Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ИЗУЧЕНИЕ КУЛЬТУР КЛЕТОК И ТКАНЕЙ МОРСКИХ МАКРОФИТНЫХ ВОДОРОСЛЕЙ

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "ИЗУЧЕНИЕ КУЛЬТУР КЛЕТОК И ТКАНЕЙ МОРСКИХ МАКРОФИТНЫХ ВОДОРОСЛЕЙ"



московский ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ 1М.В. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах руютшен

УДК 532.271;582.272:582.273:576.535

ВАСИЛЬЕВ ВЛАДИСЛАВ ГЕННАДЬЕВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ КУЛЬТУР КЛЕТОК И ТКАМЙ* МОРСКИХ ММСРОФИТНЫХ водорослей

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соисжаиже ученой степени кандидата биололтоескнх наук

Мосста-2003.

Рабата выполнена на кафедре физиологии микроорганизмов биологического факультета Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор А.Х. Тамбиев

Официальные оппоненты:

' доктор биологических наук В. А. Силкин

кандидат биологических наук В.Б, Васин

Ведущая организация:

Институт океанологии РАН

Зашита диссертации состоится «20» ноября 2003 г,, в 15ч. ЗОмин. на заседании диссертационного совета Д.501.001.052 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: ) ] 9899, Москва, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет, дом 1, корпус 12, ауд. М-1.

С диссертации: факультета МГУ.

Авторефера

14ІГ

Ц:

і К

. V биологического

Ученый секретарь дн,, , ■ •

Д.501.001.052 при МГУ ¡м.М.1 Ломоносова , Кандидат биологических наук. ' / А

1 и

Іігг ЗСали страто ва

ИЗУЧЕНИЕ КУЛЬТУР КЛЕТОК И ТКАНЕЙ МОРСКИХ МАКРОФИТНЫХ ВОДОРОСЛЕЙ

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Культуры клеток и тканей растений являются удобным объектом для физиологических, генетических и биохимических исследований, а также источником ценных продуктов клеточного метаболизма (Бутенко, 1964; 1984). Исследования способов ведения культур тканей морских макрофитных водорослей, были начаты в 60-70 годы в Швеции и Японии (Fries, 1963; 1977; Nakamura, 1974; Saga et ab, 1978; Chen, Taylor, 1978). У нас в стране это было начато в 1983 г. в группе проф. А.Х. Тамбиева. В перспективе это могло бы заменить добычу макрофитов и одновременно с выращиванием водорослей в хозяйствах марикультуры служить источником промышленно важных соединений водорослей, таких как агар, каррагинан, альгинаты и др.

В настоящее время показана возможность получения каллусных культур, аксеничного вегетативного роста, протопластов из ряда видов морских водорослей (Polne-Fuller, Gibor, 1984; Гусев, Тамбиев и др., 1984; Garcia-Reina et al., 1991; Mollet et al„ 1995; Rusig A.-M. et al., 2001), a также только двух суспензионных клеточных культур (Chen, 1989; Tait et. al., 1990).

Однако исследования культур тканей морских макрофитных водорослей достаточно трудны, что связано с их гетерогенностью по морфологическим, физиологическим и биохимическим характеристикам, сложным жизненным циклам, недостатком знаний о механизмах роста, трудностью получения аксеничных культур и, как правило, их медленным ростом.

Возможно, что, учитывая происхождение макрофитных водорослей, правомерно проводить сопоставление их культур тканей с колониальными формами водорослей, где может наблюдаться лишь начальная

д нфферен циация.

ЦНБ МОХА

В настоящее время весьма важным является ведение и развитие культур тканей новых видов морских макрофнтных водорослей с полезными для человека свойствами, а также оптимизация условии автономного культивирования их клеток и тканей с целью получения различных ценных -продуктов.

Цель и задачи исследования. Основной целью нашей работы я мялось исследование возможностей получения каллусного роста, жизнеспособных суспензий клеток и протопластов из талломов красных, бурых и зеленых морских макрофнтных водорослей.

В соответствии с этим в работе были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Подбор условий стерилизации и получение аксеничного материала нз талломов нескольких видов морских макрофитных водорослей.

2. Получение каллусного и вегетативного роста из эксплантатов водорослей в аксеничных условиях.

3. Подбор коммерческих ферментных препаратов для мацерации талломов водорослей.

4. Поиск и выделение природных продуцентов экзоферментов для разрушения специфических компонентов клеточных стенок водорослей.

5. Получение природных ферментных препаратов и изучение их ферментативных активностей.

6. Исследование эффективности воздействия коммерческих и природных ферментных препаратов на талломы морских макрофитных водорослей с целью получения жизнеспособных суспензий клеток к протопластов.

7. Изучение физиологических характеристик полученных в работе суспензий клеток и протопластов исследуемых видов макрофитнык водорослей.

Научная новизна работы. Выявлены индивидуальные комплексы антибиотиков, эффективные для получения аксеничных эксплантатов из

талломов нескольких видов морских водорослей. Установлена возможность полунения каллусного и вегетативного роста из эксплантатов тропической морской макрофитной красной водоросли - Во1гуос1ас11а пеизЬЫи.

