Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ферменты мицелиальных грибов, катализирующие расщепление полисахаридов клеточных стенок зерна злаков

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Ферменты мицелиальных грибов, катализирующие расщепление полисахаридов клеточных стенок зерна злаков"

од

-7 М'ЛМ

' ' РОССИЙСКАЯ А&ЩШЯ НА7К

ОРДЕНА ЛЕШЖ ИНСТИТУТ БИОШИИ ш.А.Н.БШ

На правах руколвсн УЖ 577.152

ЯШ Анна Юрьевна

«Ш ШЦШШГЫЖ ГРИБОВ, МШИЗИРУШВ

пшшсшшов клеточных яшок еерм эшгав

03.00.04 - бнологЕческщ: хжлкя

Автореферат диссертации ьа соискание ученой стензна кшщдата биологических наук

Москва - 1923

Работа наполнена в лаборатории ферментов микроорганизмов Института бвохвмш та.А.Н.База РЛН

Научные руксводатедп: доктор биологических наук Н.А.Родионова кандидат ззшчесних наук Л.В.Канральянц

Официальные оппоненты: доктор биологических наук В.Д.Щербухкы доктор биологЕческих'наук Е.П.Феофалова

Ведущая организация: Институт физиологии растений РАН

\

Запита диссертации состоится ьиСДС-^ 1993 г. в

10 ч. на заседании специализированного совета (К OCE.96.OI) по гфнсудденяю ученой степени кандидата наук в институте биохимии им.А.Н.Баха РАЗ (Москва, Ленинский проспект, 33, корн. 2).

у

С диссертацией ноано ознакомиться в библиотеке биологической литератур! РАН (П7071, Москва, Ленинский пр., 33, корп. I).

Автореферат разослан " (С" 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук /г^у М.И.Ыодчанов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность яроблеш. Зерно злаков играет балъшуи роль в язгзттк человека, его используют как источник сырья для различии* тэхлологичоских процессов в шкроблологической, ззвяивской, хшщввой промышлэаностах. При извлвчззза из кзмзльченного зерна крахмала, белка и других веществ клеточные стенки и осразупдив их но-тесйхарады' затрудняют провадашю технологических процессов. Клеточные стенки ззрш злаков отличается по составу z структуре полисахарздов от клеточных стенок- стеблей и листьев злаков и других высших растений. В ргзвзх частях зерна строение кпвточезх стэеок *адгэ различно. Клеточннз стенки эндосперма и алейронового сдоя зерна - это перснчнне клеточныэ стэнкк, в когорта преобладают (1^)(1^)-*5-глаканч и. арзбшоксиланн. Эти станет содержат мало цаллвлоэы (2-335) и не содераат. пектиновых веществ (кроме зерен рьса). Пэнтсзаян первичанх клзточпнх стзнок эндосперма ржи и пшеницы растсорикн в водэ и дают вязкие растворы.

Напротив, игеточяне стенки облоче:; злаков, которое при подале попадгатг во йретдап отрубей - это слогане жгэзфшхированнке структура, состок«из из дервяччнх к вторичных кжточнка стенок. В а чих стопках преобладает целлигэзз (;;:> iOZ), а татсеэ в зпгчктелъвых количествах содерпгзтся гзмицеллплозн - арабнноглшуроноксиланы (до ЗОЙ). Наряду с целлюлозой и гемицеляюяоззми отрубя, составлящиэ 10-15% от. веса зерна, содержат «гаги цззанх питательных: веществ: белков, витаминов, микроэлементов, поэтому комшаггае* Переработка струбзй является одной из актуальЕнйгкг проблем.

Несмотря на то, что исследованию клеточноЗ стенки злаков посБЯцешг мнстиз работы дзух шслэданх. деслтЕлетпй, интерес к этой пробле'лв па ослабевает (ilrcher, Stone, 19S6).

С о*зой сторозн ведутся помех з создание ахтсвннх продуцентов цэ.ияйлавдтчэшеа: з т^еллг^олнтетескта (Тегедзнтов, расщепляших как .сядагьш» кишкягздата клеточной стеняч злаков- таг: и клеточнуэ стенку в цело". С другой сторона крайне о^раязчзЕН данные о ьаханизме разрушения клеточных стенок злаков и их отдельных компонентов как In vivo под воздействием собственна! форлжнтов, так

и In vitro. Шитому исследование механизма гидролиза клеточных стенок и их полисахаридов с помощью различных комбинация гомогенно очищенных гемицвллвлаз а целлаяаз с изученными физшсо-хишческики свойства!® представляет большой научный интерес.

Изучение ферментов, расщеплявдах кяеточнуд стенку злаковых кроме теоретического интереса имеет и большое практическое значение, так как ферментные препарата, катализирувдие гидролиз гемицеллшоз и целлюлозы злаков могут использоваться в хлебопечении и комплексной переработке отходов зернового производства.

Цель и задачи исследования.'

Цель» нашей работа являлось:

- изучшь способность ферментных систем различных культур мицелиальвых грнбов разрушать полисахариды клеточной стенки зерна злаков: ксалана, (1-*3)(1-*4)-/?- глшаны, • галактомавнаны, и целлюлозу;

- установить функции гомогенных ксиланолитических ферментов в процессе разрушения ксиланов и клеточной стенки злаков.

Исходя из црли работы бшш поставлены следуицне задачи:

1. Изучить действие спиртоосажденных ферментных препаратов из мицелиальных грнбов Geotrichum candidun зс ("Целлокандин riOj-I"), Geotrichum candiclum ЗС-106 ("ЦэЛЛОКаНДИН ИОГ-II"), Aspergillus oryzae ("Ашлорязш IEOx") и ферментного препарата "Гемицашпшаза" ("Signa") из Aspergillus niger, содержащих различные карбогидргзы и другие гидролааы, на различные субстраты: ксиланн с разной структурой, галаютазннаны, (1-зЗ)(1-»4)-/»-глякаш, целяэдозу, крахмал и белки.

2. Разработать способы выделения гомогенных эвдоксиланазы, /з-ксилозидазы н a-L-арабинофураюзидазы, изучить их физико-химические свойства, механизмы действия на кскланы различного строения, а тазсю на клеточную стенку, выделенную из пшеничанх отрубей.

3. Изучить способность вышеназванных ферментных препарэтов гидролизовать целшодазо- и гемицеллшозосодэржящие отхода зернового производства.

4. Исследовать действие спиртоосазденного ферментного препарата "Целюкаядин ПОх-I" из G.candidum 3-е и гомогенно выделенной эндоксиланазы из А.огузэе на свойства теста и хлеба при

лабораторной выпечке хлеба из плешпной куют.

Научная нотзнз работы.

Впервые охарактеризованы системы фермзнтов. расщепляющих полисахарида клеточных стопок зерна злаков из ферментных препаратов "Целлокаддкн Г10х-1", "Целлокандин ПОх-П". "дмилоризин ШОх", "Гешцедлшазэ" ("Signa"). Покапано, что данные препараты содержат гидролззн. раацзплятггцке ксиланы. мавпаны, цэллплпзу, крахмал и белки.

