4:2:2:8 o-l-+3, a-l-+4 1:0,8 820

L. cichorioides бухта Троица Японского моря 20-40 Fue: Glc:Gal: Man:Xyi Rha 90:6: 1Д: 0:2,8 :0 a-l->3 1:1,6 842 820

L. japónica бухта Рифовая Японского моря и.о. Fue: GlcGal: Man:Xyl Rha 42 : 0 : 40 : 9 : 2 :0 H 0. 1:0,9 842

Примечание: н о. — не определено.

2.1.1. Фуконданазы морских бактерий-эпифитов бурых водорослей. Большая часть эпифитов (96%). исследованная нами, представлена грамотрицательными аэробными палочками, что неудивительно, так как основная часть бактерий, обитающих в морской среде, является грамотрицательными палочками (табл. 2). Из 25-ти исследованных бактерий-ассоциантов бурых водорослей, 18 штаммов (72%) катализировали деградацию фукоиданов (табл. 2).

По результатам первичного скрининга все бактерии рода Cytophaga оказались продуцентами фукоиданаз (табл. 2) Из 12 штаммов бактерий этого рода 5 продуцировали фуконданазы, действующие только на полисахарид из /.. japónica Фермент штамма 12F2 рода Cylophaga обладал специфичностью к высокосульфатированному фукоидану из L cichorioides. Еще 2 экстракта штаммов 2F7,12F9 катализировали гидролиз как полисахарида бурой водоросли L. japónica, так и /.. cichorioides. Наиболее широкой специфичностью (способностью деградировать все три субстрата) обладали экстракты бактериальных штаммов 2F9B, 2F13,2F16, 12F8 (табл. 2).

Следующими по количеству продуцентов фукоиданаз были бактерии рода Pseudoalleromonas: 6 из 8 экстрактов штаммов бактерий этого рода (75%) катали гировали гидролиз фукоиданов (табл. 2). Бактериальные штаммы 2F10 и 1F5 обладали широкой специфичностью (гидролизовапи все три субстрата) и более высокой активностью по сравнению со штаммами рода Cytophaga sp. Среди штаммов бактерий родов Vibrio и Micrococcus искомые ферменты обнаружены не были.

Таблица 2.

Активность фукоидан-деградирующих ферментов морских микроорганизмов, выделенных из бурой водоросли Г. 'еуапевсепх

Источник фермента Активность ферментов, ед*/г

Таксономическое положение Штамм Источник фукоидана

F. evane\cens L cichorioides L japamca

Cvtophaga sp 1F2 0 0 3510

Cytophaga sp 2F3 0 0 2980

Cvtophafia sp 2F5 0 0 2190

Cvlophaga sp 2F7 0 4000 4000

Cvfophaga sp 2Н9В 660 4980 1010

Cytophaga sp 2F13 1140 12550 2140

Cvtophaga sp 2F16 600 4120 1520

Cytophaga sp. 12F2 0 6220 0

Cytophiifia sp 12F5 0 0 1768

Cytophaga sp I2F9 0 8590 8590

Flexibaclerl Cvtophaga I2H8 3920 9650 4130

Flexihacler sp 12F6 0 0 6710

Psendtialtewmonas sp. IF5 1490 19650 8940

Pseudoallel omonas sp. 2Н 0 0 0

Pseudoulteromonav sp 2F4 0 0 0

Pseudoalleromonas sp. 2FI0 710 12090 37360

Pseudoalteromonwi sp. 20-92 (КММ 3296) 5290 3640 -

Pseudoalteromonas sp. 20-101/1 (КММ3298)** 2130 2630 -

Pseudoalleromonas sp. I2FI 220 8600 0

PieudiKitleramonas sp. I2F3 370 8680 0

Miuococcus sp I2F4 0 0 0

Vibno sp IF4 0 0 0

Vihi in sp 1F6 0 0 0

ни*** 2F2 0 0 о

ни*** I2F7 0 0 0

Примечание: * - Количество единиц активности фермента, содержащихся в I г сырой биомассы бактерий

(I ед. -1 ианомоль фукозы за 20 ч).

** - Штамм выделен из бурой водоросли С.]Иит.

и к *♦* _ це идентифицировано

2.1.2. Фукоидаиазы морских бактсрий-изолятов голотурии Ароъискори\ уаротсич. В тюй группе микроорганизмов, в отличие о г опифиюв водорослей, доминировали представители родов А ¡¡еготопм/РхеиЛоаИе» отогни (41,5%) (табл. 3). При тестировании фу кои да паз в 53-х бактериальных шгаммах-ассоциангах голотурии А уа/ютсич в качестве субетраюв были использованы фукоиданы двух бурых водорослей - Г. епшсяссп^ и Ь асЬопоккя (табл. 3)

Фукоидана шля активность была обнаружена у 39 исследованных штаммов (74%) Оксгракчы, полученные из 27 бактериальных штаммов, вызывали деградацию как фукоидана и* еите\сеп\, так ни)! асИопопкч. Широкой специфичностью обладали, 1лавным обраюм, чкетракты. полученные ¡и штаммов бактерии родов А1итотопа\/Р\аи1оа11еюпиим\ Продуненими наиболее активных фуконлан-лсфадируюшнх комплексов оклились шыммы М-ЗНВ-2 (КММ 3297), М-ЗНВ-9, М-ЗНВ-14/1, М-ЗНВ-15/З, М-ЗНЫУ2 (таил 3).

Среди блперий-ассоцианюв 1 оло гурии имелись продуценты фу кои дан-да радирующих ферменюв. принадлежащие к родам УФпо% М1спкосси\ч НЫотопа\ и Соп'псЬасипшт (табл 3)

Активность фукоидан-деграЯирукнцих ферментов морских микроорганизмов, выделенных из голотурии Apostichopus japonicus

Источник фермента Активность, ед*/г

Таксономическое положение Штамм Источник фукоидана

F. evanescens L cichorioides

1 2 3 4

Acinelobacter sp. M-3HL-8/1 0 240

Alteromonas/Pseudoalteromonas M-3HB-8/I 1150 230 '

Alteromonas/Pseudoalteromonas М-ЗНВ-8/2 40 1270

Alteromonas/Pseudoalteromonas М-ЗНВ-9 420 2940

Alteromonas/Pseudoalteromonas M-3HB-15/3 1540 5300

Alteromonas/Pseudoalteromonas М-ЗНВ-17/l 330 1260

Alteromonas/Pseudoalteromonas М-ЗНВ-18 1010 3150

Alteromonas/Pseudoalteromonas M-3HL-5/I 0 0

Alteromonas/Pseudoalteromonas M-3HL-6/1 0 0

Alteromonas/Pseudoalteromonas М-ЗНВ-19 0 1530

Alteromonas/Pseudoalteromonas M-3HL-6/2 3180 1060

Alteromonas/Pseudoalteromonas M-3HL-8/4 0 0

Alteromonas/Pseudoalteromonas M-3HL-11 0 0

Alteromonas/Pseudoalteromonas M-3HL-12 0 0

Alteromonas/Pseudoalteromonas M-3HL-14/1 0 0

Alteromonas/Pseudoalteromonas M-3HL-14/2 2420 0

Alteromonas/Pseudoalteromonas M-3HL-14/3 1520 450

A IteromonaslPseudoalteromonas M-3HL-17/2 0 0

Alteromonas/Pseudoalteromonas M-3HL-I8/1 0 2000

Alteromonas/Pseudoalteromonas M-3HL-I8/2 0 0

Alteromonas/Pseudoalteromonas M-3HL-18/3 п 0

AIteromonas/Pseudoalteromonas M-3HL-21/1 220 60

Bacillus sp. M-3HL-I/2 5790 2320

Коринеформы М-ЗНВ-14/2 370 22 SO

Коринеформы М-ЗНВ-25/2 930 2190

Коринеформы М-ЗНВ-27/1 2010 1590

Коринеформы М-ЗНВ-27/2 0 810

Коринеформы M-3HL-5/2 1520 0

Коринеформы M-3HL-16/2 0 0

Cvtophaga sp. М-ЗНВ-28/1 170 120

Cytophaga sp M-3HL-8/2 0 0

Flavohacterium sp. М-ЗНВ-26 0 1040

Halomonas sp M-3HL-I3/2 990 610

Halomonas sp M-3HL-I7/3 330 910

Pseudomonas/Halomonas М-ЗНВ-14/l 1230 4960

Pseudomonas/Halomonas М-ЗНВ-15/2 0 1310

Pseudoalteromonas sp. М-ЗНВ-2 2230 1480

(КММ 3297)

Pseutlomonas sp. M-3HL-7/I 3060 2350

Pseudomonas sp M-3HL-9 1470 680

Micrococcus sp ' М-ЗНВ-11/1 0 900

Micrococcus sp. М-ЗНВ-15/l 720 1980

Micrococcus sp M-3HB-25/I 0 0

Micrococcus sp. M-3HB-25/3 0 1540

Vibrio sp. М-ЗНВ-З 450 1230

Vibrio sp. М-ЗНВ-11/2 970 1700

Vibrio sp. M-3HL-4/1 0 0

Vibrio sp M-3HL-6/3 0 120

Н.И.*" М-ЗНВ-15/4 660 950

ни*** М-ЗНВ-16/l 0 337

Окончание табл 3

1 2 3 4

н и.*** М-ЗНВ-16/2 440 630

н и.*" M-3HL-2 3360 3950

ни"* M-3HL-7/2 3350 340

н и **• M-3HL-7/3 0 0

Примечание: "^Количество единиц активности фермента, содержащихся в 1 г сырой биомассы бактерий (I ед. - I наномоль фукозы за 20 ч). н.и.*** - не идентифицировано.

Специфичность по отношению к фукоидану из L. cichonoiik's проявили 10 жефактов штаммов бактерий (M-3HL-8/I, М-ЗНВ-19, M-3HL-18/1, М-ЗНВ-27/2, М-ЗНВ-26, M-3HB-I5/2. M-3HB-1I/I, М-ЗНВ-25/3, M-3HL-6/3, М-ЗНВ-16/1) и только 2 экстракта штаммов M-3HL-5/2 и Alteromonu\/Pseittfaa}leromonas М-3HL-14/2 катализировали расщепление полисахарида из F. evanescens (габл. 3).

Различное отношение фукоиданаз к фукоиданам из разных источников, наиболее вероятно, объясняется различиями в структурах используемых нами фукоиданов (табл I). Тот факт, что большое число штаммов гидролизуют фукоидан бурой водоросли L. japónica, можно объяснить наличием в его составе, кроме остатков Fue (42%) еще и остатков Gal (40%), поэтому в гидролизе -этого полисахарида могут участвовать галактаназы бактериальных экстрактов.

Интересно отметить, что основная часть штаммов содержит фукоиданазы, специфичные к высокосульфатированному 1—»З-а-Ь-фукану - фукоидану из L скИопонк"*. За редким исключением их активность по отношению к угому фукоидану выше, чем к смешанному I—>3; 1->4~а<Ы{>укану из К evanescem.

Анализ полученных данных показал, чю все обнаруженные нами источники фермсн1агинных комплексов, деградирующих фукоидаиы, имели невысокую активность по отношению к используемым субстратам. Однако эти величины активностей сопоставимы с активностями уже известных из литературы объектов, предлагаемых как продуценты этих ферментов. Лучшими продуцентами фукоиданаз зарекомендовали себя бактерии родов AUeromonas/Pseudoalteromonas как среди эпифитов водорослей, так и среди ассоциантов голотурии. Источники, которые могли бы стать суперпродуцснтами фукоиданаз, подобно известным продуцентам ламннариназ, амилаз, целлюлаз и других гликозилгидролаз, пока не найдены.

Таким образом, из 78 исследованных бактериальных игп»""ое 57 (73%) имели о составе ферментных систем фукоиданазы (табл. 4).

Такое высокое количество бактерий, имеющих фукоидан-деградирующие комплексы ферментов, говорит о важности этих ферментов для эжх энифжных бактерий. Фукоидан-дефадирующие фермешы могут быть одним из звеньев механизма адаптации морских микроорганизмов, колонизирующих как водоросли, так и животных, к среде обитания. Эти бактерии могут использовать фукоидапы в качестве одного из источников у!лерода и энер!ии Широкое распространение фукоиданаз среди морских микроорганизмов и низкий уровень их активности по сравнению с другими гликозилгидролазами, возможно, обусловлены особой ролью в живых организмах фукоиданов и преобразующих их ферментов.

