Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование состояния популяции водоросли Scenedesmus quadricauda в норме и при интоксикации методом микрокультур

ВАК РФ 03.00.18, Гидробиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование состояния популяции водоросли Scenedesmus quadricauda в норме и при интоксикации методом микрокультур"

Московский Государственный университет им. М. В. Ломоносова

Биологический факультет

На правах рукописи

г *

)

МАРУШКИНА Екатерина Викторовна

ИССЛЕДОВАНИЕ СОСТОЯНИЯ ПОПУЛЯЦИИ ВОДОРОСЛИ 5сепе(1е.чтт димЬ-гсагийг В НОРМЕ И ПРИ ИНТОКСИКАЦИИ МЕТОДОМ МИКРОКУЛЬТУР

03.00.18 — Гидробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва—2005

Работа выполнена на кафедре гидробиологам Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В .Ломоносова

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, профессор О.Ф. Филенко Научный консультант:

Кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник А.Г. Дмитриева Официальные оппоненты:

д. б.н., профессор Васильева-Кралина Инна Ивановна к.б.н. Горюнова Светлана Васильевна

Ведущее учреждение - Институт биологии внутренних вод им. И. Д. Папанина РАН (ИБВВ РАН)

Защита состоится ноября 2005 г. в /9 часов на заседании специализированного ученого совета Д 053.05.71 в Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет, ауд

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического ф-та МГУ

Отзыв в двух экземплярах просим направлять по адресу: 119899, Москва, МГУ, Биологический ф-т, специализированный Ученый Совет Д 053.05.71

Автореферат разослан гх ноября 2005 г.

Ученый секретарь совета

Н.В. Карташева

/338 3 I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Одним из основных свойств любой, как природной, так и лабораторной популяции является ее гетерогенность. Особи, образующие популяцию, не тождественны, они отличаются по возрасту, размерам, скоростям роста и, что особенно важно, по реакциям на изменение условий обитания. Именно неоднородность качественного состава популяции обеспечивает ее устойчивость и адаптацию к внешним условиям (Строганов, 1973; Гапочка, 1981; Гродзинский,1983)

Широкие возможности для исследования гетерогенности популяций предоставляют лабораторные культуры микроводорослей. В настоящий момент установлена гетерогенность популяций лабораторных микроводорослей по таким показателям, как размеры клеток (Прохоцкая, 2002), их морфологические характеристики (Тгатог 1964; Капков, 1972), фотосинтетическая активность (Погосян, 2003). Однако, оценка гетерогенности культуры по жизнестойкости и способности отдельных клеток к размножению затруднительна из-за технических сложностей. В литературе мы не нашли указаний о том, как отдельные клетки, составляющие популяцию, участвуют в ее развитии, и каким образом токсичные вещества влияют на активность деления и смертность клеток.

Поэтому целью настоящей работы являлась исследование, с применением специально разработанного метода, структурных перестроек модельной популяции водоросли ЗсепеЛезтия диас1г1саие1а(Тигр.) ВгеЬ. в норме и при токсическом воздействии.

В задачи работы входило:

1. Разработка метода раздельного культивирования ценобиев водоросли Всепейевтш диа^каиЛа и наблюдение за микрокультурами;

2. Исследование гетерогенности лабораторной популяции водорослей по выживаемости и способности отдельных клеток к делению;

3. Исследование влияния токсического воздействия на выживаемость и размножение водорослей в лабораторных популяциях;

4. Определение времени лизиса отмирающих клеток водорослей и оценка влияния на скорость лизиса присутствия токсиканта.

Научная новизна. Разработан метод, впервые позволяющий вести длительное

раздельное наблюдение за клетками микр< веднроелц £с ¡утфйсщи^а. С применением

БИБЛИОТЕКА I

Г, ¿ГЗЯг3»

нового метода впервые проведена прямая оценка смертности и активности размножения в культуре, времени лизиса погибших клеток. Установлено, что основную часть культуры составляют покоящиеся клетки, а рост численности обеспечивается небольшим количеством размножающихся клеток, доля которых изменяется в зависимости от фазы развития культуры. Впервые, на примере хлорида меди, показано, что тяжелые металлы в широком диапазоне концентраций снижают численность клеток в культурах за счет подавления размножения клеток, и лить при высоких концентрациях вызывают повышение их смертность и существенно замедляют скорость лизиса погибших клеток.

Практическое значение работы. Впервые предложен метод, позволяющий количественно оценивать изменение смертности и активности размножения в культуре микроводорослей в исследовательской практике, при биотестировании качества водной среды и при эколого-рыбохозяйственном нормировании. Впервые показано, что при оценках состояния культур и популяций по показателям соотношения живых и мертвых клеток в процессе мониторинга существенное значение может иметь не только повышение смертности, но и замедление лизиса погибших клеток.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2004» (Москва, 2004); 8-ой молодежной конференции ботаников в Санкт-Петербурге (Санкт-Петербург, 2004); 2-ой международной научной конференции «Биотехнология - охране окружающей среды» (Москва, 2004); Международной научно-практической конференции «Человечество и окружающая среда» (Москва, 2004); 3-ей Международной конференции «Актуальные проблемы современной альгологии» (Харьков, 2005); 2-ой й международной научпой конференции студентов, аспирантов и молодых ученых, посвященной 140-легию одесского национального университета им. И.И. Мечникова (Одесса, 2005). Объем и структура работы. Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, литературный обзор, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список литературы, включающий источника, и приложение. Работа иллюстрирована рисунками и таблицами.

Публикации. По теме диссертации опубликовано работ, находится в печати.

4

П. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Объектом исследования послужила альгологически чистая культура пресноводной хлороккоковой микроводоросли Ясепе^еоти« циадпсашШ Тигр. (ВгеЬ ). Для опыта использовали нормально развивающуюся культуру водорослей, частично синхронизированную чередованием "дня" и "ночи" (Успенская, 1966). Водоросли выращивали на среде Успенского N1 в люминостате с интенсивностью света до 5 тыс. люкс при 12-часовом чередовании света и темноты и температурой 20-22 °С.

В качестве модельного токсиканта был использован хлорид меди в концентрациях 0,0001 мг/л; 0,001 мг/л; 0,01 мг/л; 0,1 и 1 мг/л в пересчете на медь. Токсикант добавлялся непосредственно в культуру на разных этапах ее выращивания: в период лаг-фазы (0 сутки), в период экспоненциальной фазы (14-15 сутки) и на стационарной фазе (29 сутки). В дальнейшем культура с внесенной медью также инкубировалась в течение до 31 суток параллельно с контрольной.

Общую численность клеток водоросли в культуре определяли методом прямого счета в камере Горяева в 25 больших квадратах при трехкратном ее заполнении. Общую численность клеток выражали в тыс.кл./мл и в процентах по отношению к контролю. Соотношение живых, мертвых и отмирающих клеток (в % от общей численности) определяли с помощью люминесцентной микроскопии (Горюнова, 1952; Дмитриева, 1988). Оценку состояния фотосинтетического аппарата одиночных клеток проводилась с помощью микрофлуорометрического метода по переменной флуоресценции хлорофилла на установке, разработанной и любезно предоставленной нам для работы д.б.н. Погосяном С.И. (кафедра Биофизики Биофака МГУ). Определяли фоновую флуоресценцию (Ро), максимальную флуоресценцию (Бт) и относительную переменную флуоресценцию (Ру/Рш) ценобия.