Виервые подучены в гомогенном состоянии зндо-1,4-^-ксиланазэ и /5-ксилозидаз» из спиртоосажденкого ферментного препарата "ямшюржлш Г\1 Ох", исследованы их фяззко-химичвские и каталитические свойстве, механизм действия на различные субстрата и на клеточную стенку, выделенную аз швнюзих отрубей.

Йз фйЛЬТраТЭ культуральной ¡ЕДКОСТИ G.candidum зс впарвые наделена внсокоочищенная с-Ъ-арабикофуранозидаза. Методом электрофореза фракция «-Ь-араОКЕСфурапозидазн была разделена на две изоформы с различными молекулярными массаж и каталитическими свойствами. Били исследованы некоторые физико-химические свойства обеих изоформ а-Ь-арэбвнофурзнозидаз.

Практическое значение раОотц.

Показаны песстекг^ю пре?.:зйс-еля фсрлопткзй: препаратов из g. ciiT.didirr, Зс, обладающего гекздед'лвлазной и цеялзплззкой вктзеносткми н ^з A.cryzae, содержащего гвмицеллнгаазннй и а-амалгзный комплексу ь процессах переработка отходов зернового производства, содержащих целлюлозу, гемкиеллюлозы, крахмал и белки. Установлено, что с помощью зтлх препаратов угз отходов могут Рыть получены олигосахариды со степьнью полимеризации 4-8, Kovopuo могут использоваться в различных пидегых прожБОДствах, а также моно-, Ж- к трясяхар?да.

Исследовано влияние препарата "Ц&ллокацдш! riQs-I" из ü.canoi-dum эс на ютество пшеничного хлеба при его лабораторий выпечке.

Впердаз показано ншюсттельное действие гомогенно очзяденвой эндоксжлйназы из д. о-ут-.г нэ качество пшеничного хлеба.

Апробация работы. Результата диссертации Окли представлзнн на III Всесоюзной конференции "Биосинтез деллгиюзн и других компонентов щеточной стенки" (Казань, 1990), Всесоюзном совещании

- е -

"Биохимия хранения и переработки зерна" (Алма-Ата, 1990), Все сошной конференции "Методы получения, анализа и применения ферментов (Юрмала, 1990), VII Всесоюзном симпозиуме "Ингенернаа анзимология" (Москва, 1991), Всесоюзной конференции "Достижения биотехнологии - агропромышленному комплексу" (Черновцы, 1991), Республиканской конференции "Химические превращения пищевых полимеров" (Светлогорск, 1991), Республиканской научно-технической конференции "Разработка и внедрение высокоэффективных ресурсосберегающих технологий, оборудования и новых видов пищевых продуктов в пищевую и перерабатывающие отрасли АПК" (Киев, 1991), в докладе на Всесоюзном биохимическом общества (Москва, 1991),'на 71 Украинском биохимическом съезде (Киев, 1992).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано II работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литература, методической части, 6 глав обсуждения полученных экспериментальных данных, заключения, выводов, списка литературы. Работа изложена на 181 страницах машинного текста, содержит рисунков и 19 таблиц. Список литературы включает 237 наименований, в том числе 181 иностранных авторов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Материалы и методы исследования

В работе использовались: 4альтраты культуральных жидкостей МИЦеЛИаЛЬНЫХ грибов Geotrichum Candidus ЗС S Geotrichum candidum зс-106, выращенных, как описано ранээ (Родионова и др., 1974); технический препарат цвллшазы гриба G.candidum зс - "Цвллокандан ГГОх-1) производства НПО "Биолар" (Латвия); лабораторный препарат, полученный спиртовым осаждением фильтрата культуральной жидкости мутантного штамма G.candidum зс-106 ("Цэллоканднн ГГОх-П); технический препарат а-оыилазы "Амидоризин ШОх", полученный из миц&лиального гриба Aspergillus oryzae Производства РаССКЗЗОЗСКОГО биохимического завода (Россия); коммерческий препарат "Гемицеллвлаза" Зираы "Sigma" (CIA) из Aspergillus niger.

В работе были использованы следующие субстраты: арзбпнокезлан (АГК) пшеничной соломы, Нэ-карбоксиметилксилан (КЫК),

арабиноглвкуроаоксилгн житняка (субстраты любезно предостаалзнч' Дудакотл м.с., Одесский технологический институт пищевой гфоилшюнпостз); зрабикохсклан ржи (Ж) (любезно предоставлен Капральянцзм Л.В., Одесский технологический институт пгацевой нроьзлзлэнностл); 4-О-шталглккуропохсилан березы (1&ГК) (любезно предоставлен Каткевичем D.D., Институт хитон дрэвесины, Латвия); ксилзн decs • (НПО "Еаалар", Латвия): роптворимгЯ крахмал отнчэотраззогс производства; кчзззн ас Гаююрстецу ("Согехимрв актив"); галактоканпан (IH), п-нктрсфэилд-а-Ь-ареб1йкофураногад (п-ЕоА} , п-гтвтрофзншн»- D-гвлчктопиранозид (п-ЖузГал; v f п-ш*трофенш1-а-1>- гадактопирннозяя (П-Н^Гэл), кярбйксзметйищелзшозс (КЩ) ("Sigma", СТА); л-натрофеншнз-Б-ксиюпиранозид (п-НФрК), арабшоголактьн (АГ) ("Serva"); п-нитро-фонЕИ-а-. Б-глигсостранозлд (л-НФэГ), ксшган лшстсонаици, лихенан ("Roch-Zl&it laboratories", Вомшобрвтзшя); двлжбаоза, авицал ("Spoía", Чвзо-Словакия); метил-^-Б-ксилозид. /з-(1-2)-метилксило биозя, /з(1-3 )-метизксилобкоза, /з(1-4)-:летялксило0коза (хабезно предоставлены доктором Белым. Институт тамня Слоетцяой Ахндеиии Наук, Словакия.); фгор-,т-Р-кс^лсоад (льбезео предоставлен Возкш Д.Я., Инг/илут сияние: Ap¡íñHcr.oü гзкада:.пга наук); ксилобиоза, ксилотрдсза (л8/5езно предоставлена Ибатулггалз й.М. > кпхпитут ядэряо?} фк>гта га. Константинова, Сэйнт-Петэрбург).

Актигтгость ферментов но отношении к КМК И КЩ определяли внскозслзтрлчэсжам методом, кспользуя 0,9 мл 1,2% раствор 1~\К или С,б % раствор КМЦ ь ацятатЕом буфере рН 4,7,0,1М.Зз единицу эьтп-коотл принимает количество феркэата, шзываядее возрастание обратно® величины относительной вг.зкости на вдешицу за I мал в дзглых условиях.