Родовой состав микроорганизмов, исследованных на присутствие фукоидан-деградирующих комплексов ферментов

Количество исследованных штаммов

Таксон А. ¡аротст F. evanescens Суммарное

Общее Активные Общее Активные Общее Активные

Acinetobocter 1 I - - 1 1

Alteromona^/Pseudoiiheromonas 22 13 8 6 31 19

Bacillus 1 1 - - 1 1

Коринсформы 6 5 - - 6 5

Cvlophaga/Flexihacter 2 1 12 12 14 13

Flavobacterntm 1 1 . - 1 1

Mtcmcoccus 4 3 1 0 5 3

Pseiulomonas/fíalomonas 6 6 - - 6 6

Vibrio 4 3 2 0 6 3

Неидентифицированные 6 5 2 0 8 5

Всего 53 39 25 18 78 57

2.1.3. Гликозил! идролазы морских бактерий Р. vitrea

Выше было отмечено, что фукоиданы из L cichoríoides и F cvancscens, помимо фу козы, содержат минорные моносахариды: маннозу, галактозу, ксилозу, глюкоiy (табл I) Поэтому сушествует вероятность деградации таких полисахаридов иод действием не только фукоиданаз, но и других гликозшп идролаз

Hs большою числа бактерий КММ ТИБОХ ДВО РАН, протестированных на способность дефадирова<ь фукоидан, в качестве нродуцснюв были отобраны три штамма морских баюсрий Pseudoalferomonas airea, выделенные с поверхности талломов бурых водорослей F еváneseens (КММ 3296) и C.Jilum (КММ 3298), а также из целомической жидкости голо гурии A. japomcm (КММ 3297) Известно, чго в состав клеточной стенки бурых водорослей и кугикулы шло гурии входи г фукоидан

Любопытно было выяснить, содержатся ли фукоиданазы в штаммах этою же вида бактерий, населяющих другие местообитания, где фукоиданы отсутствуют и как состав Огликознш идролаз зависит от условий обитания? Для ответа на нею были изучены бактерии Pseudoaiteromona<¡ ciltea, включая типовой штамм и 8 штаммов из КММ (не считая трех, отобранных ранее)

В таблице 5 суммированы результаты исследования состава гликаназ и ишкозидаз 12 штаммов Р сШеа Анализ данных о присутствии ферментов, катализирующих гидролиз высоконолимерных субстратов, показал, чю все бактерии, независимо oí мест обитания, эффективно гидролизовали ламннаран Известно, что ламинариназм (1-»3-р-[)-1ЛК)каназм) присутствуют во mhoihx морских макро- и микроореани )мах Менее эффективно экстракты бактерий iидролизовали алынновую кисло!у, растворимую агарозу, КМ-целлюлогу (табл 5) Штаммы Р. titiea похожи по iликаназному составу, но дефадировать фукоиданы бурых водорослей Moiyr ферменты только трех и* них - КММ 3296, КММ 3297, КММ 3298, которые были выбраны нами для выделения и изучения свойств фукоиданаз Эти бактерии изолированы из источников, ботых фукоиданами, в отличие от остальных девя!и, в местообитаниях которых эти полисахариды отсутствуют. Полученные нами данные о i л и коз нд азах исследуемых штаммов, ферментах, которые обычно кагал тируют расщепление небольших молекул — олигосахаридов или гликозидов, но участие которых в деполимеризации фукоиданов нельзя исключить, показали, что бактерии могут быть ра шелены на две подфуппы

Активность гликознлгидролаз штаммов морской бактерии Pseadoaiteromonas citrea

С ре та обитания Срелтеч ное море, Франция Курильские острова. Скотское море, Россия Залив Петра Ветикого, Японское море, Россия Командорские острова. Берингово море, Россия

Источник Морская вола Бурые водоросли Голотурии Моллюски Асцидни Губка

F ei (mescens С fihtm A japoniCHS С. gi £71 amis Р .1 essoensis 4 traiisluadum Н аш annum Plocamia sp.

—Штамм С> Gcip.iT ' АТСС 297191 КММ 3296 КММ 3298 КММ 3297 КММ 188 КММ 157 КММ 280 КММ 327 КММ 256 КММ 216 КММ 250 КММ 504

кол 'UM in F tumcui'm 0 1920 960 350 0 0 0 0 0 0 0 0

*Ф)копдан in L cuhouuiclev 0 1300 980 470 0 0 0 0 0 0 0 0

*A 1ыинрвая кислота 1370 1720 190 1700 1190 680 500 980 0 3320 0 0

*А\ппош 350 3690 3210 3340 400 1230 910 1640 470 6270 0 0

•Ламинараи 5650 32190 5780 6780 2520 2140 1750 4220 4140 9170 1820 3370

•rivciy lau 1680 670 610 0 560 0 0 0 80 3950 0 0

"Растворимая arapuia 770 950 2120 1700 210 970 810 580 290 3490 3700 10

•КМ-ие.пю.юэа 1690 1890 2350 1420 230 1880 520 1050 50 2620 0 0

••/l-Np-a-D-Gal 0 1570 1750 2020 35100 0 0 0 8270 3800 4130 20000

•V-Np-ß-D-GIc 4 130 10 100 300 660 0 40 1200 1250 1560 150

••/i-Np-p-D-Gal 0 90 50 390 300 8 0 0 120 300 300 230 ■

*>Np-N-Ac-G!c 44000 0 0 2 130 2206 8650 2070 80 4 80 50

**/i-Np-u-D-Man 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

•*/)-Np-|i-D-X)l 0 0 2 0 3 0 0 0 0 0 0 0

**/)-Np-u-L-Flic 0 0 0 0 0 50 3 0 0 0 0 0

* */j-Np сутьфат 0 0 0 0 0 90 1450 340 0 0 0 0

* (образование I наномозя соответствующего моносахарида за 1 час/ чг белка) ** (образование I наномоля пара-нптрофенола за I мин / \и белка)

Отличительной чертой микроорганизмов одной подгруппы был синтез высокоактивной p-N-ацетилглюкозаминидазы. В нее вошли четыре штамма: АТСС 29719Т (выделен из обрата воды Средиземного моря), три штамма, выделенные из гребешка Pat inopecten yes wens н (KMM 157, КММ 280, KM M 327) (табл. 5) Микроорганизмы другой подфупиы способны к синтезу высокоактивной а-1алактозидазы: два штаммаопифига бурых водорослей F. evanescent и С. filum (КММ 3296 и КММ 3298, соответственно), один из голотурии A. japonice (КММ 3297), один из мидии Crenomytihi gravamts (КММ 188), фи из асцидий Halocyrtthia aurantium и Атагоисшт transiucuhim (КММ 216, КММ 250, КММ 256) и один из губки Píocamia sp (КММ 504) Большинство штаммов не содержало a-L-фукозидаз, a-N-aueTHJi-D-галактозаминидаз. a-D-маннозидаз, (VD-кснлозидаз.

Мощные агаролитики (КММ 216, КММ 250, КММ 256, КММ 504, КММ 3297, КММ 3296, КММ 3298) синтезировали а- и (i-D-галактозидазы. Интересно отметить, что экстракты штаммов (КММ 3296, КММ 3297, КММ 3298), которые гидролизовалн фукоидан, не имели в своем составе a-L-фукозидазы. Этот факт скорее составляет исключение из правила, согласно которому чаще всего в полисахарид-гидролазные ферментные системы организмов включены, наряду с шиканазами, и родственные им микозидйзм. Вероятно, дальнейшую деполимеризацию фукоидана выполняют другие микроорганизмы (синтезирующие фукозидазы. сульфатазы и др ) того микробного сообщества, откуда выделены тги штаммы. Способность синтезировать сульфатазу была отмечена только у бактерий, выделенных из P. yewoensis: КММ 157, КММ 280, КММ 327.

Известно, что иггаммы P. citrea, обитающие в Японском море, но своим эпигенетическим (фенотиническим) признакам очень разнообразны. Полученные результаты также позволяют предположить, что синтез О-гликозилгидролаз (фукоиданаз, p-N-ацетилглюкозаминидаз или a-галактозидаз) является внутривидовым отличительным признаком штаммов P. citrea, который зависит от происхождения штамма, т.е. от проявления (не существенных с точки зрения молекулярной таксономии) геномных особенностей н месте обитания штамма, и обусловлен его физиологической ролью в определенном сообществе организмов и давлением окружающей среды (экофизиологией штамма).

Косвенным подтверждением этому предположению могут служить сведения о том, чю, например, способность i идролизовать фукоидан связана в большей мере не с таксономическим положением штамма, а е иными причинами, и осуществляют ею гидролиз не только различные протеобактерии: Р. altea, Vibtio sp , но 1акжс и микроорганизмы Cyiophaga-Bacteroiiics-Flavohacteruini-Flexibiieter (Cyt<>phagci sp., Flavobac tenum sp.) - другого типа домена Bacteria

2.2. Особенности деградации фукоидана морскими бактериями Р, citrea

IIIluMMbi КММ 3296, КММ 3297 и КММ 3298 были выбраны для сравншедьною изучения физико-химических характеристик и специфичности их фукоидан-де« радирующих ферментов Фукоиданазы трудно поддаются очистке и их содержание невелико, кроме того, в процессе выделения они теряют активность Поп ому сравнительные исследования были проведены на ферменшых препаратах, очищенных от низкомолекулярных примесей с помощью гель-фильтрации.

2,2.1. Физико-химические свойства фукоиданаз. Препараты фукоиданаз из трех ииаммон морских бактерий /коалировали фукоидан в довольно широком диапазоне рН (рис 1 Л), что может свидетельствовать о наличии в источнике нескольких молекулярных форм фукоидан-деградирующих ферментов, имеющих различные рН-отимумы действия.

Фукоидана 1ы штаммов КММ 3296, КММ 3297, КММ 3298 оказались максимально >ффск-|ивны но действию на фукоидан при рН 6.5-7,0, чю характерно ;шя полисахарид-! идролл большинства бакюрип

100

У 80

¡3 60

1 40 Й

< 20

- - КММ 3296 КММ 3297 КММ 3298

20 30 40 50 60 70 80 Температура. С

Рис. I. Ошимум рН (А) и юмнерагурная стабильность (Б) фукоиданаз Р сигеа

Исследование термосгабильпостн показало, что активность фукоиданазы и» шгамма КММ 3298 начинает снижаться при температурах выше 40"С, ннда как активность двух друшх шгаммов (КММ 3296, КММ 3297) сохраняется при температурах выше 50"С (рис. I Ь).

2.2.2. Специфичность фукоиданаз. Специфичность действия фукоиданаз изучаемых шгаммов была исследована при использовании фукоиданов двух бурых водорослей - I. асИ<ток1с\ (янономорская популяция) и /•* е\'апе\сет (курильская популяция), различающихся структурными характеристиками (табл I). Фукоидан ¿. асИопои/е(1->3-а-Ь-фукан) имеет стснень сульфагирования в 2 раза более высокую, чем фукоидан из Р. егалечет, а молекулярную массу значительно меньшую (20-40 кДа) в сравнении с 60-80 кДа у фукоидана из фукуса (1—»3; I—И-а-Ь-фукана) В фу ко план с и? /,. ск1юпонк'\ч практически полностью сульфатированном, сульфа«ы расположены при С2 и С4, 101 да как в фукоидане из Г. тмслсс'т сульфатные группы расположены, главным образом, в положении 2

Фукоиданазы бактериальных пиаммон КММ 3297 и КММ 3298 несколько эффективнее деградировали фукоидан из сиИопоикл, то!да как ферменты штамма КММ 3296 - фукоидан иг К е\апс\сет (табл. 5) На рис. 2 представлены ре вульгаты I ель-фильтрации продуктов фермента тивною зидролиза фукоидана из А с1с1юиои1е\, полученных при действии форменшых нренараюн штаммон КММ 3296, КММ 3297. КММ 3298. Фукоидан из скИппоик'к более шубоко рафушался под действием ферментов штаммов КММ 3296 (инюркал молекулярных масс ирочуктон 2,0-3,5 кДа) и КММ 3298 (интервал молекулярных масс продуктов щцролиза 1.0-3,5 кДа) (рис. 2) Под действием фермой тв штамма КММ 3297 образовывались продукты, молекулярная масса которых составила 1,5-3.5 кДа (рис. 2 В)

Продукты реакции были разделены на Тоуореаг! 40-НЧ' на высоко-, средне- и низкомолекулярные фракции Анализ низкомолекулярных фракций показал, что ни один из исследуемых фукопдан-де1 радирую тих ферментных комплексов бактерий не 1 ид рол и зован фукоидан до появления заметною количества моно- и днеахарпдон Все озносительно высокомолекулярные продукты фсрмстагпвною щдролиза фукоидана состояли практически из фукозы (98 %) В 'Н-ЯМР-спекзрах продуктов со сред немолекулярной массой 1,0-2,0 кДа, полученных под действием фермой юн штамма КММ 3298. наблюдались сш налы нри 6-5,42.4,36.4,51 и 1,33 м д, которые характерны для фукозы. сульфатнрованной но С2 н С4.

Ajgo

4,5 4

3,5 3 2,5 2 1,5 1

0,5 0

А441 2

1,5 1

0,5 О

5 10 15 20 25 30 35 40 Объем, мл

А4У(|

А4ЧО

5 10 15 20 25 30 35 40 Объем,мл

5 10 15 20 25 30 35 40 Объем, мл

Рис. 2. Гель-фильтрация на Toyopearl 40-HW (100x1 см, 12 мл/мин) фукоидапа из L cichtmoides (А) и продуктов его гидролим, полученных под действием фу ко ила и ¿ti штаммов КММ 3296 (Б), КММ 3297 (В), КММ 3298 (Г)

Таким образом, при действии на фукоидан из /, mct&rimdes ферментным препаратом штамма КММ

я'

3298 были получены высокосульфатированные фукоолигосахариды.

По-видимому, ферментные препараты исследуемых бактериальных штаммов КММ 3296, КММ 3297, КММ 3298 содержат фукоиданазы зндо-типа действия, катализирующие гидролиз О-ишкозидных связей полисахарида с образованием довольно крупных фрагментов Ферменты жзо-типа в и)учаемых штаммах, вероятно, отсутствуют, 1ак как основной продукт их действия - фукоза, не обнаружен. Сульфатазная активность в ферментативных препаратах исследуемых штаммов также не обнаружена, что согласуется с обраюванием в качестве продукюв ферментативного гидролиза фукоидана высокосульфатнрованных фукоолш осахаридов.

2.23. Особенности дефядацин фукоидана из F. evanescens под деипвием фукоиданазы из морской бактерии Р. cilrea КММ 3296. Ранее проведенное исследование показало, что фукииданла морской бактерии Р curca КММ 3296 несколько лучше каталимрует расщепление фукоидана И1 F i'vanesiem. чем фукоидана hi L uchaimides (табл 5) Для выделения и исследования фишко-хичических свойств и специфичности фукоиданазы из Р. curca КММ 3296 биомассу бактерии наращивали на стандартной среде Ишимицу-Кимура. содержащей глюкозу (li/л). Нпкстракта по схеме, представленной на рис. 3. выделили две формы фукоиданазы - F.I и Е2. Для дальнейших исследований использовали более активный ферментный препарат Ь2, который не содержал а-галактошда^ы, целлюлагы и альгшшы.

