Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

О полисахаридах клеточных стенок грибов-патогенов и значение их в индуцировании защитных реакций хлопчатника

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "О полисахаридах клеточных стенок грибов-патогенов и значение их в индуцировании защитных реакций хлопчатника"

РГ8 ОД

~ 3 Ж1д@ШгЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

На правах рукописи

УДК 633.511 577.154 КОННОВА Элла Владимировна

О ПОЛИСАХАРИДАХ КЛЕТОЧНЫХ СТЕНОК ГРИБОВ-ПАТОГЕНОВ И ЗНАЧЕНИИ ИХ В ИНДУЦИРОВАНИИ ЗАЩИТНЫХ РЕАКЦИЙ ХЛОПЧАТНИКА

03.00.23 — Биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ташкент — 1996

Работа выполнена в лаборатории биохимии и биотехнологии физиологически активных соединений Института микробиологии АН РУз

Научный руководитель — доктор биологических наук, профессор, академик АН РУз А. Г. Халмурадон

Официальчпле оппоненты: доктор биологических наук, профос-

сор М. X. Авазходжаев

Ведущая организация —Биолого-почвенный факультет ТашГУ

им. Мнрзо Улугбека

па заседании специализированного совета Д 015.02.01 по защите диссертаций па соискание ученой степени доктора наук при Институте микробиологии АН РУз по адресу: 700128, Ташкент-128, ул. А. Кадыри,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии АН РУз.

доктор биологических паук, профес сор Ж. Сафиязов

Защита состоится «л*,» сентября 1996 г. в «

» часов

Ученый секретарь л

I Специализированного сове!та, [//

/ доктор биологических ^ М- ХОДЖИБАЕВА

ОШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одной иа биологических мер борьбы с га-иодеваниями растении считается повышение резистентности возделываемых культур. Отсюда и исходит чрезвычайно актуальная и ватная научная проблема изучения механизмов взаимодействия в системе растение-патоген, решение которой приведет к разработке биотехнологическда (генноинженерных) способов получения па-тогенустойчиных сортов хозяйственно-ценных растений.

Как известно, запуск-защитных реакций в растительных тканях происходит в результате' узнавания рецепторами растительной клетки элиситороа микроорганизмов-патогенов (P.Albersheim, 1578, Л.В.Метлицкий 1976, 1Ö85, Ы.Х.Авазходааев, 1980).

В то же время может реализовываться и другой механизм: при гидролитическом разрушении растительной оаетки ферментал! гриба-патогена происходит высвобождение из нее олигасахаршюв являющихся эндогенными злиситорами растения ■ Ш-Элберсхейы,' 19G5).• Безусловно важная роль в этом процессе принадлежит С-1,3-глэюнаэе (КФ 3.2.1.74).

Дель работы. В связи с отмеченным основной целью настоя-цего исследования явилось выделение полисахаридных структур грибов-патогенов хлопчатника Verticilium dahliae, Fusarium oxysporan и Phytophthöra sp. й выяснение их роди, а также одного из ферментов целлвлолитического комплекса указанных патогенов - в-1,3-глюканазы в процессах индуцирования защитных реакций хлопчатника, в ответ на грибную инвазию.

Для достижения указанной цели предполагалось регить следующие задачи:

1. Выделение й-1,3-гл»канагы из кулатуральной гшдгасти грибов-патогенов и изучение некоторых ее свойств; ;

2. Выделение и фракционирование суммарного препарата клеточных стенок вышеуказанных патогеноз;

3. Исследование индуцирущей способности полученных фракций полисахаридов в различных органах хлопчатника, а также в .целом растении. .. -.'..". -

Научная ноЕизва. В результате проведенных исследований получены следующие ноше данные:

Путем скрининга среди итакыов двух патогенов .хлопчатника - F. охуврогия. и Phytophthora sp. отобраны итаммы с нгиболытей.

-з-

удельной 8-1.3-глюканазяой активностью.- Изучен характер накопления е-1,3-гдюканазксй активности в культуральной жидкости указанных грибов в динамике их роста. Исследована динамика ' секреции полисахаридов в культуральную среду у V.dahlias и F. oxysporum. Обнаружено существование корреляции между увеличением удельной 8-1,3-глюканазной активности в культуральной среде а изменением уровня секреции полисахаридов.

Из культуральной жидкости грибов F.oxysporum, Phytophthora sp. и V. dahlias выделены 8-1,3-глюканазы. Изучены некоторые физико-химические характеристики ферментов, полученных из F. oxysporum и Phytophthora sp. Ступенчатой экстракцией, вклеь Човдей щелочной и частичный кислотный гидролиз клеточных сте~ кок грибов выделены полисахариды. Проведена их гель-хроматография на. Сефадексе 3-50 и Акрилексе П-4, выделены соединения с-различающимися молекулярными массами. -

Проведен ферментолиз полисахаридов клеточных стенок .Y.dahliae и Phytophthora sp. собственными 8-1,3-глюканазами.

