Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение структуры и функции термостабильной ксиланазы XYNA THERMOTOGA NEAPOLITANA

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение структуры и функции термостабильной ксиланазы XYNA THERMOTOGA NEAPOLITANA"

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИИ ТЕРМОСТАБИЛЬНОЙ КСИЛАНАЗЫ ХУМА ТНЕЙМОТОСА ЖАРОЫТАМ

(Специальность 03.00.03 - молекулярная биология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук '

На правах рукописи УДК 577. 29;577. 112. 083.3

ДАХОВА Ольга Никола

Москва - 1996

Работа выполнена в Лаборатории молекулярной генетики аназробов Института молекулярной генетики РАН

Научные руководители: к.м.н. Великодворская Г. А.

к.б.н. Зверлов В. В.

Официальные оппоненты: д.-б.н, Машко C.B.

к.б.н. Голденкова И.В.

Ведущая организация: Химический факультет Iffy им. К.В.Ломоносова

Защита состоится "11" июня 1996 г. в 14 часов на заседании Специализированного Ученого совета Д. 098.12.91 при Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 113545'Москва. .. 1-й Дорожный проезд, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНИМ генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Автореферат разослан 1996 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидата биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Биодеградация целлюлозосодержащего сырья является одной из основных задач биотехнологии. Наиболее изучены ферменты, участвующие в деградации целлюлозы и гемицеллю-лозы, в частности - ксилана, у грибов, так как уровень их экспрессии значительно .выше, чем у бактерий. Однако бактериальные целлилазы и ксиланазы, особенно ферменты термофильных бактерий, имеют ряд преимушеств с точки зрения их применения в биотехнолоп гии: более высокая удельная активность ферментов, термостабильность, меньшая степень ингибирования конечными продуктами гидро. лиза. • Из- . • ■ вестно, что некоторые представители вида .Thermo toga продуцируют высокотермостабильные ксиланазы, которые представляют потенциальный интерес для целлюлозо-буманной промышленности, так как способны обеспечить экологически чистый процесс отбеливания бумаги, заменяя хлорную кислоту. Продукция этих ферментов в самом микроорганизме. как правило, довольно низкая. Клонирование генов термостабильных гликозил-гидролаз в мезофильных микроорганизмах, в частности - в клетках Е. coll, и использование методов генной инженерии позволяют значительно увеличивать уровень экспрессии этих ферментов и-упрощает способ их получения, "очистки и изучения.-Данная работа посвящена клонированию генов термостабильных ксила-наз и целлюлаз экстремально термофильной эубактерии Thermotoga neapolitana и исследованию структуры и функции высокотермоста-бильной ксиланазы ХупА.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было клонирование генов термостабильных целлюлаз и ксиланаз экстремально термофильной эубактерии Thermotoga neapolitana в клетках Е. coll и исследование структуры и функции термостабильной ксиланазы ХупА. В.ходе работы решались следующие задачи:

- создание и анализ банка генов Т.neapolitana в клетках E.coll;

- отбор индивидуальных клонов с различной субстратной специфичностью;

- определение нуклеотидной последовательности клонированного гена ксиланазы ХупА; ' ■

- исследование структуры и функции фермента:

- изучение физико-химических свойств термостабильной ксиланазы. Научная новизна и практическая значимость работы. Из клоноте-

ки T.neapolitana было отобрано и охарактеризовано по субстратной специфичности 8 индивидуальных клонов, продуцирующих 1.4-р-глюка-назу, ламинариназу. две различные ксиланазы и четыре 1,4-р-глюко-зидазы. Был отобран клок, продуцирующий высокотермостабильную ß-ксиланазу ХупА и локализован фрагмент1 ДНК T.neapolitana, определяющий синтез данного фермента. Определена нуклеотидная последовательность гена хупа. На основе анализа нуклеотидной последовательности и выведенной из нее аминокислотной последовательности ХупА был сделан вывод, что ксиланаза А представляет собой белок с молекулярным весом 119323 Да. Сравнительный анализ гомологии аминокислотной последовательности данного бежа с последовательностями уже охарактеризованных гликозил-гидролаз и известные особенности третичной структуры данных ферментов позволили выделить в составе ксиланазы ХупА лидерный пептид и три домена (центральный каталитический домен, С-концевой целлюлозосвязывающий домен и N-концевой домен, о функциональном значении которого почти- ничего не известно), разделенных короткими лиикерными последовательностями. Делеционный анализ подтвердил предположения, что средний домен является каталитическим, С-концевой домен является целлюло-зосвязывающим -доменом, N-концевой домен обеспечивает термостабильность данного белка/ Термостабйльная ксиланаза А из рекомби-нантного штамма E.coli DH5d. содержащего плазмиду рТТ17, очищена до гомогенности по данным, электрофореза в ПААГе и определены ее основные физико-химические характеристики. На основании анализа субстратной специфичности и основных продуктов гидролиза ксилана ксиланаза A T.neapolitana охарактеризована, как эндо-1.4-ß-D-Kcn-лан ксилогидролаза (КФ 3.2.1.8). Показано, что ХупА является наиболее термостабильной из известных на сегодняшний день 'ксиланаз эубактерий.

Апробация работы. Результаты исследований" докладывались на международном симпозиуме по биотехнологии -"Protein engineering and structural biology" (Miami. USA. 1995), на VII Всесоюзной конференции "Новые направления в биотехнологии" (Пущино, 1994), а также на ежегодной научной конференции Института молекулярной генетики РАН (Москва, 1995.1996).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введе-

ния, обзора литературы, -экспериментальной части, включающей описание' объектов и методов исследования, изложения результатов исследования и их обсуждения, а также заключения, выводов и списка цитируемой литературы (Нелитературных источника). Работа изложена на ¿^.страницах машинописного текста, содержит^ таблиц и 35"рисункй6.

РЕЗУЛЬТАТЫ Й ОБСУЖДЕНИЕ

1. Создание банка генов ЛЪегто^а пеароШапа. Отбор клонов с активностью на различных полисахаридных субстратах.

