Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование культур тканей ряда видов морских макрофитных красных водорослей

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование культур тканей ряда видов морских макрофитных красных водорослей"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи УДК 582.273:581.143:576.535:577.15

ИССЛЕДОВАНИЕ КУЛЬТУР ТКАНЕЙ РЯДА ВИДОВ МОРСКИХ МАКРОФИТНЫХ КРАСНЫХ ВОДОРОСЛЕЙ.

02.00.25 - клеточная биология

Л ПТППГЖГП л т

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1397

Работа выполнена на кафедре клеточной физиологии и иммунологии Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

А.Х. ТАМБЙЕВ Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

член-корреспондент РАН, академик ВАСХНИЛ, профессор

Р.Г. БУТЕНКО кандидат биологических наук

К.Л. ТАРАСОВ

Ведущее учреждение: Институт океанологии РАН им. П.П. Ширшова

Защита состоится (]Ши)рЛ 1997г. в _часов н

заседании Специализированного Совета Д. 053.05.95 в Московском го сударственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: Москва 119899, Воробьевы горы, Биологический факультет МГУ, аур,. ■

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологическо го факультета МГУ.

Автореферат разослан 1997г.

Ученый секретарь Специализированного совета

кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Культуры клеток и тканей растений являются удобным объектом для физиологических, генетических и биохимических исследований, а также источником ценных продуктов щеточного метаболизма (Бутенко, 1964; 1984). Исследования способов ведения культур тканей морских макрофитных водорослей были начаты в 60-70 годы в Швеции и Японии (Fries, 1963; Saga et al., 1978; Nakamura, 1974). В перспективе это могло бы заменить добычу мак-рофитов и одновременно с выращиванием водорослей в хозяйствах ма-рикультуры служить источником промышленно важных соединений водорослей, таких как агар, каррагинан, альгинаты и др..

В настоящее время показана возможность получения каллусных культур, аксеничного вегетативного роста, протопластов из ряда видов морских водорослей (Polne-Fuller, Gibor, 1984; 1986; Тамби-ев и др., 1984; 1987; Butler et al., 1989), а также только двух суспензионных клеточных культур (Chen, 1989; Tait et al., 1990). Однако исследования культур тканей морских макрофитных водорослей заметно отстают от подобных исследований высших растений, что связано с гетерогенностью макрофитных водорослей по морфологическим, физиологическим и биохимическим характеристикам, сложным жизненным циклам, недостатком знаний о механизмах роста и дифференциации клеток и тканей, трудностью получения зксеничных культур и, как правила, медленным ростом.

В настоящее время весьма важным является ведение и развитие культур тканей новых видов морских макрофитных водорослей с полезными для человека свойствами, а также оптимизация условий автономного культивирования их клеток и тканей с целью получения различных ценных продуктов.

Цель и задачи исследования. Основной целью нашей работы являлось исследование возможностей получения каллусного роста, жизнеспособных суспензий клеток и протопластов из талломов несколько видов морских макрофитных красных водорослей.

В соответствии с этим в работе были поставлены следующие экспериментальные задачи:

- Подбор условий стерилизации и получение аксеничного материала из талломов нескольких видов красных водорослей.

- Получение каллусного и вегетативного роста из эксплантатов водорослей в аксеничных условиях.

- Подбор коммерческих ферыентных препаратов для мацерации талломов красных водорослей.

- Поиск и выделение природных продуцентов агаролнтических экзоферментов для разрушения специфических компонентов клеточных стенок красных водорослей.

- Получение природных ферментных препаратов и изучение их ферментативных активностей.

- Исследование эффективности воздействия коммерческих- и природных ферментных препаратов на талломы нескольких видов морских красных водорослей с целью получения жизнеспособных суспензий клеток и протопластов.

- Изучение физиологических характеристик полученных в работе суспензий клеток и протопластов красных водорослей.

Научная новизна работы. Выявлены индивидуальные комплексы антибиотиков,, эффективные для получения аксеничных тканей из талломов нескольких видов морских макрофитных красных водорослей. Установлена возможность получения каллусного и вегетативного роста из эксплантатов пяти видов морских красных водорослей. Изучено влияние ростовых веществ на каллусный рост нескольких видов красных водорослей в аксеничных условиях. Впервые из таллома морских красных водорослей выделена ассоциация агаролнтических бактерий и инфузорий и использована в работе в качестве продуцента ферментных препаратов с высокой агаразной активностью. Впервые показана возможность роста нескольких видов наземных грибов - продуцентов экзоферментов на сухой биомассе морских красных водорослей и на чистом агаре. Исследована активность полученных в работе природных ферментных препаратов (из грибов, моллюсков, бактерий и ассоциации бактерий и инфузорий) и их эффективность при разрушении клеточных стенок и межклетников красных водорослей. При помощи экспериментально подобраных ферментных комплексов получены жизнеспособные клеточные суспензии из талломов ряда видов красных водорослей, клетки некоторых из них были способны к делениям. Для двух видов бангиевых водорослей получено значительное количество протопластов, способных к регенерации клеточных стенок и делениям с образованием недифференцированных агрегатов, что, наряду с делениями клеток в суспензиях, можно расценивать как начальные стадии роста суспензионных культур.

Практическая ценность работы. Выявленные в работе комплексы антибиотиков могут быть использованы для получения аксеничных культур из ряда видов денных морских агарофитов и каррзгинофитов. Полученные в работе данные о влиянии ростовых веществ на кадлус-ный рост красны;-: водорослей могут быть полезны для оптимизации сред при выращивании культур тканей макрофигных водорослей, что б перспективе может дать возможность получения фикоколлоидов в искусственных условиях. Выделенную кали агаролитическуто ассоциацию можно рассматривать кар- перспективный источник агаролитических экзоферментов. Отработанные методики получения жизнеспособных клеточных суспензий и протопластов ряда видов морских красных водорослей могут быть рекомендованы для использования на других представителях красных водорослей. Получение каллусов, жизнеспособных клеточных суспензий и протопластов, способных к регенерации клеточных стенок и клеточным делениям, открывает перспективы перехода к суспензионным культурам - автономным источникам ценных пищевых и лекарственных продуктов.

