Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Внеклеточные ксиланазы гриба ASPERGILLUS JAP0NICUS: очистка, свойства, специфичность

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Внеклеточные ксиланазы гриба ASPERGILLUS JAP0NICUS: очистка, свойства, специфичность"

„ I \ Ji

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА., ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. М.В.ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи УДК 577.152.32

КАН ДОН УК

ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ КСИЛАНАЗЫ ГРИБА ASPERGILLUS JAPONICUS : ОЧИСТКА,СВОЙСТВА,СПЕЦИФИЧНОСТЬ

(специальность - 03.00.04 - биохимия)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва. 1990

Работа выполнена на кафедре молекулярн^ биологии биологическо факультета МГУ

Научные руководители: чл.-корр. АН СССР Кулаев И.С.

кандидат биологических наук Белецкая О

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Родионова Н.А

доктор биологических наук Безбородова С

Ведущее учреждение: Кафедра химической энзимологии химического факультета МГУ.

Зашита состоится " 28 " мая 1990 года в час.

на заседании специализированного совета Д 053.05.32 на биологическом факультете МГУ в аудитории Ж.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ

Автореферат разослан " 28 " апреля 1990 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биол. наук

Е.В.Петшкова

г , .^^цгьноптт. проблема. Интерес исследователей к полифермен-

системам, катализирующим гидролиз растительных полисахари-ЦИЦМ^оловлен, в основном, двумя причинами:

- общебиологической задачей понимания функционирования сложных саморегулируемнх энзимагических систем,

- возможностью и целесообразностью использования ферментов дол получения различных биологически активных веществ из природ-

юго растительного сырья.

3 отличие от целлюлолитических полиферментные системы, катализирующие гидролиз гемицеляюлозы, в частности, ксиланов, изучены в меньшей степени. Относительно полная информация о качественном составе полиферментных систем, свойствах и функциональной значимости их индивидуальных компонентов представлена в литературе для ограниченного числа микробных продуцентов. Имеющиеся в литературе сведения недостаточны для обобщающих выводов о дагкробннх ксиланолитических полиферментных системах.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было изучение состава, свойств и функциональной значимости индивидуальных компонентов нсиланолитической полиферментной системы гриба А. дарош-сиа.

В основные задачи работы входили:

- исследование изменения активности и спектра ксиланаз в процессе роста гриба А.;|ароп1сиз.

- выделение, изучение физико-химических и каталитических свойств ксиланаз А.

Научная новизна. Впервые изучена внеклеточная ксиланолити-ческая полнферментная система гриба А.зароп±сиа . Разработаны эффективные схемы очистки всех четырех компонентов ксиланолити-ческой. системы. Показано, что в процессе роста продуцента в среду секретирунтся экзоксиланаза 1а с р1 4.? и молекулярной массой 34 кДа, эндоксиланаза 16 с р1 4.4 и молекулярной массой 87 кДа, эндо-экзоксшсаназа 1в с р1 4.1 и молекулярной массой 33 кДа и эндо-экзоксиланаза 2 с р1 7.2 и молекулярной массой 32 кДа. Все ферменты функционально важны, гак как различаются не только по физико-химическим свойствам, влиянию ионов и ингибиторов,аминокислотному составу, но и специфичности гидролиза субстратов, кинетическим параметрам гидролиза ксажана и способности к гранс-гликозилированию. В процессе роста гриба уменьшается содержание ксиланаз I и накапливается ксиланаза 2. Ксиланаза 16 является преобладающей и ^содержание составляет не менее 50$ от суммарной ксиланазной активности. т

Практическая значимость. Разработанная схема очистки кскл; зы 16 может быть применена для наработки фермента для исследовательских целей или гидролиза ксилана в составе гемицеллюлоз растительного происхождения.

Аптюбадия работы. Работа обсуждена на совместном заседании лаборатории регуляции биохимических процессов и лаборатории физиологии роста микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР и на кафедре молекулярной биологии биологического факультета Московского государственного университета им. Ломоносова.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 тезисов и I статьи в печати.

Структура и: объем диссертации. Диссергадия состоит из введения, обзора литературы ( 2 главы), методов исследования, результатов и их обсуждения (3 главы), заключения и выводов. Работа излажена на не страницах учитываемого машинописного текста, содержит ю таблиц и 29 рисунков. Библиография включает 230 наименования, из них 163 работ иностранных авторов.