Показана возможность роста нескольких видов наземных грибов (21 штамма)- продуцентов экзоферментов на сухой биомассе морской красной водоросли В.пеизЬиШ

Исследована активность полученных в работе природных ферментных препаратов (из грибов и моллюска 1л Поп па Шогеа) и их эффективность при разрушении клеточных стенок и межклетников красных водорослей. При помощи коммерческих и экспериментально подобранных ферментных препаратов получены жизнеспособные клеточные суспензии из талломов ряда видов морских макрофитных водорослей.

Получено значительное количество протопластов из талломов красных, бурых и зеленых макрофитных водорослей, некоторые из которых способны к регенерации клеточных стенок.

Практическое значение работы. Выявленные в работе комплексы антибиотиков могут быть использованы для получения аксеничных культур из ряда видов морских макрофитных водорослей.

Отработанные методики получения жизнеспособных клеточных суспензий и протопластов ряда видов красных, бурых и зеленых морских макрофитных водорослей могут быть рекомендованы для использования на других представителях водорослей.

Получение каллусов, жизнеспособных клеточных суспензий и протопластов, способных к регенерации клеточных стенок, открывают перспективы перехода к суспензионным культурам морских макрофитных водорослей - автономным источникам ценных пищевых и лекарственных продуктов.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на конференциях:

VJJI Международная конференция и дискуссионный научный клуб; «Новые информационные технологии в медицине и экологии». Гурзуф, 6-10 июня 2000 г.

Международная научная конференции «Автотрофные микроорганизмы». Москва, 13-15 декабря 2000 г.

IX Международная конференция и дискуссионный научный клуб; «Новые информационные технологии в медицине и экологии». Гурзуф, , 1-Ю июня 2001 г.

Международная научная конференция «Биологические ресурсы и устойчивое развитее» Россия, Пущино Московской области, 29 октября - 2 ноября 2001 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на V/Рстраншш текста и включает 1В рисунков н таблицы.

В обзоре литературы изложены современные представления о культуре клеток и тканей морских макрофитных водорослей. Список литературы содержит ссылки на 291 источник, из которых 198 - зарубежные.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования служили морские макрофитные водоросли, относящиеся к отделам: Rhodophyta, CWorophyta, Phaeophyta.

I Жрэсные морские макрофитные водоросли, относящиеся к классам:

Bangiophycea: Porphyra amplissima (Kjellm.) Setcb. Et Hus.

Florid eophycea: Botryocladia neushulii; Phyllophora nervosa (D.C.) Grev.

2)3елсные морские макрофитные водоросли:

Chlorophyceaceae: Ulva sp.; UI varía sp ! enden s Rupr.; Caulerpa proliféra (Forsk.) Lamour. (nop. Siphonales); Caulerpa mexicana (Sonder) J. Agardh (nop. Siphonales); Enteromorpha intestinalis.

3) Бурые морские макрофитные водоросли:

Laminaria saccharina (L.) Lam.

Методы

Получение аксеничних эксплантатов из талломов морских макрофитных водорослей

а) При помощи поверхностных стерилизующих агентов. В качестве поверхностно стерилизующих агентов применялись два вещества: хлоргиксидинбиглюконат (ХГ) и бетадин (йодированный поливиннлпирроллидон, фирмы Alca!oid).

Обработку талломов морских макрофитных водорослей при помощи ХГ, по ранее предложенной методике (Гусев, Тамбиев и др., 1984), проводили следующим образом: части талломов погружали на 1—2 мин в 70%-ный этиловый спирт, промывали стерильной морской водой и переносили в раствор ХГ, ранее успешно примененный для высших растений (Бутенко с соавт., 1983). ХГ испытывали в концентрации 1—5 об. %. Время обработки ХГ варьировали от 3 до 10 мин. ХГ применялся на ранних этапах исследования, в большинстве же случаев, как показала практика наиболее эффективным оказался бетадин, который применялся по сходной методике (Gibor et al., 1981; Pol ne-Fu 11er, Gibor, 1984; Ramalakshmi Datta, В К Datta & V D Chauhan, 1994). Обработку бетадином проводили раствором в концентрации 0,5—5 об. % в течении 3—15 минут.

б) При помощи антибиотиков. Индивидуальный подбор комплексов антибиотиков для каждого из использованных видов водорослей осуществляли модифицированным методом антибиотических дисков (АБ-дисков) (Bauer et al.,

1966), который включал выделение чистых культур сопутствующих бактерий и подбор антибиотиков, эффективных для подавления основного числа выделенных бактериальных культур. Выделение чистых культур сопутствующих бактерий из талломов водорослей проводили следующим образом: фрагменты талломов водорослей измельчали в ручном стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком. Полученную суспензию после серии разбавлении высевали в чашки Петри и равномерно распределяли стеклянным шпателем по поверхности 0,3—0,5% бактоагара со средой PES (Provasoll, 1968), обогащенной 2% сахарозой. Культуры инкубировали в термостате при температуре 22°С в течение 1—2 недель.

Чувствительность бактериальных культур к каждому из проверенных антибиотиков определяли по величине диаметра (в мм) зоны ингибировання вокруг соответствующего АБ-диска,

Стерилизацию эксплантатов водорослей проводили следующим образом: талломы водорослей, предварительно обработанные в растворе стерилента, промывали в стерильной морской воде и измельчали на фрагменты величиной 5—8x5—8 мм. Фрагменты талломов помещали на 1—2 суток в раствор экспериментально подобранных для данного вида водоросли антибиотиков, приготовленных на морской воде в концентрации 100 мг/мл (Droop, 1967) и стерилизованных фильтрованием через асбестовый фильтр. После отмывания в стерильной морокой воде от антибиотиков эксплантаты переносили на поверхность 0,3—0,5 % бактоагара со средой PES, в ряде случаев обогащенной 2% сахарозой, в чашки Петри для проверки на аксеничность.

