Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование процессов выделения и очистки микробной эндо-1,4- β-ксиланазы из рода Geotrichum и изучение свойств фермента

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Дубовая, Наталья Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Строение клеточной стенки высших растений.

1.2. Строение основных компонентов клеточной стенки высших растений.

1.2.1. Целлюлоза.

1.2.2. Гемицеллюлозы.

1.2.2.1. Ксиланы.

1.2.2.2. Ксилоглюканы.

1.2.2.3.(1->3);(1—>4)-Р-Б-Глюкан ы.

1.2.2.4. Галактоглюкоманнаны.

1.2.3 .Пектиновые полисахариды.---------:.

1.2.3.1.Кислые пектиновые полисахариды.

1.2.3.2.Нейтральные пектиновые полисахариды.

1.3. Система ферментов, катализирующих расщепление целлюлозы.

1.4. Системы ферментов, катализирующих расщепление гемицеллюлоз.

1 »41p™JL)"*J. *J AI^D 1сэ.ийзы

1.4.2.р-Ксиланаз ы.

1.4.3.р-Глюкозидаз ы.

1.4.4. Маннаназы.

1.5. Ферменты, катализирующие расщепление пектиновых полисахаридов.

1.5.1. Пектолитические ферменты.

1.5.2. Ферменты, деградирующие основную цепь рамногалактоуронанов первого типа.

1.5.3. Ферменты, катализирующие расщепление нейтральных пектиновых полисахаридов.,.:.,.

1.5.3.1. Ферменты, катализирующие расщепление a-L-арабинанов.

1.5.3.2. Ферменты, катализирующие расщепление галактанов.

1.6. Молекулярная организация ферментов.

1.7. Практическое применение ферментов, катализирующих расщепление полисахаридов клеточной стенки высших растений.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 .Источники ферментов.

2.2. Методы определения активности ферментов

2.3. Определение белка.,.,.v.'.

2.4. Определение углеводов,.:.,.,.

2.5. Хроматография углеводов.

2.6. Изучение ксиланолитического комплекса гриба Geotrichumcandidwn3C.r.v.«.^.

2.6.1. Аффинная хроматография на МКЦ.

2.6.2. Сорбция на 4-О-МеГК из древесины березы.;.

2.7. Выделение эндо - 1,4 - р - ксиланазы.

2.7.1. Ультрафильтрация.

2.7.2. Аффинная хроматография на микрогранулированной целлюлозе.

2.7.3. Гель-хроматография на сефадексе G - 50.

2.7.4. Ионообменная хроматография на ДЭАЭ -тойоперл.

2.7.5. ВЭЖХ - хроматография на колонке TSK - ДЭАЭ -5PW.

2.7.6. Гидрофобная хроматография на колонке фенил -суперозе.

2.8. Изоэлектрическое фокусирование.

2.9. Электрофорез в ПААГ.

2.10. Определение Кт.

2.11. Определение сорбционной способности эндо - 1,4 - |3 -ксиланазы нанерастворимом 4-О-МеГК.

2.12. Выделение эндо - 1,4 - (3 - ксиланазы, способной сорбироваться на 4-О-МеГК.

2.13. Выделение ксилансвязывающего домена эндо - 1,4 - Р -ксиланазы.!.•.

2.13.1. Обращенно - фазовая хроматография на колонке Аквапоре RP - 300.;.

2.13.2. Гидролиз белка папаином.1. 2 Л 3.3. Обращенно - фазовая хроматография на колонке ^ Аквапоре RP - 300.

2.14. Применение ферментного препарата Цёллокандин II Г10х для роспуска макулатуры и обезвоживания суспензии

Целлюлозы.;.:.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Исследование способности различных препаратов расщеплять полисахариды клеточной стенки высших растений.

3.2. Сравнительное изучение динамики накопления ферментов, расщепляющих клеточную стенку высших растений штаммами Geotrichum candidum ЗС и ЗС-106.

3.3. Исследование механизма расщепления клеточных стенок высших растений.

3.4. Изучение ксиланолитического комплекса гриба Geotrichum candidum 3 С.

3.4.1. Аффинная хроматография на МКЦ.

3.4.2. Сорбция на 4-О-МеГК.

3.5. Выделение эндо-1,4 -р -ксиланазы из Geotrichum candidum ЗС.

3.5.1. Ультрафильтрация.

3.5.2. Аффинная хроматография на микрогранулированной целлюлозе.

3.5.3. Гель-хроматография на сефадексе G-50.

3.5.4. Ионообменная хроматография на ДЕАЕ - тойоперл.