Установлено, что наиболее активными злиситорами является ферментные гидрелизаты щелочерастворимых полисахаридов кдеточ--еых сменок Phytophthora sp. и V.dahliae. Показан локальный и системный характер 'индукции растительной в-1,3-гдюканазы в ответ на обработку-полученными из грибов-патогенов препаратами. Установлен синтез соединений фенилпропаноидного летаболизма в тканях хлопчатника как при воздействии полисахаридами клеточных стенок грибов, так и 8-1,3-глюканазой Phytophthora sp.

Практическая значимость. Полученные в работе новые дан жа по режиму культивирования поражающих хлопчатник грибов V.dah-. liae, F.oxysporiiB и Phytophthora sp. с цель» получения 3-1.3-глвканаз, а также полисахаридов из клеточных стенок,, изученные физиолого-биохимические характеристики 8-1.3-глюка-ыаз и полисахаридов, а также предложенная схема выделения эжекторов в числе других могут служить научной основой для разработки биотехнологических способов повышения фитоиымунитета . хлопчатника, что имеет существенное значение для дальнейшего развития хлопководческой отрасли в Республике Узбекистан и других хлопюэсеших странах. • \

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на конференции "Физиология и биохимия мицелиальных грибов в связи.с

проблемами биотехнологии" (Москза. 1994), конференции "Проблемы современной биологии и экологии'" (ТаЕкент, 1995) и VI Международном Симпозиуме по микробиологии надземной поверхности растений (Бандолъ. Франции, 13Q5).

. Публикации. По материалам диссертации опубликованы ? печатных работ, та которых 4 журнальные статьи и 3 тезиса, докда-

Q. ..

ДОЗ.

Структура и обьем • диссертация.-. Диссертация- состоит из •зведения, обзора литературы, экспериментальной часта- с обсуждением результатов, зшшзчения, выводов, списка использованной литературы. включающего /Ь^Х наиыеновашсг. Работа изложена на XSf страницах' машинописного текста, шсзочая 19 рисунков„ 4 таблицы if схему. ,

•1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ• - ■

В главе дан анализ современного состояния проблемы no ué ханизмам формировния фитоимиунитета, гидролитическим ферментам грибоз. и злиситорам защитных реакций растенк».

2.. МАТЕЙШЫ И-МЕТОДЫ- КССЛЕДСЗАШЙ ' ' - В качестве- объектов исследования нами были выбрани 3 микроскопических- гриба,. пораагюзиехлопчатяикг Verticiliiurn dah-- lias, . Fusarium oxysporm и Phvtophthcra sp.,.; Штаммы грибов- V. dahlias я F.oxysporum получены наш-. я&- лаборатории колДекцжг »лсфоорганизыов Института микрсбтаогш Ail РУз, a Phytophthora sp. любезно предоставлены с.а.с, Шаповаловой Р.А. из лаборатории- генетики иммунитета и коллекции микроорганизмов , Института генетики.АН РУз.. . ' . '.'-""•-"

V Дат проведения-•• экспериментов,- исходя, из изученяа--уровн» удельшзй 8-1,3-глюканазнои активности, в кудьтурадьной жидкости h3miï. были- Еыбраны - штаым Р-2 гриба V.dahliae. -.Среди штаммов гриба F.oxysporum был зыбрая. этапы- 203,:. а тзизев- использовался, атаки- N 4 фитопатогенного ыякрсмицега Phytophthora sp.:

Грибы выращивали^ в стащгонарньсг условиях на стерильной среде Чалека-Докса s литровых казбзх Эргенмейера» содержащих 200 мл. среда : в : оптимальных, для.каждого патогена условиях: v.dahliae.- при-23°С.в; течениэ 15-16 суток; -Р.охузроплз - пра з течение-11-12 суток и Phytophthora^sp. — при 24-25°С на.

; ■ .

протяжении 14-15 суток. На всех этапах культивирования осуществляли микробиологический контроль за чистотой культуры. Засев проводили, используя 2-х суточный инокулят. Яизнеспособ-ность культур поддерживали на агаризованнъм косячках при +4°С з течение 6 месяцев. ,

р-1,3-гддканазнуа активность в фильтрате культуральной ищкости определяли методам Шоыодьи-Нельсона (1952). За единицу ферментативной активности принимали количество фермента, которое образует 1 мкмоль Еосстанавдивашщих сахароз в пересчете на глюкозу за 1 мин в оптимальных условиях действия фермента. Удельнуа активность определяли числом единиц активности на 1 мг белка. "

Содержание белка определяли методом Лаури (1951). Выделение в-1,3-глюканаз из сконцентрированной культуральной жидкости грибов проводили, используя осаядение этанолом и гель-хрсмагографию на Сефадексе G-50 "f ins" ("Pharmacia Fine chemicals", Швеция).

рН-оптимумы >-l, 3-глюканаа определяли в интервале рН среды 3,7 - 9.1. - •

- Температурные оптимуш устанавливали а интервале-темпера-тур 28-80°С. -. , . '

Количественное содержание Сахаров в анализируемом растворе определяли фенолсернокислыы методом (Dubois, .1956).

Изучение характера секреция полисахар ядов исследовали, вьрашивая культуру в 2-х литровых колбах с краником для забора аликвот. Мицелий грибов отделяли от культуральной жидкости, дважды прошаадн средой Чапека-Докса, лишенной углеводной компонента. и инкубировали его на протяжении трех часов при оптимальной температуре в той жэ среде. Далее, в отделенной от мицелия жидкости определяли содержание полисахаридов фенал-сер-еокислш методам (Dubois, 1956).