Подбор ферментных препаратов для мацерации тканей водорослей. Для мацерации тканей водоросли использовали коммерческие ферментные препараты, а так же ферментные комплексы, выделенные нами из природных продуцентов:

1)Морского моллюска Littorina littorea

Экстракт пищеварительной системы получали и частично очищали, согласно предложенной ранее методике (Усов и др., 1970)

2)Ряд видов почвенных микро- и макромицетов, приспособленных к усвоению биомассы красных водорослей.

Для работы использовались штаммы наземных грибов, имеющие целлюлазную активность, выделенные из почв Московской, Тверской, Костромской областей, а также почв Алтая и Камчатки, предоставленные нам кафедрой микологии и альгологии Биологического факультета МГУ.

Коллекцию штаммов грибов поддерживали на скошенной агарнзо ванной среде Чапека, Среду инокулировали смыванием спор, либо добавлением мицелия. Грибы выращивались в термостате при температуре 24°С в темноте в течение 14 суток. Рост наземных грибов оценивался визуально.

Контроль ферментативной активности проводили методом определения восстанавливающей способности растворов реакцией с 3,5-динитросалициловой кислотой. К 0,5 мл раствора прибавляют 0,5 мл реагента, тщательно перемешивают, нагревают 10 минут на кипящей водяной бане, после охлаждения прибавляют 1 мл воды и измеряют оптическую плотность при 490 нм (Усов, 1969).

Реакционную способность (РС) среды, содержащей экзометаболиты и внеклеточные продукты, складывающуюся из соотношения окислительной активности (АО) и антиокислительной активности (АОА), определяли методом химических моделей (Тамбиев, 1974, 1984).

Получение жизнеспособных клеточных суспензий и протопластов. Аксеничные фрагменты таллома водорослей (0,5г) помещали на 30 мин в экспериментально подобранный осмотический раствор, чтобы вызвать предварительный плазмолиз, после чего измельчали стерильным лезвием. Затем добавляли 2,5 мл 0,5-3 % ферментных растворов, приготовленных на основе цитратно-фосфатного буфера при экспериментально подобранных

значениях pH. В этой литической смеси водоросли оставляли на 2-12 часов в темноте при комнатной температуре.

Полученную суспензию клеток и протопластов отмывали от ферментов в стерильной морской воде с добавлением осмотика при 3-5-кратном центрифугировании и фильтровали через нейлоновые сетки для освобождения от фрагментов таллома.

Отсутствие клеточной стенки у протопластов определяли окрашиванием 0,01% толуидиновым голубым при pH 1,0(МсСиНу, 1970).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Получение аксеничного материала, из талломов морских макрофитных водорослей.

В настоящее время не существует универсального метода получения аксеничных культур морских макрофитных водорослей, поскольку каждая водоросль, собранная в естественных условиях, характеризуется особым индивидуальным набором сопутствующей микрофлоры (Butler, Evans, 1990).

В ходе работы нами была отработана методика получения аксеничного материала из талломов нескольких видов морских макрофитных водорослей при двухступенчатой обработке поверхностными стерилизующими агентами и комплексами антибиотиков (Тамбисв, Николаева, 1996),

Нами был осуществлен подбор времени обработки и концентрации хлоргексидинбиглюканата (ХГ) для получения аксеничного материала двух видов красных морских водорослей В. neushulii и Ph. nervosa. При этом было показано, что для подверженного сильным обрастаниям таллома Ph. nervosa необходима инкубация эксплантатов в 5% растворе ХГ в течение 20-25 минут, а В. neushulii достаточна обработка 1% раствором в течение 5 минут. Однако использование ХГ во многих случаях приводило к быстрому обесцвечиванию и

гибели эксплантатов. В связи с этим в дальнейших экспериментах в качестве поверхностного стеря лента применяли йодистый поливнмнлпироллидон (бстадин).

Для талломов красных, зеленых и бурых морских макрофитных водорослей, используемых в работе, относящихся к разным классам, имеющих разное строение и отличающееся по сложности таллома использование бстадина приводило к подавлению основного количества микроорганизмов. При этом бетадии не был токсичен для слоевищ водорослей. В результате этой обработки примерно 90-95% эксплантатов сохраняли нормальную пигментацию.

Из таблицы I следует, что обработка бетадином частей талломов В. neiishulii способствовало выявлению нового бактериального нзолята, рост которого в обычных условиях, по-видимому, ингибировался доминирующей микрофлорой. Подобные данные получены н для других исследованных видов водорослей, а также имеется литература по подобным исследованиям. Так, после обработки бетэдином таллома А. plicata, были выявлены новые бактериальные нзоляты, а из таллома P. pat mata были изолированы агаролнтические бактерии.

Так как в отношении некоторых бактерий, в том числе живущих глубоко внутри таллома водоросли, а также для водорослей, имеющих слизь, бетадин был малоэффективен, то необходимо было его применение с экспериментально подобранными комплексами антибиотиков.