Молекулярная масса фсрмсн<а Е2 по результатам гсль-филырации составила 80 кДа

Продукты фермен ra жвного ждролиза. полученные в результат действия на фу кои дан и» Р. evanescent фукоиданазы Е2 из Р. <iiiее КММ 32%. разделили ионообменной хромаю»рафией на две фракции (Ps-I. Ps-2) (рис. 4)

Сефароза CL-6B

1,1*ед/м1 белка

Ь2

73* ед/мз белка

НЮ 200 100 400 500 600 700 К00 (Хпсм. мл

Рис 3 Схема выделения фукоиданаз морской бактерии Р. a/ica КММ 3296 Примечание:* - образование 1 мкмоля продукта в час / мг белка

Рис 4. Разделение на ДЭА'Э-целлюлозс продуктов деградации фукоидана из h\ evanenens (Рь-1, Ps-2). полученных при действии фермента Ь2 из морской бактерии Р. uncu КММ 32%

По данным жидкостной хромагогрлфии па бжнеле Р-2 (фракция Рч-1 представляла собой смесь дн-. три-, тстра- и пенгафукоолжосахаридов (рис. 5 А, 2), а фракция Рь-2 при* разделении на биоюле Р-2 выходила со свободным объемом (рис 5 А. 3). поэтому для определения ее молекулярной массы был применен ЯиреЫех 75-НИ (рис. 5 1>) Поданным т-ель-филырации фракция Рв-2 имела молекулярную массу существенно меньшую, но сравнению с исходным фукоиданом (рис 5 Б)

фу кои да н ! А

I¡ фукой А 440

{1 * 1 x -

s' 1 h -

» , 1.4 •

j х 1.2 •

Ps-I 2 0 к •

«16 •

114

> 0 2

2 3 4 5 Время, час

Объем, мл

Рис 5. Разделение продуктов дсфадацин фуконцана из Г. скиюн'/л, полученных ноч действием фермента Н2 морской баккрии Р atica КММ 3296 А - на отделе Р-2 (жи ikocihoh хромацираф "Jcol", Япония) \ стандарт фукондан и фукой

2 - фракция Ps-I

3 - фракция Ps-2

Б на Superdex 75-HR 10/30 ("Acia". FPLC). фракция Ps-2

Исследование моносачаридною состава продуктов Ps-l и Ps-2 показало, чю они состоят, в основном, из фукозы (габл 6).

Таблица 6.

Характеристика продуктов гидролиза фукокдана из Р. еуапезсею под действием фукоиданазы морской бактерии Р. сПгеа КММ 3296

Продукты Выход, % Мг.кДа или п* Моносахаридный состав, % Молярное отношение Fuc:SO_,4

Fue GalrXyl: RhaGIcMan

Фукоидан 100 40 95:2,0:2,8.0.0:0,2 1:0,70

Ps-I 70 5> п >2 96:4:0.0:0 0 1-031

Ps-2 20 2-3 97,2.0,4.2,1-0,3.0.0 1:0,53

п* - степень полимеризации

Фракция Ps-I, выход которой примерно составил 70% от суммы всех продуктов, была изучена более детально (табл. 6) С целью установить тип связи, гидролизуемой ферментом, было проведено десульфатирование и последующее метилирование исходного фукоидана и продукте его ферментативной деградации ~ фракции Рь-1.

Фукоидан из бурой водоросли F. evanescens состоял из фу коты (95%), ксилозы (2,8%), маннозы (0,2%), галактозы (2%), молярное соотношение Fue S034 - I 0,70 (табл. 6) По результатам метилирования десульфатированной фракции этого фукоидаиа процентное соотношение ацетатов 2,3,4-три-0-метил-:2,3-ди-О-метил-: 2,4-ди-0-метил>:2-0-мстил-: 3/4-0-метил фу цитов составило 23:11:39:9:18. Таким образом, количество I—>3-связей в нем, но сравнению с 1->4-связями, в 3,5 раза больше (11:39) (табл. 7)

Таблица 7.

Результаты метилирования фукоидана из Fucus evanescens и продуктов era ферментативной деградации

Фракция Ps-I состояла из фукозы (96%), галактозы (5%), молярное соотношение Fuc.S042' - 1.0,31, что соответствует сульфатированию одною из трех остатков фу кош (табл. 6) Сольволитическое десульфатирование фракции Ps-I с последующим метилированием показало, что соотношение ацетатов 2,3.4-три-О-мегил- : 2, З-ди-О-метил- : 2, 4-ди-О-метил- : 2-О-метил- : З/4-О-метилфуцига изменилось (11:50 26.13 0) по сравнению с исходным фукоидапом. В продуктах (Ps-I) количество I—>4-связанной фукозы преобладает над 1-»3-связанной, более чем в 2 раза (табл. 7)

Из этого можно сделать вывод, что фукоиданаза морской бактерии P. cilrea КММ 3296 катализирует расщепление в фукоидане доступных а-1-»3-0-гликозидных связей между остатками фукозы Это согласуется с фактом гидролиза высокосульфатированного 1~»3-а-Ь.-фукана из L. achnrionh's под действием ферментов морской бактерии Р. airea КММ 3296 (табл. 5). По всей видимости, исследуемая фукоидана«» является а-1~»3-фуканазой.

Положение О-метильных групп Содержание, %

Fucus evanescens Ps-I

2,3,4 23 II

2,3 11 50

2,4 39 26

3/4 18 0

2 9 13

2J. Внутриклеточные альгиполитические ферменты морской бактерии Р. vitrea КММ 3297 2.3.1. Влияние компонентов питательной среды на синтез ал ьги политических ферментов. В

процессе исследования состава О-гликозилгидролаз нами было обнаружено, что морская бактерия Pseudoallenmotias cifren КММ 3297. выделенная из целомической жидкое! н i од о i урин А /пропит-. синтезирует ферменты, способные дефадировать полнаинопмые полисахариды бурых водорослей -фу кои дан и альгиновую кислоту (табл. 5) Полому наряду с исследованиями фукопдлпаз были изучены и алминолишческие фермой ш бактерии Р tin си КММ 3297.

Известно, что альгиновая кислота в концентрации не менее 1 i/л среды является хорошим индуктором алы инаыжаз у морских бактерий. Фукоидан как индуктор алыинамжаз ранее не был изучен. Для выяснения факторов, влияющих па биосинтез альгинолитических ферментов морской бактерии Р. airea КММ 3297. была изучена динамика роста бактерии и у\илнзапия ею компонентов питательной сречы различною состава. В качестве индукторов были исследованы (люкоза среда Л. ксилоза среда 1> и фукоидан, содержащий й 13% полиманнуроковой кислоты - среда В.

Состав мигательной среды и змепялся в течении роста бактериальной культуры. На среде, содержащей ипокозу, стационарная фаза достигалась через 18 часов, ко]да i люкоза и другие компоненты питательной среды были почт полностью израсходованы (рис. 6 Л) В присутствии фукоидана наблюдался иженсиннын рост бактерии (рис. 6 В), но стадия лизиса клеток начиналась через 40 часов. Ксилоза, напротив, ишибировала развитие культуры (рис. 6 Б) Пептон расходовался в (ечснис первых 3-х часов се роста Стационарная фаза практически отсутствовала Культура быстро тиибала. В двух последних случаях наблюдалось видимое отсутствие расхода Сахаров и пептона - компонентов питательной среды Вероятно, бактерия не только расходует, но и сингезируст внеклеточные полисахариды и белки, важные для се жизнедеятельное!и в этих условиях.

Внутриклс!очные алыинолижческие ферменгы P\eudaaheramnnas altea КММ 3297 синтезировались на разных фазах роста бактерии Максимальная активность ферментов наблюдалась как в середине экспоненциально« фазы роста бактерии, так и на стационарной (24-26 и 37 час) и несколько снижалась на поздних стадиях, koi да намечалась i-сндснция к лизису бактерии (рис. 7).

Уровень «шыижтдтической активности зависел от природы источника узяероди 'Эффективным индукюром для этих ферментов оказался фукоидан (рис. 9, кривая I) Мнюрнал ошимальных кон цен фаций фукоидана для биосижсза алминолшичсскнх ферменюв составлял oí 1 до 4 i/л (рис. 9)

Почти в два раза синтез алы ииолитических ферменюв снижался в присутствии ипокозы (рис 7. кривая 2). Ксилоза же являлась нсблаюнрияжым фактором но только для еннюза алминаз. но и роста самой бактерии (рис 7, кривая 3 и рис. 6 Ь, I соответственно)

2.3.2. Выделение, очистка и разделение алы иноли ¡ических ферменюв. Состав алы иноли(ическнх ферменюв в экстрактах бакюрии Р. altea КММ 3297, выращенной в присутствии фукоидана и глюкозы, был проанализирован с помощью высоко)ффектнвпон анионообменнон хромаип рафии на колонке Source I5Q PR Оказалось, то в нрнсуичвни шюкозы Р anea КММ 3297 синтезировала две формы алы ииолитических ферментов* основную - AjiI и минорную - АлП (рис. 9 А)

При кульшвнронанин бактерии н присутствии фукоидана появлялась еще одна изоформа фермент -Ал111 (рис. 9 Ь)

Аию

О 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Время роста, час

О 5 10 15 20 26 30 35 40 45 50 55 60 Время роста, час

фукондан 1 •

• I

I»» • ■ ■ '

1.5 1

0,5 0

О 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Время роста, час

Рис. 6. Динамика роста бактерии (I) Р. сигеа КММ 3297 на нига]ельной среде, содержащей глюкозу (А), ксилозу (Б), фукоидан (В), к расход пептона (2). общею сахара (3), восстанавливающих Сахаров (4)

Рис 7. Изменение алыинолшической активности в течение рос га морской бактерии P. arwa КММ 3297 на средах, содержащих I I /л фукоидана ( 1 ), 1 i /л |лкжош (2). 2 г/л ксилозы (3)

Время роста, час

в? 160 j

л 140

н 120

н 100

0Е 80

X й 60

5 40

/ /

12 3 4

Концентрация индуктора, г/л

Рис 8 Влияние концентрации фукоидана на алы «политическую активность через 24 часа (I) и 37 часов (2) роста бактерии Р alien КММ 3297. За 100% принимали активность жстракт-а бактерии, выращенной в отсутствии yi леводов

А 7 so

Объем, мп

U я Z

Рис. 9 Хрома I ография ( Acta , FPLC. колонка Source I5Q РЕ) алыинолижческнх ферментов Ал1. Ал11, АлШ. содержащихся в 0.2 экстрактах морской бактерии Р utieu КММ qj 3297. выращенной в нрнсунпвии итжочы (А) 0 и фукоидана (Б) * - указана концсшрация NaCI. при которой происходит максимальная >люция ферментов.

2.3.3. Физико-химические свойства алыииолигических ферменюв морской бактерии Р. сИгеа КММ 3297. Алыинолшические фермен!ы имели характерные для бактериальных ферменюв рН-отимумы действия в районе 7,0-8,0 и сохраняли 100% активности до 35-45"С при рН 7,2 (рис 11) Молекулярные массы ферментов Ал1. Ал11, АлШ составляли 25 йДа. 79 кДа. 61 кДа инмветствеипо (рис. 12)

Для выделения и исследования физико-химических свойств н специфичности ии\ ферменюв биомассу бактерии наращивали в ирису]ст вин фукоидана Все 1ри формы алы иназ были выделены имласно схеме, представленной на рис. 10

Экстракция

Сульфатное осаждение

30%-70%

•

ДЭАЭ-сефароза СЬ-6В

70%-90%

Рис. 10. Схема выделения и очистки альгинолитических ферментов морской бактерии Р и(геа КММ 3297. Примечание: * - образование 1 мкмоля продукта в час / мг белка.

Ал1

0 10 20304050 60 70 60 Температура. С

100 * «о

1 2 О -»м

Ё 20

< 0

Ал11 /

0123456789 РН

100

ял

К 60

а 40

& < 20

0 1 2 3 4 5 6 7 РН

100

X ш 40

1 < 20

АлШ

012345678 РН

АлШ.

Рис. 11. Температурная стабильность (А) и оптимум рН альгинолитических ферментов Ал1, АлП,

Лл|

Рис. 12. Определение молекулярной массы ферментов на Superdex 75-HR (30x1.0 см) ("Acia", FPLC).

1-6СА

2-ан гидрата

3-миоглобин

4-цитохром С

5-анротинин

8 10 12 Объем, мл

14 16 18 20

23.4. Влияние ионов н двухвалентных металлов на активность альгинат-лиаз. На рис. 13 представлены результаты исследования влияния катионов Ыа\ Са3*. Мп:' па активность альгинат-лиаз Ал!, Ал11 и АлШ но отношению к иолигулуроновой кислоте как субстра гу.

Добавление N801 (0,2 М) практически вдвое, по сравнению со стандартными условиями, увеличивало активность всех исследуемых ферментов. Вероятно, тги ферменты нуждаются в высокой ионной силе среды, как и большинство альгинат-лиаз морских бактерий.

Соли М^Ь и М§504(0,0| М) более, чем в два раза увеличивали активность всех исследуемых нами ферментов (рис. 13) Ни ЭДТА, ни ионы Са3+ практически не влияли на активность альгиназ Ал1. а ионы Мп2+ интибировали активность ферментов Ал! и АлШ (рнс. 13).

Контроль эдта NaCI MgCI2 MgS04CaCls Ионы металлов

MnCI, NaCI+ NaCI+ MgSO, MgCI2

Рис 13. Влияние ионов металлов на активность альгинат-лиаз морской

бактерии Р. cilrea КММ 3297.

2.4. Субстратная специфичность альгиполитических ферментов морской бактерии Р. citrea

2.4.1. Структурные характеристики субстратов. Для сравнительного изучения -жзиматических свойств и субстратной специфичности альгинолитических ферментов Ал!. АлИ и АлШ в качестве субстратов были использованы две алыиновые кислоты - коммерческая и выделенная нами из бурой водоросли F. evanescem, а также фукоидан, выделенный из зтой же водоросли. Выводы о структуре субстратов были сделаны на основе пС-ЯМР-сиектров полисахаридов (габл К).