Препарат клеточных стенок грибов получали после гомогенизации мицелия,- отмывки его буфером от внутриклеточного содер-зсвюго, освобождения от липидов экстрагированием смесью хлороформ: спирт и от гликогена с использованием водяной бани. ; ¡Делочерастворимые полисахариды получали экстрагирование« клеточных стенок IN NaOH в течение 12 часов на холоду и посла-' дуиадаг диализом раствора. :

Кислоторастзоримые полисахариды получали частичным кислотным гидролизом клеточных стекок' 0»2К трифторуксусной кислотой в течение 3 часов при 85°С.

дпешйшескпй гидролиз дагпкжарпдог поводшш в течение 1 -*;аза при 27°С, применяя 8-1,2-глвканазу.

Гедь-йзшьтрзппо подисахзптасв проводила с использование« Сгзаденса S-50 "fine", TSK-гель bV-4.0 и Акршгкзз П-4.

Кндуцирущую активность таевздатов наследовали на про. ростка:-: хлопчатника, ..впрыскивая аликвоту испытуемого раствора в растительные ткани. Тестами для определения служил уровень акхз-зкосск 5-1,3-глзканаЕЫ и наличие сс-бдинезий фелизшропано-вдеэго метаболизма.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИСЕЕ2ПВАШЙ И КХ (ВОЩЕНИЕ

3.1. 8-'1,3-гдоканагная активность и секреция

л-Ьднсгкарйдоз в дпнаш»- роста грибов

Ка»: показатель gaaaozonraecasDro состояния грибов в процессе роста была изучена динамика накопления общего белка, общей и удельной в- 1,3-глшаказной активности в культуральной

* - явваока «-1.3-глтанвгвш! аеткв®ся о - уделва* актшость фермента а - яактия^в oCssro белка

{¿EKC-iaiyii .5-1, з-мпэкззаанок - SKTilEKOCTK С-бЕ£ружК£«£ТСЯ ES

10-ll-ё сутки КуЛЕЬТИЕИрОЕоНКЯ F. OXVSpOrtKTi Ii ES 14-15-е сутки у Pnyiophthora sp. Именко г этот жа яергзд отрезается увеличение удельной ЗКЗЖЕЕОСТИ е-1,£-ГЛ50К5К05Ы у гркбг. F.Dxysporum. В-тс время как аналогичный показатель у Phytophthora sp. ..Елблзщзет-сн уже начиная с 6-ых кудьтивзрэваввй и имеет высокий уровень ¡.ZZCTb до 17-15-ых суток Ю/ЛЪТНЕКРОВЗНКЯ. ,

Кгучёнке уровня гкаопадисгжарндсз ъ динамикг роста гриба Г. oxysporum докгзалз, что наибольший их уровень приходится на

11-12-е сутки культпвирозания (рис. , 2). Б то время как максимум е-1,3-гяюканазкой бг-ггеееости в культурагьввя жадности гриба приходится на 10-11-е сутки кг/льтивирования. Аналогичные результаты были-получены в результате культивирования гриба

. ■ У.dahliae.

Это - .-свидетельствует "о наличии - корреляции . между уровнем .секреции . фер.ектя ■ и . цоследух-еш резким увеличением секреции полисахаридов.

и и ta га

Риг.

Квмевеняе угыьхэй i-1.3-гляззнаакой Ь-Кгжезости и Сйкрецул ьздисахарадок в ¡¡кишит роста грвйа F.cxyspcnr.

. о - удельказ акпзяоспь фермента - °-,сецрвяия ггиктеддов

.2.2. ; Получение в-1,г-глзкзнзз ..

, :31роведл концентрирование кулатурального .фильтрата грибов, осакдение его этанолом, был пот/чен белковый препарат, подвергнутый гель-хроматографии на Сефадекс& Б-БО» Характер разделения показал, . что белковый препарат из.культуралькых филь-тразгов все:-: трех .изученных нами.грибов делится, на фракции,-jdö-

ладающую 9-1,3-глюканазной активностью и основной по величине пик,, имеющий в своем составе углеводы.

В табл. 1 обобщены результаты проведенной нами очистки ■ 3-1,3-глюканаз.из трех изученных нами грибов.

Таблица-1

Очистка 3-1,3-гдюканааы гель-хроматографией ¡средние данные из б.эпытов) .

Стадии очистки Белок, мг Суммарная активность, Е Удельная активность , Е/мг Выход по активности, X Степень счистки

Ризагглп охузрогит.