Нами был сконструирован банк генов Thermotoga neapolitana на базе плазмидного вектора pTZ19R. ДНК Т. neapolitana, обработанную Sau3A. лигировали с ДНК плазмиды-вектора pTZ19R. линеаризованной рестриктазой BamHI. Полученной лигазной смесью трансформировали клетки Е. coli штамм TG1. Более 90% полученных в результате трансформации клонов содержали рекомбинантные плазмиды со в став каш ДНК Т. neapolitana размером от 2 до 6 т.п.н. Отбор клонов проводился на чашках с различными субстратами, __ такими как КМЦ. лихе-нан, растворимый ксилан, 4-метилумбеллиферил-р-1Ьцеллобиопирано-зид (МУЦ), 4-метилумбеллиферил-р-1Ьглюкозид (МУГ). В дальнейшем для определения субстратной специфичности и удельной активности отобранных клонов, обладавших активностью на каких-либо из перечисленных выше субстратах, мы использовали прогретые и осветленные клеточные экстракты полученных клонов. При этом кроме КМЦ. лихенана и растворимого ксилана, мы исследовали активность отобранных клонов на таких субстратах, как Авицел (микрокристаллическая целлюлоза), нерастворимый ксилан.. ламинарин, а вместо мети-лумбелиферильннхч41роизводных - ПНФЦ. ПНФГ и ПНФКс. Полученные значения удельной активности в осветленных экстрактах отобранных клонов приведены в Табл.' 1.

Таблица 1. Активности отобранных рекомбинантных оонов (ед./мг общего белка)

Клоны Авицел Ксилан Ксилан КМЦ Лихенан Ламинарии ПНФГ МУЦ МУГ нераств. раств.

рТТЗ 0, 04 .

рТТ26 -

рТТ17 -

рТТ32 -рТТ1 • рТТб

рТТ28 -

рТТЗб -

0,39 0,41

3.2 105 6.3

21.9 - 2.0 9,2 -

16

0,02 + +

0.02 + +

25.2 ++ ++

17,2 ++ ++

Клоны рТТ1 и рТТб проявляют активность на целлобиозе: 12,6 и 8,5 ед./мг общего белка, соответственно.

По субстратной специфичности можно сказать, что плазмида рТТЗ определяет синтез р-глюканазы, плазмида рТТ26 - ламннарина-зы, плазмды рГТ17 и рТТ32 содержат гены ксиланаз, группа плазмид рТТ1.6,28.36.38.41 отвечает за синтез р-глюкозидаз. Четыре фермента имеют высокую активность на рНФД и рНФГ, а также на рНФКс (Табл.1). Две другие из отобранных р-глюкозидаз обладают высокой активностью на целлобиозе, ■ но почти не активны на таких синтетических субстратах, как рНФЦ и рЕФГ. Следует отметить,- что такие

ферменты необходимы для полного гидролиза целлюлозы до глюкозы, так ¡тк чаще всего именно целлобиоза является основным конечным продуктом гидролиза целлюлозы р-эндоглюканазами.

Были построены рестриктные карты рекомбинантных плазмид отобранных клонов. Данные блот-гибридизации по Саузерну свидетельствуют о том. что нами клонированы 8 независимых генов целлю-лолнтических и ксиланолитических ферментов ТЬегто^а пероШапа, в составе плазмид рТТЗ. рГТ17. рТТ32. рТТ26. рТТ1. рТТб. рТТ28, рТТЗб.

2. Характеристика рекомбинантных целлюлолитических и ксиланолитических ферментов Tt. neapolitana, синтезируемых в клетках Е.coli.

По анализу'субстратной специфичности ферментов, синтезируемых отобранными клонами, можно выделить основные черты ксилан- и цел-люлозо-деградирующей систем экстремальной термофильной зубактерии Thermotoga neapolitana. Эта системы представляют собой ряд фер-ментоз. которые, как-показал анализ 'культуральной жидкости " при выращивании микроорганизма на среде MMS с добавлением целлобиозы, не объединены в высокомолекулярный белковый комплекс.

Отобранные клоны обладают широкой субстратной специфичностью (Табл.1). Так, например, клон, несущий плазмиду рТТЗ, содержащую ген р-глюканазы, обладает авицелазной, лихеназной. целлобиогидра-лазной активностями и активностью зна карбоксиметилцеллюлозе (КМЦ). Два отобранных ксиланазных клона_ проявляют активность на1 ксилане и, в то же время, на МУЦ. помимо этого клон, несущий плазмиду рТТ17 обладает еще активностью на лихенане (оба указанных субстрата содержат fS-глвкозидные связи). Отобранные глюкози-дазы проявляют ксилозидазнуи активность.

Из литературы известно, что некоторые виды Thermotoga продуцируют высокотеркостабильные ксилачазамы, представляющие как научный так и практический интерес. Поэтому наш в качестве объекта дальнейших исследований была выбрана одна из ксиланаз, синтезируемая клоном, несущим плазмиду рТТ17. Предварительные исследования. проведенные на осветленном экстракте клеток, содержащих ука-

заннув плазьэду. показали, что синтезируемая ксиланаза обладает рядом интересных свойств: широкой субстратной специфичностью, высоким температурным оптимумом активности (90°С) ж уникальной тер-мостабильностьв (время полужизни фермента более 50 часов прч 85°С). Эта. первая из исследуемых наш ксиланаз Т.леароШапа была обозначена как ХупА.

3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ГЕНА р-эндоксиланазы Хуп А ТЬегто1;о§а пеароШапа.

Полная нуклеотидная последовательность вставки хромосомной ДНК Т. пеароШапа в плазшде рТТ17 была. определена по обеим цепям по методу Сеагера (Рис.1).