Оценку гетерогенности популяции водоросли по способности клеток к выживанию и размножению проводили с помощью разработанного нами метода микрокультур, позволяющего контролировать состояние и развитие одиночных клеток.

Статистическую обработку полученных результатов производили в соответствии с "Методическим руководством по биотестированию воды" (РД 118-0290,1991).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. РАЗРАБОТКА МЕТОДА РАЗДЕЛЬНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

ЦЕНОБИЕВ ВОДОРОСЛИ ЯсепеЛютю циойткаиОа.

Общая численность клеток водоросли в культуре, выращиваемой стандартным стационарным способом, в контроле изменялась в соответствии с классической логистической зависимостью с выраженным чередованием фаз.

Из исходной культуры, названной нами условно макрокул ьтуро й, на различных этапах ее развития случайным образом пипеткой отбирали по 12-24 живых (по показаниям люминесцентной микроскопии) ценобия. В контроле отбор производился каждые 3-4 суток, в опытах с токсикантом - на основных фазах ее развития. Отобранные ценобии рассаживали раздельно в камеры Горяева. Для выращивания клеток в камерах использовали отфильтрованную среду из макрокультуры. Наблюдение за каждым отдельным ценобием, выращиваемым в камере, проводили в течение 80 часов с ежедневным учетом численности и состояния клеток. Миниатюрные культуры, сформировавшиеся в камерах в результате деления клеток, мы условно назвали микрокультурами.

В зависимости от процессов, протекающих в микрокультурах, клетки были условно разделены на отмирающие - погибавшие в процессе наблюдения; размножившиеся, которые дали потомство автоспор и покоящиеся, которые остались живыми в течение 80 часов, но не дали потомства.

Основным показателем состояния культуры служило процентное соотношение отмирающих, покоящихся и размножившихся клеток.

На основе данных, полученных при анализе микрокультур, рассчитывали удельную рождаемость (Прод) и удельную смертность (псме,лн). Удельная рождаемость представляет собой среднее количество вновь рожденных клеток в микрокультурах серии, отнесенное к сроку, за который размножение произошло:

Пр„д(кл/сут) =Кр(,д/(Мисх ♦ м );

в

где: №роД- общая численность клеток появившихся в микрокультуре; Т*!^ -общая исходная численность клеток в микрокультуре, Д1 - время наблюдения, в данном случае 3 суток.

Удельная смертность выражалась как отношение среднего числа погибших клеток в микрокультурах к сроку, на протяжении которого гибель учитывалась:

Пакртп (КЛ/СУТ) = К'.тДН.сх * М ),

где: Коти - общая численность клеток отмерших в за время М

Вычисление среднего удельного прироста (п), представляющего собой прирост числа клеток на одну исходную клетку в сутки (кл/сут), проводили в соответствие с уравнением: п = (1^, - И^/Аг * Н,

где >1, и +Д1) - число клеток в сроки 1 и (1, соответственно.

Сопоставление средних удельных приростов в макрокульгуре в разные сроки ее роста и в микрокультурах из ценобиев, отсаженных в эти сроки, показало, что удельный прирост числа клеток в обоих вариантах близок (коэффициент корреляции 0,96), и это может свидетельствовать о том, что развитие процессов в микрокультурах адекватно отражает изменения, происходящие в макрокультуре, (табл. 1).

Поэтому мы сочли правомерным результаты наблюдений за развитием микрокультур проецировать на процессы, происходящие в макрокультурах и использовать полученные результаты для характеристики популяции микроводоросли в целом.

Таблица 1. Сопоставление удельного прироста численности клеток микро- и макрокультурах (кл/сут)

Срок в Удельный прирост Удельный прирост в

сутках в микрокультуре макрокультуре

0-3 -0,03 -0,06

4-7 0,06 0,06

7-10 0,13 0,10

11-14 0,33 0,30

14-17 0,21 0.16

18-21 0,14 0,09

21-24 0.17 0,08

25-28 0,04 0,04

28-31 0,07 0,01

2. ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕТЕРОГЕННОСТИ ЛАБОРАТОРНОЙ ПОПУЛЯЦИИ БСЕШВЕЯМиБ ОУВЫСАиЪА ПО ВЫЖИВАЕМОСТИ И СПОСОБНОСТИ

КЛЕТОК К ДЕЛЕНИЮ

Фракционный состав клеток, отобранных на розных этапах развития макрокультуры, существенно различался (рис.1).

100% в лаг-фазе,

когда происходила адаптация к новым условиям, основную массу (60-70%)

составляли покоящиеся клетки, доля размножающихся была всего 17 %. Доля отмирающих клеток была максимальной в самом начале

[□покоящиеся □ отмершие В размножившиеся] СУ™1

размн. отм.

25±4 22±3

пок-ся 53±5

44±4 16±4 40±4

11±4

13±5 76±7

Рис.1. Изменение фракционного состава макрокультуры в 11аблюдения и уже т 3

процессе ее роста .

- 4-е сутки понижалась

до 12,5%. На этом

этапе были низкими удельная рождаемость и удельный прирост численности клеток в микрокультуре (рис. 2). На 7 - 10 сутки доля покоящихся клеггок снизилась до 40 -50%, увеличилась доля размножающихся клеток, а доля отмирающих клеток не превышала 8 -12%.

Возрастание доли клеток, способных давать потомство, существенно повлияло на уровень удельной рождаемости. Активность размножения была наибольшей на 11 - 14е сутки, но, поскольку общая численность в культуре в этот период была относительно невысокой, заметное увеличение общей численности клеток в макрокультуре произошло только на 17-20е сутки.

Рис.2. Динамика изменения удельной смертности и рождаемости клеток в микрокуль-турах, получен-ных на разные сроки роста макрокультуры.

В стационарной фазе возрастала доля покоящихся клеток и снижалась доля размножающихся. Удельная рождаемость и удельный прирост в микрокультурах снизились. Стабилизация общей численности клеток в макро культуре произошла за счет увеличения доли покоящихся, а не погибающих клеток.

В целом в микрокультурах, отобранных на разные сроки, удельная рождаемость заметно превышала удельную смертность, достигая максимума на 11 сутки. Удельная смертность клеток, напротив, мало изменялась в ходе роста культуры. В результате изменение прироста общей численности клеток происходило главным образом за счет изменения рождаемости.

При выяснении возможной связи жизнеспособности клеток с их флуоресцентными характеристиками заметных различий флуоресцентных характеристик хлорофилла у клеток, относящихся к разным фракциям, обнаружено не было. Так средние значения ЬУРт, определенные для каждой из групп, совпадали со средними значениями, полученными для данной фазы в целом. Вместе с тем, при анализе фракции отмирающих в стационарной фазе, было установлено, что, главным образом, отмечалась гибель ценобиев, либо с наименьшими, либо с наибольшими значениями относительной переменной флуоресценции. Вероятно, что как очень высокие, так и низкие значения относительной переменной флуоресценции являются аномальными для клетки и могут свидетельствовать о ее неблагополучном состоянии. Для других фаз роста культуры такой зависимости отмечено не было.