Апробация материалов диссертации. Результаты работы докладывались на 3-й Всесоюзной конференции "Целлюлоза-90" (Казань, 1390), конференции молодых ученых "Ломоносов-96" (.Москва, 1996;, конференции " Автотрофные микроорганизмы" (Москва, 1998), конференции " Зкшого-физиологические исследования водорослей и их значение для оценки состояния природных вод" (Ярославль, 1996).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано Э печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и описка литературы. Работа изложена на 19& страница;-: машинописного текста, включая приложения, содержит IG рисунков, 19 таблиц и 25 фотографий. Список литературы включает публикации на русском и i9h на иностранных языках.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Объектами исследования были морские макрофитные красные водоросли (Rhodophyta), относящиеся к классам Banglophyceae: Porp-

луга laciniata (Lightf.) Ag.; Porphyra arnplissima (Kjeilrn.) Setch. et Hus.; и Florideophyceae: Ahnfeltia plicata (Huds.) Fries; Phyllophora Brodiaei (Tarn.) J. Ag.; Odenthalia dentata (L.) Lyngb.; Palmaria palmata (L.) Kunct.; Phyllophora nervosa (D.C.) Grev.; Gracilaria verrucosa (Huds.) Papenf.; Gelidium latifolium (Grev.) Born, et Thür.;, Chondrus pinnulatus (Harv.) Okam. из Белого, Черного и Японского морей.

Получение аксеничных тканей из талломов макрофитных водорослей проводили 2-мя способами: 1) обработка тканей хлоргексидин-биглюканатом (ХГ) (Гусев, Тамбиев и др., 1SS4), 2) обработка тканей бегадином (йодированный поливиншширроллидан) с последующем воздействием комплексов антибиотиков, индивидуально подобранных нами для каждого из использованных видов водорослей методом антибиотических дисков (АБ-дисков) (Bauer et al., 1966).

. Условия культивирования эксплантатов. Аксеничные эксплантаты (3x3мм) из талломов водорослей высаживали в чашки Петри с агари-зованной средой PES (Provasoli, 196S). Для исследования влияния ростовых веществ на культуры тканей водорослей использовали 16 комбинаций 6-бензиламкнопурика (БАП) и 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д) в концентрациях 10~7-10~5 моль. Размеры каллусов и вегетативного роста определяли окуляр-микрометром. Каллус-ные и вегетативные структуры в ряде случаев отделяли от эксплантатов в аксеничных условиях и пересаживали в чашки Петри с агари-зованной, либо в колбы с жидкой питательной средой.

Подбор ферментных препаратов (ФП). Для мацерации талломов красных водорослей использовали коммерческие ФП: 1) целлюлаза (Serva); 2) мацераза (Calbiochem); 3) пектиназа (Serva); 4) цел-дзолазы «1-14 (целловиридин, Вильнюсский з-д); 5) пектиназы/целлю-лазы #6 и 8) ксиланаза #7 (пектофоетидин, Вышневолоцкий з-д); 7) целлюлаза #3 (ФП 4-7 предоставил А.П. Синицын, каф. химической энзимологии МГУ); 8) препарат из виноградной улитки Helix pomatia (предоставлен в Ин-те биохимии им. Баха РАН), а также препараты из природных продуцентов.

Получение ФП из природных продуцентов. ФП из беломорского моллюска Littorina littorea выделяли и очищали, согласно методике (Усов, Мартынова, 1970).

С целью получения ФП ассоциацию агаролитических бактерий и инфузорий и чистую культуру бактерий, выделенные и идентифициро-

ванные стандартными методами (Методы общей бактериологии, 1984; Reic-henbach, 1989), поддерживали на среде (Lewin, Lounsbery, 1969) о бактоагаром в качестве единственного источника углерода.

Грибные ФП получали ив культуральной жидкости нескольких ви-дое почвенных микромицетоз: Aspergillus niger Tiegh.; Penicillium purpurogenum Stol; Triohoderma viricie Pers.: Fr.; Stachybotrys at га Corda; Myrothecium verrucaria (Alb. et Schw.) Ditmar: Fr.; Chaetomium globosum Кипге и ксилотрофного макромицета Pleurotus ostreatus (Fr.) Kumm., выделенных M.A. Аникиной (каф. микологии и альгологии МГУ) из природных источников и приспособленных к росту в жидкой среде (Методы микологии, 1987), обогащенной сухой биомассой красных водорослей Р. palmeta и 0. dentat3 (20г/л).

Получение и характеристика Ж. ФП получали в результате центрифугирования культуральной жидкости продуцентов в начале стационарной фазы роста культур и стерилизации через асбестовый фильтр. После лиофилизации ФП хранили при -20°С. Определение ферментативных активностей и содержания белка проводили стандартными методами (Lowry et al., 1951; Усов, Мирошникова, 1975; Carbohydrate analysis: a practical approach, 1986; Синицын и др., 19РЗ).

Получение клеточных суспензий и протопластов красных водорослей. Фрагменты талломов красных водорослей (0,5г), обработанные раствором бетадина, помещали в экспериментально подобранный для каждого вида осмотический раствор на '30 минут и измельчали стерильным лезвием. Затем добавляли 3% растворы ФП, принятые нами га стандарт при проверке их эффективности, приготовленные на основе цитратно-фосфатного буфера при экспериментально подобранных значениях рН. В ферментной смеси водоросли оставляли на 2-16 часов б темноте при 28°С на качалке при 90 об/мин. Дополнительно применяли растирание тканей в ручном гомогенизаторе. Одиночные клетки и протопласты отмывали в стерильной морской воде о добавлением осмотика и фильтровали через нейлоновые сетки диаметром 20-40 мкм для освобождения от фрагментов таллома. Протопласты отделяли 3-х кратным центрифугированием з осмотическом растворе.

Суспензию отмытых клеток помещали на сутки в раствор экспериментально подобранных антибиотиков. Затем после отмывания ино-кулят аксеничных клеток из расчета 103-104 кл./мл вносили в чашки Петри диаметром 6 см с жидкой средой PES и инкубировали при 15°С и естественном освещении 2-3 недели.

■ Исследование характеристик- клеточных суспензии. Плотность клеточных суспензий и количество протопластов определяли подсчетом количества клеток в камере Фукса-Розенталя при микроскопиро-вании. Жизнеспособность суспензий, под которой мы понимаем количество живых клеток и протопластов в данный момент, определяли окраской 0,5% раствором эрптрозина (Шевченко, Кордюм, 1972) и 0,05% нейтральным красным. Реакционную способность культуральной среды измеряли методом химических моделей (Тамбиев, 1974; 1984) на установке "Аквакон-4". Отсутствие клеточной стенки у протопластов подтверждали окрашиванием 0,01% толуидиновым синим при pH 1,0 (McGully, 1970).

