Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование органных и опухолеассоциированных иммуногенных детерминант хроматина из клеток рака прямой кишки человека

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование органных и опухолеассоциированных иммуногенных детерминант хроматина из клеток рака прямой кишки человека"

УКШШЫЖЙ НАУВЭВО-Д0СЛ1ДНИЙ 1ЖШУТ ГЕРОНТОЛОГИ АКАДИИ I МЕДКЧНИХ НАУК УКРА1НИ

рг-8_ад_

* 7 Ш1

На правах рукспису

ЫТКО В1ра йасола'1вна

ДОСЯЩЖШЯ ОРГАНКЙХ ТА ПУХЛИКОАООЦ1ПОВАЩ« ПСУКОГЕНКИХ ДЯСЕРМПШГГ ХРОМАТИНУ 3 ГЛ1ТЙН РАНУ ПРЯЛО I вши яодшш

03. 00.04 - ОЮХШЯ

Автореферат дисертацп на здсбуття зченого ступэню кандидата бюлопчних наук

Ки "18-1993

Робота виконана ь 1нститут1 бюздмп 1м. О. В. Палладша АН Украши.

Науковий кер1внж: доктор бюлопчних наук

ермЕковА а м.

0фЩ1йн1 опонент- " доктор бюлопчних наук

Л1Т011ЕНК0 О. Я.

доктор бюлопчккх наук, професор КУРСЬКИЯ Ы Д.

Пров1дна установа: ' Укра1нський кауково-доел1дний шетитут ■ • онкологи та радиологи МОЭ У крайни

Захист Б1дбудеться вересня 1993 р. в на зас1данн1 спец1ал!зовано1 ради Д 001.28.01 в Укра'1нському НД1 геронтолог! I АМН Укра1ни за адресою: 254114, КИ1В-114, вул. Вишгородська, 6?.

3 дисертащею можна ознайомитися в б1блютещ Украшського НД1 геронтологи /МН Украши

Ав"ореферат роаюланий

Бчений секретар спещал13овано1 ради

с&тяж

_1993р.

ПОТАПЕНКО Р. I.

/

- 1 -ВСТУП.

Актуальнють теми. Вивчення молекулярних процее!в, шэ лежать в основ! перетворення нормально! кл1тини на ракову, с одшею э найактуальн!ших та активно. зивчаемих проблем бюлогп та медицин!!.

Експершентально-тэоретичш доел1Дження злояк!сних пухлин принесли сагатий фагсгичний матер1ал та дуке розширили знания про пухлини, однак вони иэ не дали пояснения походкенкю пух чин.

Маличпзащя зв'язана з порушениям таких фундаментальних бюлопчних явищ, як прол1ферац!я, успадкування ознак у кл1 тинному потомств 1. Посшдовно! картини молекулярних процес!в, як1 приводить клиину до пухлинно! трансформацп на даний момент не юнуе, однак, южна а абсолютною певнютю твердити, що в основ! утвореиня будь-яко! пухлини лежать змши деяких ген!в в певн!й

ПОПУЛЯЦП КЛ1Т'/Н.

Перевалена к!льк1сть дскшджень в облает! онкологи зосеред-зкуеться на тих об'екгах та процесах, ер е вгке насл!дком зло-як!сного перетворення клиини. 1х вивчення дозволяв скласти до-сить повне /явления про ракову юитину, але. в той же час, не розкривае механ1зм!в явищ, що лежать в основ! малтлзацп кл!тини.

Наблизитися до розушння цих механ!зм1В може вивчення змш у б1лковому склад! хроматину , особливо у склад! регуляторних пухлиноасощйованих (Ндшв.

В1домо. щр при стар1нн1 в!дбуваеться накопичення помилок та мутаЩй у генетичному аларат! людини. Так, в1домо, що на рак прямо! кишки найчастше хворють люди шеля 40 рок!в, тому, особливий стерео становить пор!вняльний анал1з зм1н у склад! пухлиноасощйованих б!лк!в при старгнн! та у молодому в1ш.

Мэта та задача робот Мэтою дано5 роботи е пошук та характеристика пухлиноаеошйованих антиген1в хроматину кл!тин раку прямо! кишки людини.

У конкретн1 задач1 входило:

1. Шшук пухлиноасощйованих комплекс!в у хроматин! з кл! тин аденокаршноми прямо1 кишки людини за допомогою ¡муно-лоНчних методов.

2. Пор!вняльний анал!з пухлиноасощйованих комплекса з ра-

- 2 -

КОВ ИХ КЛ1ТИН людей piSHHX В1КОВИХ груп.

3. Досл1джння органоспециф i чност i антиген!в хроматину в нормi та при раку прямо! кишки.

4. Характеристика антигет в в елемектарних структурам оди-ницях хроматину.

5. Досл1дакення негютонових "б!лк!в та ДНК в областях хроматину, абагачених органонеспециф1чними та пухлиноасоцШо-ваними антигенами.