Дтч определения цв^шлазвой активности по отношении к хлотшовому волокну инкубационаук сйэсь. ссдергаеув Г>0 мг предварительно обработанного хлопкового толокна, 2,75 мл раствора 0,1 К адататногэ буфера рН 4.7 и 0,25. мл раствора феривнта ■йнкубюзахл в течение 60 кзш гра 40° С п определяли госстаквЕЛЕваптио спхсрч, используя кзлкбророчнуа кртвув, построенную-го глакозе матодом Шошдьи-йальсснз (Scaopyi? 1952).

Для определения осахартзакг.ей актп:?жк;ти ферментов пс отаазонис к поллоахярэдэм рэзкцгояауз; смесь, состоящую из 1С мг

субстрата (для ¿Г, лихепана и ГМ - 5 мг субстрата), 0,5 мл 0,1 Ы ацетатного буфера рН 5,0 и 0,5 мл раствора фермента, инкубировал! в течение 30 мин при 40° С. По истечении вре^анк иикубацпз реаидзю останавливали добавлением I мл реактива Шомодьк и определяла образовавшиеся Еосстанавтквавдзе сахара по методу Шокодьи-Нельсонз, используя при этом калибровочный график, построенный по ксилозе.

Бо всех случаях за оданнцу активности лрозивдаш количество фермента, катализируящее образование I мюсоль эквивалента глюкозы или ксилоза за I мин в данных условиях.

Определение активности ' фзркектоз по отношенно к п-нитрофечалиткозвдам определяли по колгсэству образовавшегося п-нитрофэнола. Концентрация субстратов составляла от 2 до 10 ккЫ, За единицу активности пршпыалЕ таксе количество фэрмента, которое катализирует расщепление I ишолп субстрата за I кин в данных условиях.

Для определения амшюлнтической активности бала использована методика ГОСТ 2026, 4-74 (Грачева и др., 1982).. Для опрэдзления глпкоамплазной и цаллобиазноЗ активностей использовали глюкозооксидазный метод (Щербугсн и др. 1971).Для определения гликоамилазной активности использовали С,5 % раствор растворимого крахмала в 0,1 М ацетатном буфере рН 5,0. Для определения црллобиазной активности 0,5 мл I Ж раствора целлобиозы в 0,1 М ацетатном буфере рН 4,7.

За единицу активности целлобиазн принимали такое количество ферйента, которое катализирует расцепление I мкшля субстрата за I мин в данных условиях.

За единицу актишости глшоамилазы принимали количество фермента, каталазируицаа образование I маюля эквивалента глгкозы за I мин в данных условиях.

Протеолитическую активность определяли ьюдафицировавным методом Аксона (Грачева и др. 1982). За единицу протеолитяческой активности принимали такое количество фэргет-а, которое за I кан при 30° С превращает в неосаздаекоз ТХУ количество казеиаата Иа, эквивалентное I мкыоль тирозина.

Для определения процента гидролиза гемвд&ллвлоз (АГК, АК, ГМ, АГ, МеГК, КМК) и отходов зернового производства 15 мг гемицеллшюз или 250 мг отходов инкубировали в 0,1 М ацетатном буфере рН 4,5 с

ферментом в течение 24 , 48 и 72 часов при 40° Исхода из количества образовавшихся восстанавливающих Сахаров, рассчитывали процент гидролиза г8;лицеллгноз. Аналогично определяла процент гидролиза клеточных стенок, полученных ж ппеничэнх отрубей.

Концентрация белка в пробах определяли по хзтоду Лоури (Тдагу а!.. 1951) с по поглощению при 280 нм.

ВосстенэвлязагщяЕ сахара определяли методой Фоглодьи-Кельссла (Бодо^у!, 1Э52), содержание глшож определяла глекозооксидрзннм методе;.: (Щербухпн и др., 1Э7Г).

с Алал^з углеводов ?*зтодом Еосгодя^ей тонкосчойвой хроматографии проводит ва хроматографамесхих пластинах "Х1езе1£&1 >30 {"Истек", Германия) В качестве углезодов-стацдаргта на бумагу наносили раствора ксплозн, арабиноэн, кетилксилобяозндя, ксилобгозы. кенлотриозы. Для разделения углеводов использовали систему растворителей бутанол-зтанол-вода (2:2:1).

Оирэ деление углеводов в белке проводили феэол-сульфатзак стадом (ШЬгЛб еъ. &1.. 1556). В кзчэстве стзнадарта использовали гшшозу.

Кзсзлзктшче?л:ое фокусирование очищенных фзрмззтоБ проводили на пяестинзх "Зе1та1уг 3-10", "Пег/я", (Германия}, зспэлаэуя нж5ор репернет белксь дет таофокусирозанпя ("РЬагп®«*? - 12В", Шьоция).

Гойэгспность ниделосных бех::ов ;игет?сжрозале кэтоддан изо элетггшчэ ского фокусирования к электровозом з 10 % МАГ в присутствии ДОН ас метод' Лаэтлмли (ЫеипГ!, 15Т0).

ьйлекуляркуа кассу белков определяла мэтедеки г*з5.трс3.орезз в шаг в ггогсутстыт дсн и пж-фагльтршщЕй ка колонке кк-сс-зооо "Рйагпас1а - ИВ" (Швеция ), уравЕовашглзсЗ 0.02 а Нг-ац&татным буфером рН 5,0, 0,2 М НаС1, используя набор колвнуаяряо-ватовше стандартоз-бзлксг *ирк» "Р!титас1а С^айсаЬз".

Результаты работа г ш оСсугденз

I. Кзучеххо сгггезшстн разлячзыл гатийпкьез и нротеьз в ффовгасг срзпарэтах ¡швллчалпгпс грибов.

Для более полной харзтггерзешег гсследуе.чнх на!.з отечественных фермзятных препаратов "Целлокгидеп ГЮх-Г' из с.сапс11г±шг. Зс, "Целлокаадан ГТОхП" из с.евгдиегпп Зс-105, "Акслорлзгн ИГ Ох" из а. огугае и коаенерчвского пр&дграта Г&гащежЕдаза" ("51£ша") били

определена активности содержащихся в них целлалолитическпх, гемицеллшолитических, амилолитических и протболиигчбских ферментов. Результаты представлены в табл. 1.

Таблица I.

Активность ферментных препаратов по отношении к различным субстратам.

Субстрат "Целлокаддин Г10Х-1" "Целлокаядзн ПОх-П" "Дмалоризин ШОх" Тешцсдлша-за (31£д1а)"

Е/г Е/мг пре- белка парата Е/г Е/мг пра- белка парата Е/г Е/мг шзе- белка парата Е/г Е/ыг пре- белка парата

АГК 20 0,10 45 0,11 20,4 .0,11 37 0,13

АК 30,5 0,15 52,5 0,13 . 35 ' 0,17 8,4 1.2А

ГМ 4,9 0,03 5,5 0,01 4,6 0,03 51 8,0

МвГК 32 0Д6 137,5 0,35 28,4 0,16 27,9 4,4

КС овса 44 0,23 101 0,26 543 3,0 58 9,06

КС лиственницы 27,9 0,15 98 0,25 ' и.о. н.о.