3.5.5. ВЭЖХ-хроматография на TSK-DEAE-5PW.

3v5.6. Гидрофобная хроматография на колонке фенил суперозе. 3 ,6. Исследование гомогенности полученной эндоксиланазы.

3.7. Изучение, физико-химических свойств эндо-1,4-ртКСиланазы из Geotrichum candidum 3 С.*

3.7.1. Определение молекулярной массы.

3.7.2. Влияние рН на активность эндоксиланазы.

3.7.3. Влияние температуры на активность эндоксиланазы.

3.7.4. Определение способности снижать вязкость и осахаривать раствор КМК.

3.7.5. Определение степени гидролиза различных ксиланов.

3.8. Выделение эндоксиланазы, способной к сорбции на нерастворимом 4-О-МеГК древесины березы.

3.8.1. Определение сорбционной способности эндоксиланазы.

3.8.2. Отделение эндоксиланазы 1 от связанного с ней 4-0

МеГК из древесины березы.

3.9. Физико-химические свойства эндоксиланазы 1.

3.9.1. Определение Кт эндоксиланазы 1.

3.9.2. Исследование способности эндоксиланазы 1 гидролизовать различные субстраты.

3.9.3. Изучение действия эндоксиланазы 1 на 4-О-МеГК из древесины березы.

3.9.4. Исследование способности эндоксиланазы 1 сорбироваться на МКЦ.

3.9.5. Определение рН-оптимума эндоксиланазы 1.

3.10. Выделение ксиланосвязывающего домена эндо-1,4-|3-ксиланазы.

3.10.1. Обращенно-фазовая хроматография на колонке Аквапоре RP-300.,.,,.

3.10.2. Гидролиз белка папаином.

3.10.3. Изучение действия выделенных пептидов на 4-О-МеГК , из древесины Березы. -.

3.11. Применение ферментного препарата Целлокандин II ГЮх для роспуска макулатуры- и обезвоживания суспензии целлюлозы.„.

ВЫВОДЫ.

СПОСИК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование процессов выделения и очистки микробной эндо-1,4- β-ксиланазы из рода Geotrichum и изучение свойств фермента"

Актуальность темы.

На нашей планете богатейшим возобновляемым сырьевым источником различных биополимеров являются растения. Многие из биополимеров уже давно нашли широкое применение, особенно, крахмал и целлюлоза. Очень давно возникли технологии, использующие крахмал в качестве основного сырья для хлебопечения, для различных бродильных производств, для крахмалопаточной промышленности и т.д. В последние годы уделяется особое внимание проблемам комплексной переработки растительного сырья, т. е. получение целевого продукта и утилизации древесных и растительных отходов. Растения - очень сложный многокомплексный вид сырья. Сложности возникают при обработке древесины и растительных отходов. В ряде случаев возникает необходимость освобождаться от гемицеллюлоз, что это крайне трудно, так как это неоднородное многокомпонентное образование, состоящее из самых различных полисахаридов, содержащих в своем составе разнообразные моносахариды и даже кислоты, которые формируются в -биополимер с образованием разнообразных нерегулярных а- и (3- гликозидных связей. Это определяет структуру гемицеллюлоз, - в них есть линейные цепи и ветвящиеся образования. Гемицеллюлозы участвуют в формировании клеточных стенок в растениях. Первично клеточные стенки, окружающие протопласты молодых растущих клеток, состоят из аморфного матрикса, представляющего собой пластичную массу, образованную пектиновыми полисахаридами, гемицеллюлозами и белками, в которую погружены микрофибриллы целлюлозы.

Несмотря на многочисленные работы в этом направлении еще очень много неясных мест в формировании растительной ткани, а главное в способах ее гидролиза. Гемицеллюлозы - это общее название комплекса соединений, связанных тем или иным способом между собой, это: ксиланы, ксилоглюканы, (l-»3);(l-»4)-P-D-nnoKaHbi, галактоглюкоманнаны и др. Для гидролиза 8 особенно сложны различные виды ксиланов. В связи с этим, важны и актуальны исследования, направленные на поиски активных продуцентов ферментов* гидролизующих различные типы ксиланов. Только обработанные ксиланазами эти биополимеры могут быть использованы в различных производствах, в сельском хозяйстве, при выращивании дрожжевых масс, в производстве бумаги, в роспуске макулатуры и т.д. Поэтому работа по поиску активного продуцента ксиланаз, изучение свойств фермента является актуальной проблемой в биотехнологии и биохимии.