Наукова новизна. Знайдено лухлиноаоощйован! алтигени у хроматин! з im тин аденокарщномн прямо* кшвки лвдини. Ветановлена íx гетероорганнíсть.

Вперше проводився пор1вняльний анал!з пухлиновсот йованих антигенiE хроматину у pls:u;x bisioskx трупах. Показано, цр природа цих пухлиноасощ йованих антиген i в у pismix bíkobhx трупах однакова

Беташвлено, пр у областях, де локал1зован1 Щ 01лки типова нуклеосомна структура не эбер!гаеться. Частина цих 61лк1в ло-калиована у надчутливих до нуклеаэ областях хроматину.

Практична значим!сть роботи. Дан! досл1дяення вносять вклад у вивчення лроцес!в, до шдбуъаться при штгтваци клтши, вони будут ь сприяти б1дьш глибокому ровушнню механ!ЗЫ1В регу-ляци транскрипцп при канцерогенез i.

Апробащя роботи. MaTepjara дисертад1йно1 роСоти допов!дали-ся на VII Шжнародн!й конференцп по пухлинним маркерам людини, м. Ки!в, lS90pv на II Росхйсько-1зрайлъському симпоз!ум1 по пептидам та Оижам, м. Москва, м. Пущно, 1392р; на VI Укратсь-кому б!ох!м!чному з'издь м. Ки1в, 1992; а також на наукових - сешнарах В1дд1лу молекулярних основ семютики 1нституту öioxi-мП ím. О. В. Паллад!на АН Укра5ни.

ПубЛ1каци. За матерюлами дисертацп опубл!ковано 8 робот.

Структура та обсяг роботи. Дисертащя складасться з вступу, огляду лиератури, опису матер i ал i в та метод1в досл!дження, результат! в, викдадених у чотирьох главах, заключно! частини, BUCHOBKib, списка лтратури (172 найменування). Робота викла-дена на 115 стор!нках та м ютить 23 рисунка та 1 таблидю.

- 3 -

МАТ ЕР I АЛИ ТА МЕТОДИ.

В досшдах використовували п1сляоперац!йний матер!ал в1д 30 хворих на рак прямо1 кишки э кдшчно встановленим та псто-лопчно шдтвердженим д1агнсзом.

Слизову нормально! прямо! кишки отримували в бюро судово-ме-дично'1 експертизи в!д людей, що загинули вна<шдок механ1чних травм.

У роботI викориетовували так! препарати: ДНК-аза I, мтроко-кова нуклеаза, повний ад'ювант Фрейнда, антикроляч1 антит!ла, мшен! пероксидазою хршу ("31дгпа",СЩА ), гемолизин ( ИЕМ ш И. Ф. Гамале!, Рос ¡я ).

Хроматин з кл1тин прямо! кишки, легень, шлунку та печ!нки отримували через стадно ядер, як описано ран1 им (Цтапэку еЬ а1. , 1975).

Для фракц!онування хроматину ДНКазою I до хроматину додавали р!зн! к1лькост! ДНКази I та тримали 10 хв при 3"/* 0. У частину проб ДНКаза I не додавалася. За фрагментацш ДНК при цьому в1дпов1даоть присупи у ядр1 ендогенн1 нуклеази. Для припинення реакцп проби ставили у льод, солюбшзован! продукти та нукле-аьо сийкий хроматин розддляли центряфугуванням.

Електрофорез б1лк1в в ПААТ-БОБ проводили по методу (ЬаештП, 1970), електрофорез ДНК та нуклеосом у 0,8Х агароз! - як описано (Маниатис и др. ,1984).

Концентрацию ДНК визначали у II ЗОБ по оптичмй густин! при 260 нм, концентрацию 61ЛК1В по (Ьоот-у еЬ а1.,1951).

1мунох1м1чк1 методи. Для шмун1зацп крол!в хроматин зм^шу-вали з таким самим об'смом повного ад'юванта Фрейнда та вводили по 0,2 мл у шк!ру. Дал1 1 мг хроматину вводили внутр^м' язево щотижнево напротяз! п'яти тишпв. Через 7 д!б шсля останньо! 1шун1зац1'1 брали кров з вушно'1 вени.

одержували осаджуючи 1,75 М сульфатом амон!я а наступною хроматографюю на целульоз! ДЕАЕ-32 у 0,02 М натр1й-фосфатному буфера.

Взаемодно антиил з антигеном досл1 джували такими методами: К1ЛЬК1СН0Ю реакщею зв'язування комплементу (РЗК)(Ьеуше

al. ,1967), 1муноензимолог1чним аншаэом (ELISA) (Pumo étal., 1983).