КМК 1130 5,65 1148 2,94 4020 22,3 136 18,2 ~

Крахмал (амилаза) 3,0 0,01 1,8 0,01 3000 14,8 - -

Крахмал (гдкоамилаза) - 611 3,38 -

АГ 9 0,05 7,4 0,02 29,5 0,14 2,8 0,41

Лихенан 9,8 0,05 10,2 0,03 19,3 0,1 -

КМЦ 240 1,2 860 2,2 105 0,58 10,0 1,55

Хлопок 11,4 0,06 96,8 0,484 2,52 0,01 следа

Казеинат На (кясл. протеа за рН 2,5) (рН 5,5) 17,7 0,05 27,8 0,07 68,6 0,38 -

18,8 0,09 18,0 0.05 132 0,73 -

Цаллобиозэ 23.6 0,12 66 0,17 38.8 0,21 1.3 0,2

П-НФ-5К 4,9 0,03 3,0 0,01 14,4 0.08 0.14 0,02

п-М*»А II? 0,5 24,1 О,ОБ 6.9 0,04 0,4 0,06

Полученные* дэнвые показыват, что все исслэдузше препараты способны гвдролизовать ге1ацелл«цозн и гликоззды, однако активность фэрмзЕтаах препаратов по отношению к отдельным субстратам значительно варьирует.

Ферментное препараты "Дмплорнзин ТГГОх" в особенности "Гемице от лаза" сод^ржзта высокоактивные гелактаназн, мэвнанззы и ЭЕдокскланазы, так как проявляли высокие активности по отношению к ксЕлану оэса, КМК, галягстолгзЕЕвну, грабаногглактэду.

Ферюнтныс препараты нз грабов с.сапа1<Ьш Зс и Зс-106 гмзли белее высокую ахтлшость по отношению к 4-С-МвГК бирезы и АГК пиегагчЕой солош, что, по-вадюлог^у, - езяззно с наличием а-глвкурэвздвзн в кешюколкшческих тестешх фэрминтнш; препаратов. Зпдокюгшнгиная активность по отношены» к КМК (таскоздо.етрпя,> была в;тие у прзпарэтг "Ашязргзпп ПТОх".

Зсь фзр.юа-диз препарата расцепляла различию 1г-Е0лтафен^тлакозлдц, что сввдетелъствувт о большом наборе гликозидаз с рэзличяшмк актшЖис:;-!^.

В препарате из с. cendidu.ii Зс наблюдалась высокая удельнал активность «-Ь-зребинофуранозидазн (0,6 Е/мг белка по сравнены: с 0,0 Е/мг бэша в лрзпарэт-з кз А.огугае), тогдэ как /дельная активность о-ксютаидзак, нзоСорот.н препарате "¿тшюргзик ПЮх" была г 4 раза виде, чет«: в препаратам та зс и Зс-ЮЗ.

11елл£'.70штлческпй кешягке фермззтов бнл более активным в препаратах из а.гап&шит Зс и Зо-106, хотя акгавпосга до отпоаеншо к цеокобзозе л (1-3) (I—I) -/з-гллггану, наоборот, били выше в нрешрагэ "¿агноригг'ч Щ0х'\

згослзйуеглых преяаретоЕ только "¿■гзяерззш ГЕТР?" обладал амйЕсздтк'еекой т» геткоамигазаой ая-пакостю.

Все изучаемые препараты . за цшшгсеяьбда "Реищеллюлазн" содержали кислые нротеазы. прячем 'Ч'-шотазян П10:С; бал в несколько раз активнее по отношению к казеину, чем прьняратн ю обоих штаммов

с.сапсЯсЗит, которые можно отнести к препаратам с низкой протеолитической активностью.

2. Ферманта тивныЯ гидролиз различных гемиделлюлоз и отходов зернового производства препарата?,ш цаллялаз и гемицеллшаз.

При изучении степени гидролиза гемицеллшоз было выяснено-, что степень гидролиза АГК пшеничной соломы, 4-0-МеГК березы и КМК всеми четырьмя ферментными препаратами была приблизительно равной (Табл. 2).

Гидролитическая способность ферментных препаратов в расщеплении сшлаах кстланов с боковыми заместителями зависит, по-нядамому, от кооперативного действия ферментов ксиланолитического комплекса.

Арабивоксилнн рзги лучше гидролкзовался препаратом "Амалоризш ПЮх" (на 72 Ж). Галактоманнан наиболее интенсивно гидролвзовалоя коммерческим препаратом Темицаштлаза" (на 43 %), препаратом "Амилоразин П10хп. напротив, гкдролизовался лишь на 4 Высокая степень гидролиза галактоманнана препаратом "Гешцеллилаза", объясняется, по-видимиу, высокой активностью /5-ыанааназы в препарате. Арабинсгалактан гидролизовался глубзе препаратами из •грибов рода АврегеШив (на 24-27 %), а препаратами га а.сато11<каа Зс и Зс-106 - на 8-9 Ж.

Из исследуемых препаратов АК ржи подвергался наиболее глубокому гидролизу всею: исследуемыми препаратами.

При изучении конечных продуктов гидролиза АГК пшеничной соломы, АК ржи, КМК препаратами "Целлжандан Г10х-1" и "Амглорнзин ШОх" методом тонкослойной хроматографии во всех случаях были заявлена пятна ксилозы, арабинозы, ксилобиозы и ксилсолигосахаридов (а в случае КМК их метилированных производных).

Так как в настоящее время усилия биотахнологов направлены на более полное извлечение питательных вэщэстз из различил отходов переработка отходов растительного сырья, нам интересно было сравнить степень гидролиза отходов зернового производства при обработке четырьмя вышеуказанными препаратами.

ТзбЛЕЦЭ 2

Степень гидролиза^гемицздлюлоз изучаемыми фврменткыми препаратами (% от количества субстрата).*

Ферментные препараты

Субстрат -----

"Цвллокан- "Целлокап- "Адвсюри- "Гемицел-дан ИОх-1" дин П01- зин Ших" лилаза" II"

Аргбшогдап-ротхохсялзн 50 - 51 46 43

АрэГшнокет-лан 60 С2 72 56 4-0-!.!эт2лг-такуронокса-

лан т 47 44 42 н.о.

Галактоканнан 15 17 4 48

АрабнЕОГалактан 8 9 24 27

На-КарбокснметЕлксилан 55 62 51 н.о.

* I кл пригоняемого раствора фермента содержал I мг белка.

Таблица 3.

Степень гидролиза гемшделлйлозосодергащь! отводов зернового производства (Ш'О)-*

Наплэисааниэ "Цгллокьвлш "Ддалоризия "Цэляогсгн- "Гэ.ъи-отхода (НЮ) Г10х-1" ТПОх" дез ц&ллвдазг"

ПСг-И"

24 ч 48 Ч 72 Ч 24 Ч 48 Ч 72 Ч 24 ч 24 Ч

1.ПШЙП2ЧЗЫв •

отруби ДЭПрО— технизирован. 10 12 13 12 14 15 13 н.о.

