Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ИНДУКТОРЫ ОБРАЗОВАНИЯ ФИТОАЛЕКСИНОВ КАРТОФЕЛЯ, ВЫДЕЛЕННЫЕ ИЗ ВОЗБУДИТЕЛЯ ФИТОФТОРОЗА

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "ИНДУКТОРЫ ОБРАЗОВАНИЯ ФИТОАЛЕКСИНОВ КАРТОФЕЛЯ, ВЫДЕЛЕННЫЕ ИЗ ВОЗБУДИТЕЛЯ ФИТОФТОРОЗА"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ЛЯВШ. ИНСТИТУТ ВШИЫИИ ИМ. А.Н.БАДА

щ>авах рувошкж

варамщзв Ввхіанг Гераонмовет .

ИВДУКТОРЫ ОБРАЗОаШІЯ ВДОАШСШШВ КАРКШДЯ,

выделенные йз воавздагеяя штофгороаа " (03.00.04 » биохимия)

Автореферат -диооерташш на оонсканне ученой степені кандидата (Зиоло пиво ких явус

Моокм» 1960 г.

/

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА. ЛЕНИНА ИНСТИТУТ БИОХИМИИ ИМ. А.Н.БАХА

Наиравах рухошгск

ЕАРАМИДЗВ Вахтавг Герасимович

ИНДУКТОРЫ ОБРАЗОВАНИЯ ФИТОАЛЕКСИНОВ КАРТОФЕЛЯ, ВЫДЕЛЕННЫЕ ИЗ ВОЗБУДИТЕЛЯ ШТОМОРОЭА

(03.00.04 - биохимия)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата бнологических- наук

Москва, 1980 г.

Г..--;-;;'О.. -

^■.^вдкза ш:. К, д. Тщя^згал

I М^МШ-

Работе выполнена в лаборатории иммунитета растений Института биохимии им. А.Н.Баха АН ССОР.

Научные руководители: доктор биологических наук

О.Д.Оаереоковская кандидат биологических наук Д.И.Чалова

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Д.И.Чдаников кандидат биологических наук В.Д.Щербузин

Ведущее учреждение: Главный ботанический сад АН СССР

Защита диссерташи состоится "Ж" 1980 г.

в час, на заседании специализированного совета

(К 002,96.01) в Институте биохимии им. А. Я, Баха АН СССР (Х17071,Ыосква, Ленинский пр., 33, корп.20'.'

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы АН СССР (Москва. Ленинский пр.',33, корп.1).

Автореферат разослан

А/* 1960 г

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

ОНЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Штерн от болезней и вредителей в настоящее время составляют примерно треть уровая мировой сельскохозяйственной продукции. Это предполагает настоятельную необходимость поиска более совершенных методов защиты растений, применительно к требованиям, выдвигаемым современным сельским хозяйством. Одним из новых, наиболее перспективных направлений современной фитоимчунологии является разработка методов защиты растений, основанных на индуцирования их устойчивости-к инфекционный болезням. Это, в свою очередь, диктует необходимость исследования природы индуцированного фитоиммушгаета.

Изучение механизмов индуцированной устойчивости до сих пор тормозилось отсутствием объективных критериев,' на основании ко~ * торах шхво было судить о том, произошло ли индуцирование ела нет. Открытие фитоалехезнов (ФА) - низкомолекулярных антибиотиков высших растении, вооружило исследователей такими тестами (Huiler, Borges, 1940; Crulckshaolc, 1963; Tomiyaoa, 1970; Иетлицкий,■Озеренковокая, 1968, 1973; Ingham, 1972; Кис, 1972, 1978; Sto«sol, 1970; Kaen, Bruegger, 1977; Albenheim, Talent, 1978). Вполне определенная связь, наблюдающаяся медку скоростью накоплений и концентрацией образующихся ФА, с одной стороны, и генетически обусловленной реакцией растение на заражение,с другой, позволила использовать ФА в качестве маркера для исследовании природы индуцированной УСТОЙЧИВОСТИ*

S самое последиее время удалось показать, что у паразитов имеются метаболиты, которые индуцируют образование ФА у растений: (Orulckehank, Parrln, 1968; Aadereon-Proutj1, Alberoheto,I975; Keen, I97S; Br-uegger, Keen, 1979; Ayers et al., 1976; Albarahelc» Talent, I978;stekoll, west, 1978). Такие метаболита подучили название индукторов.

Индуцирование ФА осуществляется на самых первых этапах взаимодействия растения и патогена* Предполагается, - что индукторн являются той антигенной детерминантов паразита, которая распознается раотением-хозяиномt включающим на этой основе сбои ответные защитные реакции, в том числе и ФА - образование.

Исследование природа и механизма действия индукторов только начинается: к настоящему времени выделены и охарактеризованы лишь

несколько таких индукторов. Большинство из них являются высокомолекулярными угдеводсодержащики. соединениями о высокой индуци-рутацей активностью, находящимися на поверхности паразита ели в составе его выделений. Ест-ественно, что без знания природы индукторов не представляется возможным донять молекулярнне механизмы индуцированной устойчивости растений. Исследование метаболитов паразитарных микроорганизмов, выполнявших роль индукторов ФА-образования, тем более перспективно, что заключает в себе практическую возможность индуцировать с та пожнем» свойство устойчивости у восприимчивых форм растений.