Таблица 8.

Химические сдвиги атомов углерода в 13С-ЯМР-спектрах альгиновых кислот и продуктов их деградации

Субстрат Химические сдвиги, м д.

^ Продукты С1 С2 СЗ С4 С5 С6

(МапА)п 101,4 71,3 72,7 79,3 77,3 176,6

(МапА)пН-Ал! 101,2 68,1 64,7 109,2 146,6

(МапА)п+Ал11 102,0 69,5 64,5 108,7 146,0

(МапА)п+АлШ 101,0 68,1 64,4 109,1 146,0

■

(GulA)n 102,0 66,2 70,25 81,3 77,1 176,6

(GuIA)n+Ajil 101,6 68,0 63,7 109,0 145,9

(GulA)n-MuiII 101,6 68,3 63,7 109,0 145,9

(GulA)n+AflIII 101,6 68,1 63,7 109,0 145,9

Таким образом, коммерческая альгиновая кислота представляет собой полисахарид, состоящий преимущественно и i остатков гулуроновой кислоты, соединенных а-1 —И-О-гликозидной связью, с включением в основную цепь небольшого количества остатков маннуроновой кислоты. Ее молекулярная масса по результатам гель-фильтрации - 8-10 кДа. Выделенная из бурой водоросли F. evanescens альгиновая кислота построена, в основном, из остатков маннуроновой кислоты, соединенных между собой Р-1—И-О-гликозидными связями. Эта альгиновая кислота является, по данным гель-фильтрации на Superdcx 75-HR, полидисперспой (5-70 кДа).

2.4.2. Действие альгинолитических ферментов на альгиновые кислоты и фукоидан. В УФ-

спектрах олигоуронидов, полученных гидролизом пол и гулуроновой и полиманнуроновой кислот, под действием исследуемых ферментов, наблюдалась полоса но: лощения при 235 нм.

В ,3С-ЯМР-спектрах этих же продуктов имелись сигналы при 6=145,9 и 109,0 м.д , характерные дня двойной связи при С4 и С5 4-дезокси-Ь-эритро-гекс-4-енопиранозилуроновой кислоты, расположенной на невосстанавливающсм конце олигомеров гулуроновой или маннуроновой кислот, образующейся в результаге реакции ^-элиминирования, катализируемой альгинолитическими ферментами (табл. 8). Эти данные являются прямым доказательством того, что ферменты Ал1, Ал II, АлIII - апьгинат-лиазы

Продуктами реакции, полученными при действии альгинат-лиазы Ал1 на полигулуронат и полиманиуронат, были олигоурониды со степенью полимеризации п >3 (рис. 14 А, Д), альгинат-лиазы Ал11 и АлШ катализировали распад альгиновых кислот до более крупных фрагментов (рис. 14 Б, Е и В, Ж, соответственно); продуктами совместного действия этих ферментов также оказались нижомолекулярные олигосахариды со степенью полимеризации 5> л >3 (рис. 14 Г) Моно- и дисахариды обнаружены не были

Таким образом, набор продуктов гидролиза поли-М и поли-Г, полученный под действием исследуемых альгинат-лиаз. характеризует их как ферменты эндо-тииа действия, которые атакуют внутренние О-гликозидные связи полисахарида В случае фермента экзо-типа действия мы наблюдали бы накопление, в основном, одного продукта (моно, ди-. или тримера)

¡1

ч <

* 5

№

, V I

2 3 4 5

Время, час

I;»

2 3

Рис. 14 Хромагофафия на биогеле Р-2 продут он. полученных при действии на полшулуроновую (А. Б, В) и нолиманнуроновую кисло гы (Д. Е. Ж) альгинолитических ферментов Ал1 (А. Д). АлИ (Б. Е). АлШ (В, Ж) из Р. а/п'а КММ 3297 и их совместном действии (Г). Стандарты: иолиманнуроновая кислота (31) и глюку ромовая кислота (3 П)

Время, час

Нами было исследовано действие апьгинат-лиаз из Р. сНгеа КММ 3297 на образец фукоидана из бурой водоросли еуапеясепз. Этот образец фукоидана был очищен от сопутствующей полиманнуроновой кислоты на ДЭАЭ-целлюлозе.

Оказалось, что только препарат альгинат-лиазы Ал11 катализирует гидролиз фукоцдана (рис. 15 Б). В результате были получены фракции продуктов, обозначенные как 1,2 (рис. 15 Б) (табл. 9).

50 100 150 200 250 300 Э50 400 450 500 Объем, мл

О 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 Объем, мл

Рис. 15. Ионообменная хроматография (ДЭАЭ-целлюлоза, 15x1 см) продуктов, полученных при действии альгинат-лиазы АлП на фукоидан из бурой водоросли К ыапезсепя. А - фукоидан, Б - продукты деградации.

Таблица 9.

Моносахаридный состав полученных фракций

Моносахаридный состав, %

Фракция Выход, % Mr, кДа Fue Gal Glc Rha Xyl Man

1 60 1-4 84 6 3 0,1 6,9 0

2 40 40 92 5 0 0 3 0

По данным гель-фильтрации на Superdex 75-HR ("Acia", FPLC) фракция I содержала низкомолекулярные фукоолигосахариды (1-4 кДа) (рис. 16 Б).

Место выхода фракции 2 при гель-фильтрации на Superdex 75-HR и на ДЭАЭ-целлюлозе совпадало с выходом исходного фукоидана (рис. 15 Б, 16 В). Можно предположить, что эта фракция представляет собой неразрушенный фухоидан.

А «о

^ фукоидан 1,5

0,5 О

4 6 8 10 12 Объем, мл

Л44»

0.4

фракции I

¿5*

О 2 4 6 X 10 12 Объем, мл

А 490

Рис. 16. Гель-фильтраЦня фу кои дана (А) и продуктов его де<радации (Б, В) под действием алыинат-лиазы Ал11 на $ирек)ех 75-НЯ (мАс1а", РРЬС).

4 6

Объем, мл

2.4.3. Исследование энзиматичсских свойств альгииат-лиаз. Энзиматнческие свойства альгинат-лиаз исследовали, используя для рсзистрации фермент и вной реакции увеличение ДАщ с течением времени реакции (т). Зависимости ДЛ2з< от * реакции ^-элиминирования полшулуроновой кислоты, катализируемой альгинат-лиазами Ал1, Ал11, АлШ, представлены на рис. 17. Начальные скорости (v, ДАгц/мин), определенные и* этих зависимостей, равны 0,0052, 0,0010, 0,0015 для алы ипаг-лиа* Ал!. Ал11, АлШ (рис. 17, кривые I, 2, 3, соответственно) и 0,0124 для их смеси, составленной в равном объемном соотношении (рис. 17, кривая 4) Видно, чго смесь трех ферментов катализирует гидролиз коммерческой алы иновой кислоты, в которой превалируют поли-Г-блоки, со скоростью, приблизительно в ~1,6 раза выше предполагаемой теоретически (у> + Уц + Ущ = 0,0077, против 0,0124 (рис. 17, кривая 5)). Таким образом, исследуя свойства суммы ферментов альгинолитического комплекса, мы обнаружили синергический эффект, который проявляется при последоватечьно-иараллельном действии всех трех алминат-лиаз на

нолимерпый субстрат.

ДА 490

.4___

Рис. 17. Зависимость ДА2н от времени при действии альгинат-лна* Ал! (I). АлИ (2). АлШ (3) на полигулуроновую кислоту (1м1/мл) в 0,1 М фосфатном буфере рН 7.2. (20°С) и их смеси, составленной в равном объемном соотношении, на •угу же кислоту (I юлу чена экспериментально (4) и теоретически рассчитана (5)).

25 50 75 НЮ 125 150 175 200 225 250 275 300 Время, мин

Вероятно, для успешного гидролиза альгиновой кислоты морской бактерии Р. с'игеа КММ 3297 необходимо наличие всех трех ферментов.

Константы Михаэлиса-Ментен (А"го) были определены для альгинат-лиаз Ал1 и АлШ по отношению к полигулуроновой н полиманнуроновой кислотам. Альгинат-лиаза Ап1 имеет практически одинаковое сродство к поли-Г- и к поли-М-блокам (АГт 24 мкг/мл и 34 мкг/мл, соответственно). Альгинат-лиаза АлШ специфична к поли-Г (40,0 мкг/мл) в большей мере, чем к поли-М-блокам (Кт 130,0 мкг/мл) (рис 18)

1/У * ЮЛ МИИ/ЛА135

10 9 АлШ. поли-М

7 ■ Ал1, поли-М

6/ /í' Ал'» поли-Г

1/S, !/мг

I/V х I0"\ mhii/AAus

I/S, 1/мг

Рис. \ 8. Определение Кт »о методу Лайнуивсра-Бсрка для альгинаг-лиаз Ал1 и АлШ.

Выводы

I. Изучено распространение фукоидан-деградирующих ферментов среди 25 штаммов морских бактерий-эпифитов бурых водорослей F evanescem и С. jilum и 53 бактерии-июля го в голотурии А japonícus. Показано, что 18 исследованных экстракпов штаммов бактериальных эпифитов бурых водорослей ^

(72%) и 38 бактерий-ассоциантов голотурии (72%) катализировали деградацию фукоиданов Высокая активность фукоиданаз отмечена для бактерий-эпифитов рода Cytophaga и бактерий родов Alleromonas/Psendoalleromonas Штаммы Pseiuloalteronwnas cilrea КММ 3296 и КММ 3298, выделенные из и

бурых водорослей L асИогюШеч и С. fih/m, соответственно, и КММ 3297 (ассоциант юлотурин A japomats) выбраны в качестве продуцентов фукоиданаз.

• 2. Изучен состав 'О-гиикотшидролаз 12 штаммов Р. airea, в том числе типового штамма АТСС 29719Г, выделенных из морских организмов. Показано, что фукоиданазы синтезируются штаммами, изолированными из организмов богатых фукоиданами, и могут служить экофизиологической характеристикой данного вида бактерий.

3. Установлено, чго фукоиданазы штаммов P. alrva КММ 32%. КММ 3297. КММ 3298 деист вуют на фукоиданы при рН 6,5-7,0, сохраняю! активность до 40-50°С. Фермойш них штаммов каылишрую! гидролиз фукоиданов из I. осhnrwhfes (I —»3-я-L-фукана) и Г. evitm'siсп\ (I—►З: I—й-а-Ь-фукана) по >ндо-шиу с образованием сульфат иронанных фук(юлш оса хари дон. В фукоолигосахарндач, ирочукгах действия фукоиданазы из Р. сШеа КММ 3296 на фукоидан из F еитечан. преобладают а-!-*4-связаннмс оеппкн фукозы По всей видимости, я о i фермеж кагшжзируст i идроли з досгунных а-1—>3-0-1 ликозидных связей и является 1-»3-а-1,-фуканазой

4. Показано, чго морская бактерия Р tilrea КММ 3297, ассоцианг п>логурии А. /а/юпит, выращенная на среде, содержащей пжжозу, синтезирует 2 внутриклеточных алыннолшнческих фермента Лл!. Лл!1. Фукоидан из бурой водоросли F. evtme\Lvn\ индуцирует биосипгез еще одною алыннолигическою фермента Ал!II.

5. Показано, чю изученные алминолишческис фермент имеют ошимумы рН 7-Х и полностью сохраняют активность до 35°С (Ал1) и 45°С (АлИ, АлШ) Молекулярные массы ферментов Ал1, Aj.II и АлШ составляют 25, 79 и 61 кДа соответственно Ноны Na' (0.2 M) и Mg"' (0,01 M) активируют гги ферменты более, чем в 2 раза. Кт для Ал1 но поли-Г н нолн-М-блокам алы иновой кисло 1ы сопоставимы и составляют 24 и 34 mki/mji соответственно. Алы ипат-лиа за АлШ имеет большее сродство к ноли-Г- (Кт - 40.0 mki/mji). чем к пол и-M-блока м (Кт- 130,0 mki/mji).

6. Все исследуемые алыинолтические фермсты являются алы ина1-л пазами >ндо-1ипа действия н де1радирукгг иолж-улуроновую и полнманнуроповую кислоты до олиюсахиридов со стелены«» полимеризации 5^ п >3. имеющих на невосстанавливаюшем конце моносахарндпые остатки с пепасыщеннои связью между С4 и С5 атомами. Смесь всех трех ферме!иов алынполптпческою комплекса Р. сШеа КММ 3297 проявляет си н ер i и чески й >ффскт при действии на полимерный субегрл!. Наличие нескольких алынполитических ферментов и фукоиданазы в одном организме обеспечивает >ф<|>ективную деструкцию нолианионных полисахаридов бурых водорослей бакт-ерией Р. а/геи КММ 3297

Список основных публикации но 1еме диссертаций

1. И.Ю. Вакунина, J1 С. Шевченко, О VI. Недатковская, H M. Шевченко. С А. Алексеева, В В. Михайлов. Т Н. Звяшнцсва Поиск фукоидан i идрола $ среди морских микроорганизмов // Микробноло! ия. 2000. Т. 69. № 3. С. 370-376

2. И Ю. Бакунина, 011. Недатконская, С.А. Алексеева, F. П. Иванова, Л А. Романенко, Н.М Горшкова. В В Исаков, Т.Н. Звя1 ннцева, В В Михаилов Особенности дефадацни фукондана морскими про геобактериями Р\ешЬм1ичат<»ш\ сШеаН Микробноло« ия 2002. Т. 71. № I. С. 49-55

3. С.А. Алексеева, И.Ю Бакунина. 0 11 Нслашковская, В В Исаков, ВВ. Михайлов, Т.Н. Звяшнцсва. Внутриклеточные алыиполитнческне ферменты морской бактерии Psctultnillaonmnas cilica КММ 3297 (в исчаш)

4 Бакунина И. К). Бурцева К)В. Сова ВВ, Шевченко НМ. Недашковская ОН, Алексеева С.А. КусаЙкнн МИ., Урванцева А М., Михаилов В.В, Звягинцева ТН Распределение фукоидаш ндролаз в морских беспозвоночных и микроорганизмах // Тезисы 2-ю Международною симпозиума «Химия и химическое образование» Владивосток 2000 С. 206

* пj/зЬ

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Алексеева, Светлана Анатольевна

Список сокращений

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Фукоиданы.