2.р<таил8 отруби дппротв-знвжрозанвне 23 35 35 35 37 37,5 35 16

З.Ячкзнюя му^а 9,6 16 17 50 57 .58 Г7 н.о.

4.ГЙ!?НЕЧЕгЭ '.УГОуСм 15 1С 18 15 17 17 24 н.о.

5.Рваные отруОн 34 38 38 ЗЙ 32 33 25

* I и применяемого растворч фзрмента содержал I кг белка

В работе бали использованы нерастворимые остатки различных отрубей (НТО), любезно предоставленные кафедрой биохимии и мпкробзодохчп! Одесского технологического института пищевой промышленности. В процессе предобработки из отрубей были извлечены крахмал и больа (Капрадьянц и др., 1992). Результаты гидролиза представлены в таблице 3.

Пшеничные НТО лучше гидролизовались препаратом "Целлокандин Г10х-П", раганзэ отруби гидролизовались приблизительно одинаково всеми препаратами за исключением "Гешполлллазы". Это мсзно объяснить частичным удалением ферментов целлвлазного комплекса при очистке препарата.

Ячменные НЮ гидролизовались на 50 % препаратда "¿¿злорсзин ШОх", тогда как препаратами из с.сашиаит Зс "и Зс-106 за 9,6 и 17 % соответственна.

При исследовании динамики осахаривания отходов зернового производства (ЕГО) препаратами "Целлокандин П0х-1" и "Лдалорнзин ШОх" было выяснено, что основное количество продуктов реакции образовывалось за парше сутки, после чего процесс резко тормозился, особенно при гидролизе препаратом "Ашлоризпн ПГОх". Это, по—видимому, связано с инактивацией ферментов при длительном инкубировании и с частичным ингибированием продуктами реакции.

Исследован» степени полимеризации продуктов гидролиза отходов зернового производства (НТО) ферментными препаратами "Акшюризин ШОх" и "Целлокандин П0х-1" показало, что полученные олигосахарады имели степень полимеризации 4-8 и могут быть использованы в различных пацевах производствах (ОЬ а1., 1990).

3. Еыдэлениз зндо-1,4-/5-ксиланазы, /з-ксилозпдазы и а-Ь-арабинофуранозидазы.

Так как в клеточных стенках зерна злаков гомщеллвдэзк представлены в основном арабиноксиланамн и

арабиноглшуроэоксиланаш, мы поставили перед собой цель выделить в гомогенном состоянии и изучить ферменты ксиланолптического комплекса: эцдр-1,4-/э~ксиланазу, /з-ксилозвдазу из ферментного препарата "Азгалоризпн ШОх" и а-Ь-арабипофуранозидазу из культуральной аздкости целлалолитического штамма с. Зс.

Разработанные способы выделения белков включали использозаняе

гель-фшштрацаонной, ионнообменной, гидрофобной и

ВЭЖХ-хроматогрзфиа. Схоиа очисток эндоксиланази, р-ксшсзяг.ази и арабпнофураяозидазы представлены соответственно в таблицах 4,5 к 6. Отдельные стадии с^.сток изображены на рис. 1,2 и 3.

Таблица 4.

Схема ОЧИСУКИ ЭЯДО-1,4-/3-КСИЛЭНБЗН из A.oryzae.

Балок Активность Выход Степень

Стадяя общза обц&я удельная по актив- очзсткк

очистки мг мг/мл К Е/мг ности, % (раз)

Экстракт тюсла цеатрзшугироважя 2520 5.6 5680 2,2 100 I

Сефадакс G-50 П36 4,2 5112 4,5 30 2,0

DEAE-софэроза 313 24 4828 15,4 85 7,0

ÎSK-BEAE-5PW 42-,0 5,2 4430 105,8 78 48

Сефакрал S-2QQ 32,0 2 3975 125 70 56,8

Таблица 5. Схомя 0\ИСТКй /МССалоЗЦДаЗН КЗ A.oryzae.

Балок ¿ктавносгъ Выход по Степень Стадия очлеткз общий общая удельная активности очистки кг мгЛи Е 2/нг % (раз)

Экстракт после 27S0 центрифугирования

Сефадакс G-50 2020

ВЕЛЕ-сефароза 1200

TSK-DEAE-5PW 52

Phenyl-superose ' 1,5

15,6 16 0,003

4,2 15,2 0,004

2,4 14,4 0,006

0,52 7,2 0,07 1,2 5,8 3,5

100 I

95 1,4

90 2,3

45 54

40 1860

Таблица 6.

Схема очистки о-ь-арабинофуранозвдаза из в.свпеШиа.

Стадия очистки Белок Актнвпость Вкход Степень общий общая удельная но ак- очистки тизности (раз) иг, кг/ил Е Е/мг % ■

Культургльпая 1530 10.4 3.12 100

хвдаость поело 0,2 I

цоЕтргфуткравания

Сефадакс С-ЬО 1206 '7,1 300 0,24 96 1.2

ВЕАЕ-сефароза 672 12,4 280 0.42 09 2,1

ЗЗК-БР-БР!? 16 0,5 169 10,5 54 52,5

ТЭК-ВВАБ-БРК 3,2 0,5 118 37 38 185

РЬеауЬ зирегозе 2,2 0,5 103 47 33 235

Копо-Б Я,2 0,5 103 47 33 235

г.0

Ю

С^аШ.М С.5

rO.se

Рас.-1. Очистка гщдрксгздшазы

Ь /»-КСЬЛОЗЕДаЗЫ ПЗ А.огуаее ЕЭ КОЛИ)«® ТЕХ-ИЕйЕ-аРч". Стартовсй буфэр - 0.02 И ткк-Н01, рН 7,4; эльзру*тций буфер - 0,02 И Т£СС-Н01, рН 7,4, 05» КаС1.

т----гоглхезек! яэ 280

ил; 2 - —'->—~—э— актнязость ¡эвдсюзетаяЕзн (А 500); 3 —о—о—о-^-ксньж^азы (I 410).

60

120

[(МНч)г£ОД, М

15

Рис. 2. Очистка ¿э-ксилозида-зь хрогдатографией на колонке "РЬепу1-5ирегозе". С-хартсвый буфер 0,1 М На-фосфат рН 6,0, 1,7 М сульфат аммония, элюирукщий буфэр - 0,1 М На-фосфат рН 6,0.

1--поглощение на 280 на;

2 -о—о- активность /з-ксилозидазы

(А 410).

■к

0.5 М,м

-Ь.гкн

Ряс. 3. Рэхроматогргфяя ареди-нофураЕОзидазн на катанке "йопо 5". СтартовыЗ; буфер: 0,02 Ы Ка-ацетат рН 4,5; эдшрушай буфер: 0,02 М .'Га-ацетат рН 4,5, 0,5

М N301. I--поглощение при

280 ни; 2 - -«—т—активность арабшофуранозидазн I; 3 —о-о-о-активность арабхшофуранозидазн II.