Культуральная жидкость 159,0 .310.0 5,1'

Упасенная культу ральная жидкость 133,0 . 654,5 4.9 100,0 »

Осаждение этанолом 1:4 36,3. 451,5 12,3 69,0 2,5

'Гель - л осматогра-на Сефадексе • 7,5 '162,3 21,7 , 25,0 4,4

а РЬ^орИЬЬога зр. '

Культуоальная -жидкость 396.0 -1548,0 ■ • 3,9

Упаренная культу ральная жадность 341.4 1250,0 ■ 3,8 .. 100,0. 1 '

Осаждение этанолом 1:4 110,3 : . г 758,0 • 6,7 57,2 ' 1,8

Гель-хроматография на Сефадексе 6-50 ; 2-1,3 ■ 354,0 14,3 27,4 3,3

УегЦсППипг с!ал11ае ,

Культуральная ■ .«ИД кость 256 ,0 ' 370.0 . 3,4 -

Упаренная культу ральная жидкость 244,4 731,2 ' 3,2 100,0 £ ■

Осаждение этанолом 1:4 75,6 604,8 3,0 73,0 2,4

Г ель - >: ромато гра-Фия на Сефадексе 0-50 13,2 . 303,6 16.7 36,3 5.0

ч-

Как видно из предетавленкых в таолице данных, в результате проведенной счистки достигается 4-5-ти кратная степень очистка фермента, что позволило получать достаточно очкаенжш препарат 0-1,3-глюканааы с максимальным сохранением ее физиологической функции.

далее, нами были изучены не!;стсрые фязико-лкынческие характеристики подученных препаратов фермента. Так. для 3-1,3-глаканазы Phytopnthcra sp. были установлены две точки pH-оптимума, соответственно разные 4,2 и 5,3. глхеэ как и длл 3-1,3-гдвканааа F.oxysporusi --при сН 4.,4 к 5,3.

При исследовании температурного оптимума подученных г.ре— паратов р-1,3-глжканаз je-; установили, что зтот показатель длл фермента из • F-oxyspono находится в интервале 48-~3°С, к то Бремя как для в-л.с-глхкаяагы Phytaphtncra ар. - 5 предала/. ' 5£-53°С.

■2.3. выделение и фракционирование полисахарадез клеточных стенок грисс-л

Для выделения клето:шьсс стенок ¡¡а«,¡к использовалась 13-дневная культура гриба V.iishliae, ii-дневная культура мик-роыицета F.cxyspesCT' я 14-дневная культура гриба Fiiytepntfcora ар. Проведенная з дальнейшем cr/пекчагал экстракция дозволила получить щелоче-.и кислотсростлсримые подисачариды.

3.3.1, Целочная экстракты клеточных стенок

Полученные в результате щелочной экстракции щеточных стенок щелочерастворимых . полисахариды У.'-ал Пае и F.oxvsporum были подвергнуты гель-хрсыатографил на Ссфадексе G-50 (рис. 3). Из представленных-данных видно, что полисам аридные смеси в обеих случаях иыеьт ассдсза' разделение: они делятся на два основных компонента,' одна га которых, высокомолекулярный, выходит со езебодным соьеиом, а. ьтсрая, «икорная фракция, низкь-ыолекулярная, выходит из колонки на 310 мл злюирования.

При хроматографии суммарных препаратов яедочерастворимых полисахаридов клеточных стекск на Акрилексэ П-4 нами были получены две фракции, одна из которых также выходит со свободным сбоеыоы и представляет собой гликопрстевд, а вторая - представляет смесь чистых олигссахаридоз близкой молекулярной мае-

Р-^ш по-нсехвдов V.dahlias л F. cacysporu®-

пргдбтаглэзы па рис.- 4а, ¿Í-; сэсиеказмвэ. Геа-хрзмкогра-фкл же аналог ¡rsí-r о пре-пьратз FRytophtnc-a sp. •имеет еескалькэ ино;;,

-/гпг-: препзргтог

прэцзш! SSKSK» (риг.

Риз.

V--^

ase «ж

Г>£>-4ясатрап!я гасксахгрздов клеточных стеяак грибов на

Сбоагьксе 1-50 -

Колоекз - г.? X 70 см . . ., ^ „

- 0.31 lí ааюяик-апетакши Cypep, pH 5,2 Скорость' злюики - 64,6 ыл/чг:

о - v.dshlia?

* - F.oxvspcruni

(S)

U

3.0 tj

' 1

з

г» i

3

ы

Í -C- т 3

t.o -

l

' Ф)

10C I'.O »5

Oft»»*- МЛ

Риг- 4 r&ib-XDOüErc-osaas? вагочепагтеоакгах паекгахгпимв кгетечннх • ' станок rpKSCE ».dahlias (a;, F.oxysparus (5) н Fhytonlthora sp. In щ Дкридекге D-4 Колонка 1.7 У. 63 см ■■ апоект - Q.Ol « амюнкй-агетггекй еуфер, pH S.О Скарогк атак« - í£ ¿z/чгс

■ В нижеприведенной таблице 2 обобщены результаты разделения суммарных препаратов полисахаридов на Акрилексе П-4.

Тл-Олипл 2

Разделение полисахаридов., полученных в результате цепочной. экстракции клеточных стенок грибов на Акрилексе П-4

1 N ! !фоакции| I ' 1 V, мл !Содержание.мг/мл]Общий вес, , мг |Соотношение ¡углевод:белок !

I 1 (углеводы! белок ¡углеводы! белок

1 I УегИсШш ¿аЪНае

1 11 пик ! 24 ! 0.063 | 0,015 | 2,50 ! 0,36 I 4,16:1

| | !П пик | 16 ! 0,024 1 - ( 0,38 | - 1

1 | рЦ5аг1ЦТТ! охузрогшл

1 1I ПИК '| 24 ! 0,096 1 0,017 | 2,30 Г 0,40 1 5,75:1

1 1 !И пик ! | 20 ¡0,007 ! - ! 0,14 ! - !