Наборы антибиотиков, эффективные для получения аксепичных культур водорослей, должны включать в себя агенты, подавляющие рост всего комплекса сопутствующей микрофлоры данной водоросли. С этой целью ит талломов водорослей, растертых в гомогенизаторе и высеянных на поверхность

Таблица 1.

Эффективность подавления сопутствующей бактериальной микрофлоры морской красной водоросли В. пешЬиШ различными антибиотиками, с предварительной обработкой бетадином.

Тип Колонии Зона подавления бактериального роста вокруг АБ-дисков, мм

стр лев пен эри тег амп ген нео Риф Фд

Бело-Кремовая 0 10 0 7 0 0 0 0 13 2

Желто-Бежевая, 2 12 0 0 5 8 0 0 6 1

разжижает агар

Беловатые, 0 1 0 10 3 0 ! 0 8 0

Мелкие

Таблица 2.

Эффективность подавления сопутствующей бактериальной микрофлоры морской красной водоросли В. пеш&иШ различными антибиотиками, без предварительной обработки бетадином.

Тип Колонии Зона подавления бактериального роста Вокруг АБ-дисков, мм

стр лев пен эри тег амп ген нео риф фд

Желто-Бежевая 5 2 0 1 8 0 0 1 10 2

Бежевая 0 10 0 2 6 6 1 0 5 1

Желто-Бежевая, і 12 1 0 5 7 0 0 6 0

разжижает агар

Бело-Кремовая 0 12 0 8 2 0 0 0 13 3

Розовая 8 8 1 1 10 6 1 0 5 I

стр-стрептомицин, лев-левом и цетин, пен-пенициллин, зри-эрмтромицин, тст-тетрациклии, аміьампициллин, ген-гсита ми цин, нео-неомицин, риф-рифампиции, фд-фурадонин.

ю

питательного агара, были выделены в чистую культуру все обнаруженные бактериальные изоляты, если они отличались по цвету, фирме или плотности колонии. Затем каждый из выделенных изолятов был проверен на чувствительность к набору антибиотических дисков (фото 1).

При выделении сопутствующих бактерий оказалось существенным растирание водорослевых тканей в гомогенизаторе, что позволило выявить линии бактерий, обитающих глубоко внутри таллома.

Фото 1. Чувствительность бактериального изолята 4 (таблица 2) из таллома В. пешЬЫи к набору антибиотиков: стрептомицин, левомицетин, пенициллин, эритромицин, тетрациклин, ампициллин, гентамицин, неомицин, рифампицин, фурадонин.

Эффективность различных антибиотиков по отношению к бактериальной микрофлоре тропической морской красных водорослей В. neushulii (без предварительной обработки таллома бетадином и с обработкой) представлена в таблицах 1,2.

Из полученных данных следует, что для достижения аксеничной культуры морской красных водорослей В. neushulii необходима двухступенчатая обработка таллома бетадином и строго индивидуальным набором антибиотиков. Комплекс антибиотиков должен включать рифампицин или левомицетнн, которые подавляют рост большинства бактериальных изолятов, и тетрациклин и эритромицин, которые ингибируютжизнедеятельность изолята 5 из таблицы 2 и изолята 3 из таблицы I соответственно. Полученные данные согласуются с данными полученными ранее на беломорских красных водорослях Ahnfeltia plicata, Palmaria paimata и Phyllophora brodiaei, где наиболее эффективными оказались антибиотики левомицетнн, тетрациклин и эритромицин. Поэтому комплекс из антибиотиков рифампицин, левомицетин, тетрациклин, эритромицин в комбинации с обработкой бетадином был в дальнейшем использован для получения аксеничного материала и из других исследованных в данной работе видов водорослей. После проверки на аксеиичность в течение одного месяца около 90-95% эксплантатов сохраняли зксеничность и естественную пигментацию, при этом не было отмечено токсического действия использованных антибиотиков.

Культивирование эксплантатов морских макрофитных водорослей в зкееннчных условиях. Каллусный и вегетативный рост. О возможности получения вегетативного роста и каллусных структур эксплантатов водорослей-макрофитов различных отделов сообщалось в ряде работ (Гусев с соавт., 1984, 1987; Тамбиев с соавт., 1984, 1996; Chen, Taylor, 1978; Fries, 1980, 1984; Saga et al. 1982; Polneetal. 1983; Polne-Fulier, Gibor 1984, 1987). Однако в настоящее время до конца не выявлены условия индукции и поддержания. В

отличие от высших растений (Бутенко, 1964), у макрофитных водорослей не доказано непосредственное участие ростовых веществ в каллусогенезе (Garsia-Reina et al„ 1991).

В нашей работе изучалось влияние различной температуры и плотности фотонного потока на частоту образования каллуса и вегетативного роста из эксплантатов красной морской водоросли В. neushulii. Эксплантаты инкубировались на чашках Петри (Фото 2) на агаризованной среде PES и в колбах объемом 750мл, при этом изучали влияние степени перемешивания жидкой среды (частота вращения 50 об/мин, температура 25°С, плотность фотонного потока 40мкмоль фотонов m'V).