При определении размеров клеток было установлено, что однозначной зависимости между размером клетки и ее принадлежностью к определенной фракции не существует. Как крупные, так и мелкие клетки могли участвовать в процессах размножения или оставаться в состоянии покоя. Исключение составили клетки с

шириной 3-4 мкм, которые не участвовали в размножении. По всей видимости, они представляли собой подрастающие молодые автоспоры. Общей тенденцией являлся несколько более крупный размер покоящихся клеток.

3. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ХЛОРИДА МЕДИ НА ВЫЖИВАЕМОСТЬ И РАЗМНОЖЕНИЕ ВОДОРОСЛИ 5с диа<1Псаис1а.

3.1 Влияние внесения меди на лаг-фазе роста макрокультуры

Добавление меди в самом начале эксперимента приводило к

значительным изменениям динамики общей численности клеток в культуре (рис.3).

В целом к концу наблюдения отмечена прямая концентрационная

зависимость, при которой с увеличением концентрации токсиканта угнетение усиливалось. Доля мертвых клеток по данным люминесцентной микроскопии также увеличивалась с возрастанием концентрации меди (табл. 2).

На рис.4 представлена динамика изменения фракционного состава макрокультуры при внесении меди на лаг-фазе, установленная методом микрокультур.

О 5 ♦ 0.0001 мгСи/л —■—0,001 мгСи/л —Х- - 0,1 мгСи/л --*--1 мгСи/л

25 30 СУТЙ

—0,01 мгСи/л ■"контроль

Рис.3. Изменение общей численности клеток водоросли относительно контроля в макрокультуре при добавлении меди на лаг-фазе роста

Таблица 2. Доля живых клеток в культуре 5с. дшс1псаш1а При концентрациях

в % от общей численности (по данным люминесцентной 0,0001 и 0,001 мгСи/л

микроскопии). общая динамика

срок кон- Концентрация меди (мгСи/л) фракций клеток

(сут.) троль 0,0001 0,001 0,01 оП 1,0 сохранялась такой же,

3 99 98 98 95 85 ~ 60 как в контроле, однако

_Ц__94__98__88__:__;__80_ - „

17 94 90 90 90 80 70 Шш °°лее НИЗК0И

I 24 96__94__94__;__;__40_ удельная рождаемость

31 94 92 94 92 90 ЗГ|

клеток. Смертность

; была близкой к контролю. При 0,001 мгСи/л доля покоящихся клеток увеличилась.

Сразу после внесения меди в концентрациях 0,01; 0,1 и 1,0 мгСи/л значения смертности в лаг-фазе были более высокими, чем в контроле,. В дальнейшем, по мере адаптации культуры к новым условиям, смертность клеток снижалась до уровня, близкого к контролю. При концентрациях 0,01 и 1,0 мгСи/л удельная рождаемость клеток, как и в контроле, была заметно выше в фазе экспоненциального роста на 14 -17 сутки, превышая значения этого показателя при концентрации 0,001 мгСи/л.

При концентрации 0,1 мгСи/л удельная рождаемость в микрокультурах в ходе всего опыта оставалась на уровне 0,06 кл/сут.

Доля покоящихся клеток при действии средних и больших концентраций меди, также как и в контроле, увеличивалась к стационарной фазе, однако, если при 0,1 мгСи/л этот показатель был в целом близок к контрольным значениям, то при 0,01 он был ниже, а при 1,0 мгСи/л в конце эксперимента даже несколько превышал значения в контроле.

Таким образом, хлорид меди при внесении его в самом начале эксперимента на лаг-фазе оказывал воздействие на численность клеток в культуре водоросли и на фракционный состав культуры. Начиная с концентрации 0,001 мгСи/л отмечено угнетающее воздействие меди на процессы размножения клеток.

микроскопии).

срок (сут.) контроль Концентрация меди (мгСи/л)

0,0001 0,001 0,01 0,1 1,0

3 99 98 98 95 85 60

11 94 98 88 - 80

17 94 90 90 90 80 70

24 96 94 94 - . 40

31 94 92 94 92 90 35

и

100% >0% 60% 40% 20% 0%

100% 80% 60% 40% 20% 0%

100% 80% 60% 40% 20% 0%

7 II 14 18 21 25 28 контроль сутки

-3 9-12 15-1* 22-25 29-31 0,001 мгСи/л сутки

0,1 мгСи/л1

28-31 супси

100% 80% 60% 40%

20% 0%

(00% 80% 60% 40% 20% 0%

100% 80% 60% 40% 20% 0%

1-3 9-12 15-18 22-25 29-31 0,0001 мгСи/л супя

0,01мг

Шл'

28-31 сутки

9-12 15-18 22-25 29-31 Г мгСи/л сутки

В

□отмершие

Рис. 4. Динамика изменения фракционного состава макрокультур после внесения меди на лаг-фазе роста, определявшаяся методом микрокультур

3.2 Влияние внесения медн на экспоненциальной фазе роста макрокультуры

При добавлении меди в культуру на экспоненциальной фазе (14 сутки) численность клеток при всех концентрациях оказалась ниже контрольных значений.

Степень угнетения культуры повышалась с возрастанием содержания меди в среде (рис. 5), однако при концешрации 0,1 мг Си/л степень угнетения была сопоставима с концентрацией 0,0001 мгСи/л.

Добавление меди на экспоненциальной фазе, также как и на лаг-фазе существенно влияло на общую численность клеток и на фракционный состав культуры В опытах с микрокультурами при всех концентрациях была отмечена полная Рис.5. Изменение общей численности клеток водоросли в остановка процессов макрокультуре относительно контроля при добавлении размножения сразу меди на экспоненциальной фазе роста после внесения

токсиканта. Клетки либо

погибали, либо переходили в покоящееся состояние. Доля отмирающих клеток с увеличением концентрации возрастала (рис. 6). Через две недели после начала эксперимента в культуре было отмечено восстановление процессов размножения при всех концентрациях, кроме самой большой (1,0 мг Си/л).

При концентрации 0,0001 мгСи/л в этот период возрастала доля делящихся клеток, что свидетельствовало об активно идущих процессах восстановления культуры. При концентрациях 0,001; 0,01 и 0,1 мгСи/л через 14 дней доля размножающихся клеток не превышала 10%, и большая часть культуры находилась в покоящемся состоянии. В дальнейшем при концентрациях 0,00001 и 0,001 мгСи/л в культуре восстанавливались нормальные или несколько замедленные процессы ее роста. При 0,1 и 1,0 мгСи/л в культуре продолжалось отмирание клеток.

В целом влияние меди на фракционный состав микрокультур при внесении ее на экспоненциальной фазе роста проявлялось в большей степени, чем при внесении на лаг-фазе. Это может быть связано с тем, что на экспоненциальной фазе была значительной доля более чувствительных размножающихся клеток.