2.1.1. Распространение.

2.1.2. Структура.

2.1.3. Функции, выполняемые фукоиданами в бурых водорослях и иглокожих.

2.1.4. Биологическая активность фукоиданов.

2.2. Фукоиданазы.

2.2.1. Номенклатура. Известные представители.

2.2.2. Физико-химические свойства фукоиданаз.

2.2.3. Тип действия и специфичность фукоиданаз.

2.2.4. Условия культивирования морских бактерий, синтезирующих фукоиданазу.

2.3. Альгиновые кислоты.

2.3.1. Распространение.

2.3.2. Структура.

2.3.3. Биологическая активность альгиновых кислот.

2.3.4. Применение альгиновых кислот и их солей.

2.4. Альгинат-лиазы.

2.4.1. Распространение. Номенклатура.

2.4.2. Свойства и специфичность альгинат-лиаз моллюсков и водорослей.

2.4.3. Альгинат-лиазы морских бактерий.

2.4.4. Альгинат-лиазы почвенных бактерий.

2.4.5. Альгинат-лиазы морских грибов, бактериофагов и вирусов.

2.4.6. Классификация альгинат-лиаз.

2.4.7. Биосинтез альгинат-лиаз.

2.4.8. Сведения о структуре каталитического центра.

2.4.9. Возможный механизм каталитического действия альгинат-лиазы AI-III из Shingomonas sp. AI

2.4.10. Биологические функции альгинат-лиаз.

2.4.11. Применение альгинат-лиаз.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Микроорганизмы и условия их культивирования.

3.2. Реагенты.

3.3. Субстраты.

3.4. Аналитические и физико-химические методы.

3.5. Определение активности О-гликозилгидролаз.

3.6. Выделение и очистка ферментов.

3.6.1. Фукоидан-деградирующие ферменты морской бактерии

Р. citrea КММ

3.6.2. Альгинолитические ферменты морской бактерии

Р. citrea КММ

3.7. Исследование свойств ферментов.

3.8. Получение и характеристика субстратов и продуктов их деградации.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

4.1. Распространение О-гликозилгидролаз в морских бактериях.

4.1.1. Фукоиданазы морских бактерий-эпифитов бурых водорослей.

4.1.2. Фукоиданазы морских бактерий-изолятов голотурии АрояНсИорт ¡аромсих.

4.1.3. Гликозилгидролазы морских бактерий Р. сИгеа.

4.2. Особенности деградации фукоидана морскими бактериями Р. сИгеа.

4.2.1. Физико-химические свойства фукоиданаз.

4.2.2. Специфичность фукоиданаз.

4.2.3. Особенности деградации фукоидана из еуапеясею под действием фукоиданазы из морской бактерии

Р. сИгеа КММ

4.3. Внутриклеточные альгинолитические ферменты морской

•« бактерии Р. сНгеа КММ 3297.

4.3.1. Влияние компонентов питательной среды на синтез альгинолитических ферментов.

4.3.2. Выделение, очистка и разделение альгинолитических ферментов.

4.3.3. Физико-химические свойства альгинолитических ферментов морской бактерии Р. сНгеа КММ

4.3.4. Влияние ионов Ыа+ и двухвалентных металлов на активность альгинат-лиаз.

4.4. Субстратная специфичность альгинолитических ферментов морской бактерии Р. сИгеа КММ 3297.

4.4.1. Структурные характеристики субстратов.

Д 4.4.2. Действие альгинолитических ферментов на альгиновые кислоты и фукоидан.

4.4.3. Исследование энзиматических свойств альгинат-лиаз.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ферменты морских бактерий Pseudoalteromonas citrea, катализирующие деградацию полианионных полисахаридов бурых водорослей"

Целью работы является изучение ферментов морских бактерий, катализирующих трансформацию полианионных полисахаридов бурых водорослей (фукоидана и альгиновой кислоты), включающее поиск, выделение и характеристику свойств, установление их специфичности и деталей механизма действия.

Полианионные полисахариды клеточных стенок бурых водорослей -фукоиданы и альгиновые кислоты обладают разнообразной биологической активностью. Наибольший интерес представляет антикоагулянтное и антивирусное действие фукоиданов, в том числе против ВИЧ, вирусов гепатита и герпеса. Фукоиданы применяют как антиопухолевые препараты, а также для получения лечебно-профилактических средств с антикоагулянтными свойствами. Альгиновые кислоты известны как гелеобразователи и энтеросорбенты. Они используются в различных областях промышленности, медицины и сельского хозяйства.

Фукоиданы бурых водорослей представляЕОТ собой семейство гомо- и гетерополисахаридов, состоящих преимущественно из остатков сульфатированной фукозы, которые связаны в основной цепи а-1—»3- или а-1—>3-;а-1—»4-0-гликозидными связями. Помимо фукозы, фукоиданы могут содержать как в основной цепи, так и в разветвлениях, минорные моносахариды: маннозу, галактозу, ксилозу, рамнозу, уроновые кислоты.

Альгиновые кислоты - линейные полисахариды, построенные из остатков О-маннуроновой и а-Ь-гулуроновой кислот, связанных 1—»4-О-гликозидными связями.

Ферменты, катализирующие деградацию , полианионных полисахаридов, используются для изучения их структуры, биологической активности и получения лекарственных препаратов. Альгинат-лиазы применяются для получения протопластов разнообразных водорослей. Из природных альгинатов с помощью высокоспецифичных альгинат-лиаз получают поли-М-, поли-Г- и поли-МГ-блоки, которые необходимы для исследований субстратной специфичности ферментов. Альгинат-лиазы в сочетании с дезоксирибонуклеазой и антибиотиками применяются в качестве терапевтических препаратов для лечения заболеваний, вызванных патогенами.

Фукоиданазы обнаружены только в морских организмах и, как правило, уровень их активности чрезвычайно низок. Альгинат-лиазы найдены не только в морских макро- и микроорганизмах, но и в почвенных бактериях. Эти группы ферментов, особенно фукоиданазы, для которых известны и исследуются в настоящее время только единичные представители, относятся к малоизученным.

В качестве источников этих ферментов нами используются морские микроорганизмы, которые являются исключительно перспективными объектами для цоиска различных биологически активных веществ, в том числе ферментов. Они содержат разнообразные ферменты и легко культивируются в контролируемых условиях.

Наши исследования расширят представления о механизмах действия ферментов вообще и ферментов морского происхождения, в частности, последние, если судить по имеющимся немногочисленным литературным данным, значительно отличаются от ферментов с аналогичной специфичностью из наземных организмов. Обнаружение новых источников - продуцентов фукоиданаз и альгиназ, изучение специфичности этих ферментов позволяет получить дополнительную информацию о зависимости "структура-биологическая активность" для полисахаридов бурых водорослей.

Результаты наших исследований могут иметь не только теоретический, но и практический интерес, так как могут использоваться для получения новых эффективных медицинских препаратов, источником которых является легко возобновляемое морское сырье.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1. Фукоиданы

2.1.1. Распространение. Фукоиданы - сульфатированные фукозусодержащие полисахариды, которые обнаружены только в морских организмах и не встречаются в наземных (Kloareg, Quatrano, 1988). Основным источником фукоиданов являются бурые водоросли (Kloareg, Quatrano, 1988). Кроме того, фукоиданы обнаружены в мембране яйцеклеток иглокожих (Mulloy et al., 1994). Наиболее богаты этими полисахаридами представители бурых водорослей порядка Fucales. Один из видов фукусовых, Fucus vesiculosas, служит сырьем для производства коммерческого препарата фукоидана.

Следует отметить, что содержание фукоиданов зависит от вида водоросли. Например, фукоиданы в Pelvetia canaliculata составляют 18-24% от сухого веса водоросли, тогда как в Durvillea potatorum 0-2% (Nagumo, Nishino, 1997). Сезон и условия произрастания водоросли также оказывают существенное влияние на содержание фукоидана (Obluchinskaya et al., 2002).

2.1.2. Структура. Химическое строение фукоиданов бурых водорослей весьма разнообразно и изменяется от источника к источнику. Они представляют собой семейство сульфатированных гомо- и гетерополисахаридов, включающее полисахариды как с относительно высоким содержанием уроновых кислот и низким содержанием фукозы и сульфатов, так и практически чистые гомополимеры -сульфатированные a-L-фуканы. Кроме фукозы и уроновых кислот в составе фукоиданов обнаружены галактоза, манноза, ксилоза, рамноза (Percival, McDowell, 1967) (табл. 1).

Фукоиданы, выделенные даже из одного вида водоросли, но произрастающей в разных условиях, различаются не только моносахаридным составом, но и степенью сульфатирования. Известно, что фукоиданы из Laminaria saccharina, произрастающей в -»Баренцевом море, более сульфатированы и состоят из остатков фукозы и глюкуроновой кислоты, тогда как полисахариды водоросли беломорской популяции наряду с фу козой и глюкуроновой кислотой содержат глюкозу (Усов и др., 1998) (табл. 1).

Таблица 1.

Моносахаридный состав и содержание сульфатов в фукоиданах бурых водорослей

Бурая водоросль Моносахаридный состав Fuc:Glc:Gal:Man:Xyl:Ram:GlcA Количество сульфатов Ссылка

Laminariales Chorda filum ♦а) 1,0:0,01:0,02:0,01:0,01:0:0 ♦6) 1,0:0,05:0,01:0,1:0,04:0(*»5,5) *в) 1,0:0,6:0,07:0,1:0,15:0:(**3,5) **26,5 »»13 »»13 Chizhov et al., 1999

Ecklonia kurome ♦a) 1,0:0:0,36:0,48:1,08:0:1,85 ♦6) 1,0:00:0,81:0,18:0,45:0:0,61 ♦в) 1,0:0:0,03:0:0:0,03 *r) 1,0:0:0,19:0:0:0,07 »2,35 »2,0 »1,61 »1,48 Nishino et al., 1991a; Nishino, et al., 1991b

Laminaria cichorioides ♦♦52:0,2:2,2:0,2:0,3:0:3,7 ♦♦90:6:1,2:0:2,8:0:0 »»44 **38 Усов, Кирьянов, 1994 Звягинцева и др., 2003

Laminaria japónica * 1,0:0,07:0,37:0,09:0,14:0,02:0,21 »1,66 Honya et al., 1999

Laminaria brasiliensis ♦♦90:0:10:0:0:0 ♦0,88:0:0,12:0,01:0:0:0 н.о. »0,77 Nagumo, Nishino, 1997 Pereira et al., 1999

Laminaria saccharina (Белое море) ♦♦a) 36,3:1,5:0:0:0:0:0:8,9 ♦*6) 14:0,6:0:0:0:0:36,8 ♦♦в) 18,6:0,2:0:0:0:0:15,0 **37 »»14,3 »»23,8 Усов и др., 1998

Laminaria saccharina (Баренцево море) ♦*a) 34,8:0:0:0:0:0:9,6 ♦*6) 20,2:0:0:0:0:0:19,7 ♦*в) 18,0:0:0:0:0:0:13,6 ♦*r) 33,8:0:0:0:0:0:10,8 »♦40,0 **20,4 **25,8 **35,4 Усов и др., 1998

Macrocystis purifera ♦♦36:0:2:0:1:0:0 н.о. Schweiger, 1962

Undaria pinnatifida •t ♦a) 1,0:0:0,77:0,04:0,03:0:0,33 ♦6) 1,0:0:0,87:0,03:0,04:0:0,12 ♦в) 1,0:0:1,76:0,04:0,08:0,17 »0,32 »1,12 »3,37 Mori et al., 1982

Fucales Sargassum litiifolium ♦2,5:0:8,4:1,0:2,5:0:4,6 **19 Abdel-Fattah et al., 1974

Ascophyllum nodosum ♦♦a) 49:0:0:0:10:0:11 ♦6)1,1:0:1:0,1:0,1:0:0,2 ♦в) 8:0:1:0:0:0:0 ♦♦г) 25:0:0:0:26:0:27 ♦♦21 »0,8 н.о. »»13 Percival, 1968; Percival, 1971 Medcalf et al., 1978 Dillon et al., 1953 Larsen et al., 1970

Fucus vesiculosus ♦ 1,0:0:0,02:0,02:0:0:0 0,9 Larsen et al., 1970

Fucus evanescens * 1,0:0:0:0:0:0:0:0,36 (ацетат) »♦35,4:4:0:0,8:6,1:0:н.о. »♦10,7:1,1:3:3,7:17,4:0:15,6 »♦33,2:0:4,5:3,5:8,1:0:28,9 »♦34:0:5,4:0:3,8:0:32,5 »1,23 н.о. »»19,6 »♦28,9 **32,5 Bilan et al., 2002

Pelvetia wrightii ♦ 10,0:0:1,0:0:0:0:0 н.о. Anno et al., 1966

Desmarestiales Desmarestia aculeate »1,0:0:2,0:0:0,13:0:1,7 н.о. Percival, Young, 1974 - мольные отношения ♦* - процентное содержание н.о. - не определено

Несмотря на широкую известность этих полисахаридов, далеко не все их структурные особенности выяснены с достаточной определенностью из-за сложности и разнообразия их структуры.

На примере полисахарида бурой водоросли F. vesiculosus видно, как изменялись представления о структуре этого фукоидана (рис. 1).

В течение долгого времени считалось, что углеводные цепи этого полисахарида содержат преимущественно остатки фукозы, соединенные а-1—»2-О-гликозидными связями и сульфатированные по С4 (рис. 1 А, Б).

Рис. 1. Предполагаемые структуры фукоиданов бурой водоросли Fucus vesiculosus.