Рост каллуса индуцировался после 2 недель выращивания в культуре на агаризованной среде. Эксплантаты находились в температурном диапазоне 1525°С, но образование каллуса происходило только при 2(РС. Эта температура и низкая плотность фотонного потока 10 ммоль фотонов m'V являлись наиболее благоприятными для индукции каллуса (Фото 4-6). Каллус образовывался из коровых клеток раневой поверхности и был пигментированным, розоватого цвета. После 2 месяцев инкубации в культуре каллус имел размер 2-Змм. Каллусные клетки были эллипсоидальной или сферической формы.

Температура 151}С не приводила к образованию каллуса, при этом большая часть эксплантатов погибала (70 %), а оставшаяся часть образовывала слабый вегетативный рост спустя 4-6 недель культивирования. В естественных условиях водоросль В. neushulii растет в тропических широтах. По-видимому, этим и объясняется плохой вегетативный и каплусный рост при низкой для этого вида водоросли температуре, в отличие, например, от видов водорослей из Белого моря (Тамбиев А.Х., Николаева Е.В. 1996).

Наиболее высокий уровень вегетативного роста аксеничных эксплантатов наблюдался при 25ПС и плотности фотонного потока 40 ммоль фотонов м"2с"', как на жидкой, так и на агаризованной среде PES (Фото 2) и составлял 90% от

общего количества эксплантатов. Сначала происходило образование небольших округлых клеток на раневой поверхности в области медуллярных клеток с последующим увеличением количества нарастающих клеток в центре. Эти клетки, видимо, можно считать каллусными, т.к. они были похожи на клетки, выросшие из коровых клеток и образовавшие каллусную ткань (Фото 3). Они были так же пигментированными. Затем довольно быстро, в течение 3-х недель происходило превращение этих клеток в проросток, который всегда прорастал, образуя поплавок. После формирования на проростке поплавка его рост шел быстрее и, спустя 4-5 недель его длина составляла 1-1,5см.

Следует отметить, что такой вегетативный рост происходил из центра раневой поверхности и затрагивал только медуллярную ткань (Фото 9). Такой вегетативный рост наблюдался только в частях эксплантата, близких к апикальному концу. И в случае помещения разветвленного аксеничного эксплантата на питательную среду PES происходило формирование проростков на двух концах этого эксплантата.

Примерно в 7-10% случаев происходило образование двойных проростков (Фото 8), что никак не влияло на их дальнейший рост. Если часть эксплантатов в жидкой питательной среде PES помещались на качалку, то наблюдался только вегетативный рост, скорость которого была меньше скорости роста без перемешивания.

Скорость вегетативного роста во всех опытах была намного выше каллус ного. При оптимальных условиях выращивания эксплантаты удваивались по размеру за 6-8 недель инкубации в среде (Фото 7). Таким образом, превалирование каллус ного или вегетативного роста при инкубации эксплантатов В. neushulii зависело от условий инкубации.

Фот« 2>Аксснкчиые эксплантаты В, ncushutii на агэриэованной срсгс PES, Фото 3.Образование каллусной структуры иа апикальной рандой локрмлкггм эксплантата В. neusbuliU исходно* увеличение х, 100. Фото W, tCaiuycxue струггуры 13. ocushutii, йырпсише при н июкой плотности фотонного потока {см, текстХ у »сличение * 18> * 50t х 100 соответствешю- Фото 7,Проросток возраст 60 сут* исходное увеличение х 3. Фот* 8.0<>разовавгис двойных проростков на апикальной раненой поверхности эксплантата В. rteuühülü при росте • течение 30 сут., исходное увеличение *5. ФотеФА-Чгстатинный рост в. neushul» » течение 30 сут., нздодиос увеличение ж [0.

Получение и исследование характеристик жизнеспособных клеточных суспензий морских макрофитных водорослей, полученных механической мацерацией таллома

Сложность мацерации талломов морских макрофитов заключалась в большом разнообразии и непостоянстве состава полисахаридов клеточных стенок и межклеточного матрикса (Усов, 1985), а также в отсутствии высокоэффективных коммерческих ферментных препаратов, разрушающих эти полисахариды (Gomez-Pinchetti, Garcia-Reina, 1993), что приводит к необходимости индивидуального подбора ферментных комплексов для мацерации талломов водоросли.

Клеточную суспензию зеленой морской макрофитной водоросли Caulerpa proÜfera получали механическим растиранием водоросли в обычных условиях в морской воде с последующим фильтрованием через нейлоновые сетки.

В данной работе исследовалась реакционная способность (PC) питательной среды, содержащей, как нативные экзометаболиты, так и внеклеточные продукты, поступающие в среду после лизиса клеток, как показатель физиологического состояния эксплантатов таллома и клеточных суспензий морской макрофитной зеленой водоросли С, prolifera. Инкубацию полученных клеток и эксплантатов таллома проводили в искусственной морской воде и в дистиллированной воде. Одновременно с определением PC среды в суспензии определяли количество живых и мертвых клеток на продолжении инкубации в течение 7 суток.

Было показано, что PC среды как эксплантатов таллома, так и среды с суспензией клеток изменялась в процессе инкубации в искусственной морской воде. Через 1,5 часа инкубации в обоих вариантах наблюдалась выраженная окислительная активность (ОА) соответственно 115% и 128% по отношению к контролю. Через сутки значения PC среды переходят в антиокислительную активность (АОА), соответственно 85% и 80%, а через двое суток инкубации

РС в опыте с эксплантатами таллома возвращалась к ОА (110%). РС среды суспензии клеток сохраняла АОА (94%), при этом живые клетки составляли 3035% от их количества. При инкубации тех же проб в дистиллированной воде в течение двух суток наблюдалась выраженная ОА, более выраженная у таллома через сутки и сравнивающаяся по величине с АО суспензии клеток на вторые сугки.