У кишкюшй реакцп зв'язування комплементу у м!кропоста-новц! комплементом правила сироватка кров! морсько! свинки. Реакц!йна сумш ( кШцевий об'ем 1,8 мл ) мютила 0,3 мл комплементу ( у титрi, що давав 70-Q0Z гемол1зу ) 0,3 мл антигену, 0,3 мл антшмл у робочому розведенш, 0,9 ыл буферу ( 0,15 M NaCl, 0,01 M трис-HCl pH 7,4, 0,005 M MgS04, 0,015 M СаС12 , 0,05% зльбушн). Сумш витримували 18 годин при 4ÖC, дал! у проби додавали по 0,3 ыл 0,25% сешибшзованих гемол!31ном еритровдшв барана, сумш тримали 60 хв при 37°С. Для припинен-ня реакцп, проби ставили у льод на 10 хв, дал1 центрифугували 10 хв при 1 600g. Шру гемол1зу визначали спектрофотометрично, В1Ш1рюючи поглинання супернатанту при 413 нм.

1муноензимолопчниЯ анализ ( ELISA ). На плату (Dynatex) з 4>1ксованим антигеном наносили, в кожну лунку антихроматинов! IgG. Дал! плату обробляли антикролячими анишлами, що були шчеш пероксидазою xpiny з наступним ïx "фарбуваннкм орто-фен!л-Д!ам!-ном. Забарвлення ф1ксуваяи додаванняы 4н HgSO.-ra вим!рювали ек-стинщю при 490 им. Величину екотинц»'! прмймали за умовн1 одиниц! • ефективност 1 взаемодИ антигена а антинлом.

РЕЗУЛЬТАТ«.

1. Виявлення лухлиноасоц!йованих антигешв в хроматшм з кл1тин аденокарцшоми прямо! кишки дюдини.

В перш!й серп експеримент!в ми характеризували одержанi п!сля !мун!аац!1 тотальним хроматином антитала. Взаемодио антит1л з хроматином анал!зували за допомогою двох методов: РЗК та ELISA, в яких антиген використовувався у максимально нативному стат, без денатуруючих агент iE.

На мал. 1 А подан! дан! по взаемодп IgG з аутолог 1 чним хроматином у реакцп зв'язування комплементу. Показано, що ауто-лончниЯ хроматин з високою ефективнютю взасмод^е в РЗК з IgG, що були отриман! з сироватки !мун!зованого кроля, Кр1м того, простежусться концентращ Яна залемисть утворення комплексу ан-

/

- Б -

тиген-аптитио. Видно но при концентрат'1 IgG 300 мкг/мл ан-ттмла з большою ефектившстю зв'язуються э аутолог^чним хроматином ( крива 1 ) щи, коли концентрат я v IgQ дор!внюе 100 мкг/мл. ( крива 2 ), тому концелтращя аитщчл 300 мкг/мл була прийнята за робочу в РЗК для подальшх експеримент!в. Так! ж як1сно дан1 були отриман1 i за до по мог о ¡о ELISA ( мал. 1 В ).

У подальший робот! використовували отримаш антихроматинов! антит!ла в досшдженнях хроматину як а нормальних, так i з мал1пизоваиих клтш прямо! кишки лкщини для з'яеування, до яких антигепних детеркинант напраиьовуоться антнпла у npoipci 1ыун!зацИ.

При робот! з иевиснаженими антиплами було показано, щр вони з р! эиою, але достатньо високои ефеетившст» взасмодисть практично з ус1ма препаратам хроматин!в, пр були отриман! з пухлин Р1зних хворих. Як РЗК, так i ELISA виявляють групи хроматин!а з р!ашш ступеней' аф!нност1 до використованих антиген!в, сд1д В1дмтии, кр реакщйна здатсть них груп не залегать в!д г!стологiчкого диагнозу пухлин. Ця р!зниця, що епостер!гаеться, мае, скор!ше, тльк!сиий, а не якюний характер.

Взаемод!я антипл з хроматинами з дефштивних тканин вказуе на наявшсть певио! килкост! сшльних антигенних детермшант в хроматинах ракових та нормальних юатин прямо! кишки людини.

Той факт, що р!вень рэакшйно! здатносп хроматин!в не зале-жить В!д г!столог!чного д1агнозу пухлин, показуе, що шучогешп детершнаяти хроматину не вв'язан! з морфолог !чними характеристиками ракових кл!тин.

Для виявдення В1дм!ниостей у хроматинi э нормальних та малтизованих кл!тин анал!зували взасмодио препарат!в хроматину а нормальних та ракових (рис.2) клтга з антихроматиновиыи антителами, виснаженими хроматинами з кл!тин дефштивио! прямо! кишки людини.

Результата експерименпв показали, що виснаженн! антихроматинов! антипла, практично не взаемодиоть з хроматинами з нормальних тканин, але продовжують взаемод!яти з антигенними де-терм!нантами хроматшив мал^тзованих кл1тин. Але, сл^д в!дм!тити, що не вс! препарати хроматин!в з кл!тин адено-карщноми вбер!гають здатн!сть взаемод^яти з виснаженими антиплами.

Виявлен! за допомогою виснаженних антит!л В1ДМ1нност1 у взаемоди антигенних детерминант нормальних та мал1ГН130ваиих КЛ1ТИН прямо'1 КИШКИ ЛЮДИНИ, можуть СВ1ДЧИТИ про присутнють пухлиноассощйованих антигешв в останн1х.