ОБЪЕКТ ИССЛЕДОВАНИЯ. МЕТОДУ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В работе использовали гриб Aspergillus japonicus , любезно предоставленных сотрудниками лаборатории физиологии роста мш роорганизмов ИБФМ АН СССР. Культивирование продуцента проводили при температуре 30°С в течение 7 дней на среде следующего состава ( в % ): свекловичный жом - 2,0, солодковые ростки - 1,0, пш< ничные отруби - 0,5, К^РОд - 0,2, ВД03 - 0,4, (ВД4)2 s04 - 0.' и MgS04 . VHgO - 0,03. Для определения активности ферментов по редуцирующим сахарам по отношении к ксилану и другим полисахаридам реакционную смесь инкубировали в течение 10 минут при 50°С и рН 4.9. Определяли образовавшиеся постанавливающие сахара по методу Шомодьи-Нельсона ( Somogyi 1952; к ison 1944). За единицу активности ксиланазы принимали количество фермента, катализирующее гидролиз I мкм гликозидных связей ксилана за I мин. Для определения ингабиругацего действия моно- и дисахаридов на активность ферментов использовали 15,0 и 3,75шмксилозы, араби-нозы, глюкозы, маннозы, фруктозы, сахарозы и целлобиоэы. Константы ингибирования ксилозой для ферментов определяли по отношению к ксилану. Использовали растворы ксилозы с концентрациями 0,235, 0,47, 0,94, 1,875, 3,75 и 5,0 мМ/мл. Для обнаружения реакции трансгликозшщрования реакционную смесь инкубировали в течение 26 часов при 40°С . Реакцию останавливали нагреванием цро< при 100°с в течение 15 минут. 2

Для анализа продуктов гидролиза ксилана под действием ксиланаз ферменты инкубировали с 0,5%-тм раствором субстрата в течение 2 ч. при 50°С. Анализ продуктов гидролиза и трансгликозилиро-вания проводили методом восходящей хроматографии на бумаге. Очистку ксиланазы 16 проводили по схеме, включающей гельфильт-рацию на сефадексе а-75 и хроматографию на HEAE- Toyopearl 650 М. Очистку ксиланаз 1а, Гв и 2 проводили по схеме, включающей гельфильтрацшэ на сефадексе о-25 и хроматофокусирование FBE-94 по методу Остермана ( 0стерман,1985). Концентрацию белка в растворах определяли спектрофотометрически при Aggg. Для определения изоэлектрических точек ксиланаз проводили изоэлектро-|юкусирование в 7^-ном полиакриламидном голе с амфолином рН 3,5/10 и рН 3/6 или формалитом рН 2,5/5 по методическому руко-зодству фирмы ( Sweden , 1982 ). Молекулярную массу ксиланаз определяли двумя методами: диск-электрофорезом в присутствии до-хецилсульфата натрия ( sds ). ( Laemii, 1970) и гельфильтрацией la. сфероне 100. Для определения оптимальных условий гидролиза, i такке влияния ионов металлов и реагентов, активность ферментов определяли при различных рН, температуре или в присутствии зоотвегствуших компонентов. Аминокислотный состав ферментов определяли после 84-часового и 48-часового гидролиза 6N HCI при !Ю°С на приборе Amino acid anal.Г339. Количественное определе-ше содержания углеводов в молекулах ферментов осуществляли при гспользовании фенол-сульфатного ( Duboia etal,I956) и антроново-чз методов ( Кос, 1955).

РЕЗУЛЬТАТЫ Ж СЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Спектр внеклеточных ксиланаз, декретируемых грибом Азрег-íiiua .japonicus . Подобно многим другим микроорганизмам,гриб .japonious также секретирует несколько ферментов, обладающих ■.силаназной активностью и отличающихся изоэлектрическими точка-га. Из оэлектрофокусирование предварительно осажденного сульфа-ом амминия препарата белков из фильтрата культуральной жидкос-я в широком интервале рН 3,5/10 показало наличие двух белковых :олос, обладающих ксиланазной активностью, с pi 7.2 и 4.0. При оследутощем изоэлектрофокусировшаш в более узких диапазонах Н - 2,5/5 для ксиланазы I и 6/8 дня ксиланазы 2 - ксиланаза I азделялась на три белка с pi 4,7(a); 4,4.(6); 4,1 (в), а кси-аназа 2 оказалась только одним белком c'pl 7,8. В процессе оста продуцента несколько уменьшается содержание ксиланаз I Га,1б,1в) и накапливается ксиланаза-2. Соотношение между кси-аназами 1а, 16, 1в остается постоянным и составляет 1:4,1:0,44.