Цель и задачи исследования. ,

Целью настоящей работы является изучение физико-химических свойств грибной эндо-1,4-(3-ксиланазы. Исходя из цели, были поставлены следующие задачи:

- провести сравнительный анализ различных препаратов, содержащих вышеупомянутые ферменты;

- селекционировать наиболее активный, продуцент ферментов, расщепляющих полисахариды клеточной стенки высших растений, основываясь на - коллекции микробных культур лаборатории «ферменты микроорганизмов» Института биохимии им. АН. Баха, ^ i любезно предоставленных нам д.б.н., проф. Родионовой Н.А.;

- изучить динамику накопления ферментов, расщепляющих клеточную стенку высших растений штаммами Geotrichum candidum ЗС и ЗС-106;

- изучить порядок расщепления клеточной стенки, для чего исследовать последовательность появления гемицеллюлолитических, целлюлолитических и пектолитических ферментов в культуральной жидкости при выращивании штамма на изолированных клеточных стенках;

- изучить ксиланолитический комплекс гриба Geotrichum candidum ЗС; 9

- получить высокоочищенный гомогенный препарат эндо-1,4-0-ксиланазы;

- изучить физико-химические свойства полученного препарата;

- выделить эндоксиланазу, способную к сорбции на нерастворимом 4-О-метилглюкуроноксилане древесины березы;

- изучить физико-химические свойства эндоксиланазы, способной к сорбции на 4-О-метилглюкуроноксилане древесины березы;

- выделить ксиланосвязывающий домен эндо-1,4-Р-ксиланазы;

- исследовать возможность применения ферментного препарата Целлокандин Г10х для роспуска макулатуры и обезвоживания суспензии целлюлозы.

Научная новизна работы.

1. Исследована способность 11 ферментных препаратов и 9 штаммов расщеплять полисахариды клеточной стенки высших растений! Показано, что штамм: Geotrichum candidum ЗС является наиболее перспективным: штаммом для выделения эндоксиланазы.

2. Установлена последовательность атаки ферментами клеточной стенки злаков. Первоначально действуют пектиназы совместно с ксиланазами, и лишь потом целлюлолитические ферменты.

3. Показано, что в культуральной жидкости Geotrichum candidum ЗС присутствуют 3 типа эндоксиланаз: содержащая целлюлозосвязывающий домен, содержащая ксилансвязывающий домен и не содержащая полисахаридсвязывающего домена.

4. Впервые из культуральной жидкости Geotrichum candidum ЗС выделена гомогенная эндо-1,4-(3-ксиланаза, содержащая ксилансвязывающий домен. Исследованы ее физико-химические и каталитические свойства и действие на ксиланы различной структуры.

5. Впервые выделен ксилансвязывающий домен грибной эндоксиланазы.

10

Практическая значимость работы

1. Установлено, что препарат Целлокандин Г10х из Geotrichum candidum ЗС-106 перспективен для применения в целлюлозно - бумажной промышленности при конверсии влагостойкой макулатуры и ускорении обезвоживания бумажной массы. Показано, что применение препарата ускоряло как роспуск бумажной макулатуры до целлюлозных волокон, так и процесс обезвоживания целлюлозной суспензии.

2. Совместно с ЦНИИ бумаги получен акт испытаний образцов ферментов, полученных на стендовой установке Института биохимии им. А.Н. Баха РАН, обладающих ксиланазной активностью на активность обезвоживания и размол бумажной массы.

3. Впервые показано наличие у грибов эндоксиланазы с ксилансвязывающим доменом.

Апробация работы,

Ls; Основные положения диссертации представлены на международных и к российских научно-технических конференциях и симпозиумах:

- «Modern problems of microbial biochemistry and biotechnology» (Pushchino,

2000);

- «Химия и биотехнология пищевых веществ. Экологически безопасные технологии на основе возобновляемых природных ресурсов» (Москва,

2000);

- «Молодые ученые пищевым и перерабатывающим отраслям АПК технологические аспекты производства) (Москва, 2000).

Публикации.

Основные результаты диссертации изложены в 7 работах.

11

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Дубовая, Наталья Владимировна

ВЫВОДЫ.

1. Изучена способность различных препаратов расщеплять полисахариды клеточной стенки высших растений. Показано, что препарат Целлокандин-П Г10х содержал наиболее высокие целлюлазные и ксиланазные активности (38,9 Е/г и 126 Е/г соответственно), а также достаточно высокие пектиназные и а-галактозидазную активности (12,7 Е/г и 29,7 Е/г соответственно). Таким образом, Geotrichum candidum ЗС - 106 наиболее перспективный штамм для использования в сельском хозяйстве и промышленности. Однако при дальнейших исследованиях была замечена его некоторая нестабильность и тенденция к снижению продуцирующей способности в отношении ферментов. Мутантный штамм требовал постоянных отборов и пересевов, поэтому для упрощения последующих исследований и получения стабильных результатов был выбран исходный «дикий» штамм Geotrichum candidum ЗС как наиболее перспективный продуцент ксиланазы.