1 Phyt.opht.hora зр.

1 !I пик ! 32 I 0,176 ! 0,080 ! 5,63 | 2,56 ! 2,19:1

1 1 |Н пик ! 20.' ! 0,033 1 0,008 1 0,66 | 0,16 ! ' 4,13:1

1 | пп лик! -20 ! 0,026 ! 0,008 ( 0,52 | 0,16 ! 2,25:1

1IV пик ! 16 1 '0,029 | 0,006 | ■0,46 | 0,10 ! 4,60:1

Представленные в ней результаты наглядно демонстрируют. т:то 1! пик, обпазушийся в результате разделения' полисахаридов из клеточных стенок грибов У.ааЬПаа и Р.охугрогш представляет собой свободные, от белков, олигосахариды. Б то же Бремя, как показали реь\'Л:.таты разделения, .полисахариды из клеточных стенок-'РЬу^рШг;-г а зр., - -как высокомолекулярная Фракция, так к Фракции олигссахаридов достаточно прочно связаны со .структурными белками.

Частичный кислотный пгдроаиз клеточных стенок грибов

Е результате проведения вторичной, кислотной экстракции нами был получен'полисахаркдный препарат со значительно мень-зш содержанием белковых примесей по сравнекю С щелочераство-рииымп полисахаридами <та6ж. 2).

с Таблица £

Результаты частичного кислотного гидролиза клеточных стенок грибов '

У, 1 Содержание,мг/мл|Общий вес, мг ■1 Соотношение 1-:-]-т—-1 углевод: белок!

¡Патоген ' -

¡РЪЛорЬ-'ЬЬогз зр.

¡углеводы,! белок 'углеводы{ .[.-__1--I--!—»;-!

! I - Г ' 1 -!

13 5,27

1 О, С

( 58,51 ] 4,84 1 14,15 : 1

' I } I 1 1

14 1 4,02 1 О,Ее 1 56,42 | 7,43 | 7,54 : 1

Е дальнейшем кислотораст-вориные полисахариды подвергали гель-:-:ронатограф:ш на Акрилексе И-4 (рис. 5), результаты которой покаэали. что. ь процессе частичного кислотного гидролцга клеточных стенок грибов образуется смесь олигосахзркдов сходкой молекулярной массы.

РИС. с.

полисахаридов. получениях в результате частичного кислотного перагкга кагточкьа стен:« пяйог нз Акдаексе П-4

• - Р^^ор^Ьота зр. _с - Р.схуграгш

-/з-

Ойщая процедура проведенных нами з1спершентоь по выделении полисахаридов и Е-1,3-глшака? представлена б следующей схеме:

t ¡¿ЛЪТУРА

!Культизкоование в оптимальных для i кэкцсго гриоя условиях! iv.danha? 27-

\ pnytopntnora sp. .£-£40i

15 cvtok

11 сvtok 14 суток

■ шльтраекя

ЕИОЙАССА

ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ

IT» Tu'y- Gü/MKH.

ОСАДОК -

МНОГОКРАТНОЕ • ПРОМЖАНИЕ БУФЕРОМ

эксггракйя бва2йы " хлоро^ши: спирт 1:1, по 12 часов

- всщяная ваня (¿.Ci часа)

hehtriwstkrobahhe 15 тыу. о&/мин. -

оса®:-:

препарат клеточных стенок)

' ' -теелочна^ экстракция.

лентригугирование 15 тыс. .оь/мин.

(ПйЖСАХАррНЫк'ПРЕПАРАТ)

"УГЗРСбОРМ+ЕУТАНОЛ

Т'ЕПЬ-'-СРШАТОГРА-ЗйЯ riA AKF/Jks.CE Ii-4 i

l

глилопро-

-n'Ji

■ кух^ттральная вдекость

упаривание er 4 раза iip;; 25 с ■ i

oc/jefiehke 31 анолз/ 1:4

' растворение ocaik, б ашонм- апеггattlg еу5ере pH S,7

ГЕХь-ХРШАТОГРАФЖ ka сефдцексе g-oü

npj:

-осадок

(клет0чуые стенки)

нейтрализации, высушивание

кислотная'экстракция

центрифугирование

суперйатан? (полисахарйеньк препарат)

геяь-.хроматографйя .

йааКвышксе п-4 олигосахариды.

О.ЛИГОСАХ,

САХАНЩЫ

2.4. Изучение индуцирующей активности выделенных соединений

В заключительных сериях напих исследований ставилась цель исследовать »индуцирующую способность полученных ппесаратсз. "•¿рзоначально нами были установлены _оптимальные концентрации еыделенкык соединений, при которых обработка- проростков хлопчатника вызывала заметные признаки устойчивости к воздействию разбавленной в 5 раз кг/ль туральяой жидкостью соотзетстзующего патогена.