Полученные в работе данные обработаны статистически при помощи ряда пособий (Плохинский, 1978; Компьютерная биометрика, 1990) и компьютерных программ "Stadia" и "Statgraphics".

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. ПОЛУЧЕНИЕ АКСЕНИЧНОГО МАТЕРИАЛА ИЗ ТАЛЛОМОВ ВОДОРОСЛЕЙ.

В настоящее время не существует универсального метода получения аксеничных культур морских макрофитных водорослей,:; поскольку каждая водоросль, собранная в естественных условиях, имеет целый комплекс уникальной микрофлоры, состав которой может меняться в зависимости от сезонных и погодных условий.

В ходе работы нами была отработана методика получения аксе-ничного материала из нескольких видов красных водорослей при двухступенчатой обработке фрагментов талломов поверхностными стерилизующими агентами и комплексами антибиотиков. При этом было показано, что среди использованных в работе двух поверхностных стерилентов наиболее эффективным был бетадин. Применение ХГ приводило в нашей работе к быстрому обесцвечиванию тканей водорослей, что, по-видимому, обуславливалось присутствием ионов хлора.

Поскольку антибиотики (пенициллин, стрептомицин и некоторые другие), применявшиеся в ряде работ для получения аксеничных культур морских водорослей (PoIne-Fuller, Gibor, 1986; Chen, 1986) не были эффективны для наших объектов, нами был осуществлен индивидуальный подбор антибиотиков для 3-х видое красных водорослей А. plicata, Ph. Brodiae/, P. palmata. Для этого была определе-

на чувствительность к набору АБ-дисков каждого из выделенных бактериальных изолятов из талломов этих видов водорослей, что было известно ранее для Рогрпуга perforata (Chen, McCracken, 1993).

Б результате было показано, что для получения аксеничных культур после обработки бетадином необходима инкубация фрагментов талломов водорослей в растворах антибиотиков, содержащих: для А. plicata - тетрациклин и левомицетин; для Ph. Braciiaei- левомице-тин с одним антибиотиком из ряда: олеандошщин, ристомицин, эритромицин, ампициллин; для P. paimata - тетрациклин с эритромицином либо левомицетином.

Поскольку наиболее эффективными для ингибирования роста сопутствующих бактерий 3-х видов красных водорослей оказались левомицетин, тетрациклин и эритромицин, их комплекс в комбинации с обработкой бетадином в дальнейшем использовался для получения ак-сеничного материала из этих и других видов красных водорослей. При культивировании около 98% эксплантатов сохраняли аксеничность и нормальную пигментацию.

2. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ЭКСПЛАНТАТОВ МОРСКИХ ВОДОРОСЛЕЙ В АКСЕНИЧНЫХ УСЛОВИЯХ.

2.1. Каллусный рост.

Как известно (Nakamura, 1974;, Fries, 1Q8G; Folne-Fuller, Giber, 1984; Тамбиев и др., 1984), аксеничные эксплантаты из талломов ряда видов морских макрофитных водорослей способны проявлять каллусный рост, однако в настоящее время до конца не выявлены условия его индукции и поддержания. В отличие от высших растений (Бутенко, 1964; 1977), у макрофитных водорослей не доказано непосредственное участие ростовых веществ в каллусогенезе 03аг~ sia-Reina et al., 1988a; Butler et al., 1989).

В нашей работе было изучено влияние 16-ти различных комбинаций БАЛ и ",4-Д на индукцию каллусного роста из эксплантатов 4-х видов флоридеевых красных водорослей: A. plicata, Ch. pinnulatus, P. paimata и Ph. nervosa (табл. 1). При этом кадлусные структуры из эксплантатов Ph. nervosa развивались с достаточно высокой частотой для представителей флоридеевых водорослей (Polne-Fuller, Gibor, 1987а; Тамбиев и др., 1988), на которую практически не влияли примененные комбинации ростовых веществ. В тех же условиях

Таблица 1.

Частота каллусообразования (в Ж) из эксплантатов (п=150-200 красных водорослей на средах с добавлением ростовых веществ.

Виды

водорослей

Конц-ция 2,4-Д, моль

Концентрация БАП, моль

О

10

-7

10

-6

10

-5

J Phillophora 1 nervosa 8 "

I-

О 10 10 10"

-7 -б

14,8(к) i 13,7

15,4 i 11,2

14.2 | 11,8

14.3 | 13,6

14,6 14,1 13,5 15,0

14,4

15.0

15.1 14,9

I '

8 Chondrus 8 pinnulatus

10" 10" 10"

2,1 (к) |

12,7** i

3,2 |

0 I

-1_

0,9(K) |

0 )

Г о |

I 0 |

2,4 1,8 4,1 0

2,1 1,6 7,5* 0

2,6 0,9 3,3 0

.Ahnfeltia plicata

I

0

IQ-"7 10~6

10

-5

0 О 0 0

0 .0;. 1 2

¿КФ)

0' 0

0

92,3(ф)

Примечания: БАП - 6-бензиламинопурин; сиуксусная 'кислота; ф - филаментозный рост опытных данных с контролем (к) значимы при

2,4-Д - 2,4-дихлорфено из эксплантатов. Различ * р > 0,05; ** р > 0,9

Таблица 2.

Нарастание агаразной активности в культуральной среде микро-макромицетов при росте на сухой биомассе Р. ра1гг^а. (г—-1-

Я

Продуценты

Агаразная активность, мЕ/мл

1 пассаж

3 пассаж

5 пассаж

Aspergillus niger Stachybotrys atra Chaetomium globosum Trichoderma viride Pleurotus ostreatus

0 0 0 0 0

10,6 10,2 10,1 9,9

0

49.4 32,4 29,6 24,6 14,8

5

0

б

частота каллусообразования из эксплантатов А. plicata (табл. 1), а также P. palmata была значительно ниже. Для Ch. pinnulatus был показан выраженный стимулирующий эффект добавления в среду 10_7М 2,4-Д, а также комбинации 2,4-Д и БАП (по 1СГ6М), что повысило частоту каллусообразования до 6 раз по сравнению с контролем.