1 ваАтодагоицатоацщцл щСааь тг .11: ^дадша!' П'т Т'^цААхци^ттегтхтАтедх^тоут-^^

1в1 хттпттпттт'т •ГЛ,1ту»|ТРгягУУП Р л * ' »диуахгтхт ГТОХЛААТЫСМУ^ с'/ААТттпх^Ацсич 1 1т1июуугоаодтат*д.ттс

-25 I -Ю

эо1 сггсацососАихцсРмшияатеткюшя^^ О а ЗТАУЬТС!!. АОРЬОУТЬ.А АТОА-ЬОРАУВЖвЬЬЬ

лидерный паггяд t домен А

10ГгРХ.9»КО!1ГОвЛ9РГвКО?УУТАвСОУААО

501 сбдамтас70ьсгщиАбЯШ»АДДигА*сггсапАДООй^^

огтях.к.гсвктятмоетсхох.твхуцтатогх'ь

С01 ССТХГСАХЦ^'и^Эиии'ГЯг'Ц^ПГСОС&ХС! 11ТСАОЦЬ п ОТЦСААаы^<Х»АОАСаАА»АР(ХГга^^

зРЯТтотвоаРоьгвтъхятвовко-гаткхьАС*

- Ест£

ЕТОРУРТТОКУСТЬТРЕЕАаРХУУТХТЗГЕКа г

аР«ОРЯабОУгхя?аРКтА&аахЕ51.гуяяк(}Ка

¿¿51

1оо1 ет">дсА£о<»оста^мтсаютзшА<га1ицоя\мии>сс^

ИЯОЛОХ»1ХО 1 V X Т О I Т ТАУ1А»ТТО*»вОивТ ' 24* МС

11,01 лдддхадтз*г«Атасал»шммш11аудл

II ИТИОвЕТаЯ-ОввТХТК*

1301 стоаААсеггао счхтсуп цссастатсАддг лзя »ча»ccтouzocтcтжcтттзJцтгtгг^^'^^Ar - ■д^к^.гг.: гти-иггтЕГАса асдлчьггйлА • а 6 т*тх РАв77.ухв*,'Т1,т Ржа о в р<т I. в у ? в о V ■ г

А К X ХХ.ВИЯРХСЕХУАЬЕОГХ.ТУиТ* - П У Р Р V г.

""'"зн домен 2

1401 CTTTOCAO JvCb 1 VXAAOGrrrTTtJO'CTUUX-JlüAAQa^^

1S01 01 J'lyCT ]У,САО^ЬТСХ1АДЛЛСТтаСААЛСТТ'ЛАЛТТСАЦС'ГТтал^

S L L А С 3 I Я Q t L l F * FBTADKYIEFfcQQNSM VV R С

1601 I

HT1.VV-H II 5 T > E W TT KDEKONLL'SKEIMrS * LR С

noi тасатасьса-Ш l'l'-i .¿aACAirrTCA>j3g*xiAjißaTCmc^ тгда^ллг^м

YJHTVVQartOKVYAtfOVVREAVDPlIQPPaX.RR

1801

ST»YCI«epDYXSbAFKFABEADPHAILrYMDYH

a«

asoi сдгс1ТсоАЛсссьлА*АДМЦДлса?CARTAOACCn UIцАддлатстг.ААоаАОААжоаАстсжн^тоаца^

?rEPKKBDXXYKLVK8I.EEKQLXDG3e*QC!tXa

AB "571

UATOiaQlESAIEEFStXP РТЕХВ1ТГ»ЬР1 S V Y

sit активный участок семейств« Ii тс

3101 О^ТГССАСТТСОАСТАСТСАДВАаСАССА»«!*^^

В 0 9TS SYiEAPRTAL XEQASEM. АОЬГЕХГК EY9R

- £*il

2301

VXTKYTrveLE&OY9WRATRXMJ)lt?Z.XrDKSYQ

u„ ___L , ^ flm л

2301 аCAAAAcrmстшггсгмС0ДТТОТЭОС ' , *3UU»AQAgCAAttATCTCCt3AAOgACAA008Tt^fQOTCk»gAAT^

AKLAYVAXT* rla*I9EOEAVVVQVl

«в? i»t домен С с

2 5 01 TOG АСОАТГССТА CATOATCTCCAAa СГ<^таДАДАТСГ?ЦГС^ТаААЗААООаАА£ХПЧ^^ ДДАСХД CACGATCTh

MDDSYUWS t *> I г Г к д У У X ATT R А Г У Е Р Я т I т

повтор С! tsSl

VTCFVP PATKKPAEO^VAXryW PWWgRTPTLQP

AB 775

2«01 OATOACaetn ЖЛЛПЦ ГЗ .1Т1Л liOAC^A^CTm^AnAgTGAgGTCAACAPQa^^

РРТГУУ1,«Т*»КЗгУК*К П_У.Е, ,У**ГУОУОГ»РТ

2701 и 1 гпшздтеттеаАтсхсаАТьесг^т:^ |тАтат»^^^ЦАт>одга>сиХ1АААТС(7Гас*осто

SFEW8ITX Р Q У t Т КХРВТХВТР Т А yiPPCKW^S*

seel о«соАсдсадга<Аг^еа>п»АДАС!1А»оц^таААстас^ . .к р т т-яд о к т • я т и я т а г ь-к l eovbtatakyctpt

IPOE X0DXWJTTT«EXST Г 3 У К К qSl»*«ATAXT

ПОЕТОр С2

К У Т. * DE.t WtfTTLAI P. P. v »KDJTSMPW Ш p P Я У Ж

XPFff*FETqYYBPPPAO P R УЯТИЯВОУГОТОТО

.A aAA Vf gTArrLtg QOryTgAAT KWETXtPapff

:зо1 сротадзаозст угкаилст^^

Т У X О У W У_СУУ&АИ ЕГООВУе1ХВ»»РРТ«и5**Р

34 OX TCCTTCAJAТГТСООААГ" LTC^GCKn^^TÄUrni? р S Г, Г О Г» у, » ь X t '

rbo iadgixaidgnC —Cor

Рпс. 1. Нуклсотнднэя последовательность гена ß-ксиланазы Хут\л Т. r.sarditana и шлшошслоткая последовательность прссгукта этого, гена. Бее регуляторкые последовательности гена и croyiCTj-pi-V.J уч,чст;си батса подчеркнуты и обозначены.