Цели и задачи работы.Цедыо работы было исследование метаболитов возбудителя фитофгороза, способных индуцировать образование фитоалексинов у картофеля. Phytophthoxa infeatans (Hont. ) de Вагу вызывает одну аз наиболее опасных болезней картофеля -фитофтороз. К моменту начала исследований сведения об индукторах ФА-образования в составе этого патогена отсутствовали, хотя ФА картофеля бшш уже достаточно охарактеризованы (Toaiyama et al., 1958; МетдищшЙ д др., 1971; Vama et al., 1971; Knteui et al*, I97Z;Coxon et al*, 1974), Соответственно, конкретными задачами работы явилось:

1. Определение наличия и локализации индукторов образования ФА среди метаболитов p.iafestans, ' '

2. Их выделение и химическая характеристика.

3. Исследование специфичности действия индукторов и их защитной роли во взаимоотношениях картофеля и возбудителя фито-фтороза.

Работа выполнялась в период 1976-1978 гг.

Научная новизна работы. Из возбудителя фитофтороза впервые ввделены и охарактеризованы индукторы, визываодие образование ФА у картофеля. В лабораторных экспериментах продемонстрирована возможность с поыощьг одного из них (липогликопротеида) повысить способность картофеля сопротивляться поражению совместимыми расами паразита.

Практическое значение работы. Теоретические положения, развиваемые в диссертации, а татае установленный факт защитного действия ллпогликопротезща, выделенного из возбудителя фитофтороза, получили подтверждение на практике в совместных исследованиях Белорусского НИИ картофелеводства и плодоовощеводетва а Института биохимии им. А.Н.Баха АН СССР. Результаты трехлетних испытаний

показала, что предпосевная обработка клубней картофеля диногли-кояротеидом в концентрации О,0005?! в такой яе степени залишала картофель от возбудителей грибных: заболеваний, как я четырехкратная обработка фунгицидом вдінебом в кокцентрадаи в Ю00 раз большей (0,5$). Дальнейшие исследования в этом направления могут открыть пращщспиально новую возможность защиты растений, основанную на индуцировании их устойчивости но тому образцу, как это происходят в природе.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работа доложены на Всесоюзном совещании по иммунитету растений к паразитарным грибам (Москва, 1377), ІУ Всесоюзном биохимической съезде (Ленинград, 1979), УШ совеаания по проблеме фитонцидов (Киев, 1979), II Республиканской конференции молодых ученых химиков (Тбилиси, 1978), на конкурсе лучшей работы Института биохимии,посвященной 60-годовщнне Октябрьской Революции (Москва, IS77).

публикации. По материалам диссертация опубликовано 6 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (7 глав), материалов и методов, результатов и их обсуждения (4 главы), заключения, выводов и списка литературы. Диссертация изложена на 137 страницах, включая 13 таблиц и 24 рисунка* Список литературы содержит 189 публикаций, в том числе 135 иностранных работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектами исследования служили клубки картофеля сортов в гибридов, обладающих различны:® гекаык фиофгороустойчивости

в1;ц4) и таюке расы t.infaa-tans, различапциёся по вирулентности (Ii 4\ 1,2,3,4).

Для получения зооспор гриб вцрзщгтатід в течение 10 дней на овсяно-агаровой среде, для получения шщелиальной массы — на жидкой картофельной среде (Gaertneur,1359).

Метод ВВДЄЛЄШІЯ индукторов из мяцелдя возбудителя фатофто-роза был разработан наш на основе фракционирования и последующего испктания полученных фракций на кндуцйрующув активность. На рис.1 представлен его окончательный.вариант, а в тексте освещается процесс методического поиска.

Мицелий гриба

Замораживание сухим льдом Разрушение на прессе (50 атм.) Экстракция диет,водой (5—10 раз) Центрифугирование при ЮОЦе Обработка ультразвуком Промывание растворителями Микроскопический контроль

Препарат шч-точнш СТЄІІОК

Зкстракцая іеі КОН Диализ

Экстракт

Рис.1. Схема получения индукторов из клеточных стецок Ц) и внутриклеточного содержимого (Б) шдеяая РлпГ-чИадв.

Критерием индущфуюцей активности служила способность раз-лепных экстрактов а фракций вызывать образование в клубнях картофеля ФА (ришитина и дюбямана) и некротической реакции. Для определения ФА был использован метод "инфекционных лунок" (Озерец-ковская и др., 1975), Количество ФА определяли колориметрически после реакции с концентрированной серной кислотой {ряаитин) в реактивом Эрлюса {.mod шин). Степень некроткзйшш ткани клубней оценивала либо визуально в балдах (по пятибалльной системе), либо на шкроскопе Ш31-6, подсчитывая процент некротизкрованных клеток на поверхности обработанных дисков (Озерещювская и др., 1979).

Для гель-хроматографяи использовали колонка (3x67 ом), заполненные сефадексом в-50 в дистиллированной воде. Пустой объем колонки (Vo ), измеренный по объему элшии голубого декстрана, составлял 76 лиг. Собирали отдельно 65 мл, а затем фракции по . * 3 мл, проводя элювдю дистиллированной водой.

На колонку с анионообменной смолой Даузкс ІхЗ/ОТ^форіа/ (1,5x10 см) наносили 50 мл исследуемого раствора, содержащего 10 мг углеводов а 10 tir белка. Собирали фракцию несвязавшихся веществ при элжцти дистиллированной водой. Эту фракцию ззтем пропускали через колонку о катионообменной смолой Дауэкс 50x8 /іҐмроріла/. Элюцив проводили также дистиллированной подой.

Удаление веществ, связавшихся с анжжообменником, проводили 2 к соляной кислотой и I н калийной щелочью. Полученные экстракты нейтрализовалиt диадизовали и использовала ддя биологических испытаний.

Содержание белка определяли методом Лоури (lowry et al.t I951), содеркаяие углеводов - по реакція о фенол-серной кислотой (Dubois et al.t І956) или антрон-серкой кислотой (ûlecbô,lS62>, О присутствии ляпидов судила качественно по реакции о Суданом черным 3 (pogers et al.» 1*969) в количественно-весовым методом после гидролиза І й соляной кислотой.