Подобно каллусам высших растений (Бутенко, 1964; 1977) и исследованных ранее макрофитных водорослей (Gusev, Taitibiev et al., 1987; Poine-Fulier, Gibor, 1987a; Butler, Evans, 1989), полученные в нашей работе каллусы формировались на раневой поверхности эксплантатов и представляли собой рыхлую массу клеток без определенной анатомической структуры. Нами были обнаружены каллусы двух типов: бесцветные, которые развивались иэ клеток медуллярной зоны эксплантатов Ph. nervosa, А. plicata и P. palmata, и пигментированные, как правило, красно-бурые каллусы, образованные из коровых клеток Ph. nervosa и Ch. pinnulatus. Частота образования и скорость роста пигментированных каллусов была значительно выше по сравнению с бесцветными. Добавление в среду источников углерода (сахароза, галактозз, маннит) не влияло на частоту индукции и скорость роста каллусов, что согласуется о данными (Butler, Evans, 1389; Garcia-Reina et al., 1992) о фототрофном росте каллусов макрофитных водорослей в отличие от большинства культур тканей высших растений (Бутенко, 1975).

Каллусы второго типа через 3-4 месяца достигали размера 2-5 мм, что характерно для флоридеевых водорослей (Polne-Fuller, Gibor, 1987а), и в некоторых случаях в 1,5 раза превышали по размеру исходный эксплантат. В нашей работе была получена пересадочная каллусная культура Ph. nervosa, которая поддерживалась более 9 месяцев при периодическом перенесении на свежую среду.

Спустя 2-2 месяца при росте на агаре с добавлением ростовых веществ до 20% каллусов второго типа могли образовывать многочисленные филаменты, представлявшие собой однорядные нити из удлиненных пигментированных клеток. Филаментозный рост происходил также с высокой частотой из медуллярных клеток эксплантатов А. plicata (табл. 1), последовательные деления которых приводили к формированию большого количества нитей, состоящих из непигменти-рованных клеток. Рост филаментов в нашей работе продолжался в течение нескольких месяцев без изменения структуры, тогда как в других работа}: подобные филаменты могли регенерировать проростки

(Bradley, Cheney, 1990), либо формировать каллусоподобные-структуры (Robaina et al., 1990; Dawes, Kosh, 1991).

В ходе нашей работы была показана высокая частота каллусооб-разования (около 35%) из эксплантатов и одиночных клеток бангие-вой водоросли Рог. laciniata, имеющей плоский таллом, при культивировании на агаризованной среде без ростовых веществ. При этом происходило формирование микрокаллусов размером до 0,5мм, состоящих из.крупных слабоокрашенных клеток.

Следует отметить, что кадлусный рост водорослей А. plicata, Ch. pinnulatus, P. palmata и Рог. laciniata :бьш получен в нашей работе .впервые, тогда как каллуоная культура Ph. nervosa описана ранее (Gusev, Tambiev et al., 1987; Тамбиев-и др., 1988). Клетки каллусов красных Еодорослей в нашей работе имели довольно толстые клеточные стенки с большими межклетниками, которые интенсивно окрашивались толуидиновым голубым, что говорит об их способности синтезировать сульфатированные полисахариды, являющиеся ценными фикоколлоидами агаровой и каррагинановой групп.

2.2. Вегетативный рост эксплантатов.

В-нашей работе из аксеничных эксплантатов А. plicata происходило образование пигментированных проростков размером 0,5-1 мм, что описано для некоторых других красных водорослей (Chen, Taylor, 1978; Aslanyan, Tambiev, 1993). После отделения от эксплантата и переноса в жидкую среду PES продолжалась дифференциация проростков: различались зоны первичных ризоидов, стволика и листовой пластины. Кроме того, около 9% эксплантатов из кончиков веточек таллома А. plicata проявили способность к апикальному росту, а также, наряду с эксплантатами Ch. pinnulatus и P. palmata, к формированию боковых веточек на плотной среде, что ранее показано для других макрофитных водорослей (Тамбиев, Асланян, 1984).

2.3. Некоторые аспекты размножения А. plicata в культуре.

В ходе нашей работы на веточках талломов женских гаметофитов А. plicata, помещенных в условия влажной темной камеры при 5°С, в течение 3-4 месяцев происходило развитие нематециев размером 1-2 мм. Количество нематециев в этих условиях было около 10-15 на сантиметр длины таллома, тогда как в аквариуме - на порядок ниже, что соответствует литературным данным (Зинова, 1955). Еоть мне-

кие, что нематеции A. plicata можно рассматривать как гонимобяас-ты, образованные на женских гаметофитах после оплодотворения кар-погона и развивающиеся на гаметофкте без отделения от него (Шоши-на, 1990), Их массовое развитие в наших опытах, по-видимому, было инициировано необычными условиями (отсутствие воды при сохранении влажной атмосферы, темнота и низкая температура).

3. ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКИ ЖИЗНЕСПОСОБНЫХ КЛЕТОЧНЫХ СУС ПЕНЗИЙ IB ТАЛЛОМОВ МОРСКИХ КРАСНЫХ ВОДОРОСЛЕЙ.

В настоящее время не решена проблема мацерации талломов морских макрофитных водорослей до одиночных клеток и протопластов, жизнеспособные суспензии которых могут являться исходным материалом для получения суспензионных культур. Красные водоросли характеризуются уникальным строением клеточных стенок и "межклеточного матрикса, в состав которых входят специфические полисахариды агаровой и каррагинановой групп (Усов, 1985). Известно, что химический состав клеточных стенок и межклетников различается не только у разных групп водорослей, но и в пределах одного вида в зависимости от возраста, участка таллома, физиологического состояния., культуральных условий и фазы жизненного цикла (Усов, 1935; Kloareg\ Quatrano, 1988), что приводит к необходимости индивидуального подбора ферментных комплексов для мацерации тканей.

3.1. Получение клеточных суспензий водорослей с помощью коммерческих ферментных препаратов.

В ходе работы было показано, что обработка талломов красных бангиевых и флоридеевых водорослей всеми исследованными коммерческими ФЛ (целлюлаза, ксиланаза, мацераза и др.) при различных режимах и комбинациях в лучшем случае вызывала небольшое размягчение тканей, но не их мацерацию.

Нами была осуществлена мацерация таллома каррагинофига Ph. nervosa при использовании коммерческих целлюлззы, ксиланазы #7, мацеразы и препарата из пищеварительной системы виноградной улитки, обладающего широким спектром ферментативных активностей по отношению к растительным полисахаридам. Суспензия состояла из одиночных коровых клеток, их агрегатов и небольшого количества протопластов из медуллярных клеток. При инкубировании в жидкой

СрВДс Б фиТОЗБхОхрифнЫХ условиях нэблюдали д6л6ки5 около О, SZ клеток, что соответствует данным других работ по флоридеевым водорослям (Cheney et al., 1987). Мацерация талломов агарофитов"G: latifolium и Gr. verrucosa этим комплексом была менее успешна.