2. Проведено сравнительное изучение динамики накопления ферментов, активных по отношению к «-НФ-Р-С-ксилопиранозИду, и-НФ-P-D-галактопиранозиду, и-НФ-а-О-галактопиранозиду, и-НФ-a-L-арабинофуранозиду, и-НФ-р-Э-глюкопиранозид, хлопку, нерастворимому 4-0-метилглюкуроноксилану древесины березы, карбоксиметилцеллюлозе авицелу, свекловичному пектину, галактоманнану, арабиногалактану штаммами Geotrichum candidum ЗС и ЗС-106. Показано, что в целом накопление ферментов у «дикого» и мутантного штаммов происходило равномерно, одинаково и достигало максимума к 92-100 часам культивирования.

3. Изучена последовательность расщепления клеточной стенки злаков. Показано, что сначала клеточную стенку атакуют пектолитические ферменты, затем ксилолитические и лишь потом целлюлолитические. Показано, что при разрушении клеточной стенки, где преобладают ксиланы, эндоксиланазы

121 появляются одновременно с пектолитическими ферментами уже через 4 часа роста.

4. Исследован ксиланолитический комплекс гриба Geotrichum candidum ЗС. Показано, что 49,7% эндоксиланазной активности сорбируется на микрокристаллической целлюлозе, 45,4% эндоксиланазной активности сорбируется на 4-О-метилглюкуроноксилане из древесины березы, а 4,6% - не содержит субстратсвязывающих доменов и не связывается ни с целлюлозой, ни с 4-О-МеГК. Таким образом, среди эндоксиланаз из Geotrichum candidum ЗС также как и среди эндоксиланаз, синтезируемых другими микроорганизмами, преобладают ферменты, содержащие целлюлозосвязывающие домены. Впервые показано наличие у грибов эндоксиланазы с ксилансвязывающим доменом.

5. Получена высокоочищенная гомогенная эндоксиланаза, со степенью очистки 23 и выходом по активности 14,2%. Активность препарата по отношению к карбоксиметилксилану составляет 34,6 Е/мг белка." - - . '<

-6. Исследованы физико-химические свойства препарата эндокиланазы. Показано, что еш молекулярная масса - 65 кДа; pi - 3,74; рН-оптимум -4,0; температурный оптимум - 50°С.

7. Впервые выделена грибная эндоксиланаза, способная связываться с ксиланом. Изучены ее физико-химические свойства: Кт - 14, 1 мг/мл; рН оптимум - 4,0. Показано, что выделенная эндоксиланаза является типичным эндоферментом и неспецифичной ксиланазой.

8. Впервые выделен КСД грибной эндоксиланазы. Его молекулярная масса составляет 30 кДа.

9. Изучено действие ферментного препарата Целлокандин - II Г10х из Geotrichum candidum ЗС-106 на роспуск влагостойкой макулатуры и ускорение обезвоживания бумажной массы. Показано, что применение препарата ускоряло как роспуск бумажной макулатуры до целлюлозных волокон, так и процесс обезвоживания целлюлозной суспензии.

122

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дубовая, Наталья Владимировна, Москва

1. Албертс Б., Брэй Д., Льюис Дж. Молекулярная биология клетки. -М.: Мир, 1994. Т. 3. С. 362-444.

2. Баразненок В. А. Выделение и свойства эндоглюканаз и ксиланаз Chaetomium cellulolyticum. Дис. канд. хим. наук. М.: МГУ, 1999. 175 С.

3. Берлин X. А. Исследование топологических- эндоглюканаз и ксиланаз ферментных комплексов Penicillium verruculosum и Trichoderma reesei. Дис. канд. хим. Наук. М.: МГУ, 1999. 170 С.

4. Голубев A.M., Килимник А.Ю., Родионова Н.А., Капрельянс Л.В., Неустроев К,Н. Выделение и свойства арабинофуранозидазы из Geotrichum candidum ЗС. //Биохимия. 1993. Т. 58. №6. С. 845-851.

5. Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов. -М.: Элевар, 2000. 512 С. ,

6. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты.- М.: Мир, 1982, ТТ. 1,2, 801 С.