Пидролиз полисахаридов осуществляли I и серной кислотой (8 часов при 100°С). Ги-цролиэати нейтрализовали а разделяли на бумаге Ватман I в системе ацетон: вода: бутиловий спирт (7;1:2, об/об)» а затем проявляли кислым ащшшфталатом. Сахарные остатки в активных фракциях окисляли перподатом натрия.

Метилирование глшана проводили со методу Хакомори (йакопюгу, 1964)* Гсдролиз метилированного глокана вели сначала в аа^ муравьиной кислоте (3 часа, 1С0°С), а после удаления последней в вакууме -він серной кислоте, 3 часа при 100®С (Раїоиі ві аі., І983). Смесь Сахаров в гздратазоте переводили в форму ацетатов полиолов (АІЬагаЬеіт «4 аі.,1967).

Для установления типа связей в полисахаридах использовали газозшдкостную хроматографію па приборе "Цвет 4 М", ври температуре І70°С ка стальної колонке 0,3x200 см с 3% ЕСНЗЗ на ОаэсЬхоа <5 . Скорость газа-носителя (% ) 60 мл/шн. Температура детектора 230°С. Ультрафиолетовые спектры сющади ка спектрофотометре Зресогй . Инфракрасные спектры - ка приборе «В -20 в таблетках квг или в хлороформе.

Фракционирование дипвдов осуществляли с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ) ка силуфоле в системах гексан : диэти-довый офир: уксусная кислота (70:30:2) - нейтральные лшщды л хлороформ; метанол: вода (65:25:4) - полярные лиггвда. Вещества обнаруживали лрн проявлении фосфгыолкбдеповой кислотой в спирте а нагревании при І050. Для идентификации отдельных классов ли-шдов использовали проявление о помощью паров вода, нингидрина (на свободную ашцюгрупау), шлибдата аммония +• хлористое олово (на фосфорсодержащие соединения), аншшнфталата или антрона в серной кислоте (на углеводсодержшдао соединения) (Кейтс, 1975). В качестве свидетелей применяла стандартные лдпвды; пальмитиновую и олеиновую кислоты, моностеарин, дистезрин, триглицериды подсолнечного масла. '

Для разделения липидов использовала такне колонки с силзка-гелем і (40/100 мод). Сракщш о колонод последовательно элюи-ровали растворителями по методу Диттмера и Веллса (м^-кю», Теїів, 1369).

Исследовали воздействие липазы и липокенгенаэы на активность ввделейного индуктора. Препарат панкреатической липазы получен из Института биоорганической химии им. М.м.Шемякина АН СССР. Активность ферлента определяли по скорости гидролиза трибути— рина (Ишгйн я др. ,1969). Липоксигенззу получали по методу Назарова и др. (1374). Об активности препарата судили по появлении максимума поглощения при 234 нм, который характеризует образование продуктов окисления ненасыщенных жирных кислот.

Данные микроскопических найщценяй обрабатывали статистически с вероятностью безошибочного прогноза j8 =0,95, В таблицах приведены: среднее арифметическое -Ни абсолютная максимальная погрешность ~й (Епохенский, 1970).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Поиски индукторов защитных реакций картофеля среди метаболитов возбудителя фктофтороза преяде всего предполагали опреде-дегае места юс локализации: содержатся ш они в грибе ада г его выделениях. Полученные наш данные свидетельствовали о том, что подавлявшее количество индуктора локализовано в мицелии или зооспорах гриба, тогда как в составе его выделений содержалось лишь незначительное количество индуцирукщего начала* £ мицелии гриба ФА-шздуциругацая активность присутствовала как внутршие-точно, так и в клеточных стенках, хотя активность последних оказалась в 3-4 раза ниже. В связи с этим предметом нашего последующего исследования служили обе фракции: клеточные стенки мицелия гриба и его внутриклеточное содержимое. Зооспоры гриба из-за их ограниченной массы не могли служить сырьем для получения индукторов.

Индукторы в составе клеточных стенок вс&Зудятеля фитсфгороза

При внедрении возбудителя фггофтороза в клетку картофеле гаустория гриба приходит в непосредственный контакт с плазма-леммой растения. Только после этого момента происходит включение реакции сверхчувствительности в случае несовместимой комбинации хозяина я паразита (Tomiyama et el,, 1967). Исходя иэ этого можно йыло предполагать, что характер взаимоотношений картофеля и возбудителя фитофтороза определяется наличием метаболитов, содержащихся в клеточных стенках паразита, которые распознаются хозяином и служат индукторами для включения ФА - образования.

Для извлечения иядуцирущего начала из клеточных стенок гриба был испробован ряд экстрагентов (на 100 мг сухого препарата стенок - 10 мл экстрагеята). Каядую партию стенок после экстрагирования ресуспендировалл в 10 мл воды. Различные экстракты, равно как и соответствующие щ* суспензии уже проэястра—

гированных клеточных стенок испытывали на способность вызывать образование рашитсна и некроза у клубней картофеля (табл.!).

Таблица I.

Способность экстрактов з'соответствущах им суспензий клеточных стенок г.infestons (раса 4) вызывать образование рищитина и некроза у клубней картофеля сорта Пркекульский ранний (г )

Экстракты

Вариант

Содержание, мкг/ш

! Î.

! б<шса \ jgg-

!рнши- !