Нами было изучено влияние физиологического состояния клеточных суспензий Ph. nervosa и Gr. verrucosa на изменение ¡реакционной способности среды (рио. 1), определяемой выделяемыми клетками акзометаболитамк. При этом была выявлена корреляция между снижением числа живых клеток в суспензии и изменениями реакционной способности, складывающейся из окислительной (OA) и антиокислительной (AQA) активности среды в процессе инкубации.

3.2. Ввдаяенне природами ферментных препаратов №1).

Основную сложность при мацерации талломов агарофиткых и родственных им водорослей (Polne-Fuller et al., 1984; Chen, 1989) представляет разрушение специфических полисахаридов агаровой группы, входящих в состав клеточных стенок и межклетников, при отсутствии высокоэффективных коммерческих ФП (Gomez-Pinchetti, Garsia-Reina, 1993). Поэтому в нашей работе для получения клеточных суспензий из талломов этих водорослей были осуществлены поиск природных."продуцентов ФП, обладающих агаразной активностью и исследование эффективности использования этих препаратов.

Согласно литературным данным, источником агараз могут служить некоторые морские моллюски (Усов и др., 1970; Liu et al., 1984) и бактерии (Morrice et al., 1983). В нашей работе в качестве продуцентов ФП были выбраны морской моллюск L. littorea, а также выделенные нами из природных источников ассоциация морских агаролитических бактерий и инфузорий и несколько видов наземных грибов (микро- и макромицетов).

Поскольку грибы способны продуцировать широкий спектр экзо-ферментов в ответ на изменение субстрата, нами впервые была предпринята попытка наращивания мицелия микро- и макромицетов на сухой биомассе морских красных водороолей с целью индукции синтеза ферментных комплексов, необходимых для разрушения клеточных стенок и межклетников, составляющих больйую часть биомассы этих водорослей. При этом было показано, что все исследованные виды грибов, кроме М. verrucaria, оказались способны к росту на сухой биомассе морских красных водорослей P. palmata (рис. 2), а также

Рис. 1. Изменение количества живых клеток в суспензиях Ph. nervosa (1) и G. verrucosa (2) и реакционной способности среды (3 и 4 соответственно) при инкубации.

Таблица 3.

Характеристики ферментных препаратов (ФП) из 4-х видов микро-II макромицетов при росте на среде с сухой биомассой P. palmata.

в-1---т1

jj i ферментативные активности ФП, мЕ /мл 8

( Продуценты ФП || (5 пассаж) 1 к i КЩ-азкая | pH 5,0 i |эндоглюканазная I pH 4,5 -,-1 ксиланазная iпротеазная Ц pH 7,5 | pH 5,0 II ! 1!

« ! Ch. flobosum 1 32,1 1 ! 21 2 1 29,9 | U 44,1 Ii

ji A. niger | 39,9 1 10,1 61,3 1 29,5 ¡j

3 Тг. viride i 138,7 1 39,7 78,4 | 77,5 |

1 PI. ostreatus » ..... i 10,1 1 о ' - -..... 17,5 | _____L 22,4 8 и

0. dentata и полностью разрушали клеточную стенку водорослей, культура St. atra, показавшая первоначально довольно медленный рост (рис. 2), в результате 4-5 пассажей на среду с сухой биомассой P. palmata, значительно его увеличила.

У исследованных 5-ти видов микромицетов (табл. 2) после 3-4 пассажей на среду с сухой биомассой P. palmata было показано появление агаразной активности в среде и нарастание ее при каждом последующем пересеве культур. Насколько нам известно, в литературе нет сведений о грибных агаразах, однако есть единичные данные о способности расщеплять агар некоторыми штаммами грибов Aspergillus tamarii и Rhisopus arrhizus (Patel, 1980). В полученных нами ферментных препаратах из куль туральной жидкости 4-х видов микро- и макромицетов (5-й пассаж) было показано также наличие целлюлазной (КЩ-азной и эндоглюканазной), ксиланазной и протеаз-•:ной активностей (табл. 3), что коррелирует с литературными данными (Синицын, 1993). Максимальную ксиланазную активность проявили . Тг. viride и A. niger. В дальнейшем нами была продемонстрирована способность этих 4-х видов грибов к росту на среде с сухой биомассой P. palmata, а для A. niger - на 0,18% агаре в качестве единственного иоточника углерода, что нельзя исключить для других исследованных видов грибов.

Полученный нами ФП из пищеварительной системы морского моллюска L. littorea проявил сходный спектр ферментативных активностей, а именно (Е/г) целлюлазную (КМЦ-азную - 42 и эндоглюканазную -.7),"ксиланазную - 22, протеазнув - 4,4 и агаразную - 16,0 Е/мл.

В ходе работы была выделена неизвестная ранее природная ассоциация агаролитических бактерий и инфузорий из таллома морской красной водоросли P. palmata. Инфузории, определенные как LFronema marinum Dujardin, представляли собой подвижные формы (10-20 мкм в длину и 6-9 мкм в ширину), покрытые рядами ресничек по всей клетке. К 4-5 суткам культивирования часть из них инцистнровалаоь. Бактерии представляли собой грамотрицательные, нитевидные палочки размером 0,3 х 3-9 мкм, погруженные в слизь и способные к скользящему движению. По совокупности морфо-физиологических и биохимических характеристик выделенные нами бактерии оказались близки виду Cytophaga diff'luens Stanier emend. Lewin. При высыхании до 1-го года ассоциация возобновляла жизнедеятельность при добавлении свежей питательной среды.

Рис. 2. Нарастание мицелия микро- и мякромицетов на среде с сухой биомассой морской красной водоросли Palmaría palmata. 1 -A. nig-er; 2 ~ Pl. ostreatus; 3 - Ir. viride; 4 - St. atra - первый пассаж; 5 - St. atra - пятый пассаж.

Таблица 4.

Удельная агаразная активность ферментных препаратов, выделенных из природных продуцентов (п=4).

Продуценты ферментных | i Arapasa ¡ Белок, -11 II

препаратов мЕ/мг белка | мкг/'мл « ti

Cytophaga sp. pH 7,0 ¡ 1115,6** ¡ 45 lí fi

Cytophaga sp.+U. marinum pH 7,0| 1519,2** 1 52 ¡!