Б результате 5 этапов очистки из препарата "Ашлоризш ИГОх" бшш ввдэленн эпдо-Т ,4-^-хсиляказа с удельпой активностью 125 Е/мг белка, выходом по активности 70 степенъв очистка 56,8 рас и

/з-ксияозидаза с удельной активностью 3,6 Е/иг Оелка. степенью очистка 1860 раз и выходом по активности 40 %.

Две формы а-Ь-арабинофуранозкдазы, получевные из фильтрата культуральной жидкости с.сатиаит Зс в результате 6 этапов очистки бнли очищены в 235 раз с выходом по активности 33 % и удельной активность!) 47 Е/мг белка.

Высокая степень очистки, а тагае малые потери белка при выделении, небольшое число применяемых стадий очистки позволили прадпологить, что данные способы выделения являются оптимальными.

Гомогенность подученных белков тдтвервдалась методами электрофореза в ПААГ с ДСН £ис. 4) и нзоалсктрического фокусирования.

Рис. 4. Электрофорзгра?£ма выделенных белков в 1ШГ с ДСН.

1 - рзперЕые белки (сверху вниз): фосфоралоза (S6 кДа), БСА (67 кДа), овальбукпн (45 кДа), зидатр-эдсин (25 КДа).

2 - зндоксяланаза; 3 - (з-кси-лозвдазз; 4 - арабипофурапози-даза I ;5-эрабзноф1'рснозидзза II.

4.Свойства эндо-1,4-/?-ксилазазр, ,^-ксжлозь;дгзи и "-Ь-арабивсфурэнозздазг:.

Молекулярные массы эндоксилангзи и /з-койюзцдагн по ддв™^-гежь-фальтрации равны соотьетстевйзс 47 кДа и 170 цДа, по данным злшарофоргза с ДСН - 46.5' и 23 кДа. Это свидетельствует о том, что эндоксиланаза является мономернш белкок, а /ч-хсилозтэдзза, прздаологотельно, состоит из двух субъединкц с одинаковой массой. Зти данные сопоставимы с даввгма, полученными при исследовании алдоксилаваз а /з-ксшшидаз из других видов рода Aspergillus

(ТавсСялов я др., 1882, 1983; К11гргеесЬа7ап1с11 еХ. а1.. 1984: Ка1о ег. а1., 1985).

Модэкулифныв мессы арабипофуранозидазы I я II равняются 80 кДа и 69 кДа.

&ОЗЛ81ПрИЧ9С1СИ0 точки всех выделенных белков находятся в кислой области (р1 от 3,60 до 4,15), что характерно для большинства грябнкх кэрбогидрэз и глигозидоз (Резрзпйе ег. а1., 1986; Я1п ег. а1., 1987). Осшве^о фтгзико-хпшчэские свойства гожгенно очищенных белков представлены в таблица 7.

Таблица 7.

Некоторые свойства зндо-1, 4-^- ксклапазы, ^-ксилозидази и а-Ь-грэбинофуракозгдао I и II.

Ксиланаза /з-Ксилози- Арайнаофуранозидаза Свойство из А.отугае даза кз из С.сапй1йшп

А.огугае I II

Молекулярная месса (ГФ) 47 1сДа 170 кДа 81,5 кДа 69 КДа

(Щ 46,5 кДа 32 кЛа 80 кДа 69 КДа

Изоэлвктрзческзя точка 3,60 4,15 4,00 3,85

% Содержания углегодов 6 н.о. н.о. н.о.

рй-Онтшкум 5,0 5,0 4.1

рК-СтабпльЕость 5,5-8,0 3,0-8,0 5,5-8,0

г°-0птсмук 50° С 70° С 50° С

^-Стабильность ДО 50° С 45° С 50° С

Ки 2,2 мг/мл 0,55 Ш 0,63 а 0,83 ММ

для КЩ для п-В&эК для П-НФпА

Ингибирсвание Ндр4", 7.1?+, н.о. и.о. я.о,

йа , са2+, н-бромсукцинэигад

При ис еда давании. субстратной специфичности эздокезланазц из А.огугае было показано, что фермент являлся эндефэрнэтта по механизму действия и гздролизовал различные ксиланы с образованием ксплоолзгосахаридол, ксилобиозн, ксилозы и арабинозы.

Из литературы известно, что зндокскланази по кехзллз.чу

действия подрззделявтся кэ несколько танов: гидролизуищь ксиданн до ксилозы, ксилобиозп и ксилоолигосахаридов (Join et.al, 1979) и пе образующие ксилозу при гидролизе хпиланов (Panbangred et.al., 1983).

По способу гидролиза грабиноксилззов • и арабиноглдкуроноксиланов ' зндоксиланазы подразделяш'ся на отцэшшпцга арабннозу от-основной цепи кскланов (KisLia et.al., 1S85) н не отщеплявдах ее - таких яцдоксзланаз большнлстзо (Yoshloka et.al., 1981). Субстратная специфичность эедоксел&еюзы представлена в табл. 8.

Исследований субстратной спецвфгтноста Р-ксйлозядгзы показало, что фзраант практически не гидролизозая ксилавк (0,62), что

; табллца 8.

Субстратная специфичность атздо-1,4-/?-кс11Лнназы.

Субстрат Гот неходкого количества

субстрата

Ксила- Кскао- АрабЕнофуравози-

паза злдаза дазз I и II

Ар&биноглксуроноксклан 9,8 0,8 0„6 0,5

Араблноксилан 12.2 1,8 н.о. н.о.

Ксилан овса 8,0 1,5 -

4-0-металглнпуропоксалан 6,1 1.2 - -

Арабншгалактгн 0,4 - о,-? 0,7

Галактожаннан - - - -

КарбошзыетЕЛксзтлан 8,0 2,2 - -

Лихенан 0,6 - ■ -

Аззцул - - - -

КарЗоксЕ-Зтшщеллзшоза 0,2 - -

КсЕлан листкенница 8,2 н.о. - -

п-Ш-в-арзбинофураноэид - 0.5 24,0 . 21,3

п-НФ-г>-ксилопиранозяд - 30,0 0,5 0,5

Целлобиоза - I - -

характерно для Солышнстез изученных /з-ксшюзидаз (Kltp.reechaYanl.ch е:.а1, 1984) (Табл. 8).

Выяснено, что /?-ксилозидяза из А.огугле обладала широкой агликонозой специфичностью, з тгкке неспецЕфнчностьл к конфигурации Р-свяон.

Обь формы Бнде.ленЕчх а-Ь-эрабкЕСфураяозидгз практически не отлечзлчсь по способности гидро.иизоЕать как полисахарида, так и гднкози/Ш. Сбэ форет зрзбинефуранпетдаз «-Ь-чребинофурапозидазн отщепляли арабинозу о? арабиноксиланз, ар^блЕоглжуроноксилана и арабшогаяактаиа.

