Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ФЕРМЕНТЫ ASPERGILLUS NIGER, РАСЩЕПЛЯЮЩИЕ КСИЛАНЫ

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "ФЕРМЕНТЫ ASPERGILLUS NIGER, РАСЩЕПЛЯЮЩИЕ КСИЛАНЫ"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР

Г +

ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им.А,Н.БАХА ). ----;-;—:-_—--

^ 2а правах рукописи

ГОРБАЧЕВА Илона-Мария.Вадию

ФЕРМЕНТЫ ДЗЕЕЖЛЬЬиЗ ККЕЯ, РАСЩЕШЯ5СЩИЕ КСШАНЫ

/Бисаюпгчесиая химия - 03.00.04/

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1977

Iшмаш *

Работа выполнена в лаборатории ферментных препаратов Ордена Ленина Института биохимии игл, А.Н.Баха АН СССР.

Научные руководители:

доктор биологических наук.профессор 1Р.В.Фениксова1, кандидат биологических наук.стардий научный Сотрудник

Н.А.Родионова.'

'Официальные оппоненты: , .

заслуженный деятель науки РСвСР,доктор биологических

наук,профессор Л.ГЛогинова,

доктор биологических наук А.Н.Петрова. -

Ведущее предприятие '.Институт физиология растений игл.К.А.Тимирязева АН СССР."

Зажата состоится" ^Л^Ф^ 1978 г. на заседании Специализированного совета /Д 002.96.01/ по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Институте биохимии км.А.Н.Баха АН СССР /117071,1'оскваДевинский проспект,33,коря.2/.

С диссертацией ьзозшо ознакомиться в библиотеке Биологического отделения АН'СОСР /МоскваДенинский пр.ЗЗ/.

Автореферат разослан "

¿Г" Ъ&гиХорЛ. 1977 г.

Ученый секретарь кандидат биологических наук

/Н.Н.Дьячков/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Ферментативный гидролиз материЬов, содеркгхгсс ксиланы,так яе как в расщепление целлюлозы,рассматривается как очень перспективная пробле?ла.Екегодаое восполнение запасов ксиланов в результате фотосинтеза делает их неисчерпаемым источником сырья для получения ксилозы.При ферментативном гидролизе ксиланов мошо получить растворы ксилозы,во наибольший интерес представляет возможность осахарцвания фе£меЕтаая, расшесяякщкми ксиланы,отходов деревообрабатывалцей промышленности, сельского хозяйства»городских отхЬдов.Получаемые ферментативные гидролизаты одревесневших отходов могут служить сырьем дня производства кормовых дрсдасей,а также источником углерода 'для вырадивания микроорганизмов,применяемых в различных отраслях микробиологической промыиленности.Ксдлоза монет быть восстановлена до ксилита,который нашел,широкое применение в медицинской и.химической про:итленнсюти.Ое12генты,расщепдящие ксиланы,используются в теоретических исследованиях дум установления структуры ксиланов и строение растительной клеточной стенки. Однако,в достаточной степени не изучено,с помощь» каких ферментов происходит расщепление ксиланов,каковы их физико-химические свойства,структура молекул и активных центров,а также не разработаны научные основы производства и применения этих ферментов.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - изучение ферментов микроорганизмов,расщепляюцих ксиланы.Для этого бы- . ли поставлены следующие задача:

- найти активный продуцент ферментов,расщепляяцих ксиланы в подобрать условия, способствующие наибольшему образованию этих ферментов,

'- выделить препарат,содержащий большое количество ферментов,рас-иешдадцих ксиланы и изучить способность втого препарата тидрола- -зовать ксиланы разной структуры,

- установить,какие ферменты,расшепдяицие полисахариды и другие * полимеры растительной клеточной стенки,содержатся.в ферментном препарате, | '

- выделить высокоочищенную,гомогенную эндо-1,4-е-ксшганазу. _

с, с-г-;;; ■!

I'Ъкк^Ш I

№ 3.2.1.8/, • .' ;

- изучить её физико-химические и каталитические свойства. „

- Натчяая новизна. Впервые описан способ получения гомогенной при исследовал ей различными методами эндо-1,4-р -ксилаяаэы из культуры отобранного, нагли активного продуцента - плесневого граба Aspergillus niser шт.14 и проведено изучение- свойств этого фермента; определены молекулярный вес,изоэлектрическая '.точка,аминокислотный состав,содержание углеводов в молекуле »наличке S Н-групп;исследована способность эндо-1,4-£-кспланазы ■ расщеплять кскланы разной стигктуры и ксилоолигосахариды.

Практическая ценность. По впервые разработанному регламенту на Московском опытном заводе ферментных препаратов получены опытные партии /54 кг/ препарата ксиланазы,содержащего ферменты расщепляющие глгжуроноксиланы на 97£ и арабоглюкуршоксиланы на 87$,что делает возможным использование этого препарата для получения ксилозы путем ферментативного расщепления кскланов,Препарат ксиланаэы из Aspergillus niger шт.14,клесте с пеллзалазой может быть использован для осахаривания грубых корьюв в животное оде тв е. Хортшие результаты были получены при применении препарата ксиланазы для увеличения выхода разных веществ из растительного материала,при их экстракции:дри извлечении из растений стероидных соединений,виноградного'сока.при применении этого . 'препарата в пивоварении.С помощью препарата ксилаяазы Aspergillus niger штЛ4 во многих лабораториях нашей страны получены изолированные протопласты,проведено изучение строения кешга-нов и растительной клеточной стенки.

Апробация работк.Результаты исследований доложены на Всесоюзном совещании по биосинтезу ферментов микроорганизмовДбилле и, 19 60/,на Республиканском совещании по вопросам получения и применения ферментов/Таллин,1969/,на Всесоюзном семинаре по химии.гемицеллшоз/0десса,1969/,на II Всесоюзном.биохимической съездеЛашкент,19еэ/,на 1У Съезде Всесоюзного микробиологического общества/Минск,1971/,на У Всесоюзной конференции по химии и биохимии углеводов/Тбилиси,1972/,на Всесоюзной конференции по разработке новых технологических процессов производства полнено вых антибиотиков и микробных ферментов медицинского назначения

/Ленинград, 1976/,на Международном Симпозиуме по превращению целлюлозы в белок и энергию Айдия, Дели,1977/;получено авторское свидетельство на продуцент ксиланазы;в конкурсе на лучшую научную работу Института биохимии ш.А.Н.Баха АН СОСР в 1975г.работе присуждена вторая премия.