, некроз, ¡-

Суспензии •] клеточных t

стенок

•"ИН,

I*" IS. |SSP-

Холодная вода 10 20 3 0 75 5

Кипящая вода 90 250 26 2 54 3 1% додецилсуль-

фат натрия 210 160 12 2

ÏH КОН 430 660 79 4 9 I

1н НИ 70 80 II / ; 0

7GJË этиловый спирт 20 50 10 .1 0 46 4

■Вода при 121°С ■ '

(автоклаварование) 320 800 84 5 15 0

Наибольшей способностью индуцировать ршаитш и образование некроза обладал щелочной экстракт, а также раствор, полученный после автоклавирования меточнкх стенок в воде. Соответствующие им суспензии клеточных степо;; имели лить слабую способность к индукции, свидетельствовавши с том, что большая часть активности ставок переходила в экстракт. Щелочной экстракт содержал только всех полисахаридов клеточных стонск ц 1фимерно 6KS белка.

Вещества,.экстрагированные I и КОИ с меточных стенок гриба, подвергали разделению на колонках о ионообменными смолами. Лол ученные фракции выравнивали по содержанию Сахаров (150 мкг/мл) и испытывали на издуцируаду» активность (табл.2).

Оказалось, что наибольшей иидугирущей активность» обладала фракция, которая не связывалась на с анионо-, ни с катионообыен-ншшм. Эта фракция состояла из углеводов, не содержала белка и

после полного кислотного гидролиза обнаруживала присутствие только одной глюкозы.

Таблица 2.

Содержанке белка, углеводов г нндуцируицая активность различных фракций, полученных после разделения щелочного экстракта клеточных стенок шцелия гриба (раса 4) на инонообменных смолах (картофель сорта Приекульский ранний -г )

Вариант

Содержание, мкг

У™*- | белка

Ешпитин, мкг/мд

Дауэко 1x2 (СХ").

Нанесено на колонку Злшровано: водой 2 н НСІ X н КОН

Дауэко 50x8 (Н+>

Нанесено на колонку Элюировано водой

10350

4650 2150 2185

3100 2000

10950

2100 6300 1035

1400 О

47

38 20 4

33 52

Фракция, актированная с колонки соляной кислотой , также обладала способностью индуцировать ришитин, однако, заметно уступала по активности водному элюату. Эта фракция, наряду с углеводами, содержала также значительное количество белка. Углеводы, входящие в состав фракции, были представлены глюкозой и маннозой. В связи с этим данная фракция была названа нами "ман-наносодержащам гликошротеадом".

Мы предположили, что наиболее активная индударуидая фракция клеточных стенок мицелия р.1п£евгаг18 состоит из полимеров глюкозы - глюкаяов. Об этом свидетельствовал также характер и положение полос поглощения ее ИК—спектра (рис,2), свойственных ОН-груапе (широкая полоса при 3400 см~Ъ; С=0 (1670 см"1); С-0, С-С (1080 см"*1); С-Н (1410 см"1) (Наканиси, 1965). Наличие в Ж—спектре слабой полоса поглощения около 900 и отсутствие полосы поглощения около 650 см**1, свидетельствующей о -глгко-

- ю -

эидной связи, давала нам основание полагать, что в исследуемом соединении имеется Р-глюкозядная связь (Щербухии, 1958),

Ряс. 2. Инфракрасный спектр глюканов клеточных стенок, выделенных из мицелия Р.1кГеа1апА (раса 4).

Для установления типа глякозидных связей и определения терминального остатка использовали метод газо-жвдкостиой хроматографии частично метилированных ацетатов полиолов углеводов, полученных после гидролиза глюканов клеточных стенок Для иденти^шкаши была использованы гидроли'заты метилированных дисахарддов с известным тисом глахозидной'связи: мальтоза (1,4), нигероза (1,3), изомальтоза (1,6). /

На гаэо-жвдкостной хроматограмме бил получен интенсивный пик, идентифицированный нами как 2,4,6-три-о-метилглюкоза с ГЦ =»1,345, что хорош согласовалось с латературнывя данными для этого производного (я^ »1,35) (£уоги£й1 ей а1., 1967). Положение этого пика совпадало также с пиком 2,4, б-три-о-метидглшозы иэ гндро— лиэата ннгерозы* Эти данные свидетельствовал» о том, что основным типом связи в исследуемом веществе является 1,3 (рис.3,лик 2).

Присутствие на зроматограмме ягка со временем удерживания ГЦ =1 связано о 2,3,4,6-тетра-о-метилглюкозой, которая возникает из терминальных, нередуцирувдих глвкозных единиц полисахарида (пик I). Наличие в гидролязате 2,4~ди-о-мзтллглюкозы с н^ =4,9 предполагало существование связи 1,6 (пик 3) в разветвлении.

Rte. 3. Газо-жиддостная хроматоірамма гидродязатов

метилированных глюканов клеточных стенок мицелия p.infestons (раса 4).

1 - 2,3,4,6-тетра-о-метилглюкоза;

2 - 2,4,6-три-о-метилгдшоза;

3 — 2,4-ди-о-метнлглюкоза (в форме ацетатов солиодов;

Таким образом, согласно нашим определениям,индукторы, находящиеся в клеточных стенках мицелия P.lofestans, представлены двумя группами веществ: 0 -1,3-глшанами, имениями также связи 1,6, и маннансодержашим гликопротеидом.

Внутриклеточные индукторы возбудителя фитофтороэа

Предварительно проведенная работа показала, что внутрикле-точно локализованные индукторы ФА~обра зования наиболее успешно могли быть извлечены при экстракции 7Q$ этиловым спиртом неразрушенного мицелия гриба, способом, предложенным Зангом к Бартяики-Гарсиа для извлечения цитошіазматических глюканов из мицелия Р.оіпвадюті (wacs, Bartnieki-Сакla, Х973), При таком способе экстрагирования в экстракт переходило до acefl внутриклеточной индуцирующей активности, тогда как индукторы, присутствушие в клеточных стенках,оставались неизвлеченными.