7. Доссон Р., Элиот Д., Элиот У., Джонс К. Справочник биохимикаг М:Мир, 1991: С.123-138. - - . ■ ^

8. Кретович В. Л. Введение в энзимологию. М.: Наука, 1986: 336 С.

9. Номенклатура ферментов. М: ВИНИТИ, 1979.-320 С.

10. Рабинович М.Л., Мельник М.С. Целлюлазы микроорганизмов// Успехи биологической химии.- 2000. Т. 40. С. 205-266.

11. Родионова Н. А., Безбородов А. М. О локализации систем ферментов, катализирующих расщепление полисахаридов растительных клеточных стенок у высших растений. Пектиназы. //Прикладная биохимия и микробиология. -1997. Т. 33, №5, с. 467-487.123

12. Родионова Н.А., Горбачева И.В., Буйвид В.А. Фракционирование и очистка эндо-1,4-Р-ксиланаз и экзо-1,4-Р-ксилозидаз Aspergillus niger// Биохимия.-1977, Т. 42, № 4, с. 659-671.

13. Родионова Н. А., Горбачева И. В!, Тавобилов И. М. Ксиланаза Aspergillus niger.// В сборнике «Проблемы биоконверсии растительного сырья» Ред. Скрябин Г. К., Головлев Е. Л., Клесов А. А. М.: Наука, 1988. С. 237-271.

14. Родионова Н.А., Капрельянс Л. В., Середницкий П.В., Килимник А. Ю. Гемицеллюлозы зерна злаков и ферменты, катализирующие их расщепление. //Прикладная Биохимия и микробиология. -1992. Т. 28. С. 645665.

15. Ahsan М. М., Kaneko S., Wang Q., Yura К., Go M., Hayash К. Capacity of thermomonospora alba XylA to impart thermostability in family F/10 chimeric xylanases // Enzyme and Microbial Technology. 2001. - V. 28 - P. 8-15.

16. Albersheim P. The primary cell wall. // Plant Biochemistry.- 1976.- P. 225-274.

17. Albersheim P. Concerning the structure and biosynthesis of the primary cell walls of plant. // Biochemistry of carbohydrate II Int. Rev. Biochem. Baltimor MD. - 1978. -V. 16.-P. 127-150.124

18. Ali Mursheda К., Kimura Т., Sakka К., Ohmiya К. The multidomain xylanase XynlOB as a cellulose-binding protein in Clostridium stercorarium.// FEMS Microbiology Letters.- 2001.- V. 198. P. 79-83.

19. Awano Т., Takabe K. and Fujita M. Xylan deposition on secondary wall of Fagus crenata fiber. // Protoplasma. -2000. -V. 219. -P. 127-150.

20. Baipai P. Application of the pulp and paper industry//, Biotechnol.Progr. -1999.-V.15.-P.2147-2157.

21. Beg Q. К., Kapoor M., Mahajan L., Hoondal G. S. Microbial xylanases and their industrial applications: a review. // Appl Microbiol Biotechnol. 2001. -V. 56. - P. 326-338.

22. Biely P. Microbial xylanolytic systems. // Trends Biotechnol. 1985 -V: 3, -P. 288-290. .V, ■ •

23. Biely P. Biochemical aspects of the production of microbial hemicellulases. //Hemicellulose and Hemicellulases. 1993. -P. 29-51.

24. Biely P., Vrsanska M., Tenkanen M., Kluepfel D. Endo-P-1,4-xylanase families: differens in catalitic properties. //J. of Biotech. 1997. V. 57. P. 151-156.

25. Bray M.R., Jonson P.E., Gilkes N.R., Mcintosh L.P., and Kilbern D.C., Warren R.A. Probing the role of tryptophan residues in a cellulose-binding domain by chemical modification. // Protein Sci. -1991.-№5. P. -2311-2318.125

26. Bryden W.L., Hew Y. L.I., Ravindran V. Mollah Influence of exogenous xylanase supplementation on apparent metabolisable energy and amino acid digestibility in wheat for broiler chickens. // Animal Feed Science and Technology.-1998.- V. 75. P. 83-92.

27. Cao. Y, Tan H. Effects of cellulase on modification of cellulose. // Cabohydrate Research. 2002. -V. 337,-P. 1291-1296.

28. Chavez R., Navarro C., Calderon I., Peirano A., Bull P., Eyzaguirre J. Secretion of endoxylanase A from Penicillium purpurogenum by Saccharomyces cerevisiae transformed with genomic fungal DNA. // FEMS Microbiology Letters -V. 2002.-V. 212-P. 237-241.

29. Christov L.P., Szakacs G., Rele M.V. & Balakrishnan H. Screening of cellulase-free fungal xylanases and evaluation of their performance on sulfitedissolving pulp. // Biotechnology Techniques -1999. -V. 13. -P. 313-316.