Публикации. Ко материалам диссертации опубликовано II работ» Объем таботы. Диссертация состоит из введения,обзора литературы,шести глав экспериментальной тети,обсуждения результатов,выводов и списка цитированной литературы,включающего 230 наименований,в том числе. 191 на иностранных языках.В обзоре литературы рассмотрены имеющиеся данные о,* структуре к сплавов и фердентая,осуществляющих их расщепление.В первой главе подробно описаны объекта и методы исследования.Результаты исследования и их обсуждение излагаются в последующих пята главах.Работа состоит из 135 страниц машинописного текста,иллюстрирована 23 таблицами, 31 рисунком,тлеет приложение,содержащее результаты практического применения,

Материалы и методы исследования Поиск продуцента ферментов ^расщенляших ксиланн,выш среда культур микроорганизмов - актиношцетов,грибов а бактерий»

Первоначальный отбор культур микроорганизмов,образующих ферменты, расщешшюпие ксиланы,проводили методом агаровых блоков / ,1953/,

Способность отобранных культур плесневых грибов расщеплять-. ксиланы изучали при выращивании их глубинным а поверхностным . методами /Оениксова и др. ,1972/, •

Препарат ксиланазы* получала по разработанному нами регламенту на Московском опытном заводе ферментных препаратов из ■ • двухдневной культуры отобранного продуцента - плесневого гриба . , АареггШш! с!еег шт.14 путем осаддения из водного экстракта культуры изопропанолом.

х Препаратом ксиланазы ш называем препарат, содержащий фер- > менты,расщепляющие ксиланы »основная цепь которых построена1 из остатков £ -ксилопиранозы, связанных ^ ,1 » 4 связью.

Для определения активности и изучения способа действия ферментов была использованы ксиланы разной структуры и .различного происхождения; предоставленные профессорш М.С.Дудкинш /Одесский т ехаол огическ ий институт/, Р. Г, Каткевич /Институт) химии' древесины АН Датв.ОСР/,Т.А.Павловой /ШШ-Гвдролиз Денизград/, Б.ФХоленковкм/ВНИИ Зе1ва(КоскБа/,а также приготовленные,, нема - /Ргееэе et al.' ,1953; Pufcui ,1958/. , . '

Бее использованные в работе нскланы представляют собой полисахариды, основная цепь которых построена из остатков D-нсило-пираяозы,связанных ß ,1 4 связью.Боковые ответвления невелики и содержат остатки L-арабофуранозы 'И и-глюкуроновей ила 4-0-MeTHn-D -глшуроновой кислот,присоединенных 1>Э д,1 2 связью к'основной цепи ксиланов /рис.1/.

-4-А В-Ксп1~Ц-А 2-КСП1+Ч-р, Я-Ксп1~4-р, B-Kcnl~

J t о

f ♦ ♦

/-4-ДВ-Ken! Ъ-Глк-mal , L-Apgjl

Рис.1 ■ Структура арабоглюиуроноксилаяа пшеничной соломы / Aapiaall , Keek .,1956/,Ken - ксилопираноза, Арф - арабо-фураноза, Гл к-та - глюкуроновая кислота.

Нейтральные и кислые ксилоолигосахариды получали путем инкубации 15 г глшуроноксилана с 0,06$ раствором фракции препарата, кс илаказ ы, с одерзсалда в больаом количестве эндо-1,4-ß -кс клан азу. ф ерглентативньД гидролиз проводили при температуре 40°С.в 0,01 М ацетатном буфере в мешочке для диализа при постоянном удалении образовавшихся продуктов. ■

Кислые ксилоолигосахариды со степенью полимеризации 2-7 разделяла и получали* препаративно хроматографией на Дауэксе /1x8/ / £io-Rad Laboratories ,США/ и на накопительной бумаге ЗШ

/ Whatman »Англия/.

Нейтральные исилослигосахаряды со степень» полжмеризаши 2-3

разделяла и получали препаративно на биогеле Р-2 / Bio-Rad Laboratories ,США/ и хроматографией на накопительной бумаге 3 ММ. Они были использованы как субстраты для изучения каталитических свойств эндо-1,4- &-ксшганазы.

Известно,что микроорганизмы образуют два теш ферментов,рас-щешишцих 'ксиланы и ксдлоолигосахариды / sinner ,1975/ :эвдо-1,4- j> -ксиланазу/1,4- f>, D-ксилш-ксшганогидролазу,КФ 3.2.1.8/, фермент Неупорядоченного действия.расщегшдадего внутренние 1,4-р -ксилозидвые связи в ксяланах и э кз o-1,4-JJ-ксилозидазу/1,4-J, D -ксилав-ксилогидродазу,КФ 3,2.1.37/,фермевт концевого действия, отщепляющего остатки d-ксилозы с невоссгганавливаадего конца цепи ксиланов в кс илоолиго сахаридов и гидролизукщего ксило-биоэу /рис.2/. ■ ■

x^x-Xi

^уХ—X,

I__jHdoKf ¡/-В-___i Рис.2 Предполагаемое

хсила'яаза _____I действие ферментов,

расщеплявдих ксилаяы ¿.х_х хц^ и ксилоолигосахариды.

*х х+ X - оста-гки ' D-ксилозы

лсилозидаза

<_ . ... . . ....

Активность, ферментов, расщепляющих ксиланы ,опре деляли следу-хщиы образом:

а/ Способность ферментов расщеплять ксиланы до восстанавливающих веществ определяла инкубацией 15 кг арабоглшу-роноксилана /АГК/ пшеничной соломы с I мл раствора фер.гента,содержащего 0,1 иг бедка и.0,5 мл 0,1 М ацетатного буфера ^И 4,2 в течение I часа при температуре 40°.3а единицу активности принимали количество фермента,образующее I кг ксилозы за I час.

б/ Активность эндо-1,4 -кскланазы определяли вис-козиметрическим методом в вискозиметре Оствальда измеряя относительную вязкость инкубационной смеси,состоящей из 3 мл 1% раствора нарбоксиметилксилана /КШ/ и I мл раствора фермента в '0,1 М ацетатной буфере 1Н 4,2 при температуре 40°.3а единицу^ активности принимали количество фермента,вазывагсцее возрастание обратной величины относительной вязкости на X единицу за 2 ми-Путы. ( ■

в/ Активность экзо-I,4-_^-нсдлозйдазн определяли инкубируя 0,6 кл 0,01? раствора ксилобяозы или ыетал-JS, D -ксялозида в 0,1 Ы,ацетатном буфере рН 4,2 я 0,5'мл раствора фермента при температура 40°.За единицу активности принимали количество фермента,образующее I кг кеялозн за:1. час. ." - Очистка эндо-1,4-j>-ксклавазы включала дробное ос&чщение-зтанслш, гель-фильтрацки через сефадекс С-50.хрокатографцр я резероматографию на гидроксилапатите и хрзьатографяш на НМ-дел-лкдозе.