Известно, что нативные экзометаболиты морских водорослей, в том числе макрофитных, обладают выраженной ОА, которая снижается при возникновении неблагоприятных условий культивирования (Тамбиев, 1984). При инкубации эксплантатов таллома и суспензии, полученных из него клеток в искусственной морской воде в течение первых суток падение ОА и переход в АОА можно, видимо, объяснить известным в литературе "культуральным шоком", наступающим при резком изменении условий инкубации. На вторые сутки как видно, эксплантаты таллома выходят из этого состояния, о чем свидетельствует появление ОА среды таллома, что нельзя сказать о среде суспензии клеток, где сохраняется АОА среды и находится около 70% живых клеток.

В дистиллированной воде "культуральный шок" наблюдается лишь в первые сутки в среде с эксплантатами таллома и не наблюдается в случае суспензии клеток, где происходит падение ОА в течение двух суток, сопровождающееся уменьшением количества живых клеток, что наблюдалось ранее у других видов водорослей (Тамбиев, Романова, 1990).

Таким образом, с помощью измерения РС возможно определить физиологическое состояние - наступление и прохождение "культурального шока" как у эксплантатов таллома, так и у полученных из него клеточных суспензий, изменяющих в течение опыта свою жизнеспособность.

Получение клеточных суспензий и протопластов с помощью коммерческих ферментных препаратов и препаратов, выделенных из природных продуцентов

Поскольку основную сложность мацерации талломов использованных в работе агарофитных и родственных им водорослей представляет разрушение специфических сульфатированных полисахаридов группы агара, входящих в состав клеточных стенок и межклетников, нами был осуществлен поиск продуцентов ферментных препаратов, обладающих агаразной активностью, и исследование эффективности использования этих препаратов для получения жизнеспособных клеточных суспензий из талломов красных водорослей.

В качестве источников ферментов были выбран морской моллюск Ь. ИЦогеа. Кроме того, в работе была предпринята попытка индуцировать синтез ферментных комплексов, необходимых для разрушения клеточных стенок и межклетников морских красных водорослей, у ряда видов наземных микро- и макромицетов, являющимися известными продуцентами целлюлаз, ксиланаз и пектина! (Синицын, 1993), путем наращивания мицелия грибов на сухой биомассе красной водоросли В. пеизИиШ (Фото 10).

Предварительный отбор штаммов грибов (18 видов, 30 штаммов) проводили на агаризованной (1,6%) модифицированной среде Чапека, не содержащей сахарозы с добавлением 4 г/л сухой биомассы водоросли В. пеизЬиШ. Среди них были отобраны штаммы, приведенные в таблице 3. Данные штаммы характеризовались достаточно хорошим ростом, и дальнейшие исследования проводили только с ними. Исходя нз того, что грибные ферменты являются адаптивными, мы осуществили ряд пассажей (до 10) грибных культур па жидкую среду, содержащую только сухую биомассу В. пеизГшШ в концентрации 10 г/л денонсированной воды МИМ О. Почти все грибы хорошо адаптировались к данной среде и к третьему пассажу образовывали видимый мицелий уже на второй день выращивания.

•■i-v-íi'tM^-i,-i-.',-,V- 41 -

При исследовании ферментативной МИШШШШаКчй^'•'Jjfí'■■■ активности культуральной жидкости ' -

грибов было обнаружено на-шчие у них i ^,

кси л знатной активности (таблица 3). '< V i

Ксилан, являясь видимо более ЩхЯЯ^^^Ш^Ш^Шк' доступным полисахаоилом лля гснбов. .V-'v:'.'-' ■

(штаммы A!, А4, А5, 559). Этот факт доказывается еще и тем, что с увеличением числа пассажей Фета Ю- Наращивание мкцелия

увеличивается ксиланазная активность П>«бов на сухсй биомассе красной

, „ водоросли В, neushulii.

культуральнои жидкости грибов, даже те

штаммы, которые ее не имели при первом пассаже, показывают достаточно высокую активность на втором и третьем пассажах (штаммы 4,72,98,354,363, 389, 440, 559, AI), что свидетельствует о высоких адаптивных возможностях, как было показано ранее на Palmaria palmata (Тамбиев, Николаева и др., 1998, Nikolaeva, Usov, Sinitsyn, Tambiev, 1999).

Данные ферментные комплексы, выделенные из природных продуцентов, а также коммерческие ферментные препараты совместно с выделенными препаратами применяли для получения клеточной суспензии из морской макрофнтной водоросли В. neushulii. Применение только коммерческих препаратов (целлюлазы, пектиназы, дрезилазы, кенланазы) в различных комбинациях и концентрациях не приводило к получению клеточной суспензии.

При обработке частей талломов морской водоросли В. neushulü полученными в работе ферментнымн препаратами из микро- и мак-ром и цетов, приспособленными к росту на сухой биомассе дайной водоросли, происходило их размягчение. При последующим растирании этих частей в ручном

гомогенизаторе было получено небольшое количество одиночных медуллярных клеток этой водоросли. Таблица 3.