30. Daniel R., Frangos Т., Bullen D., Bergquist P. Hemicellulolytic and cellulolytic functions of the domains of a b-mannanase cloned from aldicellosiruptor- saccharolyticus. // The Int. J. of Biochem. And Cell Biology.-1999. -V. 31. -P. 853859.

31. Dourado F., M. Mota, H. Pala and F. M. Gama. Effect of cellulase adsorption on the surface and interfacial properties of cellulose. // Cellulose-1999.-V. 6.-P. 265-282. ч

32. Dupon C., Roberge M., Shareck F., Morosou F., Kluepfel D. Substrate binding domains of glycanases from Streptomyces lividans: characterization of xylan-binding domains. // Biochem. J. -1998. -V. 330. P.41-45.

33. Durrand R., Rascle C., Fevrre M. Molekular characterization of Xyn 3, a member of the endoxylanase multigene family of the rumen anaerobic fungus Neocallimastix frontalis. // Curr. Genet. -1996. -V. 30. -P. 531-540.

34. Ekinci M. S., Martin J. C. & Flint H. J. Expression of a cellulase gene, celA, from the rumen fungus Neocallimastix patriciarum in Streptococcus bovis by means of promoter fusions. // Biotechnology Letters -2002. -V. 24 -P. 735-741.126

35. Eriksson K-E. Past directions and future posibilities for biotechnology and pulp and paper industry. // 7th International Conference on Biotechnology in the Pulp and Paper Industry. Vancouver, Canada. -1998. -P. A7-A10.

36. Flint H.J., Martin J., McPherson C.A., Daniel A.S., Zhang J.X. A bifunctional enzyme, with separate xylanase and glukanase domains, encoded by the xylanase D gene of Ruminococcus flavefaciens. // J. Bacterid. 1997. - V. 175. -P. 2943-2951.

37. Fry S. C. The Growing Plant Cell Wall: Chemical and Metabolic Analysis.//Essex: Longma Sci. and Technical. 1988.- 333 P.

38. Gilbert H.J., Hazlewood G.P. Bacterial cellulases and xylanases. // J. Gen. Microbiol. 1993.-V.139.-P. Г87-194. - - - - - ' r

39. Gilkes N. R., Henrissat B. A., Kilburn D. C., Miller R. C., Warren R. A. Domains in microbial fM,4-glucanases conservation, function and enzyme families. // J. Microbiol. - 1991. - V. 55. - P. 303-315.

40. Gupta R.C., Kuhadm В. В., Hoondal G.S. Improved xylanaseproduction from a haloalkalophilic Staphylococcus sp. SG-13 using inexpensive agricultural residues. World Journal of Microbiology & Biotechnology//- 2001. -V. 17. "P. 5-8. V:.-. ,.,L . ,,.

41. Henrissat B. and Bairoch A. New families in the classication of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. // Biochem. J. 1993. - V. 293.-P. 781-788.

42. Henrissat B. and Bairoch A. Updating the sequence-based classication of glycosyl hydrolases. // Biochem. J. 1996. - V. 316. - P. 695-696.127

43. Hari К., Rao S., Babu J., Reddy D. Studies on the production and application of cellulase from Trichoderma reesei QM-9414. // Bioprocess Engineering-2000. V. 22. - P. 467-470.

44. Henrissat B. A. Classification of glycosyl hydrolases on amino acid similarities. // Biochem. J. -1990. -V. 280. -P.309-316.

45. Huyghebaert G. The effect of a wheat-fat-interaction on the efficacy of a multi-enzyme preparation in broiler chicken. //Animal Feed Scince and Technology. 1997. -Y. 68. -P. 55-66. .

46. Kebir H., Dupont C., Morosoli R. Increased xylanase production in Streptomyces lividans after replacement of the signal peptide: dependence on box and inverted repeat sequence. // Biochimica et Biophysica Acta. 2000. -V. 1491. -P. 177-184.

47. Laemmli U. K. Cleavage of structure proteins during the assembly of the head of bacteriophage T 4. //Nature. 1970. - Vol. 277. - P. 680-685.

48. Lehtio J., Wernerus H., Samuelson P., Teeri Т. Т., Stahl S. Directed immobilization of recombinant staphylococci on cotton bers by functional display of128a fungal cellulose-binding domain. //FEMS Microbiology Letters. 2001. -V. 195. -P. 197-204.