сутки

—•—0,0001 мгСи/л —Я—0,001 мгСи/л —*—0,01 мгСи/л -• х--0,1 иг Си/л ---*-•• 1 мгСи/л контроль

100% 80% 60% 40% 20% 0%

14-17 суши 28-31 сугеи контроль

100% 80% 60% 40% 20% 0%

100% «0%

60% 40%

20% 0%

14-17супт ОЛмгСи/л

21-31 супси

60% 40% 20% 0%

100% 80% 60% 40% 20% 0%

17сута 0,000|мгС и/л

28-31 суши

14-17 сугеи 28-31 супм

0,01шСи/л

100% 80% 60% 40% 20% 0%

14-17 сур»^ 28-31 суш. □ покоящиеся □отмершие В размножившиеся

Рис 6. Динамика изменения фракционного состава макрокультур после внесения меди на экспоненциальной фазе роста, определявшаяся методом микрокультур

3.3 Влияние внесения меди на стационарной фазе фазе роста макрокультуры

В макрокультуре в контроле на 29е сутки общая численность клеток изменялась мало, и большую часть популяции составляли покоящиеся клетки и внесение меди повлияло на общую численность клеток слабее, чем на лаг-фазе и экспоненциальной фазе.

I

I

При

концентрациях 0,001 и 0,01 мгСи/л численность оставалась на уровне контроля и даже отмечалась некоторая стимуляция роста культуры (рис. 7). При концентрациях 0,1 и 1,0 мгСиУл снижение общей численности культуры

Рис.7. Изменение общей численности клеток водоросли в было меньше, чем при макрокультуре относительно контроля при добавлении внесении меди на меди на стационарной фазе роста других фазах.

В изменениях

фракционного состава наблюдалось три возможных схемы развития процесса. Первая имела место при больших концентрациях токсиканта (0.1 и 1,0 мгСи/л), когда происходила полная остановка процессов размножения на фоне высокой удельной смертности клеток. Это приводило к снижению общей численности клеток.

Вторая схема имела место при средних концентрациях (0,001 и 0,01 мгСи/л). Здесь происходило заметное увеличение, по сравнению с контролем, удельной рождаемости и смертности клеток, причем смертность была ниже рождаемости, что и послужило причиной некоторого прироста численности клеток в культуре. При концентрации 0,001 мгСи/л половина клеток в микрокультуре в течение 3-х суток приступала к размножению (рис. 8). Вероятно, в данном случае реализовался популяционный механизм компенсации влияния неблагоприятного фактора, когда на увеличение смертности популяция реагировала увеличением рождаемости.

Третья схема развития событий была отмечена при наименьшей из концентраций меди - 0,0001 мгСи/л. Фракционный состав культуры оказался близким к контролю и большую часть культуры составляли покоящиеся клетки. Несколько более низкой по сравнению с контролем была доля размножающихся клеток и, соответственно, удельная рождаемость. Можно предположить, что

29 30 31 32

—♦—0,0001 мг Си/л—■—0,001 иг Си/л —А—0,01 «г Си/л - -х— . 0,1 мг Си/л - ■ Ж- - ■ 1 мг Си/л ""♦■»»контроль

незначительное возрастание смертности при этой концентрации привело к тому, что компенсаторные механизмы в культуре не отреагировали на слабое воздействие, и

стимуляции

100% 80% 60% 40% 20% 0%

0.001 мг/л 0.01 мг/л 0.1 мг/л 1 мг/л □покоящиеся О отмершие В размножившиеся

0.0001 мг/л

Рис. 8. Фракционный состав макрокультур после внесения меди на стационарной фазе роста, определявшийся методом микрокультур.

размножения не

произошло. Большая часть клеток по-прежнему оставалась в состоянии покоя. Это повлекло за собой снижение прироста культуры и общей численности клеток по сравнению с контролем.

4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВРЕМЕНИ ЛИЗИСА ОТМИРАЮЩИХ КЛЕТОК Ксепейеьтж цшбгкаиЛа И ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ НА СКОРОСТЬ ПРОЦЕССА ПРИСУТСТВИЯ ТОКСИКАНТА

Для определения продолжительности лизиса отмершие ценобии водоросли оставляли в камере Горяева, где за ними продолжалось наблюдение до окончания процессов разложения. Данные учитывали ежечасно. Было установлено, что для полного лизиса клеток в контроле требуется около 2-3 часов. При добавлении токсиканта время лизиса отмерших клеток увеличивалось. Если при концентрациях 0,0001 и 0,001 мгСи/л этот параметр, как и в контроле, было меньше 6 часов (табл. 3), то при концентрации меди 1 мгСи/л среднее время лизиса возрастало до 3-6 суток, т.е. процессы лизиса были сильно замедлены.

Причем клетки, погибшие в конце опыта, разрушались медленнее, чем в начале экспозиции. В результате замедление разрушения погибших клеток при повышенных концентрациях меди происходило накопление мертвых клеток в культуре.

Таблица 3. Длительность лизиса клеток, погибших при действии хлорида меди в различных концентрациях.

Срок развития макрокультуры, Срок завершения лизиса погибших клеток, часы

18 24 30 66 90 102 126 >150

Контроль

0-31 сутки 1 1 1 1 1 III

0,0001 мгСи/л

0-3 сутки j 100

8-31 сутки II

0,001 мгСи/л

0-31 сутки 1 1 1 1 1 III

1,0 мгСи/л

0-3 сутки | 43% 57 100

8-11 сутки | 75% 100

14-17 сутки V 33% 66% 100

21-31 сутки 1 100

Таким образом высокая доля мертвых клеток в макрокультуре, определенная с помощью люминесцентных методов, может быть связана не только с возрастанием смертности клеток, но и с замедлением процессов их лизиса.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Проведенные исследования продемонстрировали важную роль покоящихся клеток в жизни популяции 5с^иш1г1саис1а. Оказалось, что в разные моменты существования культуры их доля составляет от 40 до 80 %. Таким образом, рост и развитие культуры определяются относительно небольшим количеством клеток ответственных за размножение. В отличие от бактерий и синезеленых водорослей, где покоящиеся клетки являются особой устойчивой формой с пониженной физиологической активностью, которая обеспечивает выживание популяции при наступлении неблагоприятных условий, в покоящихся клетках циа&ка^а активно осуществляется фотосинтеза.

По мере роста культуры и перехода ее на стационарную фазу доля покоящихся клеток в ней возрастает. При этом при пересадке ценобия в камеру количество среды и света, приходящееся на один ценобий, увеличивается, однако, это не приводит к усилению размножения. Это свидетельствует о том, что торможение процессов

17

деления клеток в этот момент связано не с автозатенением, а с какими-то метаболическими процессами в самих клетках или накоплением метаболитов в среде. Следует отметить, что в опытах с микроколониями хлореллы (Аникеева, Ваулина, Шевченко, 1964), где при переносе клеток на агар полностью снималось влияние накопленных в среде метаболитов, доля покоящихся клеток не превышала 5%. Это может являться косвенным свидетельством важной роли веществ, накапливаемых в среде, в переходе клеток к состоянию покоя.