200 г технического препарата кспланазы растворяли » 0,5-1 л дистиллированной води я последовательно добавляли 1,2 и 3 объе- ■ ка охлажденного до -15° этанола,Каждый раз осадок отдаляли центрифугированием при.-5°,растворяли в 100-200 мя дистиллированно» воды и высушивали диофильно, •

Осадок,полученный при добавлении 3 объемов этанола растворяли в 0»005 М растворе уксуснокислого аммония / 1-1,5 г бел* ка в 8-10 мл/ и заносила на колонку/7x35 см/ с оес[адексом 0-60. • : уравновешенную тем же раотвором.Бедок также вькивали 0,005 М ■ * раствором уксуснокислого аммония .Оракшш „ содерсюадуне эндо-1,4-' $ -кеяланазу объединяла,упаривали под вакуумом до 30-40 кл и ' высушивали лиофильно. - *

Для очаотки эндо-1,4-_£-ксиланазы на глдрохойлалатите /Levin ,196а/ на колонку / 3x55 см/,уравновешенную 0,001 М фосфатным бу^-ером рН .6,0 наносили 5 кл раствора ферлента,содержащего . 200 кг б елка. Бы,швали белок тем ^ же буфером .Фракца и, с одержали е эндо-1,-ксилаиазу объединяли,упариЕали под вакуумом,диали-зовали против 0,001 Ы фосфатного буфера и 2 мл раствора фермента , содераацего^ЮО мг • белка, повторно наносили-ка кслоаку /2,5х 44 сн/с гадроксалапатктш.{Етакциа,содеряащие эндо-1,4-/~ксила-назу. обэедкняли,упаривали под вакуумом,диализовала и высушивали лкофяльно. ' ' " ' ■

При хроматографии на КМ-дмшиозе /СМ-32, tfbatma . .Англия/ на колонку /1,8x22 с к/, у равн овеаенн ую 0,1 Ы ацетатным буфером jH 4,2 наносили 3 мл раствора фермента,содержащего 40-45 мг бел-га.Белой вымывала тем же бу$еромЛракош,содеряаше эндо-1,4-

-ксиланазу собирали и использовали для изучения свойств фермента. " ■ ,

Гомогенность эндо-1,4-^-ксиланазы исследовали с псмсщьп электрофореза в ПААГ в кислой /рН 4,3/ и щелочной /рН 8,9/ среде / OrnateIn ■ ,1964; Bavia ,1954/,а также в присутствии до-децалсульфата натрия /SDS / и ^-меркаптоэтанола / Water, OsDorn ,1969/,при определении скорости седиментации и методом седиментационного равновесия в аналитической ультрацентрифуге "Spineои модель Е /Боуэн,1973/.методом изоэлекгрического фокусирования / Veateiberg et al. ,1957/ на приборе шведской £ирмы LtB Productег ¿в и методом г ель-фильтрации через сефадекс G -200 / Andrews , 1964; Детерман, 1970/.

Для определения молекулярного веса зндо-1,4-^-кскланазы использовали методы седиментационного равновесия в ультрацентрифуге "Spinoo" гюдель Б.геяь-фильтрацаи через сефадекс G-200, электрофореза в ПААГ в присутствии SDS и £ -«еркашгоэтанола, а тагае результаты определения аминокислотного состава на аминокислотном анализаторе японской фирмы Hitaschi EL A3

Белок определяли по методу.Лоури / Lowej et al.,1951/ и на спектрофотометре СО-4 измеряя поглощение при £30 нм.

Восстанавливающие сахара определяла методом Шомодъи-Нель сона / Somogyi ,1952/.

Содержание триптофана определяли спектрофотоыетрическкм методом / Keaaineo,.Ifcisarra ,1972/.

Содержание углеводов в коле куле эвдо-1,4-j^-ксилшазы определяли антроновым методом / Roe ,1951/,

Определение углеводов после электрофореза эндо-1,4-£ -кед- . ланазы в ПААГ проводили по методу Кейзера / Peyser ',1964/.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ СБСУЖДННИБ

Отбор продуцента и получение препарата фетментов, - расщепляющих усилены.

Из литературных источников известно,что богатый набор ферментов,расщеплятеш: полисахариды,в том числе ксиланы,образуют различные микроорганизмы:актиномицетн,бактерии,грибы /ЬошасЬ , баяв ,1969; Xizulca , Zawamin&isi* ,1969/.

У 100 штаммов актин ошшетов, 36 штаммов бактерий и 44 штаммов грибов методом агаровых блоков была определена способность расщеплять коллоидаксилан. Сказалось «что наибольшей способ-востыэ к образовали» и выяеленЕЮ в среду ферментов,раедеплялцях кслланы, обладают пяеснеЕые грибы.Б связи с этил, поиски,- активно-то' продупента' в дальнейшем вели среди культур плесневыхтрибов и в результате была'отобрана культура Aspergillus niger шт. 14,образующая наибольшее количество Ферментов, расщеплявдих кси-лавы при глубинном и поверхностном культивирований. ■

В литературе имеются данные,указывающие на то,что особенно ького ферментов,расщешкгхвдх ксилаиы,образуют плесневые грябыг * триходеркы, пеницилли .аслергнллк. Однако,многие исследователя отдают предпочтение ассерпшгам И'Яспользуэт их как для изучения отдельных ферментов»так и для промышленного получения препара- . •тов ферментов, расщеплящях кспланы / Reese et al. ,1973;, Tooru ,et al. ,1973; Talcenistii , Tsujisalca ,1973/.