Пересмотр этой структуры привел авторов к выводу, что основная цепь полисахарида содержит а-1 —>3-связанные остатки фукозы, разветвления присоединены к ним в положении 2, тогда как сульфатные группы - в положении 4 (Patankar et al., 1993) (рис. 1 В).

В недавней работе Bilan и др. показали, что фракция фукоидана, выделенная из Тихоокеанской бурой водоросли F. evanescens, обладает линейной структурой и состоит из чередующихся остатков а-1—>3- и а-1 —»4-связанной L-фукопиранозы, сульфатированной по С2 (рис. 2 А). Небольшое количество дополнительных сульфатных групп расположено в положениях 3 и 4 остатков L-Fuc. Кроме того, в фукоидане часть остатков фукозы ацетилированы (Bilan et al., 2002). Практически полностью сульфатированная фракция фукоидана, выделенная из бурой водоросли L. cichorioides, образована остатками фукозы, соединенными а-1—»3-О-гликозидными связями (Zvyagintseva et al., 2003) (рис. 2 Б). ю д —»3)-a-L-Fu<y-(l—+4)-a-L-Fuq>-(l—♦3)-a-L-Fuq>-(l—»4)-a-L-Fu<y-(l—» 2 2 2 2 t t t T

SOj so3 so, so3

Б SOj SO3 SOj SO3 SO3 SOj

I. i i i i i

4 4 4 4 4 4

-»3)-Fuc-(l—»3)-Fuc-(l-»3)-Fuc-(l-+3)-Fuc-(l—»3)-Fuc-(l—»3)-Fuc-(l—♦3)-Fuc-(l—♦ 2 2 2 2 2 2 t T T T t t

SO3 S03 SOj S03 SO, SOj

Рис. 2. Структуры фукоиданов из F. evanescens (А) и L. cichorioides (Б).

Более разветвленная структура с неупорядоченным расположением сульфата предложена для фукоидана бурой водоросли Е. kurome (Nishino et al., 1991а; Nishino et al., 1991b) (рис. 3).

SOj Fuc«-(1—»3)-Fuca-(l—»

1 4 SO3

2 í l -+3)-Fuc/?a-(l —>3) v SO3 —>3)-Fucpa-(l—>3) >.4

Ъриса-(1—>2)

3)-Fucp или Fuc/a-(l—>2) S03->4)-Fucpa-(l->2)

Fucp или Fuc/a —>3)-Fuca-(l-+3)-Fuca-(l—* SO3

1 4 .i

••i T 4

4 SO3 Fucp или Fuefa

-+3)-Fucpa-(l—► 1

1 2

-Fucpa-(l—*2)-Gal-(l—»4)-Fucpa-(l—» ->3)-Fucpa-(l->

Рис. 3. Структурные фрагменты фукоиданов, вьщеленных из Е. kurome.

В целом, можно сказать, что отсутствие видимых признаков регулярности в построении полимерных молекул делает в высшей степени затруднительной построение общей концепции структуры фукоиданов. Наличие в их составе минорных компонентов (Man, Xyl, Gal) еще более усложняет структурный анализ фукоиданов водорослей. В настоящее время можно сделать предварительный вывод, что фукоиданы, выделенные из лиминариевых, представляют собой 1—»3-a-L-фуканы, а из фукусовых - 1—»3; 1—>4-а-Ь-фуканы.

В отличие от фукоиданов бурых водорослей полисахариды, выделенные из игЛокожих, обладают линейной структурой с повторяющимися тетрасахаридными звеньями (Ми11оуе1 а!., 1994) (рис^ 4).

Рис. 4. Структура повторяющихся тетрасахаридных блоков в сульфатированных фуканах из морского ежа Lytechinus variegates (А), голотурии Ludwigothurea grisea (Б) и морского ежа Arbacia lixula (В).

Предполагают, что наличие фукоидана, состоящего из регулярно повторяющихся тетрасахаридов определенной структуры, является характерной особенностью иглокожих (Mulloy et al., 1994).

2.1.3. Функции» выполняемые фукоиданами в бурых водорослях и иглокожих. Публикаций о функции фукоиданов в организмах морских водорослей и животных немного (Kloareg, Quatrano, 1988; Mulloy et al., 1994).

Предполагают, что они являются матричными полисахаридами клеточных стенок бурых водорослей (Kloareg, Quatrano, 1988). Благодаря полианионной природе, фукоиданы могут участвовать в электролитическом гомеостазе. Они очень гигроскопичны и их водные растворы MOiyr образовывать вязкие гели, обеспечивая физиологический барьер, который входит в систему иммунитета. Фукоидан выполняет функцию протектора и наряду с альгиновой кислотой предохраняет водоросль от гибели в момент отлива (Obluchinskaya et al., 2002). Предполагают та!рке, что фукоиданы участвуют в механизме ионной регуляции водоросли (Kloareg, Quatrano, 1988). Как компоненты клеточной стенки эти полисахариды обеспечивают устойчивость и эластичность водоросли.

Известно, что фукоидан, выделенный из яйцеклеток морского ежа L. variegatus, играет важную роль в их оплодотворении (Mulloy et al., 1994).

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Алексеева, Светлана Анатольевна

Выводы

1. Изучено распространение фукоидан-деградирующих ферментов среди 25 штаммов морских бактерий-эпифитов бурых водорослей Р. еуапеясею и С. /Пит и 53 бактерий-изолятов голотурии А. ]аротси$. Показано, что 18 исследованных экстрактов штаммов бактериальных эпифитов бурых водорослей (72%) и 39 бактерий-ассоциантов голотурии (74%) катализировали деградацию фукоиданов. Высокая активность фукоиданаз отмечена для бактерий-эпифитов рода СуЬорка^а и бактерий родов Акеготопаз/Ряеи^акеготопах. Штаммы Рэеи^акеготопаз сИгеа КММ 3296 и КММ 3298, выделенные из бурых водорослей Ь. ыс1югю1с1е8 и С. £йит, соответственно, и КММ 3297 (ассоциант голотурии А. ]аромст) выбраны в качестве продуцентов фукоиданаз.

2. Изучен состав О-гликозилгидролаз 12 штаммов Р. скгеа, в том числе типового штамма АТСС 29719т, выделенных из разных морских организмов. Показано, что фукоиданазы синтезируются штаммами, изолированными из организмов богатых фукоиданами, и могут служить экофизиологической характеристикой данного вида бактерий.

3. Установлено, что фукоиданазы штаммов Р. сЬгеа КММ 3296, КММ 3297, КММ 3298 действуют на фукоиданы при рН 6,5-7,0, сохраняют активность до 40-50°С. Ферменты этих штаммов катализируют гидролиз фукоиданов из Ь. Ыс1гогю1с1е8 (1 —*3-а-Ь-фукана) и Р. е\апе$сет (1—>3; 1—>4-ос-Ь-фукана) по эндо-типу с образованием сульфатированных фукоолигосахаридов. В фукоолигосахаридах, продуктах действия фукоиданазы из Р. с^геа КММ 3296 на фукоидан из К еуапехсепя, преобладают а-1—>4-связанные остатки фу козы. По всей видимости, этот фермент катализирует гидролиз доступных а-1—»З-О-гликозидных связей и является 1—»З-а-Ь-фуканазой.

4. Показано, что морская бактерия Р. сйгеа КММ 3297, ассоциант голотурии А. }аротст, выращенная на среде, содержащей глюкозу, синтезирует 2 внутриклеточных альгинолитических фермента Ал1, Ал11. Фукоидан из бурой водоросли К еуапеъсет индуцирует биосинтез еще одного альгинолитического фермента АлШ.

5. Показано, что изученные альгинолитические ферменты имеют оптимумы рН 7-8 и полностью сохраняют активность до 35°С (Ал!) и 45°С (АлИ, АлШ).

Молекулярные массы ферментов Ал1, АлП и АлШ составляют 25, 79 и 61 кДа, соответственно. Ионы (0,2 М) и Mg2+ (0,01 М) активируют эти ферменты более, чем в 2 раза. Кт для Ал1 по поли-Г и поли-М-блокам альгиновой кислоты сопоставимы и составляют 24 и 34 мкг/мл, соответственно. Альгинат-лиаза АлШ имеет большее сродство к поли-Г- (Кт - 40,0 мкг/мл), чем к поли-М-блокам (Кт -130,0 мкг/мл).

6. Все исследуемые альгинолитические ферменты являются альгинат-лиазами эндо-типа действия и деградируют полигулуроновую и полиманнуроновую кислоты до олигосахаридов со степенью полимеризации 5> п >3, имеющих на невосстанавливающем конце моносахаридные остатки с ненасыщенной связью между С4 и С5 атомами. Смесь всех трех ферментов альгинолитического комплекса Р. сИгеа КММ 3297 проявляет синергический эффект при действии на полимерный субстрат. Наличие нескольких альгинолитических ферментов и фукоиданазы в одном организме обеспечивает эффективную деструкцию полианионных полисахаридов бурых водорослей бактерией Р. с^геа КММ 3297.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Алексеева, Светлана Анатольевна, Владивосток

1. Бакунина И.Ю., Сова В.В., Недашковская О.И., Кульман P.A., Лихошерстов JI.M., Мартынова М.А., Михайлов В.В., Елякова Л.А. а-Галактозидаза из морской бактерии Pseudoalteromonas sp. КММ 701 // Биохимия. 1998. Т. 63. С. 1420-1427.

2. Баранов В. Фруктово-ягодное покрытие тортов и пирожных с альгинатом натрия // Обществ, питание. 1980. № 3. С. 12-13.

3. Бурцева Ю.В., Веригина Н.С., Сова В.В., Пивкин М.В., Звягинцева Т.Н. О-Гликозилгидролазы морских мицелиальных грибов. Р-1,3-Глюканазы морского гриба Trichoderma aureviride II Прикл. биохимия и микробиол. 2003. Т. 39. № 5. С. 550-556.

4. Иванова Е.П., Бакунина И.Ю., Недашковская О.И., Горшкова Н.М., Михайлов В.В., Елякова Л.А. Поиск продуцентов а-галактозидаз среди морских бактерий рода Alteromonas II Прикл. биохимия и микробиология. 1996. Т. 32. С. 624-628.

5. Кочетков Н.К., Бочков А.Ф., Дмитриев Б.А., Усов А.И., Чижов О.С., Шибаев В.Н. Химия углеводов. М.: Химия. 1967. С. 477-556.

6. Лоенко Ю.Н., Артюков A.A., Козловская Э.П., Мирошниченко В.А., Еляков Г.Б. Биологически активные полисахариды морских водорослей и трав // Владивосток: Дальнаука ДВО РАН. 1997. С. 12-15.

7. Недашковская О.И., Иванова Е.П., Бакунина И.Ю., Светашев В.И., Звягинцева Т.Н., Михайлов В.В. Характеристика морских бактерий Pseudoalteromonas citrea деградирующих фукоидан // Микробиологичный журнал. 2002. Т. 64. С. 3-10.

8. Розкин М.Я., Левина М.Н., Ефимов B.C., Усов А.И. Антикоагулянтная и стимулирующая липолиз активность полисахаридов из бурых морских водорослей // Фармакология и токсикология. 1991. Т. 54. С. 40-42.

9. Усов А.И. Альгиновые кислоты и альгинаты: методы анализа, определения состава и установления строения // Успехи химии. 1999. Т. 68. С. 1051-1061.

10. Усов А.И., Кирьянов A.B. Полисахариды водорослей. 47. Выделение фракций фукоидана из бурой водоросли Laminaria cichorioides Miyabe // Биоорган, химия. 1994. Т. 20. С. 1342-1348.

11. Усов А.И., Смирнова Г.П., Билан М.И., Шашков A.C. Полисахариды бурых водорослей 53. Бурая водоросль Laminaria saccharina (L.) Lam. как источник фукоидана // Биоорган, химия. 1998. Т. 24. С. 437-445.

12. Усов А.И., Чижов О.С. Химические исследования водорослей. «Знание»: М. -1988. 48 с. (Новое в жизни, науке, технике. Сер. Химия, №5).

13. Хотимченко Ю.С., Ковалев В.В., Савченко О.В., Зиганшина O.A. Физико-химические свойства, физиологическая активность и применение альгинатов -полисахаридов бурых водорослей // Биология моря. 2001. Т. 27. С. 151-162.

14. Abdel-Fattah A.F., Hussein М.М., Salem Н.М. Studies of the purification and some properties of sargassan, a sulphated heteropolysaccharides from Sargassum linifolium II Carbohydr. Res. 1974. V. 33. P. 9-17.

15. Anno K., Terahata H., Hayashi Y., Seno N. Isolation aftd purification of fucoidan from brown seaweed Pelvetia wrightii II Agrie. Biol. Chem. 1966. V. 30. P. 495-499.

16. Austin B. Taxonomy of marine microorganisms. Marine Microbiology. Cambridge: Cambridge University Press, 1988. P. 223.

17. Bartell P.F., Orr T.E., Lam G.K.H. Polysaccharide depolymerase associated with bacteriophage infection // J. Bacteriol. 1966. V. 92. P. 56-62.

18. Bilan M., Grachev A., Ustuzhanina N., Shashkov A., Nifantiev N., Usov A. Structure of a fucoidan from the brown seaweed Fucus evanescens II Carbohydr. Res. 2002. V. 337. P. 719-730.

19. Boyd J., Ghosh M., May T., Shinabarger D., Keogh R., Chakrabarty A. Sequence of the algL gene of Pseudomonas aeruginosa and purification of its alginate lyase product // Gene. 1993. V. 131. P. 1-8.

20. Boyd J., Turvey J.R. Isolation of a poly-ß-L-guluronate lyase from Klebsiella aefogenes II Carbohydr. Res. 1977. V. 57. P. 163-171.

21. Boyen C., Bertheau Y., Barbeyron T., Kloareg B. Preparation of guluronate lyase from Pseudomonas alginovora for protoplast isolation in Laminaria II Enzym. Microbiol. Technol. 1990a. V. 12. P. 885-890.