Было установлено, что полученные з результате аэлсчнсй экстракции'клеточных стенок пслисзхзеиды. вызывают заметные признаки устойчивости проростков при Бездействии разбавленной культуральясл жазксстью '/.¿аг.Пге в концентрации 0.5 мт/мд. Кроме зтей фракции зачеткой кндуцируюшей активностью обладали рзед-эпленкые 8-1,3-глюканазоя 1 пик» полученный при разделении делочньх яслисахасидоз У.сЭДИзе на Аккиексе Я-4 я концентрации 0,05-0,1 мт/мл. - •

На следующем этап« было изучено влияние зыделенных фрак-на биосинтез з тканям хлопчатника соединений фенилпрспако-•лднего ыетаболигмз. Для проведения данных зкеперимеятоз нами 'или отойоаыы следующие фракции:

1. з-1,2-глюкзназа Рпу^рМ^сга лс. (СО мкг/растеяие);

2. Зерментатизно расцепленные ьелочерастзоримые позисахаг г-.'ды кзе-кдоых стенок Рп-яосШлсга гр. (50 мкг/растение);

3. Суммапкьй препаэат аедочерастзсримых - полисахаридов У.саЛИае з концентрации (50 шг/растение);

X. Гидролиговгкные 3-1,'2-глхзкгнагок щелочераствсримые пс— лисахарнгы клеточных, ст-энок '-/...ЗаШаэ (.50 ыкг/рзстэние/;

5. з-1,о-глэсканаза 7.с5ап11ае (30 млг/ши;

Как видно из представленных ка.тй! хрематеграмм (рис. 5) обработка растений хлопчатника полисахаридами грибов патогенов приводит к активации фекилглазинаммоний лиазяей системы, о чем можно судить по содержанию коричных кислот на фронте хроматог-рпмм. Наибольшей индуцирующей активностью обладает Фракция 2. Остальные Фракции по их индударушей спсссскости можно- расположить в следующем порядке яс мере убывания их злисятсркых

-/Г-

свойств: Фракция 4 > -фракция 3 > -Зракция 1. Обработка растении Фракцией 5 оказывается токсично« длл растения и не приводит к синтезу защитных соединении, вызывая, вероятно, супрессор-нкй эффект на зздйтяуаз систему растения.

пшш

^ ^ - J® —

О О иООО

X i

3 J/

i г -J * ¿-.

Рис. б. Тонкослойная хрсиатогргфия хлороформных экстрактов стевлбй

хлопчатника при введении препаратов, полученных из гриСоа .:.' V.dahliae и Phytcphthcra sp. - I - В-ок:и-7-ивтошисугирин (скополетиа) '

1} корневые кисшты'

чй ... ' .

■ Дальнейшие исследования по изучении характера воздействия, полученных злиситорньс-: фракций на механизмы растительного иммунитета проводилось наш с использоващшм в ячестве теста уровень активности растительной в-1,3-гдюканагы,; которая является одним из гадатных белков,- образующихся в растительны:-: - тканях в ответ на ингагтаэ патогена. -".'■■•' _

.' Для исследования нами были отобраны 4 фракции:

1.'полисахариды F.oxysporum (0,5 иг/' растение);'.

2. одигоса<ариды"F.охуярогш (0,2 иг/ растение);

3. полисахариды V.dahliae (О,Б ыг/растение); .

'-4. 8-1,3-глскакааннй пщролизат 'полисахаридов V.dahliae (0,1 мг/растениэ}. .-■'.

, Спустя '24 часа после введения элисятора начи был измерен уровень активности а -1,2- глЕкакагы в различных органа:-:, растения. Как видно иг представленной диаграммы (рис. 7). после введения препаратов алиситоров,' имеет место локальная (в семядольных листьях) и системная индукция 8-1,2-глЕкзназаг отмечаемая во вое:-: органах растении.

Коршз Стебель Сеюдопв Листм

121 Нвяшж рмггегж ЕЗ Овр-яяэ фрысхисй 1 Е5§3 О^-я» »¡цщцюа 2 ШЗ Овр-оа» фрспщнт* 3 □ О^но» Ърахпзвй. 4

Рве.-7. Локальная в системная .кндукцхя в-1.2-ГЕвкаЕавы".

в тканях хлопчатника ; •.. . - "

Сравнение злзюятиркой активности полйсахарлдякх соединений двух 'патогенов хлопчатника - У.с!аЬПае и Р-охуирогот, вызываниях сходные симптомы поражения, растения, дает основание считать, что в большинстве случаев алиситоры У.йаШае намного аффективнее по их способности индуцировать .зззлтЕые реакции по ерззкенив с аналогичным препаратам иг Т. охулрогшт..

:. Сравнивая активность алиситоров, полученных-нами в ^результате степенчатой экстракции клеточных стенок гриба Р.охув-рогш, : следует отметить, что после щелочной экстракции элиси-торная активность оказывается не пояностьо извлеченной, пос-■•л^ку полученные во второй ступени : экстракции .полисахариды клеточных стенок V. схузрогит такае обладают злиенторной активностью. - • . рассыатривая локальное - ' увеличение./ ..уровня --■ активности Е-1,г-глЕканазы (в семядольных листьях), огёдует такхе подчеркнуть, что наибольшая ./иЕДуцирушэя способность присуща фракции 4 (в-1,3-глсканазЕый гидролиза? полисахаридов У.<±аШ-ае>, ■ вызывающей ' значительную агспшащш защитных механизмов в гх-нцентрации 0.1 кг/растение.'- В то же время фракция 3, -представляющая нативше полисахариды У.йаЬНаз, вызывает сходную -'.-лпБацрш только в пять раз более- высокой концентрации (0.5-¡дг/растенне).