Водный экстракт индуктора после удаления спирта и гельфиль-трации через сефадекс G-50 разделяли на ряд пиков (рис.4), которые были.объединены в три фракции.

Фракция В, не обладавшая нндуцирузсщей активностью, по-видимому, содержала визкомолекулярные углеводы. Бе удавалось отделить при диализе.

Рис. 4. Профиль элшки экстракта внутриклеточного

содержимого мицелия р.1пГвв^в1Ш с сефадекса 6-50 в индукирупцая активность полученных фракций (раса 4, сорт ^Белорусский крахмалистый - ■

V

-Л--- углеводы,

-о— - белок, //',

— ■ 'О 1 ■ - ШВДГКЦИЯ рЕЕЯТИНа

Фракция Б была представлена только углеводами, гидропизат ' которых содержал одну глюкозу. Эта фракция, названная нами "фракцией пдтоплазматических глпканов", обладала лишь слабой якдуцирувщей активности! и, по-видимому, состояла из внутриклеточных глшанов, характерных душ разлгчних видов фатофторовщ: Грабов (гетеяЬЫаеи, ВаггпАоИ-СахШа, 1Э70; ЬагЬШок!-

Оаго1а, 1973).

Наиболее активной оказалась фракция А, элюируеиая в пустом объеме колонки (V ал. — 71 мл): в концентрации 100 мкг/мд сухого -вещества она вызывала образование интенсивного некроза и накопление до 100 мкг/ш ришгпша. Эта фракция после разделения ва сефарозе съ 2В» алюировалаоь одним пиком в пустом объеме колонки. В составе этой фракции было найдеио 56-59£ липвдов, 35% углеводов и 55 белка, в связи с чем она была названа нами лшюгликопротеи—

- ІЗ -

дои - ЛТП, Фракция составляла от веса сухого мицелия.

ИК-спектр ЛТП (рис.5) также сввдетельстаовад о наличии в его составе лшшдного, белкового и углеводного компонентов. Их присутствие подтверждали полосы поглощения, характерные для днпидов: 2940, 2860 см"1 (С-Н); Х470 см"1 Л (С=0)С00й /; 1240 см"1 / т(С-0)С00н /; белка: 1650 см"1 (амид I); 1540 см"1 (амид II); углеводов: 3400 см"1 (ОН); 1080 см-1 (С-0, С-С) (Заславский и др., 1376).

Ряс. 5. Инфракрасный спектр <Ш1, выделенного из мицелия р.ииввіеш» (расы 4).

Углеводы, входящие в состав ДТП, представлены глюкозой и маннозой, наличие которых было показано хроматографически после общего кислотного гидролиза.

Для того, чтобы определит^аная часть индуктора ответственна за активность, фракция ДГЯ была подвергнута различным химическим обработкам.

Обработка ДТП цериодатом натрия не оказывала существенного влияния на индуцируицую активность. Известно, что периодатное окисление затрагивает еС-диольные группировки углеводов, в результате чего происходит разрушение полисахарндной части молекулы. Поэтому полученные данные позволяют предполагать, что углеводная часть ДТП не является ответственной за его индуцирующую активность.

Особое внимание обращали на исследование липидного компонента ЛЩ, составляющего большую часть индуктора (схема фракцконирова-

V

ния представлена на рис.6).

Рас. 6. Схема фракционирования ЛТП (цифра обозначена шшитлн-йндуцдрувдая активность отдельных фракций).

Экстрагирование ЛТП дпэтиловим старом или хлороформом удаляло примерно 105 содержащихся в нем липидов. Экстракт не обладал Ездущрувдеа активность», а оставзаяся после экстракций часть активности не теряла.

Гидролиз остатка I к НСІ приводил я сильному ослаблению ришятининдуцирущей активности. При этом активностью обладал лишь лападнаа компонент (£1 мкг/ш рвдятина), тогда как водорастворимая часть, содержащая углеводы и белок, оказалась неактивной. Полученные данные свидетельствовали о том, что индуцирующая активность ЛШ связала с наличием липядов.

С помощью хроматограф в тонком слое езлуфола в составе лжпидов ЛШ бали обнаружены как нейтральные, так и полярные лнпядн (рис.7).

Нейтральнее мшш представлены тркглицзрядами (е^ =0,54), жирными кислотами ( Вг=0,33), диглгцерцдамк ( % =0,13)* Среди полярных липидов с помощью специфических проявителей было установлено наличие , фосфосодержацих (й^ ~ 0,45 и 0,30) ,аинпщрин-

положительных (Rf аО; 0,05; 0,18) и углеводсодернащгос ( RjcO.30) соединений.

0,90

0,45 0,30

0,18

0,05 О

*f

0,54 0,33

0,13 О

Рис. 7. Схема тонкослойных хроматоіраммі лшвдов ДТП.

1 - полярные лишиш;

2 — нейтральные лишщы.

Нейтральные в полярные лкпиды были разделены на колонках о сияикагелем. Оказалось, что некоторой способностью индуцировать образование ришитина обладали только полярные лиютды (см. рис.6).

Эти данные позволяют полагать, что швдуцярухцая активность ЛГИ скорее связана с наличием полярных, а не нейтральных липидов. Об этом ate косвенно свидетельствовал тот факт, что обработка ЛШ липазой и лшюксигеназой, т.е. ферментами, затрагивающими нейтральные липидн-триглицервды и ненасыщенные вирные кислоты, не влияла на ФА-индуцируншу» активность.

Предпринятая вами попытка элюировать с сялгосагелевых пластинок и испытать на индуцирухщую активность отдельные вещества, входящие во фракцию полярных липидов, показала, что ни одно из испытанных соединений ршпитш-индуцирушей способностью не обладало.