Нами было обнаружено,что при глубинном культивировании на среде Чапека,введение ксияала в качестве единственного источника, углерода .способствовало увеличена'образования культурой A.nißei штЛ4 ферлектов.расшешшшпх.ксклацы.Пря выращивании культуры на бумаге,ксилозе и пектовой кислоте в течение'7:суток,активность $ер*,ентов,,раще1Шщцих ксиланы до восстанавливающих вевеств;со-ставляла 0,005-0,02 едД-л культуральной квдкостя,а при выращивании ва ксплане - 0,53 ед/мх. ■•'.■-. (

Вопрос о том,образуются ли ферменты, расщеплящие ксиланы,независимо оттого,на каком источнике углерода, выращиваются микроорганизмы или индуцируется ксилана^ги,ксилоолигосахаридаь1и* или ксилозвдами,является спорнии.Одзшко показано,что у некоторых микроорганизмов значительное образование ферментов.раскепляисих кскланы,происходит при введения в среду вышеупомянутых субстратов как единственных источников углерода / sSrensea ,1952,* Eins ,1966; Eriksson , Pettersso» ,1971/. . . .

В связи с необходимостью создания дешевого ферментного препа-.рата.расшелдкадего растительную клеточную стенку и способству-вдем совшению усвояемости и облагораживанию растительных кор-ыов.бшш. исследована возможность получения препарата ксиланазы А. nie«r шт. 14"при его поверхностном культивировании на средах

о разными отходами сельского хозяйства". Преимущество поверхностной культуры состоит в том,что она монет бить применена в высушенном виде как относительно дешевый ферментный препарат. \ Было установлено,что наибольшую способность к образованию ферментов,расщеплявдгсгксиланы, А. п1дег шт.14 проявляет при выращивании гриба на среде,содержащей 90$ пшеничных отрубей и 10% пшеничной соломы или пивной дробшш.Эта среда была предложена для получения препарата ксиланазы из гриба А. ь^ег шт .14.

Характеристика препарата ксиланазы - АарагйШиз п!дег тт. 14

Результаты исследования способности. препарата ксиланазы рао-• щеплять ксилаяы разной структуры /табл.1/ показали,что более глубоко гидролизуются ксиланы,не содержащие боковых ответвлений в виде остатков С -арабинозы.

Таблица I ^

- Расщепление ксаланов разной структуры препаратом ксиланазы Азрехе1Ииа п!вег шт. 14

Исследуемые жсаланы Содержание восстанавливающих веществ % от общего количества субстрата

I сутки .2 суток. 5 суток

Арабоглкжуроноксилан пшеничной соломы Глжурококсилан березовой древесины Глюкуроноксилан подсолнечной лузги Арабоксшшн рзи Кристаллический ксилан 50 79 81 | 66 79 52 81 84 не опред не опред 61 81 85 елялось ' елялось

Исследование негидрсдизованного препаратов ксиланазы остат-' i:a арабоглюкуронокеплана пзекичной соломы,составляющего 131 от количества исходного субстрата показало,что это ниэк озголекуляр-ныЗ полисахарид /мол,вес 6000,степень полимеризации 45/,Результаты кислотного гидреляза^остатка показали,что . он:на 59;состоит из восстанавливающих, веществ;среди которых обнаружено 74Й-ксилозы и арабинозы.Иизнбе. содержание восстанавливающих вещ-• еств указывает на наличие в негидродизоЕанном-остатке неуглеводной части.которая.на'ряду с боковыми ответвлениями в виде арабл-нозы,по-видимому.препятствует действию ферментов. ,

Полученный нами препарат ксиланазы А. niger шт,14 расщеплял арабоксилан и арабоглюкуронокеилан на £0-70%,а глшуроно-ксилан на 81-65^ до восстанавливающих веществ,а при определении глубины расщепления весовым методом было найдено,что препарат ксиланазы гидролизовал эти субстраты на 87* и 98$ соотнесственно Списанные в литературе препараты'ксиланазы грибного и бактериального происхождения расщепляли глюкураноксиланы древесины лиственных деревьев на 25-50% / sinner - ,1975/.

Исследование продуктов гидролиза арабоглюкуроноксилаяа ше-ничной соломы препаратом ксиланазы показало,что после первых 5 минут, гидролиза, методом хроматографии на бумаге были обнаружены ксилоза,ксилобкоза и ксилоолигосахариды.Эти экспериментальные данные дают основание предполагать,что препарат ксиланазы* А. nisei шт. 14 _содержа эндо- и экзо-типа $ерменты,расщепляющие кскланы.Это предположение было подтверждено после дробного осатдения фертентов,расщеш1явщйх кемганы,этанолом и исследования полученных фракция/ табл. 2/.

В первой фракции преобладали ферменты экзо-типа,при действии которых наблюдается незначительное снижение вязкости раствора КИС и образуется большое количество восстанавливающих Сахаров; III фракция содержала ферменты эндо-дейсгвия,сильно снижающие , еязкость раствора Ki.K и образующие незначительное количество восстанавливающих сахаров;11 фракция,по-видимому,содержала оба типа ферментов. •

Хроматография продуктов гидролиза арабоглюкуроноксклана показала,что при действии I Фракции образуется преимущественно ксилоза,а феркенты'Ш Фракция расщепляет этот полисахарид до к си-

лошшгосахаридов. ■

Таблица 2

) Фракционирование этанолом ферментов, расщепляющих ксиланы

Удельная активность

■l Препарат фермента и его фракции Фермент,снижающий вязкость раствора ХМК /А/ Фермент,расщепляющий АГК до. восстанавливающих Сахаров /В/ А В,

Препарат ксиланазы 8,8 6,0 1,46

I фракция /о сведение I об.зтанола/ 1,2? 27,0 0,05

II фракция /осаждение 2 об.зтанола/ 16,06 11,5 ■1,40

III фракция/осаэде-ние 3 об.зтавояа/ 55,0 3,5 ■ 15,7

При гель-фильтрации ферментов фракций 1,11 и III через се~ фадекс G-50 было получено несколько эндо-1,-ксилаяаз и эи-эо-1,4-^ -ксилозидаз,которые различались ^слевулягиш весом и изоэлектрическими точками. - " -

. Кроме ферментов,расщепляющих ксиланы в препарате.ксиланазы., A.ölger шт.14 были обнаружены другие ферменты, расщепляшше полимеры растительной, клетки: & -амилаза /КФ 3.2 ЛЛ./,глюкоама-лаза /КО 3.2.1.3/,зндо-1,4- S-глкжаназа./С^.фермент3.2.1.4/, зкзо-целлобиогвдролаэа /Cj фермент ,КФ 3.2. X. SI/, долигалактурояа-за /К® 3.2.1.15/,пектинэстераза /Ш 3 Л Л ЛI/,лашнаркназа / КФ 3.2.1.6/ и;протеиназа.