Ксиланазная активность штаммов грибов (% превышения по отношению к контролю)

Ш(Д. N шгаммэ Первый пассаж Второй пассаж Третий пассаж

ГгиЛйкгта Ьаэтйпит, 3 0% 0% 0%

ТгкЬжкгта 4 0% 88%

1г1сЬ'-ик'Г7)'Й *1Г>с!е. 72 0% 116% 257%

30% 138% 295%

ГпсЬо^йти ачжи М 0% 57% 36%

ТгкЬоскпча сйгоуЫЙС. 392 25*/. 60% 45%

ТгкЫкк^тоа игЮс. 414 50% 59% 50%

V. [ог^ЬгасЬ^ит. 440 0% 74% 11#%

{»¡с!инй'гт<; 35% 65% 127%

Тгк:Ь<ч}опп11 ук-^е. 355 10% 50% 86%

ТтеЬмкта 354 12% 52% 146%

ТгкАоАнтаа 559 145% [£4% 260%

1 гяЬ.чкгш У1Гн1е. 337 «% 125%

"1'1кКси1егта у(гн1е. ЗЬЗ 0% 55% 100%

СиЯуиЯагю ЁешсиЯаЛА, М 145% 182% 230%

С1>аМ1>ттит §1|}Ьо5цт, А2 80% 80% 106%

М^тпотеПа есЫпа1а, ЛЗ 73% 103% «9%

Ычо.о5ига, А4 360% 339% 4001'.

\iperyilus (Ыта, А5 150% (ТО%

-,е(чсо!а. А6 0% 25% 23%

Рста'Шит Б4 0% С% 0%

Также были получены довольно крупные агрегаты коровых клеток. Лучшие результаты были получены при применении совместно с ферментными препаратами из микро- в макромнцехов коммерческих ферментных препаратов. 11ри этом увеличивался выход одиночных медуллярных клеток.

Полученные клеточные суспензии В. пеизЬиШ состояли из небольшого числа бесцветных медуллярных клеток с деградирующими клеточными стенками и агрегатов пигментированных коровых клеток. Дальнейшее

культивирование клеточной суспензии в течение 2-х дней приводило к снижению числа живых клеток, ори этом исчезала их пигментация.

Нами был экспериментально установлен осмотический режим, при котором начиналось сжатие протопласта внутри клеточной стенки у исследованных видов морских макрофитных водорослей.

В ходе работы с помощью коммерческих и природных ферментов были получены протопласты из талломов зеленых, бурой и красной морских макрофитных водорослей {таблица 4). Таблица 4,

Относительная эффективность мацерации талломов макрофитных

водорослей рааличными ферментными препаратами.

Httj 84Шрасл* ЛЇ ОПЬІТЙ DltfMHnHliiA u\>eil*l>*t І&ГХОД ПрОТФЛЯЯСГЇОй Жизнеспособность КЛГТ'Ж

luv* Sp. 1 lt-1% -

г 11-1%; 11-0,5% -

і ІШ4КЯЙ

F-jircrcmorfih* intestinal» л Ц-1%; ЛА5%

5 +, ННЭЁ2Я

6 Ц-1%; Н-<Ц%; Д-Iii ■f. средни

t/t¥aria Spfendens 7 Ц-lis ПА 5% -

8 Ц-1%; Н-0.5%; Д-1% t««JB>

» Ц-1%; ¡1-0,5%; Л-1% средняя

Sdftlisria* 10 ІИ%; Н-0.5% -

и li-t»iu tMljifcK-i'.-o •

а А-3%

)Э Ц-1%; D-Ü,5VK-t4; А-3% ХОрОЩАЯ

РогрГіугя Ampt^mi) 14 Ц-1%; H-iuv. -

15 L, Ііпчгні-,1% -

І& Ц-!%; П-0,5%; 1. li«otea-j% -

17 Ц-1%; ЇШ, 54; А-Э% -*, средняя

« Ц-1%; II-Q.J%;K-I4: А-3% .*. средняя

IV Ц-1%; П-n.SiiK-i-SV Л-JV L. Ііиогег-3% t. Средняя

Примечания: Ц - исллюпаза, ¡1 - пектиназз, Д - дрезилаїа, А - абалон, К - ксилацазз, Жизнеспособность клеток в суспензиях через I день после получения: хорошая > 70%, средняя 30-70 %. низкая < 30 %. +■ - выход протопластов, * - выход агрегатов.

2t

Время обработки ферментными препаратами варьировало в зависимости от вида водоросли и составляло 2-6 часов. Использование коммерческого ферментного препарата абалон, выделенного из моллюска Abalone entralis, показало его положительное действие во многих случаях. Использование ферментных комплексов из микро- и макромицетов не приводило в нашей работе к выделению протопластов из исследованных нами видов водорослей -макрофитов.Наибольшее количество протопластов и наименьшее время их выхода из ткани наблюдалось у молодых талломов водорослей, а также в верхней части веточек талломов - зоне активного роста. Было показано, что выход клеток из тканей происходил труднее из больших фрагментов таллома. В ходе ферментативной обработки клетки округлялись по мере разрушения клеточных стенок и высвобождались из межклеточного матрикса, но некоторые так и оставались в нем, в этом случае требовалось перемешивание и небольшое механическое воздействие на таллом, тогда они выходили в среду (Фото 11).

i- ■ ■ vi . • * г. s.