Покоящиеся клетки не являются глубоко законсервированной системой. При слабых неблагоприятных воздействиях, когда возможность восстановления культуры зависит от скорости нарастания численности клеток в ней, они способны перейти к размножению. Примером такой ситуации может служить двукратное увеличение доли размножающихся клеток по сравнению с контролем на стационарной фазе при внесении средних концентраций хлорида меди (0,001 и 0,01 мгСи/л).

Метод микрокультур позволил разделить и рассмотреть отдельно три процесса, которые определяют общую численность клеток в культуре в конкретный момент времени: размножение, отмирание и лизис отмерших клеток.

Оказалось, что в контроле смертность клеток остается примерно на одном невысоком уровне в ходе всего роста культуры. Это означает, что главным процессом, определяющим динамику развития популяции, является размножение, а изменение скорости прироста популяции связано с изменениями в процессах рождаемости. В стационарной фазе, когда рост культуры замедляется, происходит ослабление процессов размножения, а не увеличение гибели клеток.

В связи с тем, что угнетение культуры и более низкая численность клеток по сравнению с контролем может быть связана, как с усилением процесса гибели клеток, так и с подавлением размножения, возможность раздельного рассмотрения процессов размножения и отмирания клеток особо важна при оценках токсичности загрязняющих веществ.

Исследования показали, что первой реакцией культуры на токсикант является, обычно, снижение доли размножающихся клеток и их переход в покоящееся состояние. При увеличении уровня токсического воздействия повышается смертность клеток. В опытах с длительной экспозицией показано, что при восстановлении культуры в первую очередь также происходит снижение смертности клеток и лишь при низких концентрациях токсичных веществ идет некоторое

восстановление процессов размножения. Это свидетельствует о том, что размножение является процессом, наиболее чувствительным к неблагоприятным воздействиям. Вероятно, именно с этим связана более низкая устойчивость культуры в фазе экспоненциального роста, отмеченная в наших опытах, когда процесс размножения в момент внесения токсиканта шел наиболее активно.

При оценке смертности клеток в культуре встает вопрос о времени лизиса отмерших клеток, так как количество погибших клеток, оцениваемое с помощью люминесцентной микроскопии, зависит от того за какой период проходит их разрушение. При условии высокой скорости лизиса (порядка нескольких часов), которое наблюдается в контроле и при низких дозах хлорида меди, доля мертвых клеток остается на одном невысоком уровне. При замедлении лизиса в присутствии высоких доз хлорида меди (I мгСи/л) количество погибших клеток в культуре постоянно возрастает, достигая к концу эксперимента 65% от общей численности клеток. При этом реальная смертность клеток в культуре не увеличивается, и к концу эксперимента соответствует контрольным значениям. Причиной замедления лизиса может быть как ингибирование процесса автолиза, так и угнетение активности сопутствующей микрофлоры, обеспечивающей утилизацию погибших клеток.

Таким образом, метод микрокультур позволил исследовать популяционные процессы, связанные с гибелью и размножением клеток в процессе роста культуры в норме и при воздействии хлорида меди.

ВЫВОДЫ.

1. Прием раздельного культивирования клеток водоросли Зсепедеяшия quadricauda, называемый нами методом микрокультур, позволил оценить жизнеспособность и активность клеток в макрокультуре водоросли. В частности, в культуре удалось определить относительное и абсолютное число размножающихся, покоящихся и погибающих клеток.

2. Основную часть культуры составляли клетки, находящиеся в покоящемся состоянии, особенно увеличивалась их численность в стационарной фазе роста культуры.

3. В контрольной культуре доля размножающихся клеток была сравнительно невелика, их абсолютное количество возрастало первые недели, достигая максимума к 18 суткам, с последующим снижением, в результате чего уровни размножающихся

и погибающих клеток становились близкими. Фракция погибающих клеток была меньше фракции размножающихся в период с 5 по 20 сутки. Изменение скорости прироста числа клеток в ходе развитая культуры происходило за счет изменения показателей рождаемости на фоне относительно постоянной смертности.

4. Внесение меди на лаг - фазе и экспоненциальной фазе оказывало угнетающее воздействие на общую численность клеток, в целом усиливающееся с увеличением концентрацией токсиканта. При внесении меди на стационарной фазе роста эффект угнетения отмечался при концентрациях меди 0,1 и 1,0 мгСи/л. При средних концентрациях- 0,001 и 0,01 мгСи/л, напротив, происходила стимуляция процессов размножения, так что снижения общей численности клеток в культуре не происходило.

5. Наиболее сильное влияние на фракционный состав культур медь оказывала при внесении ее на экспоненциальной фазе, когда в популяции был велик процент более чувствительных размножающихся клеток. В начале эксперимента при всех концентрациях здесь происходила полная остановка процессов размножения и некоторое усиление процессов отмирания и только через 2 недели было отмечено некоторое восстановление культуры.

6. При внесении меди на лаг-фазе и фазе стационарного роста хлорид меди главным образом оказывал угнетающее воздействие на процессы размножения клеток, а начиная с концентрации 0,001 мгСи/л происходило еще и увеличение смертности клеток.

7. Время лизиса клеток в контроле оказалось малым по сравнению с длительностью жизненного цикла клеток (2-3 часа), а при добавлении меди в концентрации 1,0 мгСи/л возрастало до 3-6 суток. Таким образом, высокие концентрации токсиканта вызывали накопление мертвых клеток в культуре, а высокая доля мертвых клеток в макрокультуре, определенная с помощью люминесцентных методов, была связана не только с возрастанием смертности клеток, но и с замедлением процессов их лизиса.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Марушкина Е.В. Определение активности процессов деления и отмирания клеток водоросли всепедевтив циаёпсаиёа методом микрокультуры (2004) //Тезисы

докладов 11 международной конференции конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2004» (12-15 апреля 2004 г.), С. 103-104.

2. Марушкина Е.В. Использование микрокультур водорослей для выявления структуры популяций (2004)// Материалы 8 молодежной конференции ботаников в Санкт-Петербурге (7-21 мая 2004 года), С. 94-95.

3. Марушкина Е.В. Особенности выращивания водоросли Ясепедевшив циа(1псаи(1а в условиях микрокультуры (2004)//Тезисы докладов 2 международной научной конференции «Биотехнология-охране окружающей среды» (25-27мая 2004 г.), С. 54.

4. Филенко О.Ф., Дмитриева А.Г., Марушкина Е.В. Исследование структуры модельной популяции водоросли 8сепе<1е8ти8 яиа(1псаи(1а методом раздельного культивирования клеток (2004)//Сборник материалов международной научно-практической конференции «Человечество и окружающая среда» 26-28 октября 2004 Москва, МГУ, С.190-195.

5. Дмитриева А.Г., Марушкина Е.В., Филенко О.Ф. Новый метод исследования модельных популяций одноклеточных микроводорослей (2005)//Материалы 3 Международной конференции «Актуальные проблемы современной альгологии» (Харьков, 20-23 апреля 2005). С.48-49.