Таким образом было показано, что препарат ксиланазы А. niger

шт.14 содержит широкий'спектр ферментов,расщеплявших полимеры клеточных стекок растений, что делает его перспективна для прл кенеяая в различных областях народного хозяйства ,а также для теоретических исследования. ■ * ' : " ' :

Резудь таты, полученные при изучения действия препарата ксиланазы на ксилакы разной структуры.и различного происхождения указывают на возможность:его применения для получения ксилоза путем ферментативного расщепления ксилансв. .

Опыты,проведенные в нстей лаборатории шказали,что перспективным является применение препарата ксиланазы шесте сиелдю-лазой для осахаривания грубых кормов в животноводстве.

В Институте физиология растений им,К.¿.Тимирязева АН СССР препарат ксиланазы бал успешно применен для получения и куль, тивирОЕания изолированных протопластов из разных растительных тканей /Р.Г.Бутенко л др, ,19?7; н.с. Б^еаЬсо а1., Х9771 А.В-Мезенцев и др.,1576/, КисЬкр в* а1., 1976/. ,.

В Пермском филиале ШЛО бумажной промышленности было пока- . зано.что препарат ксиланазы можно применять для осахаривания •предглдрсаизатов сульсЕат-деляюлоэного производства и на пслу-ченних сахарах выращивать кормовые дросзаа.

Препарат ксиланазы значительно увеличивает выход лекарственных веществ из растений при их зкстракшш /Ц.А.Боломна и др.,

1975/. ' . ,

Б Ялтинском ВНИИ ветоделкя а виноградарства "Ьгагарач" из всех исследованных отечественных препаратов для осветления сусла наиболее эффективным оказался препарат кснланазы.чго делает перспективным его применение при получении виноградного сока' / В.Н.Датунаатшш и др.,1973/.

Препарат ксиланазы дал хоршие результаты при его применении в пивоварении /Д.ЕЛифпиц,Украинский ВНИИ пищевой промышленности/.

Препарат ксиланазы был использован в теоретических исследованиях для установления структуры ксилана /Одесский.технологи-'ческкй институт пищевой прогшиленнастл, И.С.Дудкан и др,,1576/ и строения клеточных стенок растений /Институт химия древесины АН Латв.ССР,р.Г.Каткевнч д др. ,157 2,1973;В.Н.СергееваД973/.

Очистка энж>-1.4-^ -ксиланззы и исследование её гомогенности

Результаты очистки андо-1,4-^-ксяланазн А* п^ег шт. 14 представлены в таблице 3.

; , ■'. Таблица 3

Очистка эвдо-1,4- &-ксялаказы АарегеШиа п!еет шт.14

Этапы очистки Обашй белок Активность эндо-1,4-^-нсиланазн Фактор 0ЧИСТК1 Выход *

мг ед/фр ед/ыг бедка

Препарат ксиланазы 42400 373120 8,6 1.0 100

Осакиение 3 объемами этанола • 1400- 77000' 55,0 6,2 20,7

Гель-фильтрация через сефадеио <?- 50 171,2, 51630 302,0 ' 34,4 .13,8'

Хроаитографгя на гидроксилапатите . й 49170 607,0 68,9 13,2

Рехроматография на гидроксилапатите 41,в 48170 1153,0 131,5 12,9

Хроматография на КМ-целлшозе 21,7 47680. гаю,о 250,0 12,8

В результате пята этапов очистка удельная активность эядо-1,4-^-ксаланазн. возросла в 250 раз.Выход фермента 12,8;? от исходной активности. Из 200 г препарата к сплава зы А. Шеег шт.14 /42 г белка/ было получено 21,7 кг высокоочищенвой эндо-1,4-^-нсилана зы.

Исследование звдо-1,4-^-ксиланазы методом электрофореза в пслнакраламидном геле при рй 4,3 и 8,9,а танке в присутствии додедалсульфата натрия показало,что ока выявляется в виде од-

ной полосы /рис.3/.Исследование скорости седиментации в ультрацентрифуге показало,что эндо-1,4-^-ксиланаза осаядается одним пиком с жоеффишентом седшентацяи 1,46 з /рис.4~У-

Рис.3. Электрофорез высоко-очищенной эндо-1,4-6 -кса-ланазы в ПМГ, ре 4,3 I - препарат ксиланазы,II-фракция.полученная. осаждением 3 объемами этанола,III-высокоочищенная эндо-1,4-В-ксиланаза.

Рис.4, Седкментацион-нал диаграмма эндо-1(4— ^-ксиланазы.

. При исследовании методами гель-фильтрации через сефадекс

• О - 200,седиментационнаго равновесия в ультрацентрифуге/ркс. 5/ и изо электрического фокусирования /рас. 6/ эндо-1,4-р-кся-

* ланаза вела себя как гомогенный белок.

19®. 0,33 ■■

0.30 Рис.5. Исследова-

№ ние- эндо-1,4-^-

к'саланазы в ультра-

0Л0 - центрифуге методом

А75 седиментаци онног о равновесия.

0,70 {'2)0,65 пТ. , см*^

49 ■ 50 V/

. Рис.6. Изоэлектрическое фокусирование высокоочищенной

эндо-1,4-^-ксяланазы.»—о - рН, о-о - белок, А—А-

- эндо-1 »4—^5 -ксиланаза.

Кроме того.при изучении действия высоноочвдевной эвдо-1,4--коиланазы на различные полисахариды ц гликозиды оказалось, что ферлеит не расяелляет крахмал, пек тин, сектоаую кислоту,КМ-цедлшозу.галактоманнан,ламинарии,метял-^, в-ксилозид и метил-^», Б-арабинозид,т.е.зндо-1,4-^-коиланаза не содержала

примеси ферментов,которые были обнаружены - в препарате ксиланазы

У большинства исследованных - эндо-1,4-f -ксиланаз степень очистки была невысокой: 5-вО раз /Varadi et al., 1971, Tauji-saka et al*t 1971i Talcenisbl et al., 1973/»

Некоторый из них содержали примесь целлюлазы/ Eriksson ,1971/.