: -» г- . .

аАШШШЕ

Проведенные экспериментальные исследования поьволкли осветить некоторые аспекты характера ззайаоотношеккй патогенного гриба и его растения-хозяйка, и оценить в подобной системе взаимодействия физиологическую активность полисахаридов и олк-госахаркдов клеточных стенок, а также £-1.З-глвканаз трех грк-Оэв-патогеноь хлопчатника У.иаЬПае, .Р.охузроплп и РГг/ЬорЫЬо-га гр. , ;

.Совокупность получекнгсх е -настоящем -исследовании - данных, служит научной основой для успешного решения большого круга задач, прежде всего биотехнологического характера. Этот круг простирается от тепло- или глеточа о-инженерного получения таких штаммов микроскопических грибов-патогенов хлопчатника, . у {вторых сломощью трансгенеза усилена способность к биосинтезу . £-1,3-гдюканазы, поскольку, как показывает зг-сперименталъный материал, воздействие зтого фермгЕтг па Е«деленкые из клеточных стенок грибов полисахариды усиливает о злкскторную актиг-ность. Перспективным представляется также получение штаммов грибов, злиситорные молекулы которых слабо связаны со структурными компонентами клеточкой стенки, что увеличило бы количество -выщелляеыых растительными ферментам: цкдуеторов. Этот процесс, б конечном счете, приведет к значительному увеличению аштеьа -.ьгщитиых соединений, ' в -частности РР-белков •ф-1,3-глаканазы и " хитиназы. йакт увеличения активности е-а.З-глюкачааы при воздействии злиситоров из клеточных стенок 'Грибов Сил продемонстрирован в настоящей работ«.

ВЫВОДУ

1. Отобраны "ЖГсшы с камбодьвэн удельной б-1,3-глшгнаа-иой -активностью г у двух грибов-латогеков хлопчатника - Р.охув-рогиш и ПуЛорЫ-Ьога вр. Установлены оптимальные сраси культл-ьироваия грибов ■ с целью получения препаратов е-1,3-глакаказ. Изучены' некоторые физико-химические характеристики выделенных: нз культуральной - жидкости Р,охузрогиш и Phyt.ophthora.sp. В-1,3-глззканаз.

2. -Исследована динамика секреции полисахаридов в культу-

ральауп среду у грибсз .V.dahiiae и F. '• oxysoorua. Обнаружена прямая корреляция ые.тду увеличением удельной 8-1,3-глюкалазнсй активности з культуральной среде и изменением у резня секреции полисах ар-ид оз. • '

3. Ступенчатой экстракцией, вшазчавщей щелочкой и кислотный гддролиэ, получены полисахариды из клеточных стенок V.dahiiae, F.oxysporira, Phytophthora sd. ЧРелъ-хроматографией на различных носителях установлено распределение выделенных соединении по их молекулярной массе. Показано, что такой 'способ выделен« злиситороз позволяет получить олкгссахариды-

4. При "исследовании индуцирующей способности полученных фракции полисахаридов на растениях хлопчатника установлено, что максимальной элиситорной активность». обладает ферментный гидролизат полисахаридов клеточных стенок Phytophthora sp. Установлена активация защитных реакций растений, .- 2крэлгиааася з активации 3-1,3-глюкаяазы, а также-биосинтеза, соединений фе-шштропаноидного метаболизма» Показано, что воздействие выделенными препаратами грибов вызывает системну» и локальную ин-дукш® ß-1,3-глюканагной активности в тканях хлопчатника

5. Изученные физиологические характеристики грибов-патогенез,- предложенная схема выделения злиситороз, а также-показанный характер индукции защитных реакций в тканях хлопчатника маает слуяить научной основой для разработки бжигвхнеяагичйе-ких способов повышения устойчивости хлопчатника к действия патогенов.

- * ОПУБДЖОЗДННЫЕ ПО 2ИГСЕРТАЕ1И РАБОТА: • .

. 1. Кояиова. Э.З.. Хадмурадов л.Г., ' Саттзровя P.C. ¿5-1,3-глг»каназяая активность в динамика роста патогенез хлопчатника - Verticillium dahlia-a я Fusarium oxyspcrunt. . Доклады -АН РКз,"1994, >1 10, о. 47-49- .

2. КоннозаЗ.З., Хадмурадов А.Г. "Сраэнительиое изучение 3-1,3-глюкаяаз грибов Verticilliisn dafcliae и Fusarium oxuspo-ндтГ. Тезисы дскладоз конференции "Физиология и биохимия мяце---.шальных грибез з связи с проблемами биотехнологии". . Мсскза, 1394,0.77...- ' •

3. Конкоза Э.В., Саттарова P.C.. Хаамуралсв -А. Г» "Coassa-

-тигельное изучение грибов-патогенов хлопчатника'*. Тезисы докладов конференции "Проблемы современной биологии и экологии". Ташкент, 1995, т. 1, с. 52.