6. Марушкина Е.В. ,Филенко О.Ф., Дмитриева А.Г. Новый подход к изучению структуры популяции микроводоросли (2005)// Материалы второй международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых, посвященной 140-летию одесского национального университета им. И.И. Мечникова (г.Одесса, 28 марта-1 апреля 2005), С.45.

7. Филенко О.Ф., Дмитриева А.Г., Марушкина Е.В. Использование метода микрокультур для оценки состояния популяции микроводоросли//Материалы IV Международен научной конференции «Фальцфейновские чтения» (г.Херсон, 1820 мая 2005), т.2, с.43-46.

8. О Ф. Филенко, А.Г. Дмитриева, Е. В. Марушкина. Исследование структуры лабораторной популяции водоросли 8сепе<1е8ти8 циас!псаис1а Тигр. (ВгеЬ) методом микрокультур.2005. "Гидробиологический журнал" (в печати).

9. О. Ф. Филенко, А.Г. Дмитриева, Е. В. Марушкина. Оценка эффекта меди на модельную популяцию водоросли ЯсепеёезтиБ яиа<1ги:аш1а Тигр. (ВгеЬ) методом микрокультур. 2005. " Гидробиологический журнал " (в печати).

Подписано в печать 11.10.2005 Формат 60x88 1/16. Объем 1.0 пл. Тираж 100 экз. Заказ № 121 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. 102

I

I

»18802

РНБ Русский фонд

2006-4 13383

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Марушкина, Екатерина Викторовна

ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Методы исследования состояния популяций водорослей в норме и при экстремальных воздействиях.

1.1. Интегральные методы.

1.1.1. Определение общей численность клеток и анализ полученных результатов.

1.1.2. Интегральные методы оценки состояния культуры водоросли по люминесценции и флуоресценции хлорофилла.

1.2. Методы изучения гетерогенности популяции.

1.2.1. Основные подходы к объяснению гетерогенности популяции микроводорослей.

1.2.2. Изучение морфологических характеристик отдельных клеток.

1.2.3. Изучение размерной гетерогенности культур микроводорослей.

1.2.4. Изучение флуоресцентных характеристик отдельных клеток.

1.2.5. Изучение полярных характеристик клеток.

1.2.6. Дифференциальное окрашивание и плазмолитический методы.

1.2.7. Методы микро и макроколоний (методы подращивания).

1.2.8. Технические методы отбора отдельных клеток.

2. Водоросли, как тест - объект при оценках качества водной среды.

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Объект исследования.

2. Техника культивирования.

3. Исследуемые показатели.

III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Разработка метода раздельного культивирования ценобиев водоросли

Scenedesmus quadricauda

1.1 Развитие культур водоросли Scenedesmus quadricauda.

1.2 Получение микрокультур водорослей.

1.3 Сопоставление развития макро- и микрокультур.

2. Исследование гетерогенности лабораторной популяции водоросли Scenedesmns qaadricanda по выживаемости и способности клеток к делению.

2.1 Исследование методом микрокультур фракционного состава макрокультур в разные периоды роста.

2.2 Оценка наследуемости структуры микрокультур.

2.3 Исследование флуоресценции хлорофилла водорослей.

2.4. Исследование линейных размеров клеток водорослей.

3. Исследование влияния хлорида меди на выживаемость и размножение Scenedesmns quadricanda.

3.1 Влияние внесения меди на лаг-фазе роста макрокультуры.

3.2 Влияние внесения меди на экспоненциальной фазе роста макрокультуры.

3.3 Влияние внесения меди на стационарной фазе роста макрокультуры.

3.4 Влияние меди на флуоресценцию хлорофилла водорослей.

3.5 Влияние меди на линейные размеры клеток водорослей.

4. Определение времени лизиса отмирающих клеток Scenedesmus quadricauda и оценка влияния на скорость процесса присутствия токсиканта.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование состояния популяции водоросли Scenedesmus quadricauda в норме и при интоксикации методом микрокультур"

Токсичные вещества оказывают влияние на самые разные компоненты водных биоценозов: бактерии, водоросли, простейшие, ракообразные, моллюски, рыбы и др. При этом их влияние сказывается как на уровне отдельного организма или клетки, так и на уровне всей популяции и экосистемы вцелом.

Удобным объектом изучения влияния токсичных веществ на популяционном уровне являются культуры микроводорослей. Главным образом, это связано с коротким жизненным циклом отдельных клеток, что позволяет в ходе одного опыта проследить влияние неблагоприятного фактора на нескольких поколений. Кроме того, высокая численность клеток в опыте позволяет получать массовый материал для статистических сравнений.

Особый интерес к процессам, происходящим в популяции культивируемых одноклеточных организмов, появился в 50-х годах прошлого века, когда были опубликованы работы, в которых популяцию (в первую очередь, микроорганизмов) стали рассматривать как единую систему со многими разнообразными связями; систему, которая нередко ведет себя как целостный организм. В частности, в работах Иерусалимского И.Д. (1952) отмечается, что популяции микроорганизмов даже в пределах лабораторных культур характеризуются:

1) фенотипической гетерогенностью составляющих ее клеток как основой для дифференциации клеток по социальным ролям; 2) наличием внутри популяции (например, колонии микроорганизмов) в той или иной мере обособленных микроколоний; 3) целостностью популяции в процессе развития, наличием у нее интегральных свойств, отсутствующих у индивидуальных клеток; 4) способностью популяции влиять на характеристики окружающей среды при достаточной плотности клеток в ней.

Многочисленные работы по колониальной организации микроорганизмов свидетельствуют о морфологической и физиологической гетерогенности входящих в её состав клеток (Олескин, 2001). Так в популяции микроорганизмов отмечают наличие активно делящихся, покоящихся и спонтанно автолизирующихся клеток (Уголев, 1987). Особенно четким разделение клеток на эти группы становится в стационарной фазе роста (Ждан-Пушкина, Хасанова, 1991). Гетерогенность (разнородность) клеток в популяции обеспечивает устойчивость культуры к меняющимся внешним условиям (Greenberg, 2003).

По сравнению с микроорганизмами культуры водорослей изучены слабее, но имеющиеся данные позволяют предположить наличие сложных связей и в их популяциях.

Так в культурах водорослей предполагается появление резерва покоящихся клеток, обеспечивающего выживание популяции в целом при неблагоприятном воздействии (Гапочка, 1981; Саакян, 1987). Кроме того, у водорослей была обнаружена программируемая клеточная смерть, ранее описываемая только у микроорганизмов (Segovia, 2003). Этот феномен является ярким примером социального контроля, когда в интересах популяции в целом происходит гибель отдельных клеток.

Другим примером сложности процессов, происходящих в популяции микроводорослей, является наличие у них сложной коммуникативной системы. Информация между клетками культуры может передаваться с помощью различных химических агентов, на уровне метаболитоввыделяемых клетками в среду (Кажлаева, Плеханов, Максимова, 1991); путем контактного ингибирования (Costas et al, 1993). Одним из средств передачи информации может являться кальций, входящий в состав оболочки клетки (Sanders, Brownlee, Harper, 1999). Установлена возможность передачи информации из поколения в поколение путем записи ее в клеточную мембрану (Costas, Rodas. Lopez, 1991).