Физико-химические свойства эядо-1,4-^-ксиланазы

Методом гель-фильтрация через сефадекс G -200 было показано,что молекулярный вес эядо-1,4-^-ксиланазы равен 24000 .Для , калибрования колонки использовали белка с люлекулярным весом:14300 -дизоциы /Gee Lowson, ctemioala LTD., Англия/ 25000 - хиу.огрипсшоген /получен в лаборатории белка и нуклеиновых кислот И-та биохимии км.А.Н.Баха/,43000 - яичный альбумин / The British Drug Houses, LTD., Англия/,67000 - бычий сывороточный альбумин/ Koch-Light Laboratories, LTD., Англия/, 68000 - сывороточный альбумин человека / Cheraical Corporation, California, США/»

Определение молекулярного веса методой электрофореза в ПААГ в присутствии додешшсульфата натрия показало,что подвижность белков была следующей: -у лизоцима 0,88,-у яичного альбумина. 0,41,у химотр'ипсиногена 0,63,у сывороточного альбумина человека 0,16,у эндр-1,4-^-ксиланазы 0,5,последнее соответствует молекулярному весу 33000,

Ке^одом седиментационного равновесия в ультрацентркфуге бы-, ло установлено,что молекулярный вес эндо-1,4-3-ксиланаэы равен 24700.

Иэоэлекгричеекая точка /р1/ эндо-1,4- 6-ксиланазы находитот при. ifl 4,2'/рис.6/.

Антроновым методом / Кое ,1951/ в молекуле эндо-1,4-^-ксиланазы баю обнарунено 20% углеводов.После гидролиза фермента-ШХ и исследования гидролизата методом хроматографии на.бумаге была обнаружены глюкоза и небольшие количества глюкоз-' амина и галактозы.Углеводы,содержащиеся в колекуле эндо-1,4-^ -ксиланазы'не. отделялись посла электрофореза в ПААГ/Eejrser,:

1564/.Этигрезультаты дают основание предполагать, что эндо-Х,4^ кскланаза,по-видимому .является гликопротеином.

Исследование аминокислотного состава эндо-1,4-¿-ксяланазы показало1,что молекула фермента содержит порядка 212 остатков аминоккслот;среда.которых обнаругено большое количество окси-и яикарбшовых аминокислот.Шлекулярный вес эндо-Х,4-^-кси-яашзы, вычисленный по результатам определения аминокислотного состава и с учётом 20% углеводов равен 27700 ./таблица 4/.

* „ Таблица 4

Аминокислотный состав эндо-1,4- &-ксиланазы

Аминокислота Число остатков в молекуле фермента,■ Аминокислота Число остатков в молекуле фермента

Лизин 6 Алании 13

Гистидин Балин I •

Аргинин 6 Метионин 2

Аспарагановая к-та 30 Изолейцин 5

Треонин 32 ЛеЙцкн 5

Серин 28 Тирозин 16

Глютакиновая к-та 17 Сенилалшзин 5-

Прсяш 5 Триптофан 3

Глецян 36

Общее количество остатков 212 Молекулярный вес 22X73; молекулярный вес о учетом 20$ углеводов 27716.

Предварительные данные полученные при действии на фермент д-хлорыеркурибензоата,дают основание предполагать,что мсяеку-

да эндо-1,4-^ -кснлаяазы не содержит свободных 5 Н-групп.Было также показано,что 1ШБ,обладажцяй высокой специфичностью к 3Н-группам белка,не влияет на активность фермента.

Сравнение свойств исследованной нами эндо-1,4-^-ксилгназы ' А. п1еег шт. 14 со свойствами других зндо-1,4-^ -исиланаз микроорганизмов весьма затруднительна,так как сведения о.ранее ■ описанных эндо-1,4-6-ксиланазах носят, случайный характер и-получены в основном в опытах с препаратами низкой степени чистоты или техническими препаратами.

Каталитические, свойства эвро-1,4-Д-ксиланаэц

Одновременное определение падения вязкости раствора ККК и увеличения количества восстанавливающих Сахаров показало,что при снижении вязкости раствора на зндо-1,4-^>-жсилана-зэеы вызывает расцепление.этого субстрата до восстанавливающих Сахаров всего на 1/5. Это свидетельствует о том,что исследованная нами эндо-1,4-^-ксилаяаза типичный эндо-фермент,расщепляющий внутренние связи между остаткгка ксилозы в кслланах.

Установлено,что оптимальным для действия эндо-1,4-^-ксила-наэы является рН.4,2 /ацетатный буфер/; при температуре 20° фермент сохраняет активность в пределях рН от 3 до 8.Наибольшую способность расщеплять КЬК эндо-1,4-^ -ксиланаза . проявляет при температуре 50°.Исследование температурной устойчивости показало,что при 40° эндо-1,4-^-ксиланаза теряет 35$ активности /при концентрации белка 0,003 мг/мд/ я полностью кнакглвярует-ся за 15 минут при 70°.

В таблице 5 приведены результаты исследования расщепления ■ эндо-1,4-£-ксиланазой ксиланов,различающихся по структуре.

Наиболее глубоко эндо-1,4-/3-ксиланазой расщепляются глю-курсноксиланы,особенно те,у которых мало боковых ответвлений.. В значительно меньшей степени ракцепляится арабоксиланы."По-видимому .многочисленные ответвления,характерные дня араб оке планов злаков,препяготвуют образованию ферлент-субсгратного комплекса. .

/Методом хроматография на бумаге' исследованы продукты гидролиза ксиланов разной структуры /рас.7/.Показано,что конечные

Таблица 5

Растепление энко-1,4-^-нсцланазой ксиланов разкой структуры •

„ . Субстраты Расщепление,% от количества субстрата

24 ч. 48 ч. ■ 120 ч.

Глкжуровоксилан древесины березы,мол.вес 18000, Кс;Гл к в 9:1 • * 37,9 19,0 19,5

Глгокуроноксалан древесины ольхи,дал,вес 8800, -Кс:Гл к в 10:1 - 15,8 17,0 ' 17,4 30/3

Глюкуронок силая стеблей люцерны,иол.вео 12600, Кс:Гл.' к » 18:1 В8'.5 ,29,0

Арабоглюкуроноксаяан пшеничной соломы.мол.вес 19400, Кс:Ар:Гл к « 79:12:6,6 14,8 . •19,0 19,0

Арабоглюкуроноксилан стеблей тимофеевки,шл. вес 18400, КсгАрЯй к - 20:3:1 22 Д 22,7 25,4

Арабоксклан раах,содержащий 78$ пентозанов 5,2 5,8 14,3

Кристаллический ксилал, КсвЮО^ 17,4 : 21,0 22,1

1% растворы нсиланов в 0,1 М ацетатнсм буфере инкубировали с 0,01 мг зндо-Г,4-^-ксиланазы при температуре 40°.