4. Коянова Э.В.>:ашурадоа А,Г. "О полисахаридах клеточных стенок гркбоз- патогенов хлопчатника".. Химия природных сое-. динетж, 1995. N 2, с. 1Э8-201. ■ ' - ■ - ■

5. Konnova E.V., Shapovsfcva R;А., Bajanova R.M.Khaimu-radov A.G. "Fhytophthorosls of cotton in Uzbekistan". 6th international Sympasiim on the Microbiology of Aeria Plant Sur- -faces, Bandol, France,.September, 1995, p. 79:

6. Шаповалова P. A.,: Коннова Э.В., Бааанова P.M., Халмура-дов А.Г. "Распространение фитофггороза хлопчатника в Узбекистане: культурально-морфологические. биохимические характеристики возбудителя заболевания". Доклады АН РУз, 1S98, N 1-2, с.. 58-61. .

, - 7. Халыурздов А.Г., Саттарова Р.С., Коннова Э.В.: "Выделение 8-1,3-гдшаназы иа гриба. Verticillium dahliae и некоторые ее свойства'*. Биохимия, 1996, т. 61, вьш.. 4, с. 643-647. ■

Academy ex" Sciences of Republic of Uzbekistan Institute of Microbiology Konnova Ella Vladiairovna

Oa ceil wall polysaccharides of fungi-pathogen and their importannce in.induction. -at' defence reaction in cotton -

Thesis of dissertation presented for receiving- cf Degree. . of Candidate'of- Biological Sciences -

There have been selected F.axvsporura and- Phytophthora sp. strains with high B-l.S-^lucanase activity. Optimal terms of fungies cultivation for obtaining' of g-i,3-glucsnases have been established.. There were studied some physico-chemical properties of glucanases, isolated from F.oxysporum-and fhytoph-thc-ra sp. cultural broth. • '-_...

Strong correlation between &-i,3-giucanase activity-and polysaccharides secretion level was established.

Polysaccharides from V.dahliae, F.oxysporum and phytcph-thora cell walls have been.isolated by extraction after. alkaline aid acid hvdrolisis.

Studies of. polysaccharides effects on ccttcn plants showed that maximum cf inducing activity bel-ones' to ensyme hydrolysa-te of polysaccharides' fran Phytophthora sp. cell »alls.

. -It has • been shown' that induction of defence reactions of cotton plants expressed as 3-1,3-glucanase-activation and si--multaneosis biosynthesis of phenylpropanoids ¡netabolisa ccapo-' unds.

¿'збекиэтон Республиками Факдар Академиясининг

• • Микробиология Института

Коннова Зала Владимировна

Патоген намбрурлар >;ужайра крбигиникг лолисахаридлари ез уларзинг гуза усимлигнкк ^имоя килиш реакциядарини' йЕдукциясидати. ысоуити т£трисида

Биология фандари аоызодлигига таьсия зтилган

• диссертациянинг автореферата •

Руза у-акылягида - кассалзиг. ■ чачирувчи «амбуруггарни 5-1аЗ-глкйанава фер^ентини ургачкп натккасида Р.охуБропгп ьа РЬу1орп1Ьога зр. замбуругдаршш айрим тташлари тандаб олинди. 5-1,3-глккаказа - ферменти препаратлзрини/ажратиб сшиш учун 'заыбругдарни оптимад усткризг ва^и аншранди. Т.охуБрогиш ва РЬу1оргЛпога 5р. кудьтуралари ^стирилган муу,кт зритмадаридан ажратиб олингач 8-1,£-глюканазани баьзи бир физиказий -ьа киме-вий хусускятлари-урганиади.- Замбурумарда 8-1,3-глюканаза фа-оллиги ва ^узсайра полисахаридларк секрецкясининг увгариши ур-■ таспда узаро турри корреляция мвееудлиге ачи^дандк:

У.гЗаШае,/Г-охугрогш) ва РЬуюрМпога зр. замбурутдари Еташларкни ищормй ва кислотали муу,итда гидролиз . нати-

зсаоида з;ужайра ьрбигидан полисахарида^ ажратиб олинди. " Ажра-тиб олингач полисахаридларки гува ускшшгига таьсири, Яьни индукция, р?!лиш хусусиятларинй урганиш шуни курсатдики, РпуигаЬ-ЧЬога.эр. з^ужайра чэбиги подисахарвддарини . фермент. орнали олизган гидродизатларимаксшал здиситор фашяккка эге экакли-ги курсьтилди. с-1,3-глюкакааа фермента фаодлигини. ошиши ор:-;а-. ли, усиылик узинн ыоя 190122 кобилинтинк сшташжги ва фекилп-ропаноид алмашинувида тепшими биосинтегй лгавжудлити анщ-^лга-ди. Замбурутлардан гжратиб одинган препаратлар, гуза' усишшгк ту^ималарида р-1,3-глшакааа фзолдигкни бир' ыеерда индукция чилиши курсаииди'.•

Заказ № 2120. Отпечатано способом ротапринта. СОх84'/1о. Тираж 100. Отпечатано на Ташкентской книжно-журнальной фабрике Государственного комитета Республики Узбекистан по печати. Ташкент, Юнусабад, ул. Мурадоиа, 1