Вместе с тем, малоизученными остаются вопросы о роли гетерогенности культуры в процессах ее роста и развития. Не известно, какая часть клеток в популяции участвует в процессах размножения.

Целью настоящей работы являлась исследование структурных перестроек модельной популяции водоросли Scenedesmus quadricauda в норме и при токсическом воздействии.

Задачами работы служило следующее:

1. Разработка метода раздельного культивирования ценобиев водоросли Scenedesmus quadricauda и наблюдения за микрокультурами;

2. Исследование гетерогенности лабораторной популяции водорослей по выживаемости и способности отдельных клеток к делению;

3. Изучение влияния токсического воздействия на выживаемость и размножение водорослей в лабораторных популяциях;

4. Определение временив лизиса отмирающих клеток водорослей и оценка влияния на скорость лизиса присутствия токсиканта.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Гидробиология", Марушкина, Екатерина Викторовна

выводы

1. Прием раздельного культивирования клеток водоросли Scenedesmus quadricauda, называемый нами методом микрокультур, позволил оценить жизнеспособность и активность клеток в макрокультуре водоросли. В частности в культуре удалось определить относительное и абсолютное число размножающихся, покоящихся и погибающих клеток.

2. Основную часть культуры составляли клетки, находящиеся в покоящемся состоянии, особенно увеличивалась их численность в стационарной фазе роста культуры.

3. В контроле доля размножающихся клеток была сравнительно невелика, их абсолютное количество возрастало первые недели, достигая максимума к 18 суткам, с последующим снижением, в результате чего уровни размножающихся и погибающих клеток становились близкими. Фракция погибающих клеток была меньше фракции размножающихся в период с 5 по 20 сутки. Изменение скорости прироста числа клеток в ходе развития культуры происходило за счет изменения показателей рождаемости на фоне относительно постоянной смертности.

4. Внесение меди на лаг - фазе и фазе экспоненциального роста оказывало угнетающее воздействие на общую численность клеток, в целом усиливающееся с увеличением концентрацией токсиканта. При внесении меди на стационарной фазе роста эффект угнетения отмечался при концентрациях меди 0,1 и 1,0 мгСи/л. При средних концентрациях- 0,001 и 0,01 мгСи/л, напротив, происходила стимуляция процессов размножения, так что снижения общей численности клеток в культуре не происходило.

5. Наиболее сильное влияние на фракционный состав культур медь оказывала при внесении ее на экспоненциальной фазе, когда в популяции был велик процент более чувствительных размножающихся клеток. В начале эксперимента при всех концентрациях здесь происходила полная остановка процессов размножения и некоторое усиление процессов отмирания и только через 2 недели было отмечено некоторое восстановление культуры.

6. При внесении меди на лаг-фазе и фазе стационарного роста хлорид меди, главным образом, оказывал угнетающее воздействие на процессы размножения клеток, а начиная с концентрации 0,001 мгСи/л происходило еще и увеличение смертности клеток.

7. Время лизиса клеток в контроле оказалось малым по сравнению с длительностью жизненного цикла клеток (2-3 часа), а при добавлении меди в концентрации 1,0 мгСи/л возрастало до 3-6 суток. Таким образом, высокие концентрации токсиканта вызывали накопление мертвых клеток в культуре, а высокая доля мертвых клеток в макрокультуре, определенная с помощью люминесцентных методов, была связана не только с возрастанием смертности клеток, но и с замедлением процессов их лизиса.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования продемонстрировали важную роль покоящихся клеток в жизни популяции Scenedesmus quadricauda. Оказалось, что в разные моменты существования культуры их доля составляет от 40 до 80 %. Таким образом, рост и развитие культуры определяются достаточно небольшим количеством клеток ответственных за размножение, остальная же часть только поддерживает существование популяции. В отличие от бактерий и синезеленых водорослей, где покоящиеся клетки являются особыми устойчивыми формами с пониженной физиологической активностью и служат, главным образом, для выживания при наступлении неблагоприятных условий, у Scenedesmus quadricauda покоящиеся клетки достаточно активно фотосинтезируют. Это позволяет предположить, что их существование в культуре не связано исключительно с задачей выживания, а необходимо для развития культуры в нормальных условиях.

По мере роста культуры и перехода ее в стационарную фазу доля покоящихся клеток в ней возрастает. При этом при пересадке ценобия в камеру количество среды и света, приходящееся на один ценобий, увеличивается, однако, это не приводит к усилению размножения. Это свидетельствует о том, что торможение процессов деления клеток в этот момент связано не с автозатенением, а с какими-то метаболическими процессами в самих клетках или накоплением метаболитов в среде. Следует отметить, что в опытах с микроколониями хлореллы (Аникеева, Ваулина, Шевченко, 1964), где при переносе клеток на агар полностью снималось влияние накопленных в среде метаболитов, доля покоящихся клеток не превышала 5%. Это может являться косвенным свидетельством важной роли веществ, накапливаемых в среде, в переходе клеток к состоянию покоя.

Покоящиеся клетки не являются глубоко законсервированной системой. При слабых неблагоприятных воздействиях, когда возможность восстановление культуры зависит от скорости нарастания численности клеток в ней, они способны перейти к размножению. Примером такой ситуации может служить двукратное увеличение доли размножающихся клеток по сравнению с контролем в стационарной фазе при внесении средних концентраций хлорида меди (0,001 и 0,01 мгСи/л).

Существование культуры и ее рост при небольшой доле размножающихся клеток возможны только на фоне медленно текущих процессов отмирания. В экспериментах было продемонстрировано, что в контроле количество отмирающих клеток не превышает 10% в сутки (в периоды активного роста культуры около этот показатель опускается до 3%).

Метод микрокультур позволил разделить и рассмотреть отдельно три процесса, которые определяют общую численность клеток в культуре в конкретный момент времени: размножение, отмирание и лизис отмерших клеток.

Оказалось, что в контроле смертность клеток остается примерно на одном уровне в ходе всего роста культуры. Это означает, что главным процессом, определяющим динамику развития популяции, является размножение, а изменение скорости прироста популяции связано с изменениями в процессах рождаемости. В стационарной фазе, когда рост культуры замедляется, происходит ослабление процессов размножения, а не усиление гибели клеток.

Возможность раздельного рассмотрения процессов размножения и отмирания клеток особо важна при оценках токсичности загрязняющих веществ. Дело в том, что угнетение культуры и более низкая численность клеток по сравнению с контролем может быть связана, как с усилением процесса гибели клеток, так и с подавлением размножения.

Исследования показали, что первой реакцией культуры на токсикант является, обычно, снижение доли размножающихся клеток и их переход в покоящееся состояние. И лишь при усилении уровня токсического воздействия происходит возрастание смертности клеток. В опытах с длительной экспозицией показано, что при восстановлении культуры, в первую очередь, таюке происходит снижение смертности клеток и лишь при низких концентрациях токсичных веществ идет некоторое восстановление процессов размножения. Это свидетельствует о том, что размножение является наиболее чувствительным к неблагоприятным воздействиям процессом. Вероятно, именно с этим связана более низкая устойчивость культуры в фазе экспоненциального роста, отмеченная в наших экспериментах, когда процесс размножения в момент внесения токсиканта шел наиболее активно.