49. Leggio L. L., Kalogiannis S., Eckert K., Teixeira S.C.M., Bhat M. K., Andrei C., Pickersgill R. W., Larsen S. Substrate specicity and subsite mobility in T. aurantiacus xylanase 10A. // FEBS Letters. -2001. V. 509. - P. 303-308.

50. Lemos M.A., Teixeira J.A., Mota M., Gama F.M. A, simple method toseparate cellulose-binding domains of fungal cellulases after digestion by a protease. // Biotechnology Letters. 2000. -V. -22. -P. 703-707.

51. Liab K., Azadi P., Collins R, Tolan J., Sunwoo J. K., Eriksson К. -E. Relationships between activities of xylanases and xylan structures. // Enzyme and Microbial Technology. -2000. V. 27. - P. 89-94.

52. Matoh Т., Akaike R., Kobayashi M. A sensitive and convenient assay for boron in plant using chromotropic acid and HPLC. // Plant and Soil. 1997. - V. 192.-P.l 15-118.

53. McAllister K. A., Marrone L., Clarke A. J. The role of tryptophan residues in substrate binding to catalytic domains A and В of xylanase С from129

54. Fibrobacter succinogenes S85.1 I Biochimica et Biophysica Acta. 2000. - V. 1480. -P. 342-352.

55. Mitsumori M.; Minato H. Identication of the cellulose-binding domain of Fibrobacter succinogenes endoglucanase F. // FEMS Microbiology Letters. -2000.-V. 183.-P. 99-103.

56. Morosoli R., Roy C., Yaguchi M. Isolation and partial primary sequence of a xylanase from the yeast Cryptococcus albidus. // Biochem. Biophys. Acta. -1986. -V. 840. -P. 473-478.

57. Nath D., Mala R. pH dependent conformational and structural changes-of xylanase from an alkalophilic thermophilic Bacillus sp (NCIM'59). // Enzyme and ~ Microbial Technology. -2001. - V. 28. - P. 397^03.

58. T. Oksanen, Pere J., Paavilainen L., Buchert J., Viikari L. Treatment of recycled kraft pulps with Trichoderma reesei hemicellulases and cellulases. // Journal of Biotechnology. -2000. V. 78. - P. 39-48.

59. Painter T. J. Isolation of oligosaccharides in improved yield by the enzymatic degradation of polysaccharides. // Canad. J. Chem. 1959. - V. 37. - P. 497-499.130

60. Pere J., Puolakka A., Nousiainen P., Buchert J. Action of purified Trichoderma reesei cellulases on cotton fibers and yarn. // Journal of Biotechnology. -2001.-V. 89. P. 247-255.

61. Perez Vendrell A.M., Cosson Т., Gonzalez Т., Rene D.,Taillade P., Brufau J. Enzymatic assays for xylanase and |3-glucanase feed enzymes. // Animal Feed Science and Technology. 1999. - V. 77. - P. 345-353.

62. Pommier J. C, Fuentes J.- L., Goma G. Using enzymes to improve the process and product quality in the recycled paper industry. Part I. // Tappi J. - 1989. -V. 6. P. - 187-191.

63. Pommier J.C., Gong G. J., Fuents J.-L., Ronsset Т., Jokinen O. Using enzymes to improvethe processahd product quality". Part II. // Tappi J. Г990. - V. 73.-P. 192:202. . . -

64. Prade R.A.- Xylanases: from biology to biotechnology. // Biotechnol. Genet. Eny. Rev. 1995. - V. 13.- P. 187-194. '

65. Puis J. Chemistry and biochemistry of hemicelluloses: relationship between hemicellulose structure and enzymes required for hydrolysis. // Macromol. Symp. 120. 1997. -P. - 183-196.

66. Quentin M.,VM., Ebbelaar J., Derksen C., Mariani H., Van der Valk. Description of a cellulose-binding domain and a linker sequence from Aspergillus fungi. // Appl Microbiol Biotechnol. 2002. - V. 58. - P. 658-662.

67. Rao M., Kulkarni N., Shendye A. Molecular and biotechnological aspects of xylanases. // FEMS Microbiology Reviews. 1999. - V. 23. - P. 411-456.

68. Siedenberg D., Gerlach S.R., Czwalinna A., Schugerl K., Giuseppin M.L.F., Hunik J. Production of xylanase by Aspergillus awamorion complex medium in stirred tank and airlift tower loop reactors. // Journal of. Biotechnology. -1997.-V. 56.-P.205-216.