Littorina littorea pH 5,6 ! 113,8 | r*QC- í *_»(_) II

Aspergíllus niger pH 5,1 i 257,3 ) 192 » и

Staohybotrys atra PH 5,1 ! 115,7 [ 280 II

Trichoderma viride pH 5,1 ! 41,5 | 360 í

Pleurotus ostreatus pH 5,1 I 65,6 | 375 II

Chaetomium globosum pH 5,1 I 82,2 | ______________________ _ J. 360 I _n

Примечание. ** Различия значимы при р > 0,39.

> -Ассоциация к чистая культура-Оактэрии были способны к росту на среде с 0,18-1,5% бактоагаром в качестве единственного источника углерода. Присутствие инфузорий в ассоциации значительна стимулировало-агаразную активности бактерий, которая (рио. 3) на всех стадиях роста была выше в культуральной среде ассоциации по сравнению с чистой культурой бактерий. Выявленные в ходе работы оптимальные условия для роста ассоциации и чистой культуры бактерий были: темнота, рН-7,2, температура 27°С и присутствие в среде низких концентраций (0,1%) дрожжевого экстракта.

Выделенные нами бактерии С. (ЖГ 1иепэ в чистой культуре, подобно некоторым другим представителям рода Су1орЬа^а (Тип/еу, СЬПзМзоп, 1967; Кондратьева, Тен Хак Мун, 1989), были способны к утилизации ряда полисахаридов, родственных компонентам клеточных !стенок макрофитных водорослей: агара, порфирана, альгината, ксилана, КМЦ и некоторых других. ФП, полученные из ассоциации и

Рис. 3. Агаразная активность культуральной среды чистой культуры бактерий С. сШТ1иепз (1) и ассоциации бактерий С. сИГГ-1иепБ и инфузорий и. таг1гшт (2) (по реакции с окрашенным агаром).

чисто» культуры бактерий при росте на чистом агаре, были высокоспецифичны по отношению к субстрату и проявляли только агаразную активность, для которой было показано наличие двух оптимумов действия при pH 5,6 и 7,0. Максимальная удельная агаразная активность среди выделенных нами ФП при экспериментально подобранных оптимальных условиях их действия (табл. 4) была показана для препарата из ассоциации агаролитических бактерий и инфузорий.

3.3. Получение клеточных суспензий водорослей с помощью выделенных в работе природных ферментных препаратов.

В настоящее время была осуществлена мацерация талломов красных водорослей, относящихся только к трем родам: Porphyra (Pol-ne-Fuller, Gibor, 1984; Chen, 1986; Tait, 1990), Gracilaria (Cheney et al., 1986) и Grateloupia (Chen, Chiang, 1994), в состав клеточных стенок которых входят агароподобные полисахариды. Клеточные стенки и межклеточный матрикс использованной в нашей работе водоросли P. palmata построены в основном из ксиланов и суль-фатировакных галактанов агаровой группы (Fercival, MoDowel, 1967). В состав клеточных стенок О. dentata входит одонталан - сульфатн-рованный и метилированный агароподобный галактан (Усов, Козлова, 1975).

С целью получения жизнеспособных клеточных суспензий из талломов этих водорослей нами был осуществлен индивидуальный подбор коммерческих и выделенных в работе природных ФП. При этом для Р. palmata лучшими вариантами (табл. 5) были: а) комплекс ФП из L. littorea (литторина) с коммерческой ксиланаэой #7; б) двухступенчатая обработка фрагментов таллома в течение 10-ти часов препаратом из ассоциации (агараза), с последующей 3-х часовой обработкой коммерческими ФП; в) комбинация ФП из микромицета A. niger с ФП из морского моллюска L. littorea, которая позволила получить максимальную в нашей работе степень мацерации таллома P. palmata при сохранении высокой жизнеспособности клеток в суспензии (78%), Для О. dentata наиболее эффективным был комплекс ФП из микромицета St. atra и морского моллюска L. littorea.

По-видимому, успешное применение препаратов из мнкромицетов A. niger и St. atra обусловлено выработанными в ходе пассирования ферментными комплексами, специфическими по отношению к компонентам клеточных стенок и межклетников красны;-: водорослей. Клеточные

Таблица d,

Относительная эффективность мацерации таллома Palmaria palrna-ta природными ферментными препаратами в комбинации с коммерческими

(1 , - ........ || Ферментные препараты (ФП) Кол-во клеток в суспензии -- Жизнеспособ-

1 (концентрация - 3% (на 1г исходной ткани) ность клеток

I 0,8М маннит г в суспензии

| 5 часов инкубации) коровых ¡ медуллярных

1 Литторина (Ь. ШЬогеа) + ¡ ++ хорошая

| Литторина + целлюлаза + | + удовлетв.

1 Литторина + мацераза + | ++ хорошая

1 Литторина + лектиназы/ ++ i - ++ удовлетв.

9 целлюлазы #6 1

1 Литторина + ксиланаза 97 ++ | +++ хорошая

! Литторина + целлюлазы #3 л ++ ¡ i 4+ слабая

1 1 Агараза (ассоциация) i + хорошая

I Агараза + целлюлаза | + хорошая

9 Агараза + мацераза ¡ + хорошая

| Агараза + ксиланаза #7 | + удовлетв.

В Агараза + целлюлаза + | ++ хорошая

8 + мацераза 1

8 Агараза + ксиланаза #7 ++ | +++ удовлетв.

1 + мацераза 1

8 Агараза + ксиланаза #7 ++ | +++ удовлетв.

1 + мацераза + целлюлаза 1

| Агараза (10ч)+ мацераза + ++ | +++ хорошая

¡ксиланаза #7+ целлюлаза(Зч) о 1 i

« || А. тиеег l + | ++ хорошая

| А. тиеег + литторина ++ | ++++ хорошая

1 Эй. а^а + | ++ удовлетв.

| аЬга + литторина + | ....... , , ..!_ +++ хорошая .1. ____

Примечания. Жизнеспособность клеток в суспензиях: хорошая > 70% удовлетв. = 30-65%, слабая < 2SZ живых клеток. Количество клеток суспензиях: + <103; ++ 103-104; +++ 104-105; ++++ >105; жирный шриф - выделенные в работе природные ФИ. N=4-6 повторностей.