Что касается двух форм выделенных «-1-эрабшофуранозидаз та о.сспсНПтеп Зс, то гдагзо прздро.тояитъ, что в основе множэственпости белков в данном случае лэлит нооттршслнцпошай сроцессинг, так как фязико-отличэяспе свойства балков отличались незначительно. Множественность форт характерна дая многих секреткруешх глюсозидаз из источников грибного проясхокдвгкя (Тавобилов и др., 1932, 1933; 52Ьап1зМ ег.а!., 1985)%

5. Гидролиз клеточных стенок, Еыдслензнх из пшеничных с грубей-

Нвме была изучена способность ферментных препаратов "АмЕлоргнш- 1ИОх" и "Целяскавдин Г10х-1" и гймагенно очищенных белков х-эдроллзсЕать клеточные стоике, заделанные лз шеяичных отрубей. Клеточные станки бада получены ¡га Одесского технологического института пищевой проьзкшенности (.Укрзиза) а содержала саодущий жпомэршй состав гемиц^.длшюз: галактоза - 7,9 %, глюкоза - 10,5 %, арабиноза - 13,2 %, ксилоза -63Д 2, уроновые кислоты - 5,3 .

В работе асшльзозались гомогенно очйкдешше эядо-1,4-/з-ксиланаза и /э-ксшгазидаза 23 А.огугае, с-Ь-аребКЕофурапозгдаза из с:еапа1«1ит зс осшсазше выше, а также зндо-1,4-/э-гликзнЕза ;(любезш предоставленная Васильевой Н.В.), целлобиогидролаза (любэзно нрвдостдапеная Неустроэвнч К.Н.), полигалактуроназа (Лабеэно предоставленная Нурадяевой А.). Последние три бежа выделены из а.сапсЦсиха ЗС.

Данные о степени гидролиза клеточной стенка,виделеноЯ <сз

пшеничных отрубей, представлены в тэбл. 9.

Клеточная стенка гидролизоваласъ препаратом "Целлокандин Г10х-1" на 26 «,'а препаратом "Аынлоризин ШОх" на 20 Ж.

При гидролизе клеточной стенки различными гомогеныма гликаназами и гликозидэзамк было видно кооперативное действие ферментов: так, гоьюгезная эндоксиланаза гидролязовала плеточные стенки на 1.8 %, тогда как эндоксиланаза и /з-ксяиозадазо ко - 7.3 %. При совместно« действии всех .шести попользованных гогогэнннх фермэнтов гидролиз клеточных станок бед максимальным и составил 15,9 Ж.

Таблица 9.

Степень гпдролиза клеточных стенок из пцвничвнх отрубей ферментными препаратами и гомогенный: белкаш.*

Варианты

% рэещошюния от количества субстрата

1. "Цедлокардт ПОх-1"

2. "ДМЕЛОртЗйН ШОх"

3. Эндоксиланаза (7 )

4. Эндоксиланаза (7 ед.) Л-Ксшдззцдазо (1,1 ед.)

5. ЭндоксиванЕза (7 ед.) /з- Хсилозидаза (1,1 ед.) с--1г-Ар£бикофуранозидрза (0,1 ад.)

6. Эадоксаланаза.(7 ед.) /з-Ксгшэзщдаа (1,1 ед.) е-Ь-Авабинофургнозадаза (0,1 од.) ЗндоглЕИпаза (10 ед.)

7. Эндоксиланаза (7 ед.) Л-Ксалозидаза (1,1 ед.) Эндрглгасаназа (Ю ед.)

а. Эсдоксшиназа (7 ед.) . Эндоглшангза (10 ед.)

9. Зздоксалапаза (7 ед.) Эадогкканазе (10 ед.) Цэллобзогидрслаза ( )

26 20 1.8

7,3

8,5

12,3

11,9

7.2

9.3

10. Эндоглшаназа (10 ад.) Целлобиогидролаза ( ) 5.7

11. Полигалактуроназа (0,45 ед.) 0,44

12. Эвдоксшганаза (7 ед.) /з-Ксплозидазз (1,1 ед.) а-Ь-араОинофуранозидаза (0,1 ед.) Эндогликанэза (ю ед.) Целлобиогидролаза ( )

Полигалактуроназа (0,45 ед.) 15,9

*Реакционаэя смесь содержала 100 мг клеточных стенок, 5 мл ацетатного буфзра рН 4,7; 0,1 М, 2 мг/мл ферментных препаратов. Время инкубации - 72 часа.

6.Лабораторная выпечка хлеба с препаратом "Цвдло-кандан ИОх и высокоочищенной эндоксиланазой.

Содерганиэ гэшцелзтлоз (пентозэнсв) в пшеничной муке составляет около 2,5 Пентозаны наряду с белками и крахмалом определяют реологическую структуру теста ври брааении и расстойне,

поэтому ЕЕЗданаа е муку ферментного препарата "Целлокандан ГСОх-1", содержащего целлалазвый и гзмицеллшазный комплексы, а также гомогенно очкщеннув андсксилаяазу представляло большой интерес, особенно зсли в рецептуру выпекаемого хлеба входили шпенгчше отруби.

Лабораторная выпечка хлеба проводилась в Одесском селекционно-генетическом кпстптуте АСХ Украины.

Результаты лабораторных выхечек пшеничного хлеба при введении в муку прпврата "Цоллокзндин Г10х-1" и гомогенной эндоксяшшазы из

А. oryzee ПрЗДСтавЛЗНН В ТЗбЛ. ТО.

При введении е шзэничнув муку препарата "Целлоказдин Г10г-1" в количестве 5 мг на 200 г муки (0,025 %) общая, хлебопекарная оценка увеличивалась до 4,5 баллов ш сравнению с 4,25 в контроле, улучшалась пористность и увеличивался объем хлеба. При выпечке хлеба с гомогенной' эндокташзгзоЗ общая хлебояэкэряэя оценка увсличагалясь до 4,3 и 1,3 баллов для вариантов глебз без добавления отрубей и с отрубями соответственно.

Таблица 10.

Лабораторная выпечка хлеба с ферментнш» препаратом "Целлокавдин Г10х-1" и гомогенно очищенной эндоксиланэзой ИЗ A.oryzae.

Варианты Объем, V(ct,r) Пористость Балл за пористость Высота, Н(мм) Балл за высоту о|

Контроль (200 Г муки) II40 SO 4,25 145 4,25 4,2

200 г муки + I ед. эндоксила-назы 1180 92 4,27 155 4,75 4,3

200 г муки + 5 мг препарата 1240 95 4,30 160 4,85 4,5

180 г муки + 20 г отрубей (10 %) (контроль) 580 60 2,25 . 75 0,75 1.5

I80 г муки + 20 г отрубей + 5 мг препарата 630 65 2,75 85 1,20 1,7

180 г муки + 20 г отрубей + I ед. эндоксиланазы 650 70 3,0 90 1,25 1.8

вывода

I. Изучена способность ферментных препаратов "Целлокавдин Г10х-Г\ "Целлокандан ПОх-II", продуцентами которых являются G. с and i dum ЗС И G.candidum ЗС-106 СООТБетсТВвЕНО, "АМЯЛирШЕН ШОХ" КЗ A.oryzae, "ГеМИЦеЛЛШаза" ("Sigma") из A.niger катализировать ги.^ролиз полгс«ероз злаков. Все прзпараты содержали системы фаркэнтов, равщеплящах гемицеллллозы и лаканы. В препаратах "Целлокацдзн П0х-1" и "Цэллокгздян FiОх-11" преобладали цвлишззы, андоксиланаза и «-Ь-арябЕно^уранозидаза.. В препарате "Ai-хлортаин IIIUX" преобладали высокоактивные /*-глзкаЁазы, андоксиланаза и Р-ксилоаидаза, а в препарате "ГемкцеллЕдаза" ("Signa") /j-маннаназа, андоксиланаза, 1,4-/з-га лантана за.