22. Boyen C., Kloareg B., Polne-Fuller M., Gibor A. Preparation of alginate lyases from marine molluscs for protoplast isolation in brown algae // Phycologia. 1990b. V. 29. P. 173-181.

23. Brown B.J., Preston J.F. L-Guluronan-specific alginate lyase from a marine bacterium associated with Sargassum II Carbohydr. Res. 1991. V. 211. P. 91-102.

24. Chizhov A., Dell A., Morris H., Haslam SM McDowell R., Shashkov A., Nifantiev N., Khatuntseva E., Usov A. A study of fucoidan from the brown seaweed Chorda filum II Carbohydr. Res. 1999. V. 320. P. 108-119.

25. Costa A., Michaud P., Petit E., Heyraud A., Colin-Morel P., Courtois B., Courtois J. Purification and properties of a glucuronan lyase from Sinorhizobium meliloti M5N1CS (NCIMB 40472) // Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 67. P. 5197-5203.

26. Daniel R., Berteau O., Jozefonvicz J., Goasdoue N. Degradation of algal (Ascophyllum nodosum) fucoidan by enzymatic activity contained in digestive glands of the marine mollusk Pecten maximus II Carbohydr. Res. 1999. V. 322. P. 291-297.

27. Davidson I.W., Lawson C.J., Sutherland I.W. An alginate lyase from Azotobacter vinelandii phage //J. Gen. Microbiol. 1977. V. 98. P. 223-229.

28. Davidson I.W., Sutherland I.W., Lawson C.J. Purification and properties of an alginate lyase from a marine bacterium //J. Biochem. 1976. V. 159. P. 707-713.

29. Dillon T., Kristensen K., O'hEochdha C. Seed mucilage of Ascophyllum nodosum I // Proc. R. Irish. Acad. 1953. V. 558. P. 189-194.

30. Doubet R.S., Quatrano R.S. Properties of alginate lyases from marine bacteria // Appl. Environ. Microbiol. 1984. V. 47. P.699-703.

31. Duarte M.E., Cardoso M.A., Noseda M.D., Cerezo A. Structural studies on fucoidans from the brown seaweed Sargassum stenophyllum II Carbohydr. Res. 2001. V. 333. P. 281-293.

32. Dubois M., Gilles K., Hamilton J., Robers P., Smith F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances //Analyt. Chem. 1956. V. 28. P. 350-356.

33. Eftekhar F., Schiller N. Partial purification and characterization of a mannuronan-specific alginate lyase from Pseudomonas aeruginosa II Curr. Microbiol. 1994. V. 29. P. 37-42.

34. Elliot W.J., Prisant L.M. Drug delivery systems for antihypertensive agents // Blood Press. Monit. 1997. V. 2. P. 53-60.

35. Ellouali M., Boisson-Vidal C., Durand P., Jozefonvicz J. Antitumor activity of low molecular weight fucans extracted from brown seaweed Ascophyllum nodosum II Anticancer Res. 1993. V. 13. P. 2011-2019.

36. Favorov V.V. Purification of alginases by affinity chromatography on a Bio-Gel alginate column // Int. J. Biochem. 1973. V. 4. P. 107-110.

37. Favorov V.V., Vozhova E.I., Denisenko V.A., Elyakova L.A. A study of the reaction catalysed by alginate lyase VI from the sea mollusk Littorina sp. // Biochim. Biophys. Acta. 1979. V. 569. P. 259-266.

38. Fujihara M., Iizima N., Yamamoto I., Nagumo T. Purification and chemical and physical characterization of an antitumor polysaccharide from the brown seaweeds Sargassum fulvellum II Carbohydr. Res. 1984a. V. 125. P. 97-106.

39. Fujihara M., Komiyama K., Umezawa I., Nagumo T. Antitumor activity and action-mechanisms of sodium alginate isolated from the brown seaweeds Sargassum fulvellum II Chemotherary. 1984b. V. 32. P. 1014-1009.

40. Fujihara M., Nagumo T. An influence of the structure of alginate on the chemotactic activity of macrophages and the antitumor activity // Carbohydr. Res. 1993. V. 243. P. 211-216.

41. Fujihara M., Nagumo T. Effect of the content of D-mannuronic acid and L-guluronic acid blocks in alginates on antitumor activity // Carbohydr. Res. 1992. V. 224. P. 343-347.

42. Furucawa S., Fujikawa T., Koga., Ide A. Purification and some properties of Exo-type fucoidanases from Vibrio sp. № 5 // Biosci. Biochem. Biotech. 1992. V. 56. P. 18291834.

43. Ganesan M., Mairh O., Rao P. Effect of shelf life of brown algae Sarrgassum wightii (Fucales/Phaeophyta) and Turbinaria conoides (Fucales/Phaeophyta) on alginic acid yield // Indian J. of marine science. 2001. V. 30. P. 108-110.

44. Glabe C.G., Grabel B., Vacguier V., Rosen S. Carbohydrate specificity of sea urchin sperm bind in: a cell surface lectin mediating sperm egg adgesion // J. Cell. Biol. 1982. V. 94. P. 123-128.

45. Gonzalez J.M., Weiner R.M. Phylogenetic characterization of marine bacterium strain 2-40, a degrader of complex polysaccharides // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2000. V. 50. P. 831-834.

46. Grasdalen H., Larsen B., Smidsrod O. 13C-N.m.r. studies of monomeric composition and sequence in alginate // Carbohydr. Res. 1981. V. 89. P. 179-191.

47. Greiling H., Stuhlsatz H., Eberhard T., Eberhard A. Studies on the mechanism of hyaluronate lyase action // Connect. Tissue. Res. 1975. V. 3. P. 135-139.

48. Haraguchi K., Kodama T. Purification and properties of poly(P-D-mannuronate) lyase from Azotobacter chroococcum II Appl. Microbiol. Biotechnol. 1996. V. 44. P. 576-581.

49. Haug A, Larsen B, Smidsrod O. Studies on the sequence of uronic acid residues in alginic acid // Acta. Chem. Scand. 1967. V. 21. P. 691-704.

50. Haugen F., Kortner F., Larsen B. Kinetics and specificity of alginate lyases. I. A case study//Carbohydr. Res. 1990. V. 198. P. 101-109.

51. Henrissat B.A. Classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities // Biochem. J. 1991. V. 280. P. 309-316.

52. Henrissat B.A., Davies G.J. Structural and sequence-based classification of glycoside hydrolases // Cuit. Opin. Struct. Biol. 1997. V. 7. P. 637-644.

53. Jacober L.F., Rice C., Rand A.G. Characterization of the carbohydrate degrading enzymes in the Surf Clam crystalline style // J. Food Sci. 1980. V. 45. P. 381-385.

54. Kaneko Y., Yonemoto Y., Okayama K., Kimura A., Murata K. Bacterial alginate lyase: properties of the enzyme formed in a mixed culture of bacteriaisolated from soil // J. Ferment. Bioeng. 1990. V. 70. P. 147-149.

55. Kashiwabara Y., Suzuki H., Nisizawa K. Alginate lyases of Pseudomonads II J. Biochem. 1969. V. 66. P. 503-512.

56. Kennedy L., McDowell K., Sutherland IW. Alginases from Azotobacter species // J. Gen. Microbiol. 1992. V. 138. P. 2465-2471.

57. Kinoshita S., Kumoi Y., Ohshima A., Yoshida T., Kasai N. Isolation of an alginate-degrading organism and purification of its alginate lyase // J. Ferment. Bioeng. 1991. V. 72. P. 74-78.

58. Kitamura K., Matsuo M., Yasui T. Enzymic degradation of fucoidan by fucoidanase from the hepatopancreas of Patinopecten yessoensis II Biosci. Biochem. 1992. V. 56. P. 490-494.

59. Kloareg B., Quatrano R. S. Structure of the cell walls of marine algae and ecophysiological function of the matrix polysaccharides // Oceanogr. Mar. Biol. Annu. Rev. 1988. V. 26. P. 259-315.

60. Kong I., Kim Y., Kim J., Kim S., Oh D., Yu J., Kong J. Alginate lyase production of halophilic Pseudomonas sp. by recombinant Escherichia coli II J. Microbiol. Biotech. 1995. V. 5. P. 92-95.

61. Kraiwattanapong J., Motomura K., Ooi T., Kinoshita S. Characterization of alginatelyase (ALYII) from Pseudomonas sp. OS-ALG-9 expressed in recombinant Escherichiacoli II J. Microbiol. Biotechnol. 1999a. V. 15. P. 117-122.I

62. Kraiwattanapong J., Ooi T., Kinoshita S., Sugimura I.t Sawabe T., Ezura Y. Hydrophobic cluster analysis and classification of sixteen bacterial alginate lyase // J. Microbiol. Biotechnol. 2000. V. 16. P. 219-224.

63. Madgwick J., Haug A., Larsen B. Alginate lyase in the brown alga Laminaria digitata (Huds.) Lamour//Acta. Chem. Scand. 1973. V. 27. P. 711-712.

64. Madgwick J., Haug A., Larsen B. Ionic requirements of alginate-modifying enzymes in the marine alga Pelvetia canaliculata (L.) Dene, et Thur // Bot. Mar. 1978. V. 21. P. 1-3.

65. Maki H., Mori A., Fujiyama K., Kinoshita S.f Yoshida T. Cloning, sequence analysis and expression in Echerichia coli of gene encoding an alginate lyase from Pseudomonas sp. OS-ALG-9 //J. Microbiol. 1993. V. 13. P. 987-993.

66. Malissard M., Chavagnat F., Duez C., Vacheron M.J., Guinand M., Michel G., Ghuysen J-M. Overproduction and properties of the mannuronate alginate lyase AIxMb // FEMS Microbiol. Lett. 1995. V. 126. P. 105-112.

67. Malissard M., Duez C., Guinand M., Vacheron M-J., Michel G. Sequence of a gene encoding a (polyManA) alginate lyase active on Pseudomonas aeruginosa alginate // FEMS Microbiol. Lett. V. 1993. 110. P. 101-106.

68. Matsubara Y., Iwasaki K., Muramatsu T. Action of poly (a-L-guluronate) lyase from Corynebacterium sp. ALY-1 strain on saturated oligoguluronates // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1998a. V. 62. P. 1055-1060.

69. Matsubara Y., Kawada R., Iwasaki K., Oda T., Muramatsu T, Extracellular polu(alpha-L-guluronate) lyase from Corynebacterium sp.: Purification, characteristics, and conformational properties // J. Protein Chem. 1998b. V. 17. P. 29-36.

70. McClure M.O., Moore J.P., Blanc D.F. Investigations into the mechanism by which sulfated polysaccharides inhibit HIV-infection in vitro // ADS Research and Human Retroviruses. 1992. V. 8. P. 19-26.

71. Medcalf D.G., Schneider T.L., Barnett R.W. Structural features of a novel glucuronogalactofucan from Ascophyllum nodosum II Carbohydr. Res. 1978. V. 66. P. 167-171.

72. Mikhailov V.V., Romanenko L.A., Ivanova E.P. In The Prokaryotes. / Eds. Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, T., Schleifer K.-N., Stackebrandt: Springer, N. Y., 2002. (http://www.prokaryotes.com).

73. Millet J., Jouault S.C., Mauray S. Antithrombotic and anticoagulant activities of a low molecular weight fucoidan by the subcutaneous route // Thromb. Haemost. 1999. V. 81. P. 391-395.

74. Min K.H, Sasaki S.F., Kashiwabara Y., Nisizawa K. Substrate specificity of endo-polyguluronide lyases from Pseudomonas sp. on the basis of their kinetic properties // J. Biochem. 1977a. V. 81. P. 547-553.

75. Min K.H., Sasaki S.F., Kashiwabara Y., Umekawa M., Nisizawa K. Fine structure of SMG alginate fragment in the light of its degradation by alginate lyases of Pseudomonas sp. // J. Biochem. 1977b. V. 81. P. 555-562.

76. Miyazaki M., Obata J., Iwamato Y., Oda T., Muramatsu T. Calcium-sensitive extracellular poly(alpha-L-guluronate) lyase from a marine bacterium Pseudomonas sp. strain F6: Purification and some properties // Fisheries Sci. 2001. V. 67. P. 956-964.

77. Mori H., Kamei H., Nishide E., Nishizawa K. Sugar constituents of some sulfated polysaccharides from the sporophylls of wakame (Undaria pinnatifida) and their biological activities // Mar. Algae Pharm. Sci. 1982. V. 2. P. 109-115.

78. Mulloy B., Ribeiro A., Alves A., Vieira R., Mourao P. Sulfated fucans from echinoderms have a regular tetrasaccharide repeating unit defined by specific patterns of sulfation at the 0-2 and 0-4 position II J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 22113-22123.

79. Muramatsu T., Egawa K. Isozymes of alginate lyase in the mid-gut gland of Turbo cornutus II Agric. Biol. Chem. 1980. V. 44. P. 2587-2594.

80. Muramatsu T., Hashimoto H., Takahashi T. Physicochemical characteristics and conformational features of alginate lyase isozymes from Turbo cornutus // Agric. Biol. Chem. 1984. V. 48. P. 79-85.

81. Murata K., Inose T., Hisano T., Abe S., Yonemoto Y., Yamashita T., Takagi M., Saicaguchi K., Kimura A., Imanaka T. Bacterial alginate lyase: Enzymology, genetics and application // J. Ferment. Bioeng. 1993. V. 76. P. 427-437.

82. Nagumo T., Nishino T. Fucan Sulfates and Their Anticoagulant Activities // In: Polysaccharides in Medicinae Applications. (Ed. S. Dumitriu). University of Sherbrooke, Quebec, Canada. N. -York-Basel-Hong Kong. 1997. P. 545-574.

83. Nakada H.I., Sweeny P.C. Alginic acid degradation by eliminases from abalone hepatopancreas //J. Biol. Chem. 1967. V. 242. P. 845-851.