В!домо, щр на рак прямо! кишки, головним чином хворють люди похилого В1ку, тому становило Штерес провести анал1з пухлиноа-сощйованих антиген!в у хроматин! з кШтин аденокаршноми прямо! кишки у р1зних в1кових трупах.

Дослхджувалася !мунореактивн1сть хроматин 1 в з клиин аденокартноми прямо!1 кишки людей в!ком до 40 та п!сля 40 рок!в. На рис.3 подан! дан1 РЗК, з яких видно, що !мунореак-

тившсть хроматину не залежить В1Д в!ку людини. Таким чином, нами встановлена наявнють у хроматин! з раковнх митин пухли-ноасотйованих антиген!в. Проте, природа та роль цих бишв аа-лишшоться нев!домими. Не сл1д виключати той факт, що у хроматин! з ракових кл!тин може р!зко зростати к!льк!сть антигенних, детермшант, що характерн! для нормальних юптин. Окр1М того, доступшсть антигенних детермшант для взаемоди а антит!лами

може бути вищою у мал!гн!зованих ширинах.

о

о

"1СС:

r \ CL С

Wlv'

Рис.1. Взаемоди антихроматинових IgG з аутолопчними хроматинами: А - результати РЗК: концентрация антихроматинових IgG: 1 - 300 мкг/мл; 2 - 100.мкг/мл; Б - результата ELISA: концентрация хроматину: 1 - 20 мкг/мл; 2-10 мкг/мл.

Г,

>. 1С0-

СУ «с

Ш

«ч

р со

о

^ '

ь. Е 4С

5 ш 20

^

ео

и,

го

00

Зоо

! №

4С

.20

Ко!!1!ентрац1я антигену,"кг/'-'Л Кониентрац!/» антигену,'--кг/"л

Рис. 2. Вза9моД1Я антихроматинових Шсля вмснажння з

препаратами хроматин!в з нормашьних (А) та ракових(В) ¡«1 тин прямо! кишки. Результат» РЭК.

^ КокцентрацГ? антигену,"кг/"л -КонцентрацГр антигену,"кг/"л'

Рис.3. Залекшсть в^д В1ку людини 1Мунореактивност! препаратов хроматину з шитин аденокарц!номи прямо! кишки: N4,16,101 - до 40 рок1в; N11,12,66,6? - теля 40 рокхв; результати РЗК.

2. Досл1д»оння органоспециф!чност! антиген!в хроматину.

Ран I те в роботах ряду автор iB (Ermekova et al. ,1984) були виявлен! пухлиноасощйоваш антигенн! комплекси (непстоновий б1лок-ДНК) у хроматиш пухлинних клиин 18 piaffiix оргая!в. Од-нак природа цих антиген!в невщоиа. Ыота припустит!!, ко из 6iJim прол!ферад!'!, эм5р!ослециф;чш або органоспециф!чн1 б!лки, тому 1до процес малтизадп часто супроводжуеться дед«!-ференц¿юванням та втратою органоспециф!чност! (Збарский,1991).

3 малюнку 4А видно, ш,о кевиснажеш антиила, отриман! проти препаратов хроматину з юптин раку прямо'! кишки ефективно взае-мод!ють як з препаратами аутолопчного хроматину, так i з препаратами хроматин!в з нормальних ткакин прямо! кишки, легень, -шлунку та печ!нки жщини.

В настугоий серп дослшв вивчалась органоепециф!чн!сть цих !муногенних комплексов хроматину аденокарщноми прямо! кишки лвдини. Для цого антитиа проти хроматину з 1штин аденокарщноми -прямо! кишки людкни виснажували препаратами хрома- • ТИН!В В КЛ1ТИН р!зних дефштивних тканин людини. Шсля висна-ження антитол хроматином нормально!•леген! (рис.4Б, крива 4) та шлунку (рис. 4Б, крива2) хроматини як з ракових (рис. 4В ), так 1 а нормальних кштин прямо! кишки зовс1м втрачають здатнлсть зв'язуватися з антителами. В дослодах з антит!лами, виснаженими хроматином нормально! печ!нки показано ( рис.4 В, крива 3), шр хроматин з юп7ин аденокарщноми прямо! кишкк продовжуе косить ефективно зв'язуватися в цими антит1лами, в той час як хроматин з ¡штин нормально! прямо! кищки втрачае таку здатнлсть.