Таким образом, наибольшая пндушрушая активность ЛШ проявлялась только в комплексе дипвдов, углеводов (и белка?), в.кото—

ром активным компонентой, по-ездимоод, являйся лидвдный фрагмент (скорее всего полярные лшщдн). Цредпринятые нагла попытки фракционировать лишдный компонент неизбежно сопровождались резким уменьшением ФА-ивдуцирушей активности. Участие липядного компонента в качестве активного начала ЛТП представляет значительный интерес, так как активная роль липидов в составе индукторов ФА-образовакия ранее никем показана не была.

Биологическая активность и спєце+ершость действия . индукторов

Нами была исследована зависимость ищцтирутацей активности от концентрагош для ДТП, гликанов клеточных стенок и цитоаяазка-тических глшанов (рис.8).

Рис.8, Инлукадя ргвитина (А) и образование некроза (Б)

в клубнях кгртофелл сорта Белорусский крахмалистый t R-|) индукторами, выделенными из мицелия P*infeatans (раса 4). i - ЛОТ; 2 - цитсшсазматичсские глюканы; 3 - глхжаны клеточных стенок.

Оказалось, что по мере повдаенпя концентрации (до 50-100 миг/мл) 4еЬсобнос>& к ладукцди'ФА и некроза возрастала, а затем, достигнув своего максимума, более не изменялась. Предполагается, что по

мере возрастания концентрации индуктора происходит насшешге неких рецепторных участков растительных клеток, контролирующих ФА-образованив, в сяду чего избыток индуктора не молет вызвать дополнительного синтеза М, но а не подавляет этот процесс (Метлицкий, Озерецковская, 1978; Peters et al., 1978; Marcan et «a., IS79; Терехова и др., IS8G).

Следует отметить, что ришиткн-лндушфувдая активность ЛТП оказалась в 3-5 раз выше, чем соответствующая активность глюкапов клеточных стенок, а последняя больше, чем у цптопдазнат-пескгл глшанов. В таком же соответствии располагались а кривые способности индукторов вызывать образование некроза растительной ткани, что указывало на коррелйцшо ивдукцпи некротической реакции и ФА-образования у исследованных веществ. Данные, приведенные на рисунке 8, показывают также, что только ЛГП бил способен индуцировать у картофеля дозы ришитина, фунгицидные душ возбудителя фитофтороэа (100 мкг/мж), тогда как оба глюдана, даже в оптимальных для ивдукции концентрациях, не могли вызывать таких количеств ФА.

Интересно отметать, что различные индукторы ицдуцировали в одних и тех же тканях картофеля разное соотношение ришитша и любиьшна. Тая, ЛГП штудировал примерно в 10 раз больше ришптина, чем дюбимина, а глвкан клеточных стенок в три раза больше. Между тем сама раса возбудителя фитофтороза вызывала примерно равные концентрации ришитина и любимияа (табл.3).

Разное соотношение ФЛ, которые удавалось индуцировать с помощью отдельных индукторов, шесте с тем указывало на различную физиологическую роль, которую выполняет каздкй из них во взаимоотношениях хозяина и паразита. Об этом же свидетельствовало проведенное нами исследование влияния выделенных нами индукторов на проницаемость мембран клубней картофеля (табл.4).

Оказалось, что из всех исследованных индукторов мембранной активностью обладал только глюкан, выделенный из плеточных оте1ЮК гриба, тогда как цитоплазмэтические глюканы и даже ДТП не влияли на проницаемость мембрап картофеля. Это бшю показано нам на двух расах гриба - I и 4, одна из которнх совместима с испытуемым сортом картофеля (Белорусский крахмалистый - R-j), а вторая — несовместима. Излученные данные свидетельствовали также о неспе-цифическоы действии ввделекных нами индукторов.

Вопрос о специфичности действия обнаруженных нами аддукторов представляя, с нашей точки зрения, особый интерес. Поскольку дуй

Таблица 3.

Индукция ршштина и любиккна (мкг/ыд дпффузата) с помощью индукторов (в концентрации 100 мкг/мд) и эооопор infestaos .• - (раса 4, 105 зооспор/ад)

«п } Гшнан вяеточ-i- Зооспоры НЫХ стенок ■

Сорт картофеля I-г : ришк— ; 1 тна ! любимая 1- ; риша— ¡ тин jлюбивши "I--'■■"- : риш— { тин !люби-;мин

Темп (Ei > 6S 9 22 9 72 120

Белорусский крахмалистый (ГЦ) 84 17 28 14 94 97

Любимец ( R1 ) 50 5 - - 105 93

Приекульский ранний ( х) 158 8 40 5 22 13

Белорусский ранний ( г) 105 7 47 14 II 14

Огонек ( *) 101 14 20 9 16 21

Таблица 4.

Действие индукторов (в концентрации 100 миг/мл) на проницаемость клеточных мембран клубаей картофеля сорта Белорусский крахмалистый

I — '- — I—- . —— ■■ ■■ íf-- I ..--.I. I— ... I..-

j ¡Сопротивле-i Высвобокдение,ккг/мл

gg | Индуктор i ^ /I-!-

! : (углеводов ! белка

Г

_ Вода (контроль) 760 290 70

I ЛТП 730 343 65

1* Глюканы клеточных стенок 210 760 293

4 ЛТП 8S0 245 St

* Цнтоплазматическле тасканы 750 195 100

1« Глюканы клеточних стенок 200 980 305

взаимоотвоиекий картофеля и возбудителя фятофтороэа характерна дифференцированная реакция сортов, мо^по было полагать, что за включение или невключение защитных реакций у картофеля могут бить

ответственны молекулярные модификаций присутствуя!©« в них лддук-торов (А1ЬегаЬв1т» Лпйегзот-Ргог^у, 1975), Если это так,то индукторы, выделенные из определенных рас ^агофторы, должны вызывать образование фито алексико в и не!фоза у несовместимых с даяныш расами сортов и не вызывать этого у сортов совместимых.