- ■! О -

суспензии P. pslîTîSts состояли в основном кз бесцветным Медуллярных клеток размером SO-ûO мкм с деградирующими клеточными стенками (количество протопластов из них было не более 1%) и небольших агрегатов (по 5-8 клеток) пигментированных коровы:-: клеток. Доля одиночных норовых клеток была около 20% от их общего количества. При культивировании полученных клеточных суспензий P. palmata и 0. dentata в жидкой среде в течение 2-3 недель количество живых клеток обоих видов водорослей постепенно снижалось до 28-32%, однако клеточные деления не происходили.

В ходе работы было показано, что в отличие от флоридеевых для мацерации однослойных талломов неисследованных ранее видов бангиевых водорослей Рог. laciniata и Рог. amplissima, была достаточна обработка агаразным ФП, выделенным из ассоциации агароли-тических бактерий и инфузорий. При этом происходила практически полная диссоциация талломов на одиночные клетки и протопласты. Жизнеспособность клеток в суспензиях была около 92%. Использование ФП из моллюска и грибов в нашей работе, как и в другой (Chen et al., 1994), было токсично для клеток порфиры, что проявлялось в их обесцвечивании и разрыве клеточных мембран. Около 5Z клеток в полученных суспензиях Рог. laciniata и Рог. amplissima после отмывания от ферментов и переноса в среду PES при фотоавтотрофных условиях делились с формированием недифференцированных агрегатов по 6-10 клеток.

4. ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКИ ПРОТОПЛАСТОВ КРАСНЫХ ВОДОРОСЛЕЙ.

В настоящее время протопласты успешна изолированы из тканей большого количества высших растений (Глеба, Сытник, 1984) и некоторых морских макрофитных водорослей, в том числе только нескольких родов красных водорослей: Porphyra (Saga et al, 1986; Chen, 1987; 1989), Gracilaria (BJork et al., 1990) и Grateloupia (Chen, Chiang', 1994). В ходе нашей работы (табл. 6) были получены жизнеспособные протопласты из талломов двух неисследованных ранее видов бангиевых красных водорослей Рог. laciniata и Рог. amplissima при б-часовой обработке ФП из агаролитической ассоциации, проявившим максимальную удельную агаразную активность (табл. 4). В состав клеточных стенок порфиры входят порфираны, ксиланы, мэн-наны (Fercival, 1979), однако, по-видимому, для получения прото-

Эффективность получения протопластов ив талломов морских макро фитных красных водорослей (п = 3-5).

Виды \ Выход водорослей (протопластов |(клеток на |1г ткани)

Ь

Жизнеспособность протопластов, %

Р -регенера-| ция клеточ- | ных стенок | Д - деления |

.Условия получения

S

Porphyra ¡7,2+0,5 xlO5 laciniata*I

85,3+6,3

Р,Д |3% агараза, 6ч

Porphyra |5,6+0,7 xlO5 amplissimal

81,5+5.5

Р,Д |3% агараза, 6ч

Palmaria 17,8+0,9 xlOz palmata |

72,4+11,3

|3% Asp. niger |3% литторина, 10

Odonthalia 15,5+0,7 xlO2 cientata I

70,1+10,8

|3% St. atra |3% литторина,10

Phy1lophora|2,1+0,3 xlO2 nervosa I

21,5+6,3

12% пектинаэа 12% мацерозим 12% целлюлаза 12% улитка, 10ч

Примечание: * - протопласты были выделены в культуру.

пластов из порфиры наиболее важной является деградация порфира-нов, осуществляемая агарззным препаратом.

После отделения протопластов Рог. laciniata от клеток и клеточных агрегатов и переноса в среду PES с маннитом, численность их составила 7,2 х 105 клеток из 1г ткани, жизнеспособность -85%, размер 20-40 мкм (табл. 6). При микроскопировании наблюдали ярко окрашенный хроматофзр, занимавший центральную часть протопласта. Деградация клеточной стенки была подтверждена отсутствием

О'АрЗШКЕЗКйй xujiyиДИНОВшЛ ГОЛ'уиЫм (Iv'cGUlIy, 1Э7и; . ПрИ рЗЗбЗВЛбККй среды дистиллированной водой протопласты лопались. При инкубации в жидкой среде PES с маннитом наблюдали их спонтанное слияние.

При последовательном уменьшении концентрации осмотика до таковой морской воды, большинство протопластов P. laciniata формировало клеточные стенки на 3-4 сутки культуры. При этом клетки, окрашенные толуидиновым голубым, приобретали интенсивно розовый цвет, что говорит о появлении сульфатированных полисахаридов на поверхности клеточной мембраны. Однако, примерно у 10% протопластов происходили Еыбросы части цитоплазмы и их лизис.

После регенерации клеточной стенки протопласты сохраняли шаровидную форму, а спустя 3-4 дня обнаруживались вытянутые клетки. На 4-5 сутки культивирования наблюдали клеточные деления, которые приводили к формированию небольших недифференцированных агрегатов. Клетки в них сохраняли интенсивную пигментацию и имели довольно толстые клеточные стенки. Клеточные деления, к которым были способны около 5% клеток, происходили в течение 2-3 недель при культивировании в фотоавтотрофных условиях.

В ходе работы была показана возможность получения протопластов из 3-х видов флоридеевых водорослей Ph. nervosa, P. palrnata и 0. dentata (табл. 6). Протопласты каррагикофитa Ph. nervosa были получены при помощи комплекса коммерческих ФП, включающего экстракт виноградной улитки, характеризующийся высокой полисахари-дазной активностью. Изоляция протопластов из талломов агарофитов и родственных им водорослей происходила только в присутствии выделенных в ходе работы природных ФП. Наибольшее количество протопластов P. palrnata и 0. dentata, меточные стенки которых состоят в основном из ксиланов и сульфатированных полисахаридов группы агара, было получено без коммерческих ФП при использовании экстракта моллюска L. littorea в комбинации с грибными ФП из А. niger и St. at га, проявившими коиланазную и агаразную активности.

Количество выделенных протопластов флоридеевых водорослей было не более 103 клеток на 1г исходной ткани, размер их в зави-мости от вида составлял от £0 до 50 мкм. Протопласты были выделены .в основном из медуллярных клеток, выполняющих запасающую функцию и имеющих относительно тонкие клеточные стенки. Тогда как довольно толстые стенки защитных коровых клеток не разрушались в нашей работе ни при каких условиях. Численность жизнеспособных

upOTQuJicvuTOB КЗ флОрмдЭ&БЫХ ВОДОрООЛЭй ООСхЗВЛЯЛЗ 25 ~ 72% ОТ ИХ общего количества. Поскольку протопласты флоридеевых водорослей были получены в сравнительно малом количестве, нам не удалось выделить их из суспензии и проследить за их возможной регенерацией.