Анализ отриманих даних ! пор1вняння ефектиьност! взаемодп невиснакених та виснажених аитипл з препаратами хроматинов з Р13НИХ орган!в дозволяе • зробити наступи! висновки: виявлен! пухлиноасощйован! антигеки, серед яких кемае бiflKiв,- характер-mix т!льки для печ!нки; спектр iмуногенних бшсгв хроматину аденокарщноми прямо! киики практично повшстю. сповпадае з б!лками, то входять до складу хроматинов з )штин легень та шлунку. Ц1 ж б!лки входять. також до складу хроматину нормально! прямо! кишки, однак, кольк^сть !х значно менша, шж в хроматин! ракових кмтин. Таким чином, у хроматин! пухлинних юптин пря-мо1 кишки с б!лки, сп!льн! для хроматишв шлунку та легень,

Л

Б

Ь 40 к

1 20

га

ё ео

ш

; Концентрац1?? антигену,"кг/'-л Концентрад1)> антигену,"кгА'л

Рис. 4. Взаемод1я антихроматинових 1^6 з препаратами хроматина з кл1тин аденокарцшоми прямо1 кишки(1) та нор-маяьних прямо 1 кишки(2), шлунку(З), леген 1(4) .печшш (б) - А;

Б - взаемод1я хроматину з ракових юл тин прямо1 кишки лкщини з антихроматиновими 1^6, виснаженими препаратами ХрОМЭТИН1В 3 юнтин нормально! прям01 кишки(1), нормального шлунку(2), нормально! печ1нки(3) та нормально! леген!(4).

Рис.5. ,Електрофорез нуклеосом, одержаних розщепленням м1кро-коковою нуклеазою (А): 1 - 2 хэ; 2 - 20 яв; 3-45 ХВ; Б - 1муноензимолог !чний анал1э розподиу антигешв в нуклеосомах та 1х ол1гомерах.

причому Kl лькють таких öiJLKiB при малтлзаци аначно шдвщэ-на, в nopiBimnin з хроматином клтж дефш!тивцо! тканини.

Тобто, можна припустити, щр при мал1гшзацп клиин прямо! кишки людини к1льк!сть гетероорганних антиген!в зростае.

3. Досмпдження розподиу антиген 1 в у елеменгарних структур-них одиницях хроматину.

На даний чао у Л1тератур! дискутуеться питания про участь тканиконеспециф1Чних та пухлиноасощйованих б!лк1в у спе-циф!чн1й регуляцп тр-шскригшп, а такок про регулярну структуру нуклеосок в акт-сному хроматин! (Labhart et al. .1982; Derenzini et al. ,19Ш та e дан!, що вкшзують на В!дсутн1сть нуклеосом у го д!лякках хроматину, як! ьасгять регуляторн! посл!довност! ДНК гешв, що тракскрибуються (Han et al. ,1988). Тому уявлялося • дощльним вивчення наявност! !муногенних нег!стонових б!лк1в в нуклеосомах та ix.оj.iгомерах, до, а одного боку, 'дас мокливють ощнити эв'язок тканиноспециф!чних та пухлшоасощйованих антиген i.B з первинними субодиницями хроматину, а з lHiuoro - мода забеэпечити додаткову !нформащю про нуклеосомну структуру регуляторних областей активних ген!в.

На рис. 5А представлена електрофореграма нуклеазного перевару хроматину протягом 5, 20 та 45 хвилин. Видно, ко у Фракци 1 переважають високомолекулярн! фрагменти хроматину та ол!Гонук-леосоми, у фракци 2 - ол!гонуклеосоми р1зкоч довжини, а у фракци 3 - моно-, д!- та тршуклеосоми. Подальш! досл!ди по 1мунолопчному анал!зу розпод1лу антигешв у продуктах розщепг 'лення шкрококовою нуклеазою in vitro хроматин!в з кл1тик аде-нокаршноми прямо! кишки людини показали (рис.5Б), щр антитма реагуюгь з антигенами, HKi мютяться в тетра- та олтэнуклеосо-мах i практично не взаемодиоть з фракщями моно-, Д1- та три-нуклеосом, хоча на електрофореграм1 цього препарату (рис.5А дор!жки 2,3) видно, да вони складають основну масу утворених фрагмент!в хроматину. Ц! дан! !муноблоту пшвердилися в нас-тупних досл!дах, коли фракцп моно-, тетра- та ол1гонуклеосом за допомогою електроелюцп добували з гелю i дал1 досл!джували в реакци зв'язування комплементу (рис. 6А) та за допомогою методу ELISA (рис. 6Б). Показано, щр фракщя мононуклеосом в РЗК

100

ЬО ' СО

40

20

о

0

*£1000:

1 Ь00'

Ц шо.

с 400 2001

V3

Рн о о чэ

КонпентрэиХя антегену,"кг/"л

Д,

I

Я

Рис. б. Взасмсшя антипл проти аденокаршкоми прямо! кипжи а фракщями моно(1)-, тетра(2)- га ол1гонуклэосом(3) пюля електроелюцп з гелю: А - результат РЗК; Б -результата ELISA.

100 t'i ьо 60-j

£

о

40

20

I 10 ■

Концентрация антигену,"кг/"л

Рис.7. Вэаемод1я антит1л проти аденокаршноми прямо'1 кишки з фракщями моно-(1), тетра-(2) та олтэнуклеосомСЗ), . оброблених м1крококовою нуклеазою пюля електроелюцп з гелю.