Для изучения этого вопроса была испытана способность индукторов ЛШ и глюканов клеточных стенок, выделенных из-двух рас Р.1лГеа«ап9 (I и 4), вызывать образование ришитана и некроза у сортов и гибридов картофеля, имениях различные гены ^ятофгоро-устойчивости. Данные, приведенные в таблмце 5, свидетельствовали об отсутствии свойства специфичности у обоих индукторов, поскольку они индуцировали образование примерно одинакового количества ФА в некроза, независимо от комбинации сорт картофеля - раса гриба. Обнаруженные различия скорее определялись сортовыми особенностями, а не отражали специфику взаимоотношений данною сорта с расой паразита.

Неспецифичность индуцирования защитных реакций картофеля с поыощьв ЛГЛ и глюканов клеточных стенок мицелия г.1пГез1апз,

Таблица 3.

100 мкт/мл

I

{Раса,из; {которой)

I

дга

Гдюкан клеточных ; стенок

Сорт

Белорусский крахмалистый

I 69 31,3+4,4 18 9,1+1,2

4 74 39,6+3,6 II 4,5+0,5

I 70 34,2+2,6 21 11,8+1,8

I 39 27,3+3,6 18 8,1+1.4

4 44 22,5+2,7 23 9,2+1,6

I 56 26,3+3,3 II 5,0+1,0

4 58 29,8+3,8 17 8,0+0,8

<И1)

Темп ( Е-)) ГЕбрИД 2245 (К4)

Гибрид 314/68

(Н4) Дриекульский

I 158 52,1+4,8 68 14,1+1,7 4 149 49,8+3,0 60 11,6+1,4

4 105 46,7+3,9 42 8,9+1,2

С помощью индукторов удавалось включить ФА-образование у всех без исключения испытанных сортов картофеля, в том числе и у универсально-восприимчивых сортов (Приекульский ранний, Белорусский ранний). Причем нам неоднократно приходилось наблюдать, что рецессивные по R -генам сорта картофеля образовывали под действием индукторов гораздо больше ФА, чем сорта с генами фито-фтороустойчивоста. Причины этого попа еще остаются неясными.

Сходство препаратов 1ГП, а также глдканоэ клеточных стенок, выделенных из различных рас фитофторы ipaca: I; 4; 1,2,3,4), подтверждено нами и на примере идентичности их инфракрасных и ультрафиолетовых спектров поглощения.

Таким образом, с помощью индукторов, выделенных из различных рас граба, удавалось индуцировать образование QK у любого (из , числа исследованных) сорта картофеля, ііікнно поэтому ранее в тексте, таблицах ж рисунках указывались различные расы гриба, аз которых выделяли индукторы, и различные сорта картофеля, на которых проводили биолошческие испытанЕя. Выбор сорта и расы в данном случае принципиального значения не имел.

ФА-о бра зова на е а появление неіероза, как известно, являются главными характерными особекнаст/азі з штатной .реакции сверхчувствительности, лежащей в основе устойчивости картофеля к возбудителю фитофтороза. Поэтощу можно бшіо сшщать, что выделенные наш индукторы образования ФА и неіфоза лвхшгек' и индукторами защитных реакций картофеля. С целью проверить,так¡ли это, диски клубней картофеля обрабатывали ДТП в концентрации 10 мкг/мя, а затем заражали совместимой расой гриба (табл.6).

Подученные данные позволяв заключить, что предварительная обработка индуктором ослабляла развитие совместимой расы гриба. Это выражалось в уменьшении числа пораженных клеток а глубины проникновения гриба, а также подавлении споронсиения на поверхности диска, С увеличением интервала медку обработкой индуктором и последующим Енфвдгровэннем защитное действие препарата возрастало.

При действии ЛТП в концентрации 10 мкг/мд иэдущровалиоь лхоь следа ришитияа (2-6 мкг/ыл), однако в ответ на поеледущее заражение совместимой расой грнба его количество оказывалось значительно большим (21—24 мкг/мл), чем это било без предварительной обработки. По-видимому, обработанные растения проявляли большую устойчивость к заражению не потому, что в их тканях уже

Таблица 6.

Ослабление развития фитофтороза после.обработки клубней ЛГИ в концентрации 10 мкг/мл (сорт Белорусский крахмалистый -

раса I)

Время ] Обработка клуб- І^шіа (Сьщв ¡р^.

мезду .1__'поврегден- ! ¡конидий! тин,

т1~гт~: !нах гток' і Iе

| 1 І д І І ^ток I хю ;

Вода Зооспоры ЗХ,8+2,8 21,5+1,8 1,62 2

0 ЛГП Вода - - - 6

ЛГП Зооспоры 25,2+1,8 13,1+1,1 0,85 21

• Вода Зооспоры ЮО+О 23,4+2,3 3,7 6

5 ЛГП Вода - 2

ЛГП Зооспоры 31,5+2,8 11,3+0,9 0,16 24

содержались М, а потому, что они приобретали способность активнее сопротивляться инфекции, В обработанных тканях индуцировались не сада ФА, а скорее потенция к их образованию»

Защитное действие ЛГП не являлось результатом его влияния на гриб, поскольку проведенные нами исследования показали, что препарат ЛГП даже в концентрации 200 мкг/мл ке подавлял развития Р.іоГеяі&гш.