Согласно литературным данным, при культивировании протопластов флоридеевых водорослей формирование клеточных стенок и клеточные деления происходили лишь в единичных случаях (Bjork et al., 1990; Mollet et al., 1995), a регенерация таллома осуществлена только из протопластов Gratelaupia sparsa (Chen, Chiang, 1994). Для бангиевых водорослей известно несколько типов развития протопластов после регенерации клеточной стенки: каллусы, листовой таллом, филаменты конхоцелиса (Chen, 1987; 1989; Polne-Fuller et al., 1984) и клеточные суспензионные культуры, полученные только у двух видов: Рог. miniata (Chen, 1989) и Рог. umbilicalis (Tait et al., 1990).

Мы склонны расценивать деления клеток и протопластов, регенерировавших клеточные стенки, в полученных нами суспензиях флоридеевых и бангиевых водорослей как начальные фазы роста суспензионных культур. Клеточные суспензионные культуры описаны для большого количества высших растений (Еутенко, 1984), а также некоторых видов животных (Клеточная инженерия, 1987), однако в настоящее время трудно достижимы для морских макрофитных водорослей. В перспективе развитие культур клеток и тканей морских макрофитных водорослей может дать автономные круглогодичные источники пищевых и других ценных соединений, в том числе фикоколлоидов, а также исходный материал для выращивания водорослей в комплексах марикультуры.

выводи.

1. В работе были подобраны индивидуальные комплексы антибиотиков, эффективные для.получения аксеничного материала, и отработана схема стерилизации талломов ряда видов морских макрофитных красных водорослей.

2. Впервые получен каллусный рост из эксплантатов 4-х видов морских красных водорослей - Chandras pinnulatus, Palmaria palma-ta, Ahnfeltia plicata и Porphyra laciniata. Из эксплантатов Phyl-lophora nervosa получена пересадочная каллусная культура.

- ¿á -

•i. Частота каллусообрнзовзнкя зависела от вида водорослей; выявлено значительное стимулирующее влияние ростовых веществ на нее для Chondrus pinnulatus и на филаментозный рост из эксплантатов Ahnfeltia plicata.

4. Было показано, что агарофитная водоросль Ahnfeltia plicata способна к вегетативному размножению путем образования проростков на аксеничных эксплантатах на агаризованной среде.

5. Впервые выделена из таллома морской красной водоросли Palmaria palmata природная ассоциация агаролитических бактерий вида Cytophaga diffluens и инфузорий вида Uronema marinum*, ага-разная активность зкзоферментоЕ ассоциации в присутствии инфузорий была выше по сравнению с активностью чистой культуры бактерий при всех исследованных условиях.

6. Впервые показана способность шести видов почвенных грибов (микро- и макромицетов) к росту на сухой биомассе морских красных водорослей, а также выявлена и охарактеризована агаразная активность грибных ферментных препаратов.

7. Было показано, что для получения жизнеспособных суспензий клеток и протопластов бангиевых водорослей наиболее эффективным был ферментный препарат ив ассоциации бактерий и инфузорий, а для флоридеевых - комплекс выделенных в работе ферментных препаратов из моллюска Littorina littorea и микромицетов Aspergillus niger н Stachybotrys atra.

8. В работе были получены клеточные суспензии из талломов ряда видов морских красных водорослей, жизнеспособность клеток в них постепенно снижалась в течение 2-3 недель в жидкой среде в фотоавтотрофных условиях; клетки некоторых из них были способны к делениям с образованием недифференцированных агрегатов.

9. Были получены жизнеспособные протопласты из талломов пяти видов красных водорослей-, протопласты двух видов Porphyra в жидкой среде регенерировали клеточную стенку и делились с образованием клеточных агрегатов.

10. Деление клеток и протопластов, регенерировавших клеточные стенки, в суспензиях Porphyra laciniata, Porphyra amplissima и Phyllophora nervosa с образованием недифференцированных агрегатов мы склонны расценивать как начальные стадии роста суспензионных культур.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Тамбиев А.Х., Романова Е.В. (Николаева Е.В). О возможности получения аксеничных оуспензий клеток морских макрофитных водорослей / Тез.докл. III Всесоюэн. конф. "Биосинтез целлюлозы и других компонентов клеточной стенки. Целлюлоза - 90". Казань, 1990.- С. 134.

2. Тамбиев А.Х., Николаева Е.В., Асланян Р.Р. Изучение кал-лусных структур и некоторых аспектов размножения Ahnfeltia plicata Белого моря // Вестник МГУ, сер 16. Биология.- 1996.- N 2.-С. 89-43.

3. Николаева Е.В., Тамбиев А.Х. Изучение фототрофных жизнеспособных клеточных суспензий из морских макрофитных водорослей / Тез. докл. конф. "Автотрофные микроорганизмы". М., 1996. - С. 46.

4. Тамбиев А.Х., Усов А.И., Николаева Е.В. Обнаружение природной ассоциации морских агаролитических бактерий и инфузорий // Океанология.- 1936.- Т. 36.- N Б.- С. 766-768.

5. Тамбиев А.Х., Николаева Е.В. Получение аксеничных культур морских макрофитных красных водорослей // Биотехнология.- 1996.-N 10.- С. 51-56.

6. Тамбиев А.Х., Аникина М.И., Николаева Е.В. Получение жизнеспособных клеточных суспензий морских макрофитных Еодорослей при помощи грибных ферментных препаратов / Сб. мат. конф. " Эколо-го-физиологические исследования водорослей и их значение для оценки состояния природных вод". Ярославль, 1996.- С. 172-173.

7. Николаева Е.В., Тамбиев А.Х. Агаролитическая ассоциация морских бактерий и инфузорий / Тез. докл. конф. молодых ученых "Ломоносов-96". М., 1396.- С. 35.

8. Тамбиев А.Х., Синицын А.П., Николаева Е.В., Аникина М.И. Воздействие экзоферментов наземных грибов на клеточную стенку морских красных водорослей // Биотехнология.- 1997.- N 2.- С.

9. Тамбиев А.Х.< Николаева Е.В., Синицын А.П., Аникина М.И. Действие грибных ферментных препаратов на таллом красной водоросли Palmaria palmata // Вестник МГУ, сер 16. Биология. 1998, в печати.

10-14.