Продукты гидролиза глюкуроноксиланов - ксилобиоза,ксилотриоза и небольшое количество ксилозы д'ксилоолигосахаридов со степенью полимеризации больше З.При расщеплении арабоглюкуроно-

ксиланов образуется большое количество ксилоолиго сахарвдов, которые,по-видимому,содержат арабпнозу.Арабоксиланы расщепляются незначительно до ксслоолагосахаридов со степенью полимеризации больше 3. , :

12 3

оэоСо

6 7 8 9 Ю М

а

•Ксз

3

О

л

Кс

2

Ар

Кс

Рас.7. Хроматограмма продуктов[гидролиза ксиланов.1-ГК из стеблей донника,2-Ш из древесины березы, 3-1К из древесины ольхи,4-ГК из подсолнечной лузги,5-ПС из стеблей люцерны, 6-АК.из секян рхи/по-лученный накп/,7-АК из семян ржи /ВНИИ Зерна/,8-ШС из стеблей тимофеевки,9-АГК из пшеничной соломы, КЗ-Кристаллический исалан,состоящей'только из ксилозы..

М-иетчика /Кс.Ар.Кс^Дсз/ * • Кс-ксилоза,Ар-арабиноза,Ко2-коклобиоза,Ксз-ксилотриоза.

ч \ * 1

В известной нам литературе шло данных о степеЕи расщепления и продуктах гидролиза ксиланов разной структуры высоко-очищенными эндо-1,4-^-ксялаиааакя.

Константа Кихаэлиса для исследованной нами эндо-1,4-^ -кси-ланазы при действии на КМК была равной ЗхЮ^г/ыя,Такого же порядка Клп,при действии на тот же субстрат была найдена дня эндо-1,4-6-ксиланазы,выделенной из препарата пеллюлазы' /Нгагв1в& ^Кеикот ,1966/.

Г

Была исследована способность эндо-1,4- ^ -ксиланазы расщеплять ксилоолигосахариды,При инкубации 0,5^ растворов олигоса-харидов с 0,002% раствором эндо-1,4-ксиланазы через 2,5 часа в реакционной смеси не было обнаруяено:увеличения содержания восстанавливающих Сахаров.Эти. результаты указывают на очень, низкую скорость расщепленид ксилоолигосахаридов эндо-1,4-^-ксилаяазой.

^ . ■При инкубации 1% растворов ксилоолигосахаридов в течение 16 , часов в последутаем исследовании-образовавшихся продуктов методом хроматографии на бумаге было обнаружено,что андо-1,4-^-кскланаза не расщепляет ксилобиозу.Ксилотриоза и ксклотетрао-эа расщеплялись до ксилобиозы и ксилозы.Основным продуктом гидролиза ксилопентаозы была ксилотетраоза,а ксилогексаоза расщеплялась преимущественно до ксилопентаозы и ксилотетраозы

Рис.8, Хрома-тогралка продуктов гидролиза ксилоолигосахаридов. Х-нсшюза/ыет-чик/Д-ксило- ' триоза, 2-ксшю-тетраоза,3-кси-лопентаоза,4-ксилогексаоза, I*,2',3*,4* ~

контроль.

При инкубации фермента с глюкуршонсиланом в присутствии ксилозы а исследования образовавшихся радиоактивных продуктов у эндо-1,41 ^-ксиланазы ке была обнаружена трансгли-коэилгная активность.Однако,изучение продуктов гидролза кси-

/ рис.8/. X 1*1

Кед

(зКс

* Кс4

1.

Ко

ксклопентаозы и ксилогексаозы - не характерных для действия фермента эндо-типа,дают основание предполагать>что,по-видимому .условия,при которых происходило расщепление этих сдигоса- . харвдов,быля благоприятны-для проявления трансгликозил^ной активности у эндо-1-кскланаэы.

Определена скорость расщепления глюкуроноксилана иксило-олигосахарддов эндо-1,4-</5-ксил£назой,Результаты гидролиза К растворов глювуроноксялана и олигосахаридов 0,002? раствором эндо-1,4-^-ксиланазы в течение 16 часов при температуре 40°' приведены в таблице 6.

Таблица 6

Зависимость скорости расщепления эндо-1,4-^-ксяланаэой ГК и ксшюолигосахаридов от степени полимеризации

Субстрат ' Относительная скорость расщепления4*

Глшуроноксилан Ксилонанооза Ксилотетраоэа ЮО . ' и 7,4

+Скорость расщепления иижурсконсалана принимали за 100.

Таким образом было установлено,что скорость расщепления . ксклоолигосахаридов увеличивается с увеличением их степени полимеризации. '' "

К^для эндо-1,4-/1-ксилаказы при действии на ксилотетраозу оказалась равной 1,04х10~3М.

Немногочисленные исследования расщепления ксилоолигосахаридов эндо-1,4-^-нсиланазой показали,что скорость расщепления алигосахарддов несколькими зндо-1,4-у5-ксиланазаки А.п1гаг также возрастала по мере увеличения степени их полимеризации некоторые из этих ферментов проявляли травсгликозшфную активность при действии на ксилотетраозу и ксилопентаозу в опреде-

ленньк условиях / ТакеШаЫ, ТзиЗЛаака. ,1975/.Кп>. Щ>И действии на ксплотетраозу у этих эядо~1,4-^-нсилаяаз* составляла ЫО^М - 1,4x10 М. </

- Исследованы продукты,образугаиес я при расщеплении глюкуро-ноксилана стеблей'донника /мол.вес 15900,Кс:Гл кв 6:1/ зндо-1,4-у*-ксиланазой. ; / \ . " .- ■ ■•.'

После гидролиза этого полисахарида в течение 48 часов,в условиях непрерывисто удаления образовавшихся продуктов/ фермен-^ тативный гидролиз проводили в мешочке для диализа/ были выделены негидролизованный остаток глюкуроноксилана,составляющий 2,3$ по весу и нейтральные ц кислые слягосахариды.

Нейтральные олигосахариды,определенные котолрм хроматографии на бумаге с известными метчиками,представляли собой ряд от ксилобиозы до ксилопентаозы.

- Кислые олигосахариды были охарактеризованы как альдоуроно-вые кислоты от биуроновой до гептауроновой,среди которых преобладали высокомолекулярные альдоуроновке кислоты со степеныз полимеризации 5,6 и 7.