Применение высоких концентраций ЛГП, индуцирующих фунгиток-скческие дозы ФА, представляется мапоперспективным {ІЛетлицкий, Оаерецковская, 1978), поскольку содержание фітоалексянов в обработанных тканях монет достичь токсических для человека и животных концентраций, в результате чего растения станут непригодными для пищевых и корковых целей ( Кис, Ситгіег, ?Э76).

Данные наших лабораторных экспериментов нашли подтверждение в испытаниях на опытных делянках защитного действия ЛГП, проведенных в совместных исследованиях Белорусского НИИ картофелеводства и плодоовощеводства {Н.А.Дорожкин и В.Г.Иванюк) и Института биохимии им.А.Н.Баха АН СССР. Клубни трех сортов картофеля обрабатывали перед лосадкой выделенным нами препаратом ЛГП в концентрации 0,001, 0,0005 в 0,0001%ї. В контрольных опытах картофель четырехкратно обрабатывали фунгицидом цинебом (0,5£) по схеме,

которая рекомендуется в настоящее время для защиты от возбуди-. теля фвто^гороза.

Результаты трехлетних испытаний доказали, что эффективность однократной обработки картофеля препаратом ЛГИ в концентрации О,0005% не уступала по своему зайдеткому действию четырехкратной обработке цииебом, концентрация которого была в 1000 раз больше (Метлицкий и др., 1578). Обработанные растения не накапливали в своих тканях ФА, но обнаруживали повышенную способность сопротивляться инфекции. Особенно важно отметить, что о помощью ЛГИ удалось повысить устойчивость не только к возбудителю фигофтороза, но и комплексу других болезней карто&еля: ранней сухой пятнистости, рвэоктовдозу и парше обыкновенной. Принципиальное отличие ЛЩ от фунгицидов состоит в том, что его действие направлено не на ингибирование паразита, а на индуцирование механизма устойчивости ш тому образцу, как это происходит в природе,

ВЫВОДЫ

1. В мицелии возбудителя фггофтороза обнаружено несколько"

индукторов ФА - образования у картофеля, различавшихся по своей природе и икдушруюцеХ активности, Два индуктора - 1,3~глю-каны и маннансодержаада гликопротеид - находішгсь в клеточных стенках мицелия гриба, а два - лшогликопротевд и цдтоплазмати-чемше глюканы - локализованы шутриклеточно.

2. Во степени индуцирующей активности обнаруженные индукторе распределялись следующим образом: липогликопротеид ^глюканов клеточных стенок цитоплазматических глккаксв маннансодериа-хего гликопротеида.

3. В состав лшогликопротеида входало около 60Й липидов,

углеводов я 5Й белка. Для проявления индуцирущей активности

липогликопротеида необходим комплекс ляпидоа с углеводама, в котором за активность, по-Е:іди:>іому, ответственен лщщдный компонент (скорее всего полярные литид).

4. Количество фатоалекскнов, образовавшихся код действием индукторов, коррелировало с интенсивностью некротической реакции.

5. Липогликопротеид к гдюкаїш клеточних стенок не обладали свойством специфичности; будучи выделенными из различных рас возбудителя фитофтороза, они индуцировали фітоалексинообразование у всех испытанных сортов картофеля, в том часле а у универсально-восприимчивых.

6. Обработка клубней дипогликопротеидом в малых концентрациях повышала способность картофеля сопротивляться совместимый расам возбудителя фитофтороза. Предполагается, что в результате обработки штенси<£шшруется потенция картофеля к фитоалексинообрззова нию в момент контакта с инфекшей. Защитное действие липоглн-копротеида в отличие от фунгицидов направлено не на шгибярование паразита, а на индуцирование в растениях механизмов устойчивости.

Список работ; опубликованных по материалам диссертации:

1. Чалова Л.И., Оэерецковская О.Л., Курганова Л.А., Барамидзе В.Г.,

Проценко М.А., Дьяков Ю.Т., Метлицкий Л.В. Метаболиты фито-патогенных грибов-индукторы защитных реакций растений (на примере взаимоотношений картофеля и phytophthora infestons). Доклады АН СССР. 1976, Т.230, J6 3, с. 722-725.

2. Чалова Л.И., Барамидзе В.Г., Юрганова Л.А., Дьяков Ю.Т.,

Озерецковская 0.Л., МетлицкЕЙ Л.В. Изолирование и характеристика индуктора защитных реакций картофеля из цитоплазматического содержимого возбудителя фитофтороза. Доклады АН СССР, 1977, т.235, № 5, С. 1215-1218.

3. Метлицкий Л.В., Озерецковская О.Л., Дорожкин Н.А., Ивашок В.Г.,

Чалова Л.И., Юрганова Л.А., Барамидзе В.Г. Индуцирование устойчивости картофеля к паразитарным грибам. Прикладная биохимия и микробиология, 1978, т.14, Л 2, с. 262-270.

4. Барамидзе В.Г.. Биохимические механизмы устойчивости картофеля

к паразитарным грибам. Материала II Грузинской республиканской конференции молодых химиков, Тбилиси, 1978, с. 124-127.

5. Чалова Я.И., Юрганова Л.А., Баращщзе В.Г., Метлицкий Л.В.

Лишдсодержашй комплекс из гриба îfaytopbtbora infeatana (Vont.) d* Вагу как индуктор защитных реакций у картофеля. Тезисы доклада на 17 Всесоюзном Биохимическом съезде. Ленинград, 1979, с. 266-267.

6. Чалова Л.И., Барамидзе В.Г., Юрганова Л.А. Индуцирование

фитоалексинов картофеля. Тезисы доклада на УШ совещании по проблеме фитонцидов. Киев, 1979, с. 14-15.

Т-СЙ403,подп.в печ.21/П-80г.

Зак.Й 1й1,тяр.150.0РТП Мосгияротрааса