практично не взаемод^е в антит1лами проти аденокаршноми прямо! кишки, фракцп тетра- та ол1гонуклеосом демонструють. нав1ть при низьких концентрашях, високу реакшйну здатн!сгь. В ELISA (рис. 6Б) фракцп тетра- та ол!гонуклеосом такоя демонструють високу реакшйну эдатнють. Мононуклеосоми в ELISA такая реагу-ють з антителами, але значно нижче нш тетрата ол1гонуклеосоми. Цей факт мо»да пояснити тим, що в РЗК реакшя в!дбуваеться у розчин! в пор!вняно великому об'ем1, що перешкоджае вближенню монОнуклеосом, на в!дм1ну в1д цього в ELISA реакшя в:цб\гваст -ся в дуже малому об'ewi на нос!!, щр. молАию, сприяе iM¿TatU' високоорган!эовано! структури повноц!нного бьпк^-). антигену. Це припущення було шдтверджено в дек ..дьх, коли фракци moho-, тетра- та ол!гонуклеосом шел електроелюцп 8 гелю знову об-робляли М1крококовою нуклеазою, шеля чого проводили ^с^ьышя 8¿ допомогою РЗК (рис.7). ВС! фракц!! п1пля С.,ООКИ IX M1KPOKO-ковою нуклеазою припиняли взаемод!яти 8 алгчплами.

Таким чином, пухлиноасоц!йован! шуногенн! ЧГВ хроматину практично в!дсутн! у фракщях moho-, ди- та тринуклеосом, тобто одинична нуклеосома не мютить антигенiв хроматину. Найменшим 1мунолог!чно реакцШноздатним фрагментом хроматину е тетранук-леосома. Взаемод1я а антиплами в!дм!чена í у фракщях шшнук-леосом б!льшого роам!ру.

Грунтуючись на одержаних результатах, неыожливо зробити од-нозначний висновок про наявнють чи вдаутнють типово1 нуклео-comho'í структури в областях хроматину, щр м!стять пухлиноа-сощйовши .та органонеспециф!чн! антигени. Однак, можна стверд«увати, що повнощнний б!лковий антиген В1дсутн1й в оди-ничшй нуклеосом1, а властивий лише наднуклеосомним структурам, мшшальною а яких е тетрануклеосома.

Вивчення локал!зац!1 пухлиноасошйованих антиген1в хроматину a kjiíthh аденокарц!номи пряш! кишки людини.

Значний ¡нтерес представляс питания про локал1зац!ю 1муно-генних КГБ у хроматин!. Рашше було показано, шр ДНК областей хроматину, що активн! у транскрипцП переварюеться ДНКазою I значно ефективнше, híjk основна маса хроматину (Weisbrod,1982). Окр!м цього, у хроматин! знайдено облаетi надчутлив! до ДНКази1 (Weintraub.1979), hkí мютять регуляторн! посл!Довн^т! ген1в,

та с мюцямй пр1кршлення до ДНК регуляторних 61Ж1В (Hutchinson et al. ,1985).

Хроматин з кл1 тин нормально! прямо! кишки та аденокарш номи прямо'! кишки переварювали ДНКазою I. Процент переваривания виз-начали по к 1 ль кос Ti кислоторозчинно! фракцп до тотального хроматину. -

Показано, що фракщ'1 хроматину, отриман! на ранн!Х етапах переварювання хроматину ДНКазою (1-3% ДНК розщеплюсться до кис-лоторозчиьно! фракцп) значно збагаченi ¡муногеннимл б1лками (рис.8А). 1з зб1льшенням ступеню пдрол!зу ДНК ефективн!сть взаемодП отриманих фракщй хроматину э антит i лаии починас зменьшуватися. Отршан! дан! св^дчать, що надчутлив! до нуклеа-зи облает! хроматину дужэ гбагачен! !муногеншши НТВ. Разом з цим, в областях, переважко чутливих до ДНКази I, шр збагачеш структурними посл1довностями активно транскркбуемих ген1в, ан-тигени в!дсутн!. Сл1д зазначити, що у отримуемих за допомогою переварювання хроматину ДНКазою 1 фракциях, практично уся ДНК являе собою ккслоторозчинн1 дезоксирибонуклеотиди, та, отяе, доступн!сть антигенних детершнант не може бути обметена характером упаковки хроматину та ДНК-б1лковими взаемод!ями. Якась частина !муногенних НТВ локатзусться, ' мабуть, в областях, що' не можна отримати перевариваниям ДНКазою I у даних1 умовах.

Також сл!д BiflMiTHTH, що ступ!нь взаемод!! цих фракщй з хроматину аденокаршноми прямо! кишки з антитыами вищий, Hirn у

- аналог!чних фракций з хроматину нормально! прямо! кишки.