При оценке смертности клеток в культуре встает вопрос о времени лизиса отмерших клеток. Дело в том, что количество погибших клеток, оцениваемое с помощью люминесцентной микроскопии, зависит от того за какой период проходит их разрушение. При условии высокой скорости лизиса (порядка нескольких часов), которое наблюдается в контроле и при низких дозах хлорида меди, процессы отмирания и разрушения клеток оказываются сбалансированными и доля мертвых клеток остается на одном невысоком уровне. При замедлении лизиса в присутствии высоких доз хлорида меди (1 мгСи/л) количество погибших клеток в культуре постоянно возрастает, достигая к концу эксперимента 65% от общей численности клеток. При этом реальная смертность клеток в культуре не увеличивается, и к концу эксперимента соответствует контрольным значениям. Причиной замедления лизиса может быть ингибирование процесса автолизиса, так и угнетение активности сопутствующей микрофлоры, обеспечивающей утилизацию погибших клеток.

Таким образом, метод микрокультур позволил рассмотреть популяционные процессы связанные с гибелью и размножением клеток в процессе роста культуры в норме и при воздействии хлорида меди.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Марушкина, Екатерина Викторовна, Москва

1. Аль-Сальман И.М. (1988). Исследование влияния Zn, Cd, Со и сульфатного засоления на зеленые водоросли. -Дисс. . канд. биол. наук. М.- 74с.

2. Андреева В.М. (1975). Род Chlorella. Морфология, систематика, принципы классификации. Л.: Наука. - 110 с.

3. Аникеева И.Д., Ваулина Э.Н., Шевченко В.А. (1964). Действие УФ лучей на хлореллу// Радиобиология. 4, N 6.- С. 883—892.

4. Артюхова В.И., Дмитриева А.Г., Филенко О.Ф., Чжао Цзюнь (1996). Влияние бихромата калия на динамику культуры и размеры клеток Scenedesmus quadricauda (Тигр.) в различные сезоны года// Альгология. 6, N 1.- С. 26—35.

5. Багоцкий С.В., Санин М.В., Эйнор Л.О. (1992). Пестициды и их воздействие на водные экосистемы: Обзорная информация. М.: ВНИИТЭИагропром. 48 с.

6. Барашков Г.К., Киристаева Н.М. (1977). Токсичность соединений меди для Chlorella pirenoidosa// Гидробиолог, журнал. 13, N 4.- С. 92—94.

7. Белевич Т. А. Динамика биомассы и функциональные характеристики морских планктонных водорослей при воздействии кадмия. Дисс. . канд. биол. наук. М. -106с.

8. Белянин В.Н., Сидько Ф.Я., Тренкенису А.П. (1980) Энергетика фотосинтезтирующей культуры микроводорослей. Новосибирск: Наука. 136 с.

9. Бигон М., Харпер Дж., Таундсенд К. (1989). Экология. Особи, популяции и сообщества (в 2-х томах).- М.: Мир.-. 477 с.

10. Божков А.И. (1997). К вопросу о факторах, влияющих на токсичность сернокислой меди для Dunaliella vulgaris// Альгология. 7, N 3,- С. 251—261.

11. Брагинский Л.П., Величко И.М., Щербань Э.П. (1987). Пресноводный планктон в токсической среде.- Киев.: Наукова думка,- 180 с.

12. Васильев И.Р., Маторин Д.Н., Венедиктов П.С. (1988). Метод биотестирования природных вод по замедленной флуоресценции микроводорослей//Методы биотестирования вод. Черноголовка. С.23—26.

13. Васильева Т.В. (1988). Токсико-генетическая оценка качества водной среды с использованием альготестов (на хлорелле). Дисс. . канд. биол. наук.- Одесса.- 149с.

14. Веселова Т.В., Веселовский В.А., Власенко В.В. (1990). Вариабильность как тест перехода клетки в состояние стресса в условиях интоксикации// Физиология растений. 37, N 4,- С. 733—738.

15. Веселовский В.А. (1990). Структурно-функциональные изменения мембран растительной клетки при адаптации к повреждающим воздействиям. Дисс. . докт. биол. наук.- М.- 155с.

16. Веселовский В.А., Веселова Т.В. (1990). Люминесценция растений,- М.: Наука,- 201с.

17. Веселовский В.А., Веселова Т.В., Дмитриева А.Г., Маренков B.C. (1987) Биотестирование природных вод при помощи полевого портативного флуориметра//Методы биоиндикации и биотестирования природных вод.-Л.:Гидрометеоиздат,- С.58-63.

18. Владимирова М.Г., Семененко В.Е. (1962). Интенсивная культура одноклеточных водорослей.- М.: Изд-во АН СССР.- 59 с.

19. Водоросли. Справочник (1989)/Вассер С.П., Кондратьева Н.В., Масюк Н.П. и др.- Киев: Наукова думка.- 608 с.

20. Гаврилова О.В., Рудакова Е.Е. (2001). Влияние спектрального состава света на морфогенез коккоидных зеленых водорослей (Chlorophyta)// Альгология. И, N 2.- С. 165—175.

21. Тапочка JI.Д. (1981). Об адаптации водорослей,- М.: Изд-во МГУ.- 80 с.

22. Галочка Л.Д. (1994). Популяционные аспекты устойчивости цианобактерий и микроводорослей к токсичечкому фактору. Дисс. . докт. биол. наук.- М.- 155с.

23. Герасименко Л.М. (1974) Специфика морфологических изменений некоторых водорослей в процессе их роста и развития в синхронных культурах. Автореф. дисс. . канд. биол. наук,- М,- 21с.

24. Гильяно Н.Я., Малиновский О. В. (1980). Go-фаза в клеточном цикл/Надежность клеток и тканей.- Киев: Наукова думка.- С.99—106.

25. Горовец В.К. (1976) Зеленые водоросли.- Минск: Изд-во БГУ.- 80 с.

26. Горюнова С.В. (1952). Применение метода люминесцентной микроскопии для распознания живых и мертвых клеток водорослей// Труды ин-та микробиологии АН СССР. вып. 2.- С. 64—78.

27. Горюнова С.В. (1956). Техника применения метода люминесцентной микроскопии для гидробиологических исследований// Жизнь пресных вод СССР.- М.-Л.:Изд-во АН СССР,- 101 с.

28. Горюнова С.В., Герасименко Л.М., Пушева М.А. (1980). Роль нуклеопептидов в клеточном делении водорослей.-. М.: Наука.- 198 с.

29. Гродзинский Д.М. (1983). Надежность растительных систем.- Киев: Наукова думка.- 365 с.

30. Гудков И.Н. (1977). Гетерогенность образовательных тканей высших растений и ее роль в радиочувствительности/Системы надежности клетки. -ЬСиев.: Наукова думка.- С. 118—136.

31. Дмитриева А.Г. (1988). Метод биотестирования по определению живых и мертвых клеток водорослей с помощью люминесцентной микроскопии//Методы биотестирования вод. Черноголовка. С.85—89.35,3637,3839,40