Нуклеотидная последовательность содержит открытую рамку считывания длиной 3264 п.н., что соответствует 1055 аминокислота»: остаткам и молекулярному весу белка 119323 Да. Теоретически определенный вес белка коррелирует с полученным экспериментально по данным электрофореза в SDS ПААГе - 116000 Да. Инициирующему АТС кодону предшествует типичная последовательность-- ^Шайяа-Дальгарно AAGGAGGTGG. которая полностью комплементарна 3'-концу 16S РНК Е.coll. Область промотора находится на 129 нуклеотидов впереди от стартовой точки. Обнаруженные на 5' некодирующем участке промо-торные последовательности TTGAa (-35) и ТАТААТ (-10) близки к ка-ноническиы и коррелирует -с ух:е известны:® для некоторых генов .Thermo toga проыоторными последовательностями, представленными Ли-ао и Деннис (Llao and Dennis). В терминальной области открытой рамки считывания на 32 нуклеотида ниже опал-стопкодона (TGA) расположена полиндромная последовательность со свободной энергией шпильки м-РНК -19. ООккал. за которой следует олиго (dT) последовательность. что позволяет предположить наличие р-независимого терминатора.

4. ^СРАВНЕНИЕ АМИНОКИСЛОТНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ КСИЛАНАЗЫ XYJÍ А

rTt. neapolitana С ДРУГИМ КСИЛАНАЗАЖ

Проведенный нами сравнительный анализ гомологии аминокислотной последовательности ксиланазы Хул A Tt. neapolitana с аминокислотными последовательностями уже охарактеризованных целлюлаз и ксиланаз с учетом известных особенностей третичной структуры данных ферментов позволили выделить в составе ксиланазы ХупА три домена. обозначенные А. В и С. разделенные короткими линкерными последовательностями, которым предшествует сигнальный пептид длинной в 29 акинокилот (Рис. 1,2). Последовательность из'пяти положительно заряненных аминокислотных остатков ( Arg, Lys) на N-конце и последующая область из гидрофобных аминокислот являются наиболее характерными чертами сигнального пептида. Сравнение структур различных лндерных последовательностей, в том числе ксиланазы Xyn X С. thermoceilum () и эндоглвканазы Cel Z C.stercora-г1шп (Jaurus et al.. 1936) позволило нам локализовать место отщепления сигнального пептида в позиции Ala 29.

1 371 600 687 1055

SP А В active site с1 С с2

Рис. 2. Структурные участки ß-ксиланазы ХупА Т. neapolitana.

Каталитический домен отделен от некаталитических доменов короткими последовательностями, содержащими Thr-Ser или Pro (в области 367 а. к. о. и 688 а. к. о., Рис. 1.2), которые, как полагают, выполняют роль подвижных связок между доменами и обнаружены у ряда целлюлаз и ксиланаз (Knowless et al., 1987). Эти междоменные участки более доступны воздействию протеаз. особенно в гетероло-гичных хозяевах. •

Сравнение первичной структуры ксиланазы а демонстрирует значительное сходство ее-центрального домена В. включающего с 331 по 687 аминокислотнные остатки, с каталитическими доменами глико-зил-гидролаз семейства 10 (Henrlssat. 1991). Исходя из гомологии последовательностей можно заключить, что центральный домен В ксиланазы а выполняет те же функции - является каталитическим доменом. Наибольшая степень гомологии - 58,5% - обнаружена с N-конце-вым каталитическим доменом Се1 В Caiflocellum saccharolyticum (Saul et al., 1990). Другие гликозил-гидролазы семейства 10 также обладают значительным сходством аминокислотной последовательности с Хуп а Tt. neapolitana. Так, например, Xyn A Calddcellum saccharolytlcum имеет 46,8% идентичности, Хуп В Butyriovibrlo fibrisel-vens - 41,3%, Xyn A Bacillus spec. S5 - 36,2%. В домене обнаружен мотив активного центра, являющийся консервативным у большинства гликозил-гидролаз'семейства 10 :

[GT] -х(2) - [I.VH] —X— [LIVMF3 — IST3 -Е*- tLIVHF] - [DN) - ELIVMF)

ч

в центре которого находится каталитический аминокислотный остаток Glu-604, (Рис. 4), который, как было показано на примере целлоби-огидролазы Сех Cellulomonas fimi, относящейся к данному семейс-

тву, непосредственно участвует в расщеплении гликозидной связи, выступая в роли нуклеофила ( Tull et al., 1991).

XYNA TTNEP Z46945 EEAIKKFSTIPGIEIHITELDISVYR-DSTSN 597- -607

GUNB CALSA P10474 N-SIKLFSSIPGIEIHITELDMSLYNYGSSEN 278- -288

XYNA CALSA P23556 KKAIEVYASL-GLEIHITELDISVFEFEDKRT . 245- -255

XYNA BACS5 P07528 RASFEKFTSL-GLDNQVTELDMSLYGWPPTGA 294- -304

XYNA THESA P36917 KASIEKLASL-GVEIQVTELDMNMNGNISNEA 593- -603

XYNX CLOTM P38853 KASIEKLASL-G7EIQVTELDMNMNGNVSNEA 445-455

XYNB BUTFI ■ P26223 RTALEMYGST-GLQIHITELDMHNADPSEESM • 248- -258

XYN4 CALSA P23557 KTTLETFAKL-GLQIHITELNFEIKGDESNRT 209- -219

XYNA PSEFL P14768 ATO-KIVALSPTLKIKITELDVRLMPYDGNS 503- -513

GUX CELFI P07986 RQNLQEFADL-GVDVRITELDIRMRTPSDATK 267- -277

XYNA STRLI P26514 RTTLQNFAAL-GVDVAITELDIQGAPASTYAN 270- -280

XYLP PENCH P29417 SGALNALASAGTEEVAVTELDIAGATSTDYVD 260- -270

XYNZ CLOTM P10478 IDQNIKRYAEIGVIVSFTELDIRIP-QSENPA 747- -757

XYNA ASPAK P33559 -GALNALAGAGTKEIAVTELDIAGASSTDYVE 256- -266

XYNA BUTFI P23551 TNALNSFLRA-GFEVQITELDITNKGDYDLfflí 304- -314

XYNA RUMFL P29126 ETALKKFLST-GLEVQITELDITCTNSAEQAD 879- -889

XYNA CRYAL P07529 -PAAMNLFSDQGLEVPMTELDVRIPVNGNDMP 207- -217

XYNB PSEFL P23030 -TAIDNIWNQ.VGKP IYISEYDIGDTHDQVQLQ 523- -533

Рис. 3. Сравнение аминокислотных последовательностей консервативных участков каталитических доменов ксиланаз и целлзапаз семейства 10 глшшзил-гидролаз. Подчеркнута высококонсервативная последовательность.