На рис. 8Б подан! результата дослшв з антит!лами до хромати-

- ну аденокарщноми прямо! кишки, що були виснахеш хроматином з дефштивно! тканини. Показано, що фракцп, ЯК1 отримуваии п!сля нуклеазно'! обробки хроматину з аденокарш номи прямо! кишки продовкують виявляти 1мунореактивн1Сть. Цей факт вкаэуе на те, що 1муногенн1 бики, що специф1ЧН! для аденокарш номи прямо! кишки, та не виявляються у нормальних тканинах локал1зован! у надчутливих до ДНКази I областях.

Дал! визначали сп!вв!дношення ДНК/б1лок у фракщях п!сля ДНКазного переварювання. При розщепленн1 \,7Z ДНК до кислоторозчинно! фракцп це cniBBiдношення становило 1/3,2 , при роз-щзпленн! 4,57. —1/2,5, а при 11% , май*е як у .тотального хроматину, 1/1,9 (у тотального хроматину 1/1,6), шо тдтверджус

• - 14 -

гературн! данi про абагачення гадчутливнх областей активно транскрибуемих посл1довностей б1лками.

KpiM того, в1домо, пр ц! обласп шстять сайти, що чутлив! не т1льки до ДНКааи i, а й до ендогенних нуклеаз, míkpokokobo'í нуклеаэи. Тому становило 1нтерее вивчення фракцп так названого ядерного соку, який, як ввакаеться, отримуеться в процес! вид!лення хроматину, . та являе собою продукт переваривания хроматину ендогенними нуклеазами. Було показано, що ядерний с!к а дуда високою ефективнютю зв'яэуе антшчла проти хроматину з ten i тин аденокартноми прямо1 кишкг. кр!м turo, фракция, отоиу • на автолничним переваром хроматину до 0,9 % т • лиолотороз-чинн!й ДНК таком показуе злачно зза; ачення !муногенними балками. Становило штерес з'ясувати яка фракщя ядерного соку ■мостить Щ антигенн! комплекси. Для цьго ядерний с<к деятрифу-гуваяи при 100 OOOg для отриманш ocarv та ,;осл! длсували у по-дальших експериментах. К!льк!сть ДНК, мютила^л у осад1 ядерного соку становила 1-3% Bis ycíel млькосп вид1леного хроматину.

На рис. 9 показано, що осад ядерного соку зиачно сильн!ше взаемод1е з антитиами, шж тотальний хроматин. При визначенн! сп1вв!дношення ДНК/б1лок у осад! ядерного соку було показано, як i для чутливих до ДНКази I фракций хроматинх. абагачення у два рази на бики. У супернатант! ядерного соку !мунореак-тивнкзть практично не збер!гаеться.

Таким чином, показано, ир шуногеншсть не зв'язана з пулом в i ль них б1лк!в, а напевно, обушвлена комплексом С!Ж1в з ДНК.

Становило 1нтерес з'ясувати природу цих антигенних комплекс i в ядерного соку. Для цього проводили електрофорез у натив-них умовах фракц!й осаду та супернатанту ядерного соку, та фракщй хроматину, чутливих до ДНКази I. 3 рис.ЮА видно, шр у Фракщях п!сля переварювання ДНКазою I до 1.5Z по кислотороз-ЧИНН1Й ДНК присутн! комплекси ДНК-биок майже ycix po3MipiB, при переварюванн1 до 9% по кислоторозчинн!й ДНК зникають висо-коыолекулярш комплекси (в^д 6 ООО п. н. до 23 ООО п. н.), та основна шса кошлекс!в розтаиовуеться у облает i 600 -2 ООО п. н. та 125 п. н. При 1муноензимолопчшй обробщ н!троцелульозних фольтр1в з !ммоб!л!аованими на шх фракц!ями тсл^ ДНКазного переварювання хроматину (рио.ЮБ) було показано, що незалежно

Bis ступени переваривания шунореактивнють проявляеться у фрактях, що б i ль се 2-ЮОО пар нуклеотщцв.

При електрофоретичному анал1з1 осаду ядерного соку було показано, що у ньому наявн! дв1 групи комплекса ДНК-б!лок: низь-комолекулярн1 - 125 п. н. та високомолекулярш - В1д приблизно 2000 до 23 ООО пар нуклеотид1в. У супернатанп ядерного соку присутня низькомолекулярна фракция (нижче 125 п. н. ), яка, мож-ливо, являв собою продукт и деградацп комплекс iB ДНК-б1лок. 1муноензимолог!чне досл!дження дих комплекс!а показало, що !му-нореактивн!сть виявляють лише високомолекулярш фракцп осаду ядерного соку, супернатант ядерного соку п не проявляе.