3

Таблица I. Изменение спектра ксиланаз в процессе культивирования гриба Aspergillus japonlous

Время Ксиланазная Ксиланазная активность ( изоэлектрофокусирование при рН 3,5-10

культивиро- активность и рН 2,5-5) (% от суммарной активности)

ВЭНИЯ В среде (.% 1-Кгчттгянячя I--ГппФнотатпгя 1 -

от максималь- _лсшганаза 1_ Ксилана- ьоотношение

ной активности) 1а 1<5 1в Ха+кз+Тв за 2 1/2 1б/1а+1в+2

I 2,6 16,2 66,6 7,2 90,0 10,0 9,0 2,0

2 5,2 16,1 66,2 7,2 89,5 10,5 8,5 2,0

3 42,0 16,2 66,6 7,2 90,0 10,0 9,0 2,0

4 72,0 15,1 62,1 6,8 84,0 16,0 5,3 1.6

5 84,0 13,7 56,2 6,1 76,0 24,0 3,2 1,3

6 100,0 13,5 55,5 6,0 75,0 25,0 3,0 1,2

7 76,0 13,7 56,2 6,1 76,0 24,0 3,2 1,3

Среди всех ферментов преобладающей всегда является ксиланаза 16 (табл.1).

Очистка внеклеточных ¿ссиланаз АзрегеШиэ Зароп1оиз . Среда най-деных наш внеклеточных ксиланаз А.аароп±сиэ преобладающим ферментом является ксиланаза 16, активность которой постоянно составляла около 60% суммарной активности в фильтрате культуральной жидкости. В этой связи представлялось целесообразной разработка быстрого и эффективного способа очистки ксиланазы 16. Оптимальный вариант схемы очистки показан на рис.1. Очищенный по данной схеме препарат оказался гомогенным при изоэлектрофокусировании в интервале рН 3-6 и электрофорезе в ПААГ. Степень очистки фермента составляла 1410,0, а выход - 156,5% (табл.2). После ионообменной хроматографы! на г>£АЕ- Тоуореаг1 650 М суммарная ксила-назная активность возрастала почти в 2 раза по сравнению с предыдущим этапом, что может быть связанн с удалением в процессе хроматографии ингийирующих ксиланазу примесей.

Таблица 2. Результаты очистки ксиланазы 16 из фильтрата культуральной" жидкости гриба а, ларошсиз.

Стадии очистки

Суммарный белок (мг)

Ксиланаза 16

Суммарная Удельная активность активность

(ед) (ед/мг)

Степень очистки

Выход

Фильтрат

культуральной

жидкости

58634

33369

0,57

100

Осаждение сульфатом аммония

6625

33920

Сефадекс 0-75 1489 ЧЕАЕ- Тоуореаг1 65 650 М

5,10

8,9

26520 17,80- 31,2 59250 804,00 1410,0

100

79,5 156,5

Для полного изучения ксиланолитической системы гриба А.оароп±оид очистку минорных ксиланаз 1а, 1в и 2 проводили по схеме, включающей гельфильтрап^по на сефадексе Сг—25, хроматофокусирование на НЗЕ-94 (пслибуферионообменник) и рехроматофокусирование на РВЕ-94 (рио.2). Результаты очистки представлены в табл.3. В результате очистки были получены все три минорные ксиланазы с общим выходом 8,3$.

Фильтрат кулъгуральнок нздкости

Осаздение белков сульфатом аммония (660 г/л)

I

Гельшильтрация на сешадексе 0-75 (5 х 100 см)

Элюция 0,05 М трис-НС1 буфером, рН 8.0

Хроматография на БЕАЕ- Тоуореаг1 650 М ( 2 х 15 см)

Элюция последовательно 0,035 М и 0,06 М ШС1 в 0,05 М трис-НС1 буфере, рН 8.0

Кснланаза 16

Рис.1. Схема очистки внеклеточной нсиланаза 16 А.дароп1оиа

Фильтрат культуральной жидкости ( 6 суток роста) I

Осаяденпе белков сульфатом аммония (660 г/л)