69. Somogyi M. Determination of reducing sugar. // J. Biol. Chem. 1945. V. 160. - №1. - P. 61-68.

70. Somogyi M. Determination of reducing sugar. // J. Biol. Chem. 1952. -V. 195.-№1.-P. 19-28.

71. Subramaniyan S., Prema P. Cellulase-free xylanases from Bacillus and other microorganisms. // FEMS Microbiology Letters. 2000. - V. 183. P. 1-7.

72. Subramaniyan S., Sandhia G.S., Prema P. Control of xylanase production without protease activity in Bacillus sp. by selection of nitrogen source. // Biotechnology Letters. 2001. - V, 23. - P. 369-371. fi^fe

73. Sutton В., Ellis D. Implementing clonal proppagation and genetic engineering implications for pulp and paper. // 7th International Conference on Biotechnology in the Pulp and Paper Industry. Canada. - 1998. -A29-A31.

74. Teleman A., Tenkanen M., Jacobs A., Dahlman O. Characterization of 0-acetyl-(4-0-methylglucurono)xylan isolated from birch and beech. // Carbohydrate Research. 2002. - V. 337. - P. 373-377.

75. Timell Т.Е. Enzymatic Hydrolysis of a 4-O-methyl-glucuronoxylan from the wood of white birch. // Svensk Papperstidn. 1962. - V. 65. - P. 435-449.

76. Tolan J.S., Vega R. The use of enzymes to decrease the Cl2 requirements in pulp bleaching. // Pulp and Paper Canada. -1995. V.96. - P. 107110.

77. Tomme P., Gilkes N.R., Robert C.MJr., Warren A.J., Kilburn D.G. An internal cellulose-binding domain mediates adsorption of an engineered bifunctional xylanase/cellulase. // Protein Eng. 1994. - V, 7. - P. 117-123.

78. Tseng M.-J., Yap M.-N., Ratanakhanokchai K., Kyu K. L. Purification and characterization of two cellulase free xylanases from an alkaliphilic Bacillus firmus. // Enzyme and Microbial Technology. 2002. - V. 30. - P. 590-595.

79. Tuula T. Fibre modification in nature: modes of action of cellulolytic enzymes. // 7th International Conference on Biotechnology in the Pulp and Paper Industry. Canada. - 1998. - A171-A174.

80. Urgun M., Unyayar A., Nalcaci O.B. Alternative source and technology of the production of pulp and paper. // 7th International Conference on Biotechnology in the Pulp and Paper Industry. Canada. - 1998. - C175-C178.133

81. Van TilbeurghH., Tomme P., Claeyssens M.,Bhikhabhai R.? Pettersson G. Limited proteolysis of the cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei. Separation of functional domains. //FEBS Lett. 1986. - V. 204. - P. 223-227.

82. Warren R. Microbial hydrolysis of polysaccharides. // Annu. Rev. Microbiol. 1996.-№ 50. - P. 183-212. .

83. Warren R,, Boraston A., Kilburn D., Stalbrand H. Mannanase Man26A from Cellulomonas 0mi has. a marman-binding module, // FEMS Microbiology Letters. 2000. - V. 183. -P. 265-269. - 7: - : .

84. Whitaker J. R., Granum P. Determination based on difference in absorbance at 235 and 280 nm . // Analyt. Biochem. 1980. - V. 109: - P. 156-159.

85. White Т., Thibault L„ Watkinson J., Sung W., Yaguchi M., Wood M., Huang F. Protein engineerimg of xylanase for pulp bleaching application. // FEMS Microbiology Reviews. 1994. - V.13. - P.335-350.

86. Wilson C. M. Quantitive determination of sugars on paper chromatograms. // Analit. Chem. 1959. - V. 131. - P. 7-12.

87. Wingfield M. Diopulping of sugarcane bagasse: improvement of the semi-alkaline sulfite antraquinone progress. // 7th International Conference on Biotechnology in the Pulp and Paper Industry. Canada. - 1998. - B53-B55.

88. Wong K.Y., Maringer U. Substrate hydrolysis by combinations of Trichoderma xylanases. // World Journal of Microbiology & Biotechnology. 1999. -V. 15.-P. 23-26.134

89. Wong К., Saddler J. N. Applications of hemicellulases in the food feed and pulp and paper industries. // In Hemicellulose and Hemicellulases. 1992. P. 127-143.

90. Wright J.D. Future directions and research needs of the pulp and paper industry. // 7th International Conference on Biotechnology in the Pulp and Paper Industry. Canada. - 1998. - A3-A6.

91. Xiao Z., Gao P., Qu Y., Wang T. Cellulose-binding domain of endoglucanase III from Trichoderma reesei disrupting the structure of cellulose. // Biotechnology Letters. 2001. - V. 23. -P. 711-715.