В подальших експериментах за допомогои SDS-електрофорезу та 1муноблоту вивчали !муногенн1 б i лки хроматину та фракщй, чут-ливих до переварювання ДНКаэою I з юптин дефштивно! прямо! кишки та аденокаршноми прямо! кишки, встановлено, шо BiflMiHHocTi носять скорше к!льк1сний, Hix якюний характер. '

Розглядаючи спектр б1лк!в ДНКазо-чутливих областей хроматину з нормальних юптин прямо! кишки та аденокарш номи прямо! кишки людини було встановлено, що вони р!зняться. В нуклеазо-чутливих областях аденокарш номи присутн! два б! лки в облает! близько. 120 кД та немае б1лка з молекулярной масою близько 67 кД, що присутн 1 й в нуклеазо-чутливих областях хроматину з юитин деф!китивно! прямо'! кишки. KpiM того, як у нуклеазочутлив!й фракц!1 хроматину з кл!тин нормально! прямо! кишки, так ! у нуклеазо-чутлив!й фракцп з клиин аденокарш номи прямо! кишки присутн! однаков! балки з молекулярного масою близько 90 кД , 40 кД та близько 30 кД, bmîct ягах мае лише деяк! к!лыасн1 розб!жност! в нормальному та пухлинному хроматин!.

Результата 1муноензимолог!чного тестування показали, що б!лки, ЯК1 були в1зуал!зован1 за допомогою електрофорезу с 1му-ногенними.

Показано, що деяю нуклеазо-чутлив1 фракцП хроматин1в з юптин аденокарш номи прямо! кишки мають !муногенн! б1лки з молекулярном масою близько 120 та 90 кД, a iHiiii, KpiM цих б!лк!в мають те ДВ1 б!лков! полоеи в облаетi 40 та 30 кД.

Таким чином, поява в нуклеазо-чутлйв1й област1 хроматину з юптин аденокарш номи прямо1 кишки Oukîb, яких немае в норм! може свiдчити про активацт певних reHiB в процес! канцерогене-

ву. I иавпаки, той факт, що в пуклеазо-чутливих додянках адено-картнош аникае биок в молекулярной ыасою 67 кД мока влазува-ти на репресш певних ген1в.

В подальших експериывнтах перев1ряли взаеыодио б1лк!в, що були 1шоб1л1вован1 па н!троцелулъозних ф!льтрах з антителам проти аденокарцщоми прямо! кишки, виснаиенши препаратами хроматинов э деф1Н!тивио! тканини (рис. 10В). В ДНКаао-чутливих фрактях хроматишв з клотин аденокартноми прямо! юшки зникае окраска б1лк1в в облает! 90 кД, у частики препаратов вялишаеть-ся лише одна пофарбована полоса в области кД, у ¡ниш час-тш кр!м не! вовуалозуються двх полоси в облаем "О .а 30 кД, 1 ц! б1лки е пухлиноасощйованими анти. ¿нами для аденокартноми прямо! кишки. Виявлен! р03б!М10СТ! у склад! цих пухлиноасоц!йо-раних антиген!в не залеяать в1д г¡етологочного Д1агнс. у ¡.>хди-ви, а скороше е насл!дком протеолову високомс тел/лярних б!ЛК1в в процеоо розвитку пухлин, та !х некротизнц!!.

Таким чином показано, нр нуклеазо-чутлив! дшь л хроматину э клотин аденскарщноми та дефштшно! прямо! кивки збагачеш ¡муногенними б!лками, частина 8 яких е пухлиноасощйованими, в основному ш болки високомолекулярн!.

Рис.8. Взасмод!я антит1л до хроматину клиин раку прямо! киши з фракщяии хроматину а кл!тин раку прямо! кишки п!сля обробки ДНКазою I з розним ступеней г!дрол!зу хроматину: А - 1 - 1,1%; 2 - 2,3%; 3 - 16,5%; .4 - тотальний хроматин; Б - 1 - 1,1%; 2-8,3%; 3 - тотальний хроматин, антитола виеншлеио препаратами хроматину в кл!т. . нормально! прямо! кишки.

Салабай EL В. , Срмекова В. ü Зв' явок ентигеШв хроматину 8 нуклеосомно» струхтурою//Тези доп. VI Укра'шського öioximim-ного 8'1зду, ки1в.1992. -3. -С.101.

6. Салабай П.а , Терновий К.С., Bitko ЕМ., Д1брова Т.'Л , Пула- ' ковсышй В. I., Срмекова В. Ы. Пухлиноасоцt йован 1 б!лки нукле-ааонадчутливих д1лянок хроматину а ракових кл!тин//Тези доп.

VI Укра!нськйго бюх!м1чного з' 1эду, Ки1в,1992.-3.-С. 108.

7. Ternovoi K.S., Bitko V.N., Galahin К. A., Dlbrova Т. L., Kulakovskl V.l., Salabai P.V., Errookova V.M. Chromatin antigens of human colon and lung tumcrs//7th International Conference on Human Tumor Markers, Kiev, September 10-14, 1990. -P. 270.

8. K.S. Ternovoi, V.N. Bitko, V.l. Kulekovsky, P.V. Salabai, V. bl Yermkova Immunogenic proteins of nuclease-sensitive region of tumor cell chromatin//!! Russian-Israel Symposium on Peptides й Proteins, Itoscow, Pushcshlno, June 2-9,1992. -P. 60.