1

Гельбильтрацня на колонке ( 5 х 50 ) с сефадексом С(-25

Элашхя буфером трис-НС1 Гтэ , рН 8.0 Сгущение через мембрану

Хроматофокусировантна колонке ( 1,5 х 20 ) с РЗЕ-94

Элюция полнбуфером

Рехро^а?о;юкуспрование препарата ( 1а + 16 )

на РВЕ-94

I

. Рехрог.:ато'':';окусирование на РВЕ-94 1а, Хв, 2

КС-1

КС-1в

КС-2

Рис.2. Схема очистки внеклеточных кснланаз 1а,1в и 2

Грибе. А.эаропгсиз

Таблица 3. Результаты очистки внеклеточных ксиланаз 1а,1в, 2 гриба A.Japonious.

Ферменты Суммарный Суммарная Удельная Степень Выход

белок активность активность очистки {%)

(мг) (ед) (ед/мг)

фильтрат куль- 192200,0 туральной жидкости 751107,5 3,9

Осаждение суль- 78375,0 фатом аммония 627000,0 8,0 2,1 100

Гельфильтрация 14390,0 на сефадексе й-25 404331,0 28,1 7,2 64,5

Хромагофокуси-рование на RBE-94 ксиланаза 1а+1б 1190,0 ксиланаза 1в 234,9 ксиланаза 2 2025,0 70767,0 1667,0 55812,0 59,5 7 1 27,2 15,3 1,8 7|0 11,3 0,3 8,9

ИТОГО: 347В,9 128246,0 20,5

¡Сроматофокуси-эование на РВЕ-94 ксиланаза 1а 46,0 ксиланаза 1в 50,8 ксиланаза 2 276,9 1405,5 684,5 50154,0 30,6 13,4 181,1 7,9 3,4 46,4 0,2 0,1 8,0

ИТОГО: 373,7 52244,0 8,3

Ъ ходе очистки активность ферментов существенно снижается, в частости, при хроматофокусировании и рехроматофокусировании на РВЕМ, хотя при этом хорошо разделяются белки, близкие по изоэлектри-1бским точкам. Возможно, что при изоэлектрической точке белки частично осаждаются, что приводит к потерям ферментов. Кроме этого, 5 ходе хроматофокусирования на ЕВЕ-94 -с использованием РВ-74 наб-шдалось образование значительного количества нерастворимого осад-са в растворе ферментного препарата в присутствии полибуфера. Сатзактешстика очищенных внеклеточных ксиланаз гриба АзреггШиа

japonicus'_. Ксиланаза 1а имеет изоэлектрическую точку при

>Н 4,7, ксиланаза 16 - при рН 4,4, ксиланаза 1в - при рН 4,1, а есиланаза 2 - при рН 7,2. Молекулярные массы ксиланаз 1а,1б,1в и Î составляют соответственно 34000Да, 87000Да, ЗЗОООДа и 32000Да :ри определении методом гельфильтрадии через колонку со сфероном :00, 34000Да, 22000Да,ЗЗОООДа и 32000Да при определении методом (лектрофореза в ПААТ в присутствии sds • В отличие от других ферментов, величина молекулярной массы ксиланазн 16 при определении