Последовательность Thr-Glu-Leu-Asp располагается приблизительно на одинаковой позиции внутри каталитических доменов глико-змл-пщролаз семейства 10. Замена консервативных аминокислотных' остатков Glu-600 и Asp-602 в ксиланазе А Т. saccharolyticum полностью нарушала ферментативную активность белка, что является подтверждением участия -данных аминокислотных оста'гков в Механизме кислотного катализа (Lee et al.. 1993). Наличие в активном центре консервативного остатка глитаминовой кислоты в качестве нуклеофи-. ла я значительное сходство аминокислотных последовательностей

между Хуп А и СЕХ позволяет предположить, что ксиланаза А Т. neapolltana гидролизуьт ß-гликозидные связи субстрата, вероятнее всего, с сохранением аномерной конфигурации гликозидов. (Gebler et al.. 1992). Центральный домен В, включающий аминокислотные остатки с 371 по 687, содержит наиболее консервативный участок активного центра - ITELDI - и имеет самую высокую степень гомологии с каталитическими доменами других гликозил-гидролаз семейства 10, представленного б основном ксиланазами (Рис. 3). Каталитический домен ксиланазы А Т. neapolltana является центральным доменом и окружен двумя некаталитическими доменами.

N-концевойвой домен А, включающий аминокислотные остатки с 30 по 367, обладает сходством ( 40% ) с N-концевыми доменами Хуп X С. termocellum и Хул А Т. saccharolyticum. функциональное значение которых до сих пор окончательно не определено. Было показано, что присутствие К-концевого домена важно для термостабильности у ксиланазы А Т. saccharolyticum, а так же у акилопуллуланазы С. thermohydrosulfuricum (Lee et al., 1993). N-концевые доменк у ксиланаз Т. saccharolyticum и Tt. neapolltana обладают значительной степенью гомологии, указывающей на родственные функции этих некаталитических доменов.

С-концевой димен на 43% идентичен целлшозосвязывающим доме-' нам ксиланазы Хуп X С. thermocellum и Хуп А Т. saccharolyticum. В домене найдены две повторяющиеся последовательности, обозначенные как С1 (позиция 720-851) и С2 (позиция 895-1040. Рис. 2). В последовательности обоих повторов обнаружено 29,8% идентичных и 8.4% взаимозаменяемых аминокислотных остатков.. Наличие таких повторяющихся концевых последовательностей характерно для целлюлозо-свя-' зывающих доменов различных гликозил-гидролаз. в том числе, и для ксиланаз (Jauris et al.. 1990). Вероятно, данный домен выполняет в ХупА именно функцию связывания с целлюлозой.

5. ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА fi-КСИЛАНАЗЫ XYNA Tt. neapolitana ИЗ КЛЕТОК Е. coll.

Данные по очистке белка представлена в таблице 2. На рис.4.с представлены фотографии полученных электрофореграмм и зимограмм в ПААГе. . ,

Таблица 2. ЭТАПЫ ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНОЙ ß-КСИЛАНАЗЫ Tl. neapolitana ИЗ КЛЕТОК Е. coli.a)

ЭТАП

! СУММАРНЫЙ! СУММАРНАЯ ! УДЕЛЬНАЯ ! ВЫХОД,! СТЕПЕНЬ ! БЕЛОК, МГ! АКТИВНОСТЬ ! АКТИВНОСТЬ i % ! ОЧИСТКИ с) ! ! U Ш/мг белка! " !

Осветленный 620 410 0.7

экстракт Концентрирование 225 266 1.2 (Amicon YM10) Ионообменная

хроматография 9,0 818 90.8

(S-sepharose HP)

Гель-фильтрация (Sephacryl 6,5 721 111.3 S-200 HP )

100

65

2.7 (1.7)

- 6) ' 69.0 (129.7)

. 95,4 (159,0)

а) Точность всех указанных измерений 10%;

б) Учесть потери на данной стадии невозможно из-за увеличения суммарной активности в результате удаление ингибирувдего агента:

с) Для степени очистки белка в скобках указаны значения, рассчитанные по возрастанию удельной активности, а без скобок -по количеству белка;

Удельная активность в процессе очистки определялась на растворимом ксилане из зерен овса (oat spelts xylan).

Анализ зимограммы показал, что в неочищенном лизате присутствует три мажорные полосы активности с молекулярным весом 116. 91 и 72 кда и 64 кДа. При этом последняя проявляется только при инкубации при 37°С и не проявляется при прогреве при 80°С. Мы предположили. что белки с меньшим молекулярным весом образуются в результате отщепления, доступных для протеиназ концевых областей

белка или же целых доменов (учитывая возможность протеолитическо-го расщепления в области линкерных междоменных "Шт-Бег последовательностей). не влияющих на каталитическую активность фермента. В случае с белком с молекулярным весом 64 кДа наблюдается потеря термостабильности, но каталитическая активность сохранена.

123456 789 10

Рис. 4. Злектрофореграмма препарата {5-ксиланазы ХупА Т. neapolitana в ГШГе с 0,5% ксиланом. Гель после удаления SDS инкубировался в рабочем буфере фермента при 37°С. Дорожки 1-4 соответсвуют фракциям 33, 32,» 31 и 30 ионо-обменной хроматографии: 5 - прогретый ( 20 мин., 80° С) экстракт, клеток Е. coll. содержащих плазмиду рГТ17; 6 - белковые . маркеры 116; 97.4; 66.2; 45 и 31 кДа; 7-10 - фракции 23,- 24. 22. 21. Анализ зимограммы клеточного экстракта (дорожка 5) показал, что метод получения зимограмм путем добавления субстрата в гель не позволяет определить точный молекулярный вес данного белка в связи с высокой степенью его адсорбции ■на ксилане. В дальнейшем мы использовали метод переноса белка на ПААГ с субстратом.

Как видно из данных, представленных в таблице, на третьей стадии очистки (ионо-обменной хроматографии) суммарная активность белка возрастает в 3 раза, что связано, по-видимому, с удалением ■ некоего ингибирующего агента данного фермента, содержащегося в ' клеточном экстракте Е_со11. ■ Поэтому, считать стпень очистки фер-: мента в данном случае правильнее по количеству белка.

белок фермент

ш лизкои мз кшл

Рис. 5. Электрофореграмыа р-ксиланазы ХупА в 10% ПААГе с 503x2 и зимоградаа, полученная методом переноса белка на ПААГ с 0,5% ксиланом: Ж - маркерные белки; ЛИЗ неочищенный прогретый клеточный экстракт; КСИЛ - очищенный препарат р-ксиланазы ХупА:' •

По нашим оценкам ксиланаза была очищена в 95 раз и после очистки представляла собой по данным электрофореза в БОБ ПААГе гомогенный белок с молекулярным весом 116000 Да (Рис. 6). По данным гель-фильтрации молекулярный вес белка также соответствует 116 кДа, из чего следует, что в нативных условиях белок находится в виде мономера. Удельная активность очищенного фермента составила 111,3 и/мг белка.

6. СУБСТРАТНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ. АНАЛИЗ МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ р-КСИЛАНАЗЫ ХУН А П. пеароШапа.

Данные по субстратной специфичности очищенного до гомогенности фермента представлены в та лице 3. Ксиланазная активность очищенного фермента варьирует в зависимости от источника ксилана от 63.4 до 1И.зи/мг.

Таблица 3. СУБСТРАТНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ КСИЛАНАЗЫ XYN А

СУБСТРАТ

УДЕЛЬНАЯ ! АКТИВНОСТЬ ! U/мг белка !

ксилан п *'

нерастворимый 79,4

растворимый 111,3 ксилан 2)

нерастворимый'- 63.4 .

растворимый 65,8

лихенан 2,3

р-глюкан из зерен ' 4.О

ячменя

КМЦ 0.23

4-метилумбеллиферил-р- 2.8

Б-целлобиопиранозид

4-метилумбеллиферйл-а-' ' О,16 ~

Ь-арабинопиранозид

р-нитрофенил-р-Б-кси-

лозид .0.47

КЛАССИФИКАЦИЯ

ФЕРМЕНТАТИВНОЙ

АКТИВНОСТИ

эндо-1.4-р-ксиланаза. КФ 3.2.1.8

эвдо-1,4-р-ксиланаза. ,КФ 3.2.1.8 эндо-1,4-р-глюканаза. КФ 3:2.1.4

эндо-1,4-р-глюканаза. КФ 3.2.1.4

эндо-1.4-р-глюканаза, КФ 3.2.1.4 (5-зкзоглюканаза, КФ 3.2.1.91 a-L-арабинофурано-зидаза. КФ 3.2.1.55 g-ксилозидаза. КФ 3.2.1.73

п ксилан из овса. Sigma, Cat. No. Х-0627. oat spelts xylan;

2) ксилан из древесины березы. Sigma, Cat. No. X-0502; blrchwood xylan ' *1 точность определения активности +/- 0,05 U/мг белка.

Кроме того, фермент обладает значительной активностью на ли-хенане и fl-глюкане из зерен ячменя. Фермент такзе имеет активность на МУЦ и ПНФКс. что свидетельствует о наличии у него целло-биогидралазной и ксилозидазной активности. У фермента есть активность на 4-металумбеллиферил-а-Ь-арабиношф'ансзиде, которая свойственна многим ксиланазам -{Hazlewood,' .

Для определения типа действия Хуп А методом ТСХ был проведен анализ продуктов гидролиза-ксилана и лихеяана данным ферментом.

Для сравнения на ТСХ наносили образец конечных продуктов гидролиза лихенана р-глюканазой В.шасегапэ и образец конечных продуктов гидролизе ксилана ксиланазой ХупА В.зиЬШ15 при анализе продуктов гидролиза лихенана и ксилана соответственно.

Х1-Х2

> Zj «ч ~

S 1

3 4

Рис. 6. хроматогафия гидролиза ß-ксиланазой neapolitana. S ■ ксилоза и гидролиз ксилана:

Тонкослойная продуктов ксилана ХупА Т.

маркеры ксилобиоза; 1 - 15

мин.; 2-30 мин.; 3-1 час; 4-2 часа; 5-6 часов; 6 -12 часов.

Рис. 7. Тонкослойная

хроматография продуктов. гидролиза лихенана.

ламинарина и КМЦ ß-ксиланазой ХупА. Гидролиз-лихенана: 1--ß-глюканаза В. macerans

(2часа); 2, 3 - маркеры: глюкоза. целлобиоза,

целлотриоза. целлотетроза и целлопентоза; -4 - ß-ксиланаза ХупА Т.neapolitana (2 часа); 5 - гидролиз ламинарина ß-ксиланазой ХупА (2 часа); 6 - гидролиз КМЦ ß-ксиланазой ХупА (2 часа).

Как видно из представленных на рис. 6,7 хроматограмм. на начальных этапах инкубации появляются высокомолекулярные олигосаха-риды. Основным конечным продуктом гидролиза ксилана является ксилобиоза. в меньшей степени среди конечных продуктов присутствуют

ксилогриоза. ксилотетроза и ксилоза. При гидролизе лихенана конечными продуктами являются целлотриоза и целлогексоза. Эти дан-

ные показывают, что по типу гидролиза ксилана данный фермент монет быть охарактеризован как зндо-1.4-(Я)-ксилан ксилогидролаза.

Исходя из полученных данных по субстратной специфичности кси-ланазы ХупА и анализа механизма гидролиза ксилана и лихенана этим. ферментом, а также принимая во внимание классификации глико-зил-гидролаз (В. Непг1зза1 еЬ а!.. 1991) ш определили этот фермент как зндо-1.4-р-0-ксилан ксилогидролаза семейства 10. Широкая субстратная специфичность достаточно типична для целлюлаз и кси-ланаз. Известно, что некоторые гликозил-гиддолазы семейства 10 расцепляют не только р-1,4~ксилозидные связи, но и |5-1.4-глюко-зиднке связи (5-глюканов или МУЦ (ЬиеШ е1 а1.. 1990). К этому семейству относится .экзоглюканаза С. Пт1. которая обладает также высокой ксиланазной активностью (И1кез еХ. а1., 1984). Ксиланаза 2 С. ШегтосеНига обладает целлобиогидралазной активностью ( бге-р1пе1 еХ а1., 1988). Минорные активности на широком спектре субстратов, обнаруженные .у гликозил-гидролаз семейства 10.. могут, быть результатом неспевдфического расщепления гликозидных связей (Бге-р1пег ег а1.. 1988).

Для фермента были определены зависимость активности от температуры и от величины рН, а также была исследована стабильность-дакного фермента при разных температурах (Рис. 8 А,Б.В). Наибольшая величина активности фермента была зафиксирована при температуре 102°С и рН5.5. Как показано на графике (рис. 8, В), ксиланаза стабильна при инкубации в течение 3 часов при 90°С в отсутствие субстрата. После 2 часов инкубации при 100°С в отсутствие субстрата сохраняется 50" ксиланазной активности. По последним данным ХупА является наиболее термостабильной из всех известных ксиланаз эубактерий ().

100 80

20

3.0, 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 .

РН '

Б

120т-

,оо|- воЪ

' Л 80

"и " ~ ^

< | - __ . - 954:

* 403 \

! .

20 ^100%

°5 50 1 йо 150 2й0 Т»лпе глт.

1 60 и С

н 40

20-

°30 50 70 . . 90 ПО (етоегсЫге ("с)

Рис. 8. Графики зависимости активности р-ксиланазы ХупА Т. пеароШапа от величины рН (А), температуры (Б) и кривые стабильности . фермента при различных температурах (В). ■Зависимости снималась: А - при 80° С; Б - при рН 5,5; В - при рН 5,5 и обозначенных температурах.

с

7. СТРУКТУРА р-КСИЛАНАЗЫ ХУК А П. пеароШапа.

Исходя из данных анализа гомологии аминокислотной последовательности ксиланазы А с другими гликозил-гкдролазами мы предположили, как уке говорилось выше, что белок состоит из трех докенов. Лля исследования функций этих доменов получены делгдаи гена с С-кониа трем рестрикгнъы сайтам (Ркс. 9).

'В дзлькейазм для удобства очисти; неиоячсразмернух белков, синтезируемых при траисляшш полученных деледай гена хуп а, ш ьсполь^оелш систему векторов рОЕ, а которой на 5' и/гаш на 3' энззх ?рагнеятЕ ДЖ вводится последсвательиось, кодоруаоая

6хН1з, что позволяет очищать экспрессирутоцийся с плазмиды белок методой афинной хроматографии на N1—1ГГА агарозе.

ХупА. синтезированная в системе рОЕ и содержащая на и- и С-концах последовательности бхШэ. была очищена методом афинной хроматографии на К1-НТА агарозе. Как показали исследования, биохимические свойства полученного белка были идентичны свойствам белка, очищенного по первой схеме, представленной ранее.

Полученные таким образом пептиды и их свойства представлены, на рис. 11 и в таблице 4.

-- 5ас1 ■ ВатН!

;к1

КрШ

ЕрМ ЕсоИ ВгЯ

РИ1 ВатН!

аот

Есьт

хупА

о г£с

ч с а

Е£223Е23 /рОТВНКП'тда»^-- лддаодя • •спяииоел ядАюшек

п.4 п.1

пА п.! +

.. ■ п!

Рис.-9. ' Подрожат рестржтная карта 'гсяат хупа. 'структурно участки {Нссиланазы ХупА Т. пегроШапа, получегшке дглешюпнш зарката балка и их свойства.

и ев

V

- 22 -

Конструкции, содержащие В домен с 248 по 775 аминокислотный остаток или В и С домены с 248 по 1055 ам.к. остаток сохраняли активность (Рис. 9). Белок, не содержащий ни N-концевого. ни С-концевого доменов, обладал ксиланазной, лихеназной й МУЦ-гидро-лизующей активностью. Таким образом можно сделать вывод, что присутствующий в ХупА каталитический домен отвечает за все ферментативные активности, кодируемые клоном рТТ 17. Практически полное удаление., домена С не влияло на активность фермента, в то время как удаление относительно малого участка каталитического домена приводило к полной потере ферментативной активности белка, из чего можно заключить, что С домен не обладает каталитической функцией. Удаление N-концевого домена гак же не имело существенного значения для проявления каталитической активности.

Была исследована термостабильность белков, содержащих домены ABC, АВ, ВС или В (Рис. 9, Табл. 4). Результаты, приведенные в таблице 4. показали, что удаление N-концевого А домена в белке 6xHls-BC-6xHis и 6xHis-B приводит к потере 86% активности после инкубации в течение. 30 минут при 80.°С.. Одна из таких протеолити-ческих форм белка, по-видимому,. не содержащая N-концевого домена, образуется в результате неспецифического процессинга при экспрессии хуп а в Е. coll, и была обнаружена наш на зимограмме осветленного экстракта клеток, только'при инкубации при 37°С. и отсутствовала на зимограмме прогретой при 80°С. Удаление С-концевого домена Хуп а (белок ав) не оказывает влияния на термостабильность фермента. Полученные данные могут служить подтверждением сделанного Хазлевудом предположения, что одной из возможных функций N-концевых доменов некоторых гликозил-гидролаз является стабилизация третичной структуры белка 'Шаг1еиоос1. g.P. et al., 1991).

Таблица 4. Термостабильность и способность связываться с целлюлозой ксиланазы Хул А и полученных неполноразмерных белков.

термостабильность связывание

% остаточная активность11 с целлюлозой21

фермент

80° С : 90° С : 100° С %

Хуп АБС 89 84 68 27,2

Хул АВ 88 . 86 40 2,3

6хН1з-ВС-6хН1з 14 3 0,9 58,8

бхШэ-В 14 И 1.8 н. 0.

"11 Клеточный экстракт, содержащий ХупА или его делетированные варианты АВ, ВС и В, инкубировался 30 мин. при указанной температуре, после чего измерялась остаточная активность при 65°С за Юмин., за 100% принималась активность исходного фермента при тех же условиях реакции.

2 Неточный экстракт, содержащий 1 ед. ксиланазной активности инкубировали•с 10 мг Авицела, 1 мг БСА в 1 мл 50 мМ ацетатного буфера рН 5„5 непрерывно перемешивая при 37°С. После одночасовой инкубации пробы центрифугировали и определяли оставшуюся ксила-назную активность в супернатанте. Связывание определяли как разность общей активности (100%) и относительной остаточной активности в супернатанте.

■ Исходя из-гомологии С-концеБого, домена ХупА Т.пеароШапа с целлюлозосвязывающими доменами других ксиланаз. мы предположили, что функцией этого домена явояется связывание с целлюлозой. Для проверки этого предположения мы исследовали способность связыва-

ния с целлюлозой у всех полученных- неполноразмерных белков, представленных на Рис. 9 и в таблице 4. 97.7% белка, не содержащего С-концевой домен (Xyn А - АЕ). осталось не связанным с микрокристаллической целлюлозой. Белки, содержащие С-концевой домен, адсорбировались на целлюлозе. Способность связываться с целлюлозой у белка 6xHis-BC оказалась наиболее высокой (58,8%). ~ Приведенные выше данные указывают на роль С-концевого домена, как цел-люлозосвязывавдего. Многие мультадоменные ксиланазы содержат цел-люлозосвязывагаций домен (ЦСД) (Gilbert et al., 1993). Целлюлозос-вязывавщий домен Xyn А не обладает сходством аминокислотных последовательностей с ЦСД известных семейств. По-видимому, С-конце-вой -домен ксиланазы А T. neapolitana' составляет вместе с ХупХ С. thermocellum и XynA T. saccharolyticum новое семейство бактериальных целлюлозосвязываюцих доменов". Возможно, что ЦСД, присутствующие в выше названных ксиланазах, способствуют более эффективному гидролизу таких комплексов, в которых молекулы ксилана тесно связан с молекулами целлюлозы, и этим отличаются от ранее охарактеризованных ЦСДов других известных целлюлаз и ксиланаз.

ВЫВОДЫ

1. Дана предварительная характеристика генов 8 целлюлаз и ксиланаз Tiiennotoga neapolitana, клонированных в клетках Е. coll. Показана индивидуальность этих генов.

2. Отобран клон, несущий плазмиду рТТ17, определяющую синтез высокотермостабильной р-ксиланазь. с широкой субстратной специфичностью. Определена нуклеотидная последовательность соответствующего гена. Открытая рамка считывания кодирует белок, состоящий из 1055 аминокислот, общей массой 119323 Да.

3. Термостабильнаяj р-ксиланаза ХупА очищена до гомогенности и определены ее основные биохимические характеристики: температурный оптимум - 102° С; оптимум рН - 5,5; удельная активность -111.3 Ед./мг; молекулярная масса - 116000 Да.

4. На основании .данных анализа субстратной специфичности и анализа основных продуктов гидролиза ксилана и лихенана р-ксила-наза XynA T.neapolitana охарактеризована как эндо-1,4-р-Д-кси-лан ксилогидролаза (КФ 3.2.1.8.).

5. Методом сравнительного анализа определена структура кси-ланазы ХупА. Показано, что фермент состоит из Н-концевого сигнального пептида и трех доменов, А, В и С, разделенных коротки™ линкерными последовательностями. Методом делеционного анализы исследованы функции отдельных доменов, и показано, что средний домен является каталитическим и относится к семейству 10 глико-зил-гядролаз; Н-концевой домен отвечает за термостабильность белка; С-концевой домен является целлюлозосвязывающим доменом нового типа, характерного для ксиланаз.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Дахова О.Н.. Зверлов В.В.. Великодворская Г.А. Клонирование и экспрессия генов высокотермостабильных целлшлолитических ферментов, экстремально термофильной эубактерии Thermo toga neapo-litana. - Тезисы VI конференции "Новые направления биотехно. логии". Еущино, 19ЭЗ, стр. 152.

2. O.N. Dakhova. Н.Е. Kurepina. V.V.Zverlov. V.A. Svetllchnyi and G. A. Vellkodvorskaya. Cloning and expresión in E. coli of Thermotoga neapolltana genes coding for Enzymes of carbohydrate substrate degradation. - Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993. V. 194. p. 1359-1364.

3. Dakhova 0.. Vellkodvorskaya G. Thermostable cellulolytic enzymes coded by genes of the thermophilic eubacterlum Thermotoga neapolltana cloned in Esherichia coll. - Protein Engineering 1995, V. 8. p. 58.

4. Zverlov V.. Piotukh K.. Dakhova 0.. Vellkodvorskaya G. and Borriss R. The multidomaln xylanase A of the hyperthermophi-lic bacterium Thermotoga neapolitana is extremely thermorésistant. - Appl. Microbiol. Biotechnol. 1996. V. 45, pp.245-247.