2. Препарат "Амилоризин ШОх" характеризовался низкой целлзлолитическтй и высокими а?я1юлятическ0й и щютеолспгчвскоЯ активностями, тогда как в обоих препаратах "Целлокандин ПОх" (I и II) амилолятическая активность отсутствовала, а протеодиткческая была слабой.

3. Из препарата "Амилоразян ШОх", продуцентом которого является- А.огугао гыделена гокогзнная эндо-1,4тЗ-ксилэназа со степенью очистки 56,8 раз, молекулярной массой 46,5 кДа, изоэлектрической точкой 3,6. Фермент расцеплял ксиланн до ксилоза, ксилобиозы и ксялоолш-осахаридов и относился к группе зядоксиланаз, отщэплянцих арабшюзу от арабиноксилана.

4. Кз препарата "Амилоризин ШОх" получена гомогенная А-КЕСлозадаза со стэпеньп очистки 3,6 раз, молекулярной массой 160 кДа, изозлектрической точкой 4,15, состоящая из двух субъединиц равного веса. р-Ксилозэдаза в незначительной степени гидролизовала ксиланы, обладала широкой аглзконовой специфичностью и была не специфичной к конфигурации р-связи.

5. Из фильтрата культуральной жидкости в.оа лЛйшп Зс, облздаищзй высокой арэбикозидазной активностью были гомогенно очищены две молекулярные формы а-Ь-арабинофуранозидазы с молекулярными массам*- 50 и 69 кДа и изоэдектрическима точками 4,00 и 3,85.

6. При гидролизе клеточной стенки, вид&ленной из пшеничных отрубей различными гомогенными гликаназада к гликозидазамя было установлено кооперативное действке ферментов. При совместном действии всех шести использованных ферментов гидролиз клеточных стенок был максимальным и составил 15,9 %.-

7. Эффективность осахаривания рзаных, пшеничных и ячменных отрубей зависела от кооперативного действия карбогидраз целлшазного и гемицеллвдазного комплекса и была приблизительно равной для препаратов "Целлокандпн ГЮх-1", "Цзллокандан ПОх-11" и "Амилоризин ШОх". В" результате действия препаратов на отруби получен?' олигосахаридн-со степень® полимеризации 3-8, которые могут использоваться как добавки в различных пищевых производствах.

8. При введении преперата "Целлокандин Г10х-1" и гомогенной эвдоксиланаза, выделенной пз д..огугае в пшеничную муку в обоих случаях наблюдалось улучшение свойств теста и выпекаемого хлеба.

- 26 -

Список рвбот, опубликованных до материалам диссертации

1. Килимник A.D., Капрельянц Л.В., Ыартанозич Л.И.., Родионова H.A. Клеточная стенка вы сикх растений и ее ферментативное расщепление // Тзз. докл. III Всесошн. конференции "Биосинтез целлшюзн и других компонентой клзточной степхп". - Казань, IS9D, с. 17.

2. Килимник A.D., Капрельянц Л.В., Середняцкий Л.В., Ыартиновяч Л.И., Загустила H.A., Родионова H.A. перспективы применения препаратов целлилазы ИЗ Geotrichum Candidus в хлебопекарной промышленности // Тез.. докл. конференции "Метода, получения, анализа и применения ферментов". - Рига, 1930, с. 150.

3. Кшшианк A.C., Кгпрэльяиц Л.В., Середннцтай П.В., ?орвж/аа H.A. Ксиланазы кицэлпальяых-грибов и их фазнко-хтогсескке свойства //Тез. докл. 711 Всесоизн. симпозиума "йзавнерная знзнмолагия". -Москва, 1991, с. I54-IS5.

4. Капрельянц Л.В., Кшекняк A.D., Духанина А.Р., Родионова H.A. ПршэнвЕие феркэнтов при комплексной переработке зерна // Тез. докл. Всасовзн. ковфврэнцпи "Дозтешнея баотахнологик агропрошшлепноку комплексу". - Черновцы, 1991, с. 166.

5. Капрзльтнц Л.В., Кезшшик A.D., Стыгач И.В. Ферментированные зерновые завтрака // Тез. докл. Реслубл. научно-технической конференции . "Разработка и. внедрение зыаокоэфЬективных ресурсосберегающих технологий, оборудования и новых видов шцэвнх продуктов в пвщезую а шрерабатявэгааг» отрасль АПК". - Клев, 1991, с. 165.

6. Килимник A.D., Кшзррльянц Л.В., Род1анзкз H.A. Ф1знко-х1ч1чн1 властавост! фермент1в, як1 розчзшяпть аргбйгаксшганп зеряових // Тези дошв!д1й VI Укра1нського з 1зду. - Khíb, I9S2, с. 23. . '

7. Кшшаньк I.D., Кшрельшц, JÍ.D., МартЕВозпч Д.И., Родионова H.A. Феркенты, катализарукисе расцепленкв ' пентозаюв и их применение в хлебопечении // Тез. докл. t Всесохьн. конференции "Химические превращения пищевых биополимеров". - Светлогорск, 1991, с. 114.

8. Родионова H.A., Капрельянц Л.В., Середняцкий В.П., Кшшишпс A.B. Гемицеллшсзы зерна злаков и фермента, катализирующие их расщепление. - Дрдкл. бдохш.1. я КЕкробяол., 1992, был. 5, с. 645-665.

9. Голубев'A.M., Кшпшних А.Ю., Родионова H.A., Капрельянц Л.В., Неустроев К.Н. Выделение и свойства «-Ь-арабинофуранозп-дазы из. Geotr/c/ium cs.ndidum ЗС. - Биохимия, 1993, т. 58, Л.2, с. 234-239.

10. Голубев A.M., Ибатулжн 5.Ы., Кшшанж A.B., Родаонова H.A., Неустроев К.Н. Выделение и свойства эндокснланазы и -кси-лозидазы из CfspegUlus.. cryzze . - Еяотшя, 1993, т. 58, й 6, с. 845-851.

П., Coluber A.M., Klllmik A.Yu., Neustroev K.N., Pickeragiil R.W. Crystals of jj-xylaaase iron CtspergS/Jus oryeoe - J. Kol. 3lol., 1993, Vol. 230, p. 661-663.