методом гельфильтрации почти в 4 раза больше, чем при определен методом электрофореза в ПААГ в присутствии йвз . эти данные поз воляюг предполагать, что молекула ксиланазы 16 состоит из четыре субъедониц. Ксиланаза 1а с максимальной скоростью гидролизует 0,5$-ннй ксилан при рН 4,7-4,8 и при 52 - 54°С, ксиланаза 16 -при рН 4,8 - 4,9 и при 54°С, ксиланаза 1в - при рН 4,8 и при 54 55°С и ксиланаза 2 - при рН 4,9 - 5,0 и при 60 - 65°С. Б отличие от остальных ферментов ксиланаза 2 гидролизует субстрат с максим льной скоростью при более высокой температуре, в то же время ее оптимум рН практически идентичен таковому для других ферментов. Стабильность изучаемых ксиланаз может быть охарактеризована следующим образом: I) ксияана 1а является стабильным ферментом в широком диапазоне рН и температур, в тоже время ксиланазы 16 и 2 наиболее лабильны при рН 3,0 и 4,0 в температурах 4° - 50°С; 2)в изучаемые ксиланазы наиболее стабильны при рН 7,0 в интервале те; ператур 4°- 50°С. Ксиланазы 1а и 16 менее, а ксиланазы 1в и 2 бо лее чувствительны к присутствию МаС1 в растворе. В присутствии 0,3 М №С1 ксиланазы 1а и Гб сохраняли активность соответственно на 30$ и 50%, а при концентрации 0,5 М ИаЯ все ксиланазы инак-тивировашгсь соответственно на 25$, 8%, 50^, 79$. Среди четырех ферментов относительно стабильным ферментом к влиянию мочевины о: залась ксиланаза 1а, т.к. до концентрации мочевины 0,25 М ферме» сохранял активность полностью, в то время как ксиланазы 16,1в и : теряли активность соответственно на 30$, 47$ и 20$. Ксиланазы I (1а,16 и.1в) не являются меташюзависимыми ферментами и сохраняю' полностью активность в присутствии ЕДГА,(табл.4). Однако, ксилан за 2 инактивировалась на 19$ в присутствии ЕИНА. Все ксиланазы о( личаются также по влиянию ионов металлов ип-ЖБ, 31)3 и £-МЭ на их активность. Все ксиланазы А„зароп1сиз различаются по & нокислотному составу ( табл.5). Ксиланазы л.^ароп1сиа в своем составе содержат преобладающее содержание остатков кислых аминокислот по сравнению с содержанием остатков основных аминокислот. Ксиланазы 1а и 2 по соотношению остатков кислых аминокислот и ос татков основных аминокислот ( 1,9 - 2,4 ) относятся к широко рас пространенной груше микробных ксиланаз, а ксиланазы 16 и 1в (3, 3,8) - к весьма ограниченной группе из пяти описанных микробных ксиланаз. Интересно, что величины соотношения не коррелируют с и электрическими точками ксиланаз, вероятно,вследствие ашдированш остатков кислых аминокислот.

Таблица 4. Влияние ионов металлов, ЕйГА и некоторых ингибиторов на активность ксиланаз 1а, 16, 1в и 2.

Факторы

Активность ксиланаз {%)

Li+

Ag+

Pe

Со

Mn~

Mg

Zn'

Ca:

Cu'

2+ 2+ "2+

2+ 2+ 2+ 2+ ,2+

Cd' Fe3+ EDTA л-ХМБ 3DS

0-МЭ

при 5 . 10" % при 5 • . ИГ5 М

16 1в 2 16 1в 2

100 85 85 74 100 106,5 107 100

44 52 88 0 67 100 100 98

62 26 26 95 101 99,2 95 100

89 85 85 100 102 102 116 100

4,1 9 15 0 79 97,5 97 100

98 94 106 62 100 roo 100 105

91 63 50 54 103 103 III 94

97 104 82 89 103 105,5 107 100

88 39 35 0 94,7 98,8 105 100

60 26 12 60 97 97,5 100 95

47 3,7 27 89 94 76,3 108 106

100 108 103 81 100 104 105 100

1,7 0 1,7 0 4,0 16,7 2,8 3,3

100 62,5 17^8 0 100 100 85,3 70,5

100 100 8Д 82,9 100 100 93,0 100

По содержанию остатков различных аминокислот ксиланазы a.japonicus практически не отличаются от описанных микробных ксиланаз. Только в аминокислотном составе ксиланазы 2 обнаружено некоторое превышение по сравнению с литературными данными содержания адалина и валина, а в ксиланазе 1а - гистидана. Интересно, что ксиланаза 2 отличается от других ксиланаз a.japonicus в 2 раза меньшим содержанием остатков тирозина и фенилаланина. Молекулы всех ксиланаз A.japonicue содержат в своем составе небольшой углеводный фрагмент. Наиболее обогащена углеводом ксилатаза 16, молекулярная масса углеводного фрагмента которой составляет 6525Да. Ксиланазы гриба а.japonicua различаются по специфичности действия на различные субстраты (табл.6). Активность ксиланазы 1а по отношению кнзилану из овса фирмы " Serva " не менее, чем в 3 раза превышает активность на остальных субстратах. Среди: всех субстратов фермент преимущественно гидролизует ксиланы и их производные, хотя среди nix слабо расщепляет' ксилан лиственницы и не действует на 4- N-глюкуроноксилан. В то же время ксиланаза 1а в значительной степени катализирует гидролиз КМЦ. Ксиланаза 16 предпочтительно гидролизует ксилан овса фирмы ''Serva " со скоростью не менче, чем в 3 раза