: ■ V- % - t. Ч 4" 4 ......... ;

- "'í*. 'i* C'*....:."1-:-"- ■■■

■■ «i ."Vr.'- -'í V

<■ "v : »vVw. *v» • *.

i ■ aí'íU-A'V."'!

i'i

Фото И. Протопласты зеленой водоросли (Луагш Бр1епс1еп5, увеличение хЮО Жизнеспособность протопластов зависела от вида водоросли и колебалась от 15% до 80%. Деградация клеточной стенки была подтверждена отсутствием

окрашивания толу иди новым голубым (МсСиНу, 1970). При разбавлении среды дистиллированной водой протопласты лопались.

В опытах с Е. ЫеБМпаПз выход протопластов шел лучше, чем у других зеленых водорослей. Это связано с тем, что при разрезании эта водоросль расслаивалась, и поэтому облегчалось действие ферментов. Получение протопластов бурой водоросли Ь, зассЪаппа шло постепенно. Сначала происходило размягчение коровой ткани и из нее при помощи механического растирания выделяли протопласты коровых клеток, а затем при дальнейшем действии ферментов размягчалась и медуллярная ткань из которой в последствии выделяли протопласты {Фото 12).

Фото 12. Протопласты бурой водоросли ЬатшагтзассЬаппа, увеличение х400

В опытах с морской красной водорослью Р. атрПББ^а (Таблица 4 варианты 17,18) наблюдали лишь размягчение ткани, при механическом растирании которой получали суспензию агрегатов клеток (2-6 клеток). В варианте 19 при дополнительном применении вместе с комплексом ферментов экстракта из Ь. ИПогеа наблюдали сильное размягчение ткани. Здесь было

необходимо лишь слабое механическое растирание, в результате чего наблюдали выход агрегатов и отдельных клеток. При дальнейшем инкубировании в растворе ферментов происходит растворение остатков клеточных стенок и выход протопластов, но при этом также происходит их л тис.

При последовательном уменьшении концентрации осмотика до уровня морской воды, большинство протопластов Laminaría saccharina и Porphyra amptissima регенерировали клеточную стенку. После регенерации клеточной стенки протопласты сохраняли шаровидную форму. Такие клетки сохраняли жизнеспособность в течение недели.

Выводы

!. В работе были подобраны индивидуальные комплексы антибиотиков, эффективные для получения аксеничного материала, я отработана схема стерилизации талломов ряда видов морских макрофитных водорослей.

2. Впервые получен каллусный и вегетативный рост из эксплантатов тропической морской макрофитной красной водоросли Botryocladia neushuiii. Превалирование каллуслого или вегетативного роста при инкубации эксплантатов В. neushuiii зависело от условий выращивания,

3. Показана способность 21 штаммов почвенных грибов (микро- и ман-рсмицетов) к росту на среде с сухой биомассой морской красной водоросли Botryocladia neushuiii в качестве единственного источника углерода. Выявлена ксилзназная активность грибных экзоферментных препаратов, которые использовались для получения клеточной суспензии из морской макрофитной водоросли В. neushuiii.

4. В работе были получены клеточные суспензии из талломов ряда видов красных и зеленых морских макрофитных водорослей (Caulerpa proliféra, Botryocladia neushuiii, Porphyra amplissima). Жизнеспособность клеток в них постепенно снижалась в жидкой среде в фотоавтотрофных условиях в течение 7 суток,

5. Были получены жизнеспособные протопласты из талломов 5-ти видов красных, зеленых и бурых морских макрофитных водорослей. Протопласты двух видов регенерировали клеточную стенку.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Васильев В.Г., Тамбиев А.Х. Реакционная способность нативных экзометаболитов и внеклеточных продуктов макрофитных зеленых водорослей в различных условиях инкубации. Труды VIII Международной конференции "Новые информационные технологии в медицине и экологии"ЛТ+МЕ 2000, Украина, Ялта-Гурзуф, 2000, с. 81-82.

2. Тамбиев А.Х., Кирикова H.H., Васильев В.Г. Действие КВЧ-облучения на лксеннчные эксплантаты и фоготрофные клеточные суспензии морских макрофитных водорослей. Материалы Международной научной конференции «Автотрофные микроорганизмы». Москва, 2000, с.180-181.

3. Васильев В.Г., Лихачев А.Н., Тамбиев А.Х. Использование ксилана красных морских водорослей наземными редуцирующими грибами. Труды IX Международной конференции "Новые информационные технологии в медицине и экологии'МТ+МЕ 2001, Украина, Ялта-Гурзуф, 2001, с. 11 ]-П2.

4. Васильев В.Г., Кирикова H.H., Лихачев А.Н., Тамбиев А.Х. Ферментативная активность штаммов наземных редуцирующих грибов, растущих на талломе морской красной водоросли в качестве источника углерода. Материалы Международной научной конференции «Биологические ресурсы и устойчивое развитие». Пущино, 2001, с.33-34.

5. Васильев В.Г., Тамбиев А.Х. Каллусный и вегетативный рост красной морской водоросли Botryocladia neushiilií на питательной среде. Биотехнология, 2002, №5, с.70-73.

6. Vladislav G.Vasiljev, Е ka ten па V.Nîkolaeva, Alexander H.Tambiev. Protoplast isolation from thalli of some species of red seaweed, (в печати).

Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к.102 Тираж 50 экз. Заказ №78