ВЫВОДЫ

1. Изучена способность плесневых грибов,актиномицетов и ■ , бактерий расщеплять ксиланы.Установлено ,что наибольшее количество ферментов,расщепляющих ксиланы,образует плесневые гря-бы,среди которых самым активным продуцентом при глубинном и поверхностном культивировании оказался гриб АарегеШиз а!еег . шт.14.

2. Препарат ксиланазы А. п1£вЕ шт.14 гидролизовал за 24 часа ксиланы разной структуры и происхождения ва 60-87$. фракционирование ферментов,расщепляющих ксиланы,показало,что в препарате ксиланазы содержатся несколько молекулярных форм .эндо-1,4-^-ксиланазы и экзо-1,4-уГ-ксилозидазы.

3. Получена высоко отеленная гомогенная, эндо-1,4-^ -кси-ланаза со степенью очистки 250 и выходом 12,8&.1.'ллекулярный вес фермента 24000-27000.Мэлекула:знда-1,4-5-ксиданазы состоит из одной полкпепгидной цепи,содержащей порядка 212 аминокислотных остатков.Установлено,что в молекуле фермента со-

держатся углеводов,состоящих из глюкозы,гзюкозамияа в га- * лактозы.При электрофорезе углеводы не отделяются ог белка.

4. Наибольшую активность эндо-1,4-Д-ксиланаза проявляет . при рН 4,2 и температуре 50°.При температуре 20° фермент ус- ' тойчив в пределах рН 3-8, при 40° эндо-1,4--Р» -кскланаза теряет > 35% активности при концентрации белка 0,003 мг/мл и полностью-, инактивируется при 70° за 15 минут.' . к

5. Установлено,что эндо-1,4-^-ксилалаза гидролизует нси-ланы разной структуры на 14-30$.Конечные нейтральные продукты расщепления кспланов - ксалобиоза.ксилотриоза и небольшие количества ксилозы и более высокомолекулярных ксилоолигосахариуяб-

6. Эндо-1,4-^-ксиланаза не расщепляет ксалобиозу.Кснло-трпоза и ксилотетраоза расщепляется до ксвло'биозы и ксилозы;. . ксилопентаоза - преимущественно до ксилотетраозы,ксилогексаоза - до ксилопентаозы и ксслотетраоза.Скоро сть расщепления ксмло-. олагосахарддоз возрастает с увеличением их степени полимеризации.

7. При постоянном удалении продуктов гидролиза эндо-1,4-- ' £-ксиланаза расщепляет'глюкуроноксклан-стеблей донника на,

97^.Среди нейтральных продуктов гидролаза обнаружены ксилоби- , , оза;ксилотриоза,ксклотетраоза и ксилопентаоза^кнслые проекты '* .*' гидролиза - преимущественно высокомолекулярные альдоуроновые кислоты со степенью полимеризация 5 , 6 и 7.

Список работ,опубликованных по материалам диссертации!

I. Н• А.Родпоно ва,Р.В.ОенКксова,И.В.Итомленските.197I,О ферментативном расщеплении кскланов.Химия древесины,8,127-134. .

2*Н.А.Тиунова,Р.Б.Фениксова,Н.Я.Кобзева,В.Д.КузнецовД.И. , Костычева,Н.А.Родионова,И.В.Итошенскате,Д.Т.Пириева Л971.Гмд-ролитическке ферменты актиномицетов.Прикл.биохим.микробиол,' УП,4,456-46:;

3.Р.В.Сениксова,Н.А .Родпоно ва.И.В. Ит омлен гаите, И.В, Улезло, Н.Я.Коб зева. 1972,Штата Аареге111иа.п!зег 15 - продуцент нсяланазы.Авт.сбида&62871.Бзми,изобр. ,>3 за 1973г.

4. Н. А.Родионова,И.В.Итомленските,Н.Я.Коб зева, И.В.Улезло. 1973.Изучение ксиланазы плесневых грабов.феркенты микроорга-- *. низмов."Наука*,М*.131-134.

Н. А .Тиун ова ,Н. Я .Коб зева,?. В. Феннксова ,Н, А .Р одпонова, И. В. Горбачева Д. И .Ко стычева. 1973. Неко торке таеклеточные гидролитические ферменты грибов и бактерий.Прикл.биохим.мккробиол. IX, 2, 198-202.

6. Н. А .Родионова,И.В .Горбачева, В. И .БуЯввд. 197 5.Выдел енле, очитка.и некоторые физико-химические и каталитические свойства эндо-1,4-к сил аназы и зкзо-1,4-^-ксилозидазы Aspergillus niger .Всесоюзный симпозиум по биоорганической химии.Рефераты научн, со общ., стр,29-30,Владивосток.

7. Н. А. Родионова ,Н. А .Тиунова, И. В .Горбачева, Л. И. Мартино вач, Г.Н.Румянцева.IS76.Получение и очистка селлюлазн и ксиланазы и перспективы их применения в производстве лекарственных веществ из растительного сырья. Материалы Всесоюзной конференции по раз- * работке новых технологических процессов производства полиеновкх антибиотиков и микробных ферментов медицинского назначенияЛе-нинград, стр. 14-16. • -

8. Н,А.Родионова,И.В.Горбачева,В.И.Вуйвид. 1977.Фракционирование и очистка эндо-1,4-^-ксйяаназ и экзо-1,4-^-ксилози-даз Aspergillus niger .Биохимия,42, 4, 659-671.

.9. I.V.Goxbachyova, H.A.Rodionova. 1977. Purification and characterization of endo-1,4- J -xylanaae from Aspergillus niger. Abstracts of Papers Internat. Syraposium on Bioeonveraation of Cellulesic Substances into Energy, Chemicals and Microbial Protein. February, 21-23» Dllbi, p. 18-19.

10. I.V.Gorbachevs, H.A.Rodionova. 1977. Studies on Xylan Degrading Enzyraea. I. Purification and Characterization of Endo--1,4-Ji -Xylanase from Aspergillus niger str. 14. Biochin. Biophys. Acta, 4М» 79-93.

11. X.V.Gorbachevs^ H.A.Rodionova. 1977» Studies on Xylan Degrading Enzymes. II* Action pattern of Endo-1,4- J5 -Xylanase from Aspergillus niger sts. 14. Biochim.Biophys.Acta., 484. 94-102.

: M-doU'^

г.__________

• Типография X030 Госплана СССР