Таблица 5. Аминокислотный состав ксиланаз a.¡japónicas

Аминокислоты 1а 16 1в 2 Микробные ферменты, моль %

ост./моль моль % ост./моль моль % ост./моль моль % ост./моль моль %

Aap 41 13,1 88 11,0 35 11,4 22 7,4 7,2-13,7

Thr 29 9,2 100 12,6 29 9,5 45 15,1 4,3-15,99

Ser 37 II,8 88 11,0 32 10,5 36 12,1 4,4-17,3

Glu 23 7,2 52 6,5 29 9,5 23 7,7 4,5-12,8

Pro 14 4,5 40 5,0 12 3,9 13 4,4 1,5-9,85

Gl y 31 9,9 112 14,1 33 10,8 22 7,4 7,7-28,2

Ala 24 7,6 48 6,0 29 9,5 43 14,4 2,8-11,2

1/2 Cys Н,0 Н,0 8 1,0 5 1,6 5 1,7 н,о

Val 16 5,1 64 8,0 20 6,5 28 9,4 3,0-8,1

Met 5 1,6 8 1,0 6 2,0 6 2,0 0-2,2

Ile 10 3,2 32 4,0 12 3,9 II 3,7 2,1-5,3

Leu 22 7,0 32 4,0 16 5,2 12 4,0 2,8-8,7

Туг 14 4,5 56 7,0 19 6,2 10 3,4 1,7-9,2

Phe 14 4,5 24 3,0 II 3,6 5 1,7 1,7-4,9

Lys 14 4,5 20 2,5 8 2,6 9 3,0 1,7-7,4

His 14 4,5 12 1,5 5 1,6 5 1,7 1,0-3,8

Arg 6 1,8 12 1,5 5 1,6 3 1,7 0,6-5,8

Киел.а.к./ 1,9 3,2 3, 8 2, ,4 1,2-5,8

Осн.а.к. 2,7-4,2

Туг+РЬе 9 10 9,8 5,1 3,4-13,2

Содержание углевода,% 1,82 7,5 2, 9 6, ,2

Молекулярная масса белковой части.Да 33498 82932 31018 29479

Молекулярная масса углеводного фрагмента, Да 618 6525 957 1984

Молекулярная масса фермента, Да 34II6 89098 31975 31463

хаолица ь. иуостратная специфичность ксиланаз гриоа Aspergiiiua laponicus

№ Субстраты Фирма Активность ксиланаз,%

la 16 Ib 2

I Ксилан овса т, контроль В Ксилан овса Serva IDO 100 100 100

2 Sigma 21 20,5 119,5 51,8

0 Ксилан бука Serva 44 17,4 13,3 63,3

4 Ксилан лиственницы Sigma 8 29,8 23,9 11,2

5 Гемицеллюлоза Биолар 33,5 17,5 6,5 34,1

6 Арабиноглюкуроноксилан - 26,1 17,0 61,1 48,6

7 4- N-глюкуроноксилан - 0 33,3 63,6 93,0

8 Глюкоманнан Биолар 3,7 1,8 16,7 2,3

9 Галактоманнан Sigma 1,5 0 1,2 3,2

10 Дрожжевой манная Koch-Light 8,3 0 6,2 1,4

II Целлюлоза микрокристаллическая Serva 2,2 1,7 8,2 6,5

12 КМЦ Sigma 21,7 1,3 17,0 14,5

13 Ламинарин Serva 2,5 0 5,7 0

14 п-Нитрофенил-ксилопиранозид Koch-Ligixt 0 0 0 0

15 п-Нитрофенил-глюкопиранозид Serva 0 0 32,1 0

16 Софороза Serva 0 0 20,6 0

17 Целлобиоза Serva 0 0,9 28,7 0

18 Гентибиоза Serva 0 0 23,0 0

превышающей скорость гидролиза остальных ксиланов и ихпроизводных, использованных в работе в качестве субстратов.Ксиланаза 16 из четырех ферментов наиболее специфична по отношению к гидролизу ксиланови и»производных и практически не действует на все другие полимерные и низкомолекулярные сахариды. Ксиланаза 1в наиболее неспецифический фермент, который обладает способностью катализировать гидролиз полимерных ксиланов и целлюлоз, а также низкомол кулярных дисахаридов. Ксиланаза 2 предпочтительно гидролизует кс. лан овса фирмы " Serva " и 4-к-глюкуроноксилан, а также ксиланы и их производные из разных источников. Так же, как ксиланазы 1а и 16, и ксиланаза 2 не действует на дасахариды и гликозиды. Для ксиланаз A.japonicus характерно то, что каждый фермент из поли-ферменгной системы обладает способностью гидролизовать отличавши еся по структуре субстраты с различной скоростью, имея при этом общий главный субстрат для всех ферментов -нзилан овса фирмы " Serva". Среди четырех ферментов ксиланаза 2 обладает самой вые кой способностью связываться с ксиланом (Km 2,7 мг/мл), а кси ланаза 1а наиболее слабо связывается с ксиланом ( Km 20 мг/ыл) (табл.7).

Таблица 7. Кинетические параметры ксиланаз гриба A. japonicus о

Ксиланазы V max (мкМ/мин) К m (мг/мл) ^max/ Кш

1а 5,0 20,0 0,25

16 2,5 5,9 0,42

1в 1,6 10,0 0,16

2 1,0 2,7 0,37

Ксиланазы A.japanicua различаются по ингибированию моно- и дисахаридами, в том числе и теми моно- и дисахаридами, которые не являются конечными продуктами гидролиза и даже не входят в состав данного субстрата (табл.8). Интересно, что в присутствии моно- и дисахаридов активность ксиланаз 1в и 2 подавляется более существенно, чем активность ксиланаз 1а и 16.

Таблица 8. Влияние юно- и дисахаридов на активность ксиланаз гриба A.japontcua.

Активность ксиланаз (%)

иахариды при 15мМ при 3,75 Ш

1а 16 1в 2 1а 16 1в 2

Ксилоза 27,0 5,0 19,0 1,4 58,4 30,0 45,7 18,6

Арабиноза 3,5 10,0 0 2,1 80,2 100 21,5 27,1

Глюкоза 0 5,0 4,7 0,7 22,7 75,0 15,5 7,9

Манноза 0 5,0 0 2,9 77,6 85,0 26,2 34,3

Фруктоза 5,7 15,0 5,8 9,7 29,7 70,0 9,9 12,9

Сахароза 100 93,3 63,6 61,0 100 100 90,5 90,0

Деллобиоза 3,5 0 0 0 27,0 10,0 0 0

Для ксиланаз 1а, 1в и 2 ингибирование Б-ксилозой носит конкурентный характер, а для ксиланазы 16 - неконкурентный (табл.9).

Таблица 9. Константы ингибированш ксилозой гидролиза ксила-на ксипаназами А.^арап1оиа,

Ксиланазы 1а 16 1в 2

,мМ 1,5 0,8 1.2 0,22

Тип ингибирования конкур. ньконкур. конкур. вонкур.

Ксиланазы A.japanicus существенно различаются по продуктам гидролиза ксилана (рис.3). Так, ксиланаза 1а при гидролизе кси-лана образует только ксилозу, т.е., по-видимому, отщепляет ксилозу с конца полимерной цеш ксилана. По критерию Риза ( Reese, Maguire, 1968) ксиланаза Ia относится к типичным экзоксиланазам. Ксиланаза 16 гидролизует ксилан до ксилобиозы и ксилоолигосаха-ридов с четным числом остатков ксилозы. По всей видимости ксиланаза 16 представляет собой типичный эндофермент. Ксиланаза 1в ЩИ; гидролизе ксилана образует ксилозу, ксилобиозу и ксияоолигосахари-дн с любым числом остатков ксилозы. Этот фермент по-видимому, обладает способностью эндоксиланазы, в то же время обладает способностью ксилозидазы, т.к. при гидролизе образует ксилозу. Фермент также действует на гликозид и на дисахариды. Ксиланаза 2 гидролизует ксилан до ксилозы, ксилобиозы и ксилоолигосахаридов только о нечетным числом остатков ксилозы. Фермент, по-видимому, является ксиланазой смешанного эндо- экзо типа действия.

.д

■г-*■

А

2 ь I; и к."

# #

л « и г к кмтзы

Рис. 3. Хроматография на бумаге продуктов гидролиза кси-лана ксиланазами

1а - ксиланаза 1а, 16 - ксиланаза 16, 1в - ксиланаза 1в, 2 - ксиланаза 2 КС - ксилоза

цифры - степень полимеризации ксилоолигоса-харидов.

Б

г ц г^И ц и

Сштрп.....| Ку^'Л-Л^ V;

Рис. 4., Определение продуктов реакции транегликозилиро-вания для ксшсаназ 1а,1й,1в и 2 А - Инкубирование ксиланаз 1а,1б,1в и 2 с п-НФК

при 40°С рН 4.9 в течение 26 часов. Б - Инкубирование ксиланаз 1в с целлобиозой, 2 -

НШГ и 4 - НФГ при 40°С рН 4.9 в течение 26 часов. КС - ксилоза, НФК - нитрофенщжсшюпиранозид Д - целлобиоза, НФГ - нитрофенилглюкопиранозид

Три изучении реакции трансгликозилирования ксиланазами А. «.ротл-ыи установлено, что ксиланазн 1в и 2 обладают высокой способ-аостыо катализировать реакцию трансгликозилирования при действии га п-НФК, а для ксшганазы 1в также и на целлобиозу (рис.4). Пля ксиланазы 16 величину трансгликозилазной активности оценить невозможно, ввиду ее слабой способности гидролизовать п-Ж. Ксиланаза 1а, по-видимому, не обладает этой активностью три действии на п-НФК.

Таким образом, внеклеточная ксиланолитическая полифермент-гая система гриба А.3арап1сиз состоит из четырех функциональ-ю важных ферментов, различающихся по физико-химическим свойст-эам, влиянию ионов и ингибиторов, аминокислотному составу, специфичности гидролиза субстратов и способности к трансгликозшги-зованию.

ВЫВОДЫ

[. Разработаны схемы очистки всех.компонентов внеклеточной ксиланолитической полиферментной системы гриба А.^ароп1сиа. Ферменты очищены и охарактеризованы. I. Показано, что ксиланолитическая система гриба а. ¿арашсиэ состоит из четырех функционально важных ферментов:

- экзоксиланазы 1а с р1 4.7 и молекулярной массой 34 кда,

- эндоксиланазы 1Б с р1 4.4 и молекулярной массой 87 кДа,

- эндо-экзоксиланазы 1в с р1 4.1 и молекулярной массой 33 кДа,

- эндо-экзоксиланазы 2 с р1 7.2 и молекулярной массой 32 кДа.

Все ферменты различаются по физико-химическим свойствам, злиянию ионов и ингибиторов аминокислотному составу и содер-ганию углеводов, субстратной специфичности и кинетическим параметрам гидролиза ксилана, по способности к траясгликозилиро-занию.

Установлено, что в процессе роста гриба при уменьшении содержания ксиланаз I накапливается ксиланаза 2. Эндоксилана-за 16 постоянно преобладает и ее содержание составляет не менее 50$ от суммарной ксиланазной активности. Содержание ксиланаз 1а, 1в и 2 не превышает соответственно 16.2,7.2 и 25$ от суммарной ксиланазной активности.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Рязанова Л.П., Кан Дон Ук, Белецкая О.П., Кулаев И. С. Спектр ксиланолитических ферментов Aspergillus sp. . _ Всесоюзная конференция " Биоконверсия - 88. Теоретические основы микроб ной конвёрсин", тезисы докладов, Рига, 1988, с.92.

2. Рязанова Л.П., Белецкая О.П., Кан Дон Ук, Кулаев И.С. Очистка и характеристика внеклеточной ксиланазы I из гриба Aspergillus ар. _ Всесоюзная конференция " Биосинтез ферментов микроорганизмами", тезисы докладов, Ташкент, 1988, с.250-251.

3. Белецкая О.П., Рязанова Л.П., Полоротова Е.В., Кан Дон Ук, Стефанова М.Е., Стаййова Д.Д., Панин А.Л., Ледова Л.А., Го-ворко Д.В. Деллшазы и ксиланазы грибов рода Aspergillus : свойства, физиологическая роль, способ образования множественных форм. - В сб. "Актуальные проблемы биохимии эукариотов ипрокарио тов", ОНТИ НЦЕИ, Пущино, 1990 ( в печати).

4. Ryaianova L.P., Beletskaya O.P., Kan Don Uk, Kulaev I.S. Purification and characteristics of Xylanase secreted Ъу the fungus Aspergillus sp. - In 2-international symposium "Overproduction of microbial products", Prague, 1988, p.249.

25.04.90 г. Зак. 25Э0Р Тир. 125 экз. Уч.изд.л,- I.О Отпечатано на ротапринте в ОНТИ НЦБИ