84. Nakagawa A, Ozaki T, Chubachi K, Hosoyama T, Okubo T, et al. An effective method for isolating alginate lyase-producing Bacillus sp. ATB-1015 strain and purification and characterization of the lyase // J. Appl. Microbiol. 1998. V. 84. P. 328335.

85. Nelson T.E. A photometric adaptation of the Somogy method for the determination of glucose // J. Biol. Chem. 1944. V. 153. P. 375-381.

86. Nisano T., Nishimura M., Yamashita T., Sakaguchi K., Murata K. On the self-processing of bacterial alginate lyase // J. Ferment. Bioeng. 1994. V. 78. P. 109-110.

87. Nishino T., Kiyohara H., Yamada H., Nagumo T. An anticoagulant fucoidan from the brown seaweed Ecklonia kurome II Phytochemistry. 1991a. V. 30. P. 535-539.

88. Nishino T., Nagumo T., Kiyohara H., Yamada H. Structural characterization of a new anticoagulant fucan sulfate from the brown seaweed Ecklonia kurome II Carbohydr. Res. 1991b. V. 211. P. 77-90.

89. Nisizawa K., Fujibayashi S., Kashiwabara Y. Alginate lyases in the hepatopancreas of a marine mollusc, Dolabella auricular Solander // J. Biochem. 1968. V. 64. P. 25-37.

90. Obluchinskaya E., Vaskoboinikov G., Galynkin V. Contens of alginic acid and fucoidan in focus algae of the Barents sea // Appl. Biochem. Microbiol. 2002. V. 38. P. 186-188.

91. Okazaki M., Furuya K., Tsukayama K., Nisizawa K. Isolation and identification of alginic acid from a calcareous red alga Serraticardia maxima II Bot. Mar. 1982. V. 25. P. 123-131.

92. Okinaka Y., Mimori K., Takeo K., Kutamura S., Takeuchi Y., Yamaoka N., Yoshikawa M. A structural model for the mechanisms of elicitor release from fungal cell walls by plant beta-l,3-endoglucanase // Plant. Physiol. 1995. Vol. 109. № 3.P. 839-845.

93. Patankar M.S., Oehninger S., Barnett T., Williams R., Clark G. A revised structure for fucoidan may explain some of its biological activities // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 21770-21776.

94. Pecina A., Pascual A., Paneque A. Cloning and expression of the algL gene, encoding the Azotobacter vinelandii alginate lyase: purification and characterization of the enzyme//J. Bacteriol. 1999. V. 181. P. 1409-1414.

95. Percival E. Glucuronoxylofucan, a cell-wall component of Ascophyllum nodosum. Part I // Carbohydr. Res. 1968. V. 7. P. 272-283.

96. Percival E. Glucuronoxylofucan, a cell-wall component of Ascophyllum nodosum. Part II. Methylation // Carbohydr. Res. 1971. V. 17. P. 121-126.

97. Percival E., McDowell R.H. Chemistry and Enzymology of Marine Algal Polysaccharides. N. Y.-L.: Acad. Press. 1967. P. 219.

98. Percival E., Young M. Carbohydrates of the brown seaweeds. Part III. Desmarestia aculeate II Carbohydr. Res. 1974. V. 32. P. 195-200.

99. Pitt T.L., Raisbeck L.C. Degradation of the mucoid polysaccharide of Pseudomonas aeruginosa by Beneckea pelagia II J. Appl. Bacteriol. 1978. V. 45. P. 297-300.

100. Ponce M.A., Pujol C.A., Damonte E.B., Flores M.L., Stortz C.A. Fucoidans from the brown seaweed Adenocystis utricularis: extraction methods, antiviral activity andmstructural studies // Carbohydr. Res. 2003. V. 338. P. 153-165.

101. Preiss J., Ashwell G. Alginic acid metabolism in bacteria. I. Enzymatic formation of unsaturated oligosaccharides and 4-deoxy-L-eayi/i/-o-5-hexoseulose uronic acid // J. Biol. Chem. 1962. V. 237. P. 309-316.

102. Redenbach M., Kieser H.M., Denapaite D., Eichner A., Cullum J. A set of ordered cosmids and a detailed genetic and physical map for the 8 Mb Streptomyces coelicolor A3 (2) chromosome // Mol. Microbiol. 1996. V. 21. P. 77-96.

103. Rehm B.H.A. Alginate lyase from Pseudomonas aeruginosa CFl/Mlprefers the hexameric oligomannuronate as substrate // FEMS Microbiol. Lett. 1998. V. 165. P. 175180.

104. Riesen V.L. Digestion of algin by Pseudomonas maltophilia and Pseudomonas put ida II Appl. Environ. Microbiol. 1980. V. 39. P. 92-96.

105. Romeo Т., Preston J.F. Purification and structural properties of an extracellular (1—>4)-p-D-mannuronan-specific alginate lyase from a marine bacterium // Biochemistry. 1986. V. 25. P. 8385-8391.

106. Rossel K.G., Srivastava L.M. Seasonal variation in the chemical constituents of the brown algae Macrocystis integrifolia and Noveocystic luetkeana II Can. J. Bot. 1984. V. * 62. >.2229-2236.

107. Saga N. Isolation of protoplasts from edible seaweeds // Bot. Mag. 1984. V. 97. P. 423-427.

108. Sakai Т., Kimura A., Kato I. A marine strain of Flavobacteriaceae utilizes brown seaweed fucoidan // Mar. Biotechnol. 2002. V. 4. P. 399-405.

109. Sakai Т., Takeshi S., Kimura A., Hitomi H., Kojima D., Kaoru S., Ikai В., щ Katsushige K., Akiyoshi N., Sumiko S., Nakanishi K., Kato I., Ikunoshin R. Endo alginate lyase // 2001. Patent USA № 6277616.

110. Sasaki KM Sakai Т., Kojuma K., Nacayama S., Nakanishi Y., Kato I. Partialpurification and characterization of an enzyme releasing 2-sylfo-a-L-fucopyranose from2.sulfo-a-L-fucopyranosyl-(l—>2)pyridylaminated fucose from a sea urchin,

111. Strongylocentrotus nudus II Biosci. Biotech. Biochem. 1996. V. 60. P. 666-668. i

112. Sawabe T. // Nippon. Suisan. Gakkaishi. 2000. V. 66. P. 615-618. (перевод с японского на русский).

113. Sawabe Т., Ezura Y., Kimura Т. Characterization of an alginolytic marine bacterium from decaying Rishiri-kombu Laminaria japónica var. ochotensis // Nippon. Suisan. Gakkaishi. 1992. V. 58. P. 141-145.

114. Sawabe Т., Ohtsuka M., Ezura Y. Novel alginate lyases from marine bacterium Alteromonas sp. strain H-4 // Carbohydr. Res. 1997. V. 304. P. 69-76.

115. Sawabe Т., Sawada C., Suzuki E., Ezura Y. Intracellular alginate-oligosaccharide degrading enzyme activity that is incapable of degrading intact sodium alginate from a marine bacterium Alteromonas sp. //Fisheries Sci. 1998. V. 64. P. 320-334.

116. Schaumann K., Weide G. Enzymatic degradation of alginate by marine fungi // Hydrobiologia. 1990. V. 204/205. P. 589-596.

117. Schiller N., Monday S., Boyd C., Keen N., Ohman D. Characterization of the Pseudomonas aeruginosa alginate lyase gene (.AlgL): cloning, sequencing, and expression in Esherichia coli II J. Bacterid. 1993. V. 175. P. 4780-4789.

118. Schweiger R.G. Methanolysis of fucoidan. II. The presence of sugars other than L-fucose//J. Org. Chem. 1962. V. 27. P. 4270-4276.

119. Seiderer L.J., Newell R.C., Cook P.A. Quantitative significance of style enzymes from two marine mussels (Choromytilus meridionalis Krauss and Perna perna Linnaeus) in relation to diet // Mar. Biol. Lett. 1982. V. 3. P. 257-271.

120. Shimokawa T., Yoshida S., Kusakabe I., Takeuchi T., Murata K., Kobayashi H. Some properties and action mode of (1—>4)-p-L-guluronan lyase from Enterobacter cloacae M-l // Carbohydr. Res. 1997a. V. 304. P. 125-132.

121. Shiraiwa Y., Abe K., Sasaki S.F., Ikawa T., Nisizawa K. Alginate lyase activities in the extracts from several brown algae // Bot. Mar. 1975. V. 18. P. 97-104.

122. Skjak-Brak G. Alginates: biosynthesis and some structure-function relationships relevant to biomedical and biotechnological applications // Biochem. Plant Polysacch. 1992. V. 20. P. 27-33.

123. Skjak-Brak G., Larsen B., Grasdalen H. The role of O-acetyl groups in the biosynthesis of alginate by Azotobacter vinelandii II Carbohydr. Res. 1985. V. 145. P. 169-174.

124. Skjak-Brak G., Grasdalen H., Larsen B. Monomer sequence and acetylation pattern in some bacterial alginates // Carbohydr. Res. 1986. V. 154. P. 239-250.

125. Skjak-Brak G., Martinsen A. Applications of some algal polysaccharides in biotechnology // In Seaweed Resources in Europe: Uses and Potential, ed. MD Guiry, GBlunden, 1991. P. 219-257. NewYork: Wiley & Sons.

126. Stevens R.A., Levin R.E. Purification and characteristics of an alginase from Alginovibrio aquatilis II Appl. Environ. Microbiol. 1977. V. 33. P. 1156-1161.

127. Suda K., Tanji Y., Hori K., Unno H. Evidence for a novel Chlorella virus-encoded alginate lyase //FEMS Microbiol. Lett. 1999. V. 180. P. 45-53.

128. Sutherland I.W., Keen G.A. Alginases from Beneckea pelagia and Pseudomonas spp. // J. Appl. Biochem. 1981. V. 3. P. 48-57.

129. Takeshita S., Oda T., Muramatsu T. Spectroscopic studies on dénaturants and guluronate lyase from a marine bacterium // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1995. V. 59. P. 881-885.

130. Takeshita S., Sato N., Igarashi M., Muramatsu T. A highly dénaturant durable alginate lyase from a marine bacterium Purification and properties // Biosci. Biotech. Biochem. 1993. V. 57. P. 1125-1128.

131. Tanaka K., Nakano T., Nogychi, Rigman W. Purification of a-L-fucosidase of Abalone livers //Arch. Biochem. Biophys. 1968. V. 126. P. 624-633.

132. Thanassi N.M., Nakada G.I. Enzymic of degradation fucoidan by enzymes from the hepatopancreas of Abalone//Arch. Biochem.Biophys. 1967. V. 118. P. 172-177.

133. Tseng C., Yamaguchi K., Kitamikado M. 2 Types of alginate lyase from a marine bacterium Vibrio sp. Al-9 // Nippon. Suisan. Gakkaishi. 1992a. V. 58. P. 743-749.

134. Tseng C., Yamaguchi K., Kitamikado M. Isolation and some properties of alginate lyase from a marine bacterium Vibrio sp. Al-128 // Nippon. Suisan. Gakkaishi. 1992b. V. 58. P. 533-538.

135. Tseng C., Yamaguchi K., Nshimura M., Kitamikado M. Alginate lyase from Vibrio-Alginolyticus ATCC-17749 // Nippon. Suisan. Gakkaishi. 1992c. V. 58. P. 2063-2067.

136. Warren J. Microbial hydrolysis of polysaccharides // Annu. Rev. Microbiol. 1996. V. 50. P. 183-212.

137. Watanabe T., Nisizawa K. Enzymatic studies on alginate lyase from Undaria pinnatifida in relation to texture softening prevention by ash-treatment (Haiboshi) // Bull. Jpn. Soc. Sci. Fish. 1982. V. 48. P. 243-249.

138. Wong T., Preston L., Schiller N. Alginate lyase: Review of major sources and enzyme characteristics, structure-function analysis, biological roles, and applications // Annu. Rev. Microbiol. 2000. V. 54. P. 289-340.

139. Yonemoto Y., Tanaka H., Hisano T., Sakakuchi K., Abe S., Yamashita T., Kimura A., Murata K. Bacterial alginate lyase gene: nucleotide sequence and molecular route for generation of alginate lyase species // J. Ferment. Bioeng. 1993. V. 75. P. 336-342.

140. Yoon H., Hashimoto W., Katsuya Y., Mezaki Y., Murata K., Mikami B. Crystallization and preliminary X-ray crystallographic analysis of alginate lyase Al-II from Shingomonas species A1 // Biochem. Biophys. Acta. 2000. V. 1476. P. 382-385.

141. Yoon H., Hashimoto W., Miyake O., Murata K., Mikami B. Crystal structure of alginate lyase Al-III complexed with trisaccharide product at 2.0 A resolution // J. J. Mol. Biol. 2001. V. 307. P. 9-16.

142. Yoon H., Mikami B., Hashimoto W., Murata K. Crystal structure of alginate lyase Al-III from Shingomonas species A1 at 1.78 A resolution // J. Mol. Biol. 1999. V. 290. P. 505-514.

143. Zhuang C., Itoh H., Mizuno T., Ito H. Antitumor active fucoidan from the brown seaweed, umitoranoo (Sargassum thunbergii) // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1995. V. 59. P. 563-567.

144. Zvyagintseva T.N., Shevchenko N.M., Popivnich I.B., Sundukova E.V., Isakov V.V., Scobun A.S., Elyakova L.A. A new procedure for the separation of water-soluble polysaccharides from brown seaweeds // Carbohydr. Res. 1999. V. 332. P. 32-39.

Информация о работе

Алексеева, Светлана Анатольевна
кандидата биологических наук
Владивосток, 2003
ВАК 03.00.04

Диссертация

Ферменты морских бактерий Pseudoalteromonas citrea, катализирующие деградацию полианионных полисахаридов бурых водорослей - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Ферменты морских бактерий Pseudoalteromonas citrea, катализирующие деградацию полианионных полисахаридов бурых водорослей - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы