Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика ферментов амилазного комплекса термофильной бактерии Thermotoga Neapolitana

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Березина, Оксана Валентиновна

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Классификация амилаз

1.2. Структура крахмала и других a-D-глюканов

1.3. Субстратная специфичность амилаз

1.4. Классификация гликозилгидролаз на основе гомологии аминокислотных последовательностей

1.5. Способы действия амилаз на полисахаридный субстрат: «одноцепочечный», «многоцепочечный», «множественная атака»

1.6. Строение активных центров амилаз. Концепция Хироми-Тома

1.7. Общие черты каталитического механизма, характерные для гликозилгидролаз в целом

1.8. Особенности механизма действия амилаз

1.9. Пространственная структура амилаз

1.10. Кальций и другие металлы в молекулах амилаз. Основные физико-химические свойства амилаз

1.11. Применение микробных амилаз

1.12. Термостабильные амилазы

1.13. Гипертермофильные эубактерии рода Thermotoga

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды

2.2. Химические реагенты и ферменты

2.3. Выделение хромосомной ДНК Th. neapolitana

2.4. Конструирование геномной библиотеки Th.neapolitana и создание библиотеки рекомбинантных клонов

2.5. Выделение и анализ плазмидной ДНК

2.6. Определение нуклеотидной последовательности

2.7. Определение амилолитической активности на чашках

2.8. Приготовление клеточных экстрактов и первичная очистка белка

2.9. Определение субстратной специфичности и анализ продуктов гидролиза

2.10. Определение концентрации белка

2.11. Электрофоретические методы исследования белков

2.12. Определение активности термостабильных амилолитических ферментов в клеточных экстрактах

2.13. Очистка из Е. coli рекомбинантных а-глюкозидазы и цикломальтодекстриназы

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Создание банка генов Th. neapolitana. Отбор клонов, продуцирующих термостабильные амилазы

3.2. Определение и сравнительный анализ нуклеотидной последовательности участка ДНК Th. neapolitana из клонов, проявляющих активность на полимерных субстратах

3.3. Характеристика рекомбинантной мальтодекстрин-гликозилтрансферазы Th. neapolitana

3.4. Сравнение свойств мальтодекстрин-гликозилтрансфераз из Th. neapolitana и Th. maritima

3.5. Сравнительный анализ аминокислотной последовательности мальтодекстрин-гликозилтрансферазы из Th. neapolitana

3.6. Характеристика фрагмента хромосомной ДНК из клонов, гидролизующих метилумбел л ифер и л л-a-D-м ал ьтози д

Сокращения, используемые в тексте диссертации:

Да - Дальтон

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДСН - додецилсульфат натрия

ДТТ - дитиотрейтол ед. - единица активности фермента

ПААГ - полиакриламидный гель п.н. - пар нуклеотидов т.п.н. - тысяч пар нуклеотидов среда LB - среда Luria-Bertani

ФМСФ - фенил-метил-сульфонилфторид, ингибитор сериновых протеиназ

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

IPTG - изопропил-[3-0-тиогалактопиранозид

Введение Диссертация по биологии, на тему "Характеристика ферментов амилазного комплекса термофильной бактерии Thermotoga Neapolitana"

Гидролиз крахмала до глюкозы под действием ферментов - амилаз, является одной из отраслей биотехнологии. В связи с широкой распространенностью растений, богатых крахмалом, амилазы занимают важное место в биохимических исследованиях, направленных на решение задач биотехнологии, связанных с получением Сахаров из возобновляемых источников сырья.

Особый интерес проявляется в отношении термостабильных ферментов. Проведение биотехнологических процессов при высоких температурах с использованием термостабильных ферментов позволяет ускорить гидролиз за счет увеличения скоростей реакций, понижения вязкости растворов как исходных веществ, так и продуктов гидролиза, а также избежать опасности микробного заражения сред.

Экстремально термофильные эубактерии рода Thermotoga, живущие в геотермальных источниках при температурах 55-90°С, являются облигатными гетеротрофами и используют для роста различные углеводородные субстраты, в частности, крахмал. В настоящее время известно несколько амилолитических ферментов Thermotoga maritime, обладающих исключительно высокой активностью и устойчивостью к воздействию различных денатурирующих агентов при температурах 70-100°С, что делает их перспективными для применения в ряде промышленных производств. Например, при ферментативном гидролизе крахмала, при получении глюкозо-фруктозных сиропов, необходимо действие амилаз на крахмал при температуре 70°С и выше. Амилазы Thermotoga могут выдерживать такую температуру без потери активности и интенсивности гидролиза. Высокая термостабильность амилаз Thermotoga позволяет использовать их в качестве удобной модели для исследований механизмов, обуславливающих термостабильность белковых молекул. Поэтому поиск амилолитических ферментов из разных видов

Ibermotoga, изучение их физико-химических свойств и оптимальных условий действия представляют значительный интерес.

Целью настоящей работы стало изучение ферментов амилазного комплекса гипертермофильной эубактерии Thermotoga neapolitcina.

В ходе работы решались следующие задачи:

- создание банка генов Th. neapolitana в клетках Е. coli; поиск генов, кодирующих термостабильные амилазы, действующие на полимерные субстраты и олигосахариды;

- определение нуклеотидных последовательностей клонированных генов;

- создание штаммов-продуцентов отобранных амилаз; разработка способов очистки рекомбинантных белков из клеток Е. coli;

- изучение физико-химических и ферментативных свойств найденных амилаз;

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Березина, Оксана Валентиновна

Выводы:

1. Сконструирован банк генов Th. neapolitana на базе плазмидного вектора pUC18 в клетках Е. coli XL 1-Blue. Из банка отобрано четыре клона, два из которых проявляют термостабильную амилазную активность на полисахаридах, а два других - на мальтоолигосахаридах.

2. Определены нуклеотидные последовательности и проведен сравнительный анализ клонированных фрагментов ДНК Th. neapolitana. Рекомбинантные плазмиды из клонов, проявляющих амилазную активность на полисахаридах, содержат ген мальтодекстрин-гликозилтрансферазы. Рекомбинантные плазмиды из клонов, проявляющих амилазную активность на мальтоолигосахаридах, содержат гены а-глюкозидазы и цикломальтодекстриназы.

3. Разработаны схемы препаративного выделения и очистки рекомбинантных мальтодекстрин-гликозилтрансферазы, а-глюкозидазы и цикломальтодекстриназы из клеток Е. coli.

4. Исследована субстратная специфичность найденных нами ферментов. Мальтодекстрин-гликозилтрансфераза действует на мальтоолиго- и полисахариды, гидролизуя 1,4-а-гликозидную связь и перенося образовавшуюся часть цепи на другую молекулу субстрата. а-Глюкозидаза гидролизует мальтозу. Цикломальтодекстриназа гидролизует цикломальтодекстрины и мальтодекстрины до глюкозы и мальтозы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных исследований из сконструированного нами в клетках E.coli XL 1-Blue банка генов Th. neapolitana, были отобраны клоны, проявляющие термостабильную амилазную активность на крахмале, и клоны, проявляющие термостабильную амилазную активность на мальтотриозе. Из отобранных клонов выделены рекомбинантные плазмиды, определены нуклеотидные последовательности их вставок.

Проведен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей с последовательностями из базы данных EMBL. Показано, что плазмиды pTnal и рТпа2 из клонов, гидролизующих крахмал, содержат ген мальтодекстрин-гликозилтрансферазы, а плазмиды pTnml и pTnm2 из клонов, гидролизующих мальтотриозу, содержат расположенные рядом гены цикломальтодекстриназы и а-глюкозидазы - malA и aglA.

Рекомбинантная мальтодекстрин-гликозилтрансфераза была очищена из клеток E.coli. Достигнута 10-кратная очистка белка. Молекулярная масса мальтодекстрин-гликозилтрансферазы составила 52 кДа, что соответствует вычисленной на основании анализа нуклеотидной последовательности (51,9 кДа).

Гены - malA и aglA были разделены и субклонированы в плазмидный вектор pQE-32. Созданы штаммы-продуценты E.coli XL1-Blue, несущие плазмиды: pQE-32-malA и pQE-32-ag/A. Получены очищенный в 233 раза препарат цикломальтодекстриназы и очищенный в 87 раз препарат а-глюкозидазы.

Исследованы субстратная специфичность и свойства найденных ферментов. Обнаружено, что мальтодекстрин-гликозилтрансфераза гидролизует 1,4-а-гликозидные связи олигомерных и полимерных 1,4-а-глюканов (мальтоолигосахаридов, амилозы, амилопектина, крахмала) и переносит одну часть цепи на акцепторные мальтодекстрины. В результате реакции образуется набор мальтоолигосахаридов, начиная от мальтотриозы и длинее. Активность фермента возрастает на 70% в присутствии 10 мм СаСЬ

Цикломальтодекстриназа гидролизует цикломальтодекстрины с образованием линейных мальтоолигосахаридов, а затем гидролизует их до глюкозы и мальтозы. а-Глюкозидаза гидролизует мальтозу и мальтоолигосахариды до глюкозы. Активность фермента на мальтозе значительно выше, чем на мальтоолигосахаридах. Фермент активен лишь в присутствии НАД+ и ДТТ, оптимальные концентрации которых - 0.5 мМ и 200 мМ соответственно. В присутствии 2 мМ МпСЬ активность а-глюкозидазы возрастает в 2.5 раза.

Оптимумы активности для всех трех ферментов совпадают и составляют 85-90°С, рН 7-7.5, что принципиально важно для проведения одностадийного гидродиза крахмала.

При проведении сравнительного анализа выведенной аминокислотной последовательности мальтодекстрингликозилтрансферазы из Th. neapolitana с белками из баз данных EMBL и SWISSPROT обнаружен высокий уровень идентичности (93%) с мальтодекстрин-гликозилтрансферазой из близкого организма - Th. maritima. Мальтодекстрин-гликозилтрансферазы Thermotoga имеют высокую степень гомологии (35-65%) с а-амилазами и цикломальтодекстрин-гликозилтрансферазами (семейство 13 гликозил-гидролаз по классификации Хенриссата). Гомология с мальтодекстрин-гликозилтрансферазами из других организмов составляет меньше 25%. Таким образом, мальтодекстрин-гликозилтрансферазы из Thermotoga, вероятно, следует отнести к особому подсемейству мальтодекстрин-гликозилтрансфераз в пределах большого семейства 13 гликозил-гидролаз, к которому относятся альфа-амилазы и родственные им ферменты.

Аминокислотная последовательность цикломальтодекстриназы из Th. neapolitana имеет в своем составе участки, высокогомологичные консервативным регионам и потенциальным активным центрам гликозил-гидролаз семейства 13. Гомология с белками этого семейства составляет 44-54%, на основании чего, цикломальтодекстриназу из Th. neapolitana можно отнести к семейству 13 (альфа-амилаз и родственных им ферментов).

В полностью секвенированном геноме Th. maritima обнаружена нуклеотидная последовательность, предположительно кодирующая цикломальтодекстриназу и высокогомологичная (82 %) клонированному нами гену цикломальтодекстриназы из Th. neapolitana.

Сходство аминокислотных последовательностей мальтодекстрин-гликозилтрансферазы и цикломальтодекстриназы из Th. neapolitana с семейством альфа-амилаз указывает на эволюционную близость этих ферментов и возможное сходство их пространственных структур.

Первичная структура альфа-глюкозидазы из Thermotoga neapolitana высоко гомологична (91% идентичности, 97% сходства) первичной структуре альфа-глюкозидазы из близкого организма - Th. maritima. Альфа-глюкозидазы из Thermotoga не проявляют существенной гомологии с альфа-глюкозидазами из других организмов (сходство - меньше 20%). Гораздо выше сходство с альфа-галактозидазами и 6-фосфо-бета глюкозидазами (41-48%), принадлежащими к семейству 4 гликозил-гидролаз по классификации Хенриссата. Эти ферменты осуществляют гидролиз гликозидной связи по общему для гликозил-гидролаз каталитическому механизму. Пространственная структура не известна ни для одного из белков семейства 4 гликозил-гидролаз. Однако известно, что на N-конце каждого из этих белков расположен регион, предположительно принимающий участие в связывании НАД. У альфа-глюкозидазы из Th neapolitana это аминокислоты с 6 по39.

Несмотря на высокий (88-95%) уровень идентичности белковых последовательностей Th. neapolitana и Th. maritima, в расположении их генов имеются некоторые отличия. Например, у Th. maritima участок ДНК

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Березина, Оксана Валентиновна, Москва

1. Номенклатура ферментов / Под ред. А.Е. Браунштейна. М.: ВИНИТИ, 1979. 320 с.

2. Hiromi Keitaro, Ohnishi Masatake. Некоторые замечания к классификации амилаз // Ibid. 1984. - 31, N 2. Р 74-82.

3. Tonozuka Т, Ohtsuka М, Mogi S, Sakai Н, Ohta Т, Sakano Y. А neopullulanase-type alpha-amylase gene from Thermoactinomyces vulgaris R-47. Biosci Biotechnol Biochem, 1993, Mar; 57(3):395-401.

4. Liebl W, et al. Purification and characterization of a novel thermostable 4-alpha-glucanotransferase of Thermotoga maritima cloned in Escherichia coli. Eur J Biochem. 1992, Jul 1; 207(l):81-8.

5. И.Н. Галич. Амилазы микроорганизмов. Киев. Наукова думка. 1987.

6. Bacon J. S. D. Factors Limiting the Action Polysaccharide Degrading Enzymes. Microbial Polysaccharides and Polysaccharases, N.Y.: Acad. Press, 1979, p.269-284.

7. Fogarty W. M., Kelly С. T. Amylases, Amyloglucosidases and Related Enzime. Economyc Mycrobiology. N.Y.: Acad. Press, 1980, v. 5, p.115-170.

8. Critical Rewiews in Biochemistry and Molecular Biology. CRC Press Inc., v. 24, p. 329-418.

9. Takagi Т., Toda H., Isemura T. Bacterial and mold amylases. Enzymes, 1971, v. 5, p. 235-271.

10. Harada Tokuya. Bacterial isoamylases and pullulanases. J.Jap. Soc.Starch. Sci., 1984, v. 31, N2, p. 38-47.

11. Жеребцов H.A. Амилолитические ферменты в пищевой промышленности. М.: Лег. и пищ. пром-сть, 1984,160 с.

12. Хорлин А.Я. Активные центры карбогидраз // Структура и функции активных центров ферментов. М., Наука, 1974, с. 39-69.

13. Henrissat В. A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities. Biochem. J, 1991, v. 280, p. 309-316.

14. Henrissat В., Bairoch A. New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino- acid sequence similarities. Biochem. J, 1993, v. 293, p. 781-788.

15. Heinrich P., Huber W., and Liebl W. Expression in Escherichia coli and Structure of the Gene Encoding 4-a-Glucanotransferase from Thermotoga maritima. System Appl. Microbiol, 1994, v. 17, p. 297-305.

16. Henrissat В., Bairoch A. Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases. Biochem J., 1996, v. 316, p.695-696.

17. Meyer K.N., Gonon W.F. Analisis of action pattern of a-amylases. Clin. Acta, 1951, v.34. p. 294-298.

18. Robit J.R., French D. Multiple attak hypothesis of a-amylase action: action of porcine pancreayic, human salivary and Aspergillus oryzae a-amylases. Arch. Biochem. Biophys, 1967, v. 122, N 1, p. 8-16.

19. Greenwod C.T., Milne E.A. Starch-degrading enzymes: properties and action pattern of the a-amylases from barley, oats., rye and wheat. Strake, 1968, v.20, p.139-143.

20. Клесов А.А. Ферментативный катализ. М., МГУ, 1984, т.2, 216 с.

21. Квеситадзе Т.И. Грибные и бактериальные амилазы. Тбилиси, Мецнереба, 1984,154 с.

22. Bayley J.M. French D. The significans of multiple reactions in enzime-polimer systems. J.Biol.Chem., 1957, v. 266, N 1, p.1-14.

23. Suetsugu N., Koyama S., Yakeo K., Kuge T. Kinetic studies on the hydrolyses of a-, |3- and y-cyclodextrines by Taka-amylase A. J. Biochem., 1974, v.76, p.57-63.

24. Abdullah M., French D., Robyt J.F. Multiple attack by a-amylases. Arch.Biochem.Biophys., 1966., v. 144., N 3., p.595-598.

25. French D., Levine M.L., Pazur J.H., Norberg E. Studies on the Schardinger dextrines. The action of soy bean beta-amylase on amyloheptaose. J.Amer.Chem.Soc., 1959, v. 72, N4, p. 1746-1748.

26. Kondo H., Nakatani H., Hiromy K., Matsuno R. Multiple attack in porcine pancreatic a-amylase-catalysed hydrolysis of amylose studied with a fluorescence probe. J.Biochem., 1978, v. 84, N. 2, p. 403-417.

27. Allen J.D., Thoma J.A. Repetitive attack by Aspergillus orizae a-amylases. Biopolymers, 1976, v. 15, p.729-746.

28. Thoma J.A. Model for depolymerizing enzymes. Application to a-amylases. Biopolymers, 1976, v. 15, p. 729-746.

29. Hutny J., Ugorski M. Kinetics of hog pancreas a-amylase development of the multiple attack model. Arch.Biochem.Biophys., 1981, v.206, N 1, p. 29-42.

30. Robyt J.F., French D. Multiple attack and polarity of action porcine pancreatic a-amylase. Arch.Biochem.Biophys, 1970, v. 138, N 2, p. 662-670.

31. Kondo H., Nakatani H., Hiromi K., Matsuno R. Product distribution in amylase-catalysed hydrolysis of amylose. Comparison of experimental results with theoretical predictions. J. Biochem., 1980, v. 87, N 4, p. 10531070.

32. Robyt J. F. Mechanism and Product specificity of alpha-amylases. 1989, v. 36, N. 4, p. 287-301.

33. French D., Youngguist R.M. Abst Papers Amer. Assoc. Cereal Chem, 1960, 45th Meeting. Abst., p.42.

34. Thoma J.A., Brothers C., Spradlin J. Subsiete mapping of enzymes. Studiies on Bacillus subtilis amylas. Biochemistry, 1970, v. 9, N 8., p. 1768-1775.

35. Thoma J. A., Rao G.V.K., Brothers C. El al. Subsiete mapping of enzimes. Correlation of product patterns with Michaelis parameters and substrate-induced strain. J. Biol. Chem., 1971., v.246, N 18, p. 5621-5635.

36. Allen J.D., Thoma J.A. Depolimerse computer modeling. Biochem. J., 1976, v.159, N 1, p.105-120.

37. Allen J.D., Thoma J.A. Subsiete mapping of enzimes. Application of the depolimerse computer modeling of two amylases. Biochem. J., 1976, v. 159, N 1, p.121-132.

38. Allen J.D. Subsiete mapping of enzimes: application to polysaccharide depolymerases. Methods in Enzymology, 1980, v. 66, p. 248-277.

39. Thoma J.A., Spradlin J.E. Action pattern of amylases I. Tha Brewers Digest, 1970, January, v.l, p. 58-63.

40. Thoma J.A., Spradlin J.E. Action pattern of amylases П. The Brewers Digest, 1970, February, v.ll, p.66-70.

41. Thorgerson E.M., Brewer L.G., Thoma J.A. Subsite mapping of enzimes Use of subsite map to simulate complete time course of hidrolysis of a polimeric substrat. Arch. Biochem. And Biophys, 1979, v. 196, N 1, p. 13-19.

42. Hiromi K. Interpretation of dependency of rate parameters on the degree of polymerization of substrate in enzyme-catalysed reaction. Bioche. Biophys. Res. Commun., 1970, v.40, N 1, p. 1-6.

43. Suganuma Т., Matsuno R., Ohnishi M., Hiromy K. A study of the mechanism of action of Taka-amylase A on linear oligosaccharides by product analisis and computer simulation. J.Biochem., 1978, v. 84, N. 2, p. 293-316.

44. Kondo H., Nakatani H., Matsuno R., Hiromy K. Product distribution in amylase-catalysis hydrolysis of amylose. J. Biochem., 1980, v. 87, N.4, p.1053-1070.

45. Suganuma Т., Ohnishi M., Hiromi., Morita Y. Evaluetion of subsite afinnities of soybean |3-amylase by product analysis. Agric. Biol. Chem., 1980, v. 44, N 5, p.1111-1117.

46. Hiromi K., Nitta I., Numata C., Ono S. Subsite affinities of glucoamylase: examination of the validity of the subsite of theory. Biochem. Biophys Acta, 1973, v. 302, N2, p. 362-375.

47. Blake C.C. F., Koenig D.F., Mair G.A, North A.C.T., Phillips D.C, Sarma V.R., Nature, Lond., 1965, v. 206, p. 757.

48. Э. Фершт. Структура и механизм действия ферментов / под ред. Б.И. Курганова. М., Мир, 1980, с. 41-42, 395-396.

49. Беленький Д.М. Особенности ферментативного гидролиза а-1,4-глюкозидных связей .Успехи биол. химии, 1971, 12, с.164-181.

50. Thama J., Wakim J., Steart L. Comparison of the active sites of alpha- and beta-amylase. Biochem and Biophys. Res. Communs, 1963, v. 12, p.350-361.

51. Matsuura Y, et al. Low resolution crystal structures of Taka-amylase A and its complexes with inhibitors. J Biochem (Tokyo), 1979 Dec; v. 86(6), p. 1773-83.

52. Matsuura Y, Kusunoki M, Harada W, Kakudo M. Structure and possible catalytic residues of Taka-amylase A. J Biochem (Tokyo), 1984 Mar; v. 95(3), p. 697-702.

53. Swift HJ, et al. Structure and molecular model refinement of Aspergillus oryzae (TAKA) alpha-amylase: an application of the simulated-annealing method. Acta Crystallogr В., 1991 Aug 1; v. 47 ( Pt 4), p. 535-44.

54. Brady RL, et al. Solution of the structure of Aspergillus niger acid alpha-amylase by combined molecular replacement and multiple isomorphous replacement methods. Acta Crystallogr В., 1991 Aug 1; v. 47 ( Pt 4), p. 52735.

55. Matsuura Y, et al. Molecular structure of taka-amylase A. I. Backbone chain folding at 3 A resolution. J Biochem (Tokyo), 1980 May; v. 87(5), p. 1555-8.

56. Kusunoki M, Matsuura Y, Tanaka H, Kakudo M. X-Ray structure and catalytic mechanism of Taka-amylase A. J. Jap. Soc. Starch. Sci., 1983, v. 30, N2, p.141-147.

57. Hofmann BE, et al. Three-dimensional structure of cyclodextrin glycosyltransferase from Bacillus circulans at 3.4 A resolution. J Mol Biol., 1989 Oct 20; v. 209(4), p.793-800.

58. Knegtel RM, et al. Crystallographic studies of the interaction of cyclodextrin glycosyltransferase from Bacillus circulans strain 251 with natural substrates and products. J Biol Chem., 1995 Dec 8; v. 270(49), p.29256-64.

59. Knegtel RM, et al. Crystal structure at 2.3 A resolution and revised nucleotide sequence of the thermostable cyclodextrin glycosyltransferase from Thermonanaerobacterium thermosulfurigenes EMI. J Mol Biol. 1996 Mar 1; v. 256(3), p. 611-22.

60. Klein С, et al. Catalytic center of cyclodextrin glycosyltransferase derived from X-ray structure analysis combined with site-directed mutagenesis. Biochemistry, 1992 Sep 22; v. 31(37), p.8740-6.

61. Penninga D, et al. Site-directed mutations in tyrosine 195 of cyclodextrin glycosyltransferase from Bacillus circulans strain 251 affect activity and product specificity. Biochemistry, 1995 Mar 14; v. 34(10), p. 3368-76.

62. Bender H. On the role of histidine residues in cyclodextrin glycosyltransferase: chemical modification with diethyl pyrocarbonate. Carbohydr Res., 1991 Jan 15; v. 209, p. 145-53.

63. Kamitori S, et al. Crystal structure of Thermoactinomyces vulgaris R-47 alpha-amylase II (TVAll) hydrolyzing cyclodextrins and pullulan at 2.6 A resolution. J Mol Biol., 1999 Apr 16; v. 287(5), p. 907-21.

64. Mikami B, et al. Structure of raw starch-digesting Bacillus cereus beta-amylase complexed with maltose. Biochemistry, 1999 Jun 1; v. 38(22), p. 7050-61.

65. Aleshin AE, et al. Refined structure for the complex of acarbose with glucoamylase from Aspergillus awamori var. XI00 to 2.4-A resolution. J Biol Chem., 1994 Jun 3; v. 269(22), p. 15631-9.

66. Fisher E.H., Stein E.A. a-Amylases. The enzymes.-2-ed.-N.Y; London, Acad. Press, 1960, v. 4, p.313-343.

67. Liebl W, et al. Properties and gene structure of the Thermotoga maritima alpha-amylase AmyA, a putative lipoprotein of a hyperthermophilic bacterium. J Bacterid., 1997 Feb; v. 179(3), p. 941-8.

68. Machius M, et al. Activation of Bacillus licheniformis alpha-amylase through a disorder~>order transition of the substrate-binding site mediated by a calcium-sodium-calcium metal triad. Structure, 1998 Mar 15; v. 6(3), p. 28192.

69. Цыперович A.C. Ферменты (основы химии и технологии). Киев, Техника, 1971, 358 с.

70. Иммобилизованные ферменты : Современное состояние и перспективы. Под ред. И.В. Березина, В.К. Антонова, К. Мартинека.М., Изд-во Моск. Ун-та, 1976, 358 с.

71. Sin К, Nakamura A, Kobayashi К, Masaki Н, Uozumi Т. Cloning and sequencing of a cyclodextrin glucanotransferase gene from Bacillus ohbensis and its expression in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol., 1991 Aug; v. 35(5), p. 600-5.

72. Bovetto LJ, Backer DP, Villette JR, Sicard PJ, Bouquelet SJ. Cyclomaltodextrin glucanotransferase from Bacillus circulans E 192. I. Purification and characterization of the enzyme. Biotechnol Appl Biochem., 1992 Feb; v. 15(1), p. 48-58.

73. Wimmer B, Lottspeich F, Ritter J, Bronnenmeier K. A novel type of thermostable alpha-D-glucosidase from Thermoanaerobacter thermohydrosulftiricus exhibiting maltodextrinohydrolase activity. Biochem J., 1997 Dec 1; v. 328 (Pt 2), p. 581-6.

74. Krohn BM, Barry GF, Kishore GM. An isoamylase with neutral pH optimum from a Flavobacterium species: cloning, characterization and expression of the iam gene. Mol Gen Genet., 1997 May 20; v. 254(5), p. 469-78.

75. Kim 1С, Cha JH, Kim JR, Jang SY, Seo ВС, Cheong TK, Lee DS, Choi YD, Park KH. Catalytic properties of the cloned amylase from Bacillus licheniformis. J Biol Chem., 1992 Nov 5; v. 267(31), p. 22108-14.

76. Dong G, Vieille C, Zeikus JG. Cloning, sequencing, and expression of the gene encoding amylopullulanase from Pyrococcus furiosus and biochemical characterization of the recombinant enzyme. Appl Environ Microbiol., 1997 Sep; v. 63(9), p. 3577-84.

77. Д.Б. Лифшиц, Б.Ц. Михайловская, Г.И. Козловский. А.с. 614130 СССРб МКИ2 С 12 D 13/10. Комплексный ферментный препарат для получения пивного сусла из несоложеного ячменя. Опубл. 05.07.78, Brcm.N 25.

78. Ладур Т. А. Производство сахаристых продуктов из крахмалосодержащего сырья с применением ферментов. М., ЦНИИТЭпищепром, 1978, 472 с.

79. Argos P., Rossmann M.G., Grau U.M., Zuber Н., Frank G. and Tratschin J.D. Thermal stability and protein structure. Biochemistry, 1979, v.18, N 25, p.5698-5703.

80. Имшенецкий А. А. Микробиологические процессы при высоких температурах.М.; Л., Изд-во АН СССР; 1984, 164 с.

81. Campbell L.L., Manning G.B. Thermostable a-amylase of Bacillus stearothermophilus. Ibid., 1961, v. 236, N 11, p.2962-2965.

82. Логинова Л.Г., Головачева P.С., Егорова Л.А. Жизнь микроорганизмов при высоких температурах. М., Наука, 1966, 269 с.

83. Логинова Л.Г., Егорова Л.А. Новые формы термофильных бактерий. -М, Наука, 1977, 175 с.

84. Kriegshauser G, et al. Pullulanase from the hyperthermophilic bacterium Thermotoga maritima. purification by beta-cyclodextrin affinity chromatography. J Chromatogr В Biomed Sci App., 2000 Jan 14; v. 737(1-2), p. 245-51.

85. Bibel M, et al. Isolation and analysis of genes for amylolytic enzymes of the hyperthermophilic bacterium Thermotoga maritima. FEMS Microbiol Lett., 1998 Jan l;v. 158(1), p. 9-15.

86. Meissner H, et al. Thermotoga maritima maltosyltransferase, a novel type of maltodextrin glycosyltransferase acting on starch and malto-oligosaccharides. Eur J Biochem., 1998 Dec 15; v. 258(3), p. 1050-8.

87. Bergey's Manual of determinative bacteriology. (1994) J.G. Holt et al (eds.) 9th ed., Williams and Wilkins, Baltimore.

88. Huber R., Langworthy T.A., Konig H., Thomm M., Woese C. R., Sleytr U. V., StetterK. O. Arch. Microbiol., 1986, v. 144, p. 324-333.

89. Huber R., Stetter К. O. The Order Thermotogales. In: The Procaryotes. A Handbook on the Biology of Bacteria, Ecophysiology, Isolation, Identification, Applications. New York: Springer-Verlag. 1992, v. II, p. 3809-3815.

90. Nelson КБ, et al. Evidence for lateral gene transfer between Archaea and bacteria from genome sequence of Thermotoga maritima. Nature, 1999 May 27; v. 399(6734), p. 323-9.

91. Dakhova ON, et al. Cloning and expression in Escherichia coli of Thermotoga neapolitana genes coding for enzymes of carbohydrate substrate degradation. Biochem Biophys Res Commun., 1993 Aug 16; v. 194(3), p. 135964.

92. Zverlov VV, et al. Highly thermostable endo-l,3-beta-glucanase (laminarinase) LamA from Thermotoga neapolitana: nucleotide sequence of the gene and characterization of the recombinant gene product. Microbiology, 1997 May; v. 143 (Pt5),p. 1701-8.

93. Zverlov VV, et al. Thermotoga neapolitana bglB gene, upstream of lam A, encodes a highly thermostable beta-glucosidase that is a laminaribiase. Microbiology. 1997 Nov; v. 143 (Pt 11), p. 3537-42.

94. Slater M.R., Hartnett J.R, Huand F., Bolshakova E.V., Otto D.R., Novikov A.A., Velikodvorskaya G.A. themophilic DNA polymerases from Thermotoga neapolitana. 06.07.1995, USA Patent Applications, N 08/484, 661

95. Liebl W, et al. Analysis of a Thermotoga maritima DNA fragment encoding two similar thermostable cellulases, CelA and CelB, andcharacterization of the recombinant enzymes. Microbiology, 1996 Sep; v. 142 ( Pt 9), p. 2533-42.

96. Saul DJ, et al. Sequence and expression of a xylanase gene from the hyperthermophile Thermotoga sp. strain FjSS3-B.l and characterization of the recombinant enzyme and its activity on kraft pulp. Appl Environ Microbiol. 1995 Nov; v. 61(11), p. 4110-3.

97. Wassenberg D, et al. Xylanase XynA from the hyperthermophilic bacterium Thermotoga maritima: structure and stability of the recombinant enzyme and its isolated cellulose-binding domain. Protein Sci., 1997 Aug; v. 6(8), p. 1718-26.

98. Ruile P, et al. Isolation and analysis of a gene encoding alpha-glucuronidase, an enzyme with a novel primary structure involved in the breakdown of xylan. Mol Microbiol., 1997 Jan; v. 23(2), p. 267-79.

99. King MR, et al. Thermostable alpha-galactosidase from Thermotoga neapolitana: cloning, sequencing and expression. FEMS Microbiol Lett., 1998 Jun 1; v. 163(1), p. 37-42.

100. Bullock W. O. et al. Bio techniques, 1987, v. 5, p. 376-378.

101. MBI Fermentas. Catalog and product application guide. 1996/1997, p. 186 -188.

102. Maniatis Т., Fritsch E. F., Sambrook J. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,1982.99

103. Bradford M. M. Anal. Biochem., 1976, v. 72, p. 248-254.

104. Laemmli U. K. Nature, 1984, v. 227, p. 680-685.

105. Препараты ферментные. Методы определения амилолитической активности. ГОСТ 20264.4-74

106. Синицын А. П., Черноглазое В. М., Гусаков А.В. Итоги науки и техники. Сер. Биотехнология. М., ВИНИТИ, 1990, с. 59-66.

107. Chaplin М. F. and Kennedy J. F. Carbohydrate Analysis: a Practical Approach. Oxford: 1RL Press, 1986, p. 1-36

108. Miller G. L., Blum R., Glenon W.E. and Burton A.L. Anal. Biochem., 1960, v. 2. p. 127-132.