Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Антиген мембран жировых глобул женского молока. Характеристика и использование в иммунодиагностике опухолевых заболеваний

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Антиген мембран жировых глобул женского молока. Характеристика и использование в иммунодиагностике опухолевых заболеваний"

На правах рукописи

Полетаева Ольга Александровна

АНТИГЕН МЕМБРАН КИРОВЫХ ГЛОБУГШ1СКОГО МОЛОКА

ХЛРАКТЕРИСТШСА К ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ШШУН0ДИАГН0СТ11КЕ ОПУХОЛЕВЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

03.00.23 - биотехнология

14.00.36 -"иммунология и аллергология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1996

Работа выполнена в лабораторий ионоклональных антител Научно-технического центра лекарственных биотехнологий АО "Биотехнология"

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ: доктор медицинских наук, профессор д. Ю.Барышников

кандидат химических наук. Г.В.Виха

' СЗИЩЩЫШ ОППОШГШ: доктор биологических наук, профессор А. Е. Мошков

доктор биологических наук, профессор Л. В. Козлов

ЕЕДУЦАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Гематологический Научный Центр РАМН, г. Москва

Защита состоится "<Л и .. .чч^.'^.... 1996 г. в . Ш часов на заседании диссертационного совета Д 053.34.13 в Российском химико-технологическом университете им. Д.И. Менделеева по адресу:

125041. Миусская площадь, д. 9.

С диссертацией мояно ознакомиться в библиотеке Российского химико-технологического университета им. Д. И. Менделеева.

Автореферат разослан " . 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

И. И. Гусева

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Успехи гибридомной технологии привели к быстрому развитию производства и широкому применению мо-ноклональных антител(МКА) в практической диагностике. Рынок диагностических МКА сформировался уже к концу 80-х годов и в настоящее время бурно развивается. Совершенствуются принципы и методы иммунодиагностики с помощью МКА с целью повышения скорости и качества диагностики. В онкологии моноклональные антитела используют для дифференциального иммунологического исследования пункта-тов, скарификатов. соскобов с опухолей при хирургических операциях с целью уточняющей диагностики. Для целей скрининга и мониторинга, выявления рецидивов неприемлема пункционная биопсия для забора биологического материала. Поэтому используют свойство антигенов опухолей слущиваться и поступать в кровоток, где они могут быть определены с помощью МКА. С целью расширения возможностей диагностики злокачественных новообразований в последнее десятилетие широко разрабатываются методы серологического определения в сыворотке опухолеассоциированных антигенов. Для целей мониторинга рака молочной железы с большим или меньшим успехом используют такие маркеры, как РЭА (раково-эмбриональный антиген), сывороточные антигены: СА-15-3, MCA, СА 19-9, СА 125, TPS стканеспе-цифический полипептидный антиген). 3 качестве диагностических признаков используются следующие критерии: 1) повышение уровня маркера против верхней границы нормы; 2) выраженная динамика снижения уровня маркера после лечения не менее, чем на 50% . На сегодняшний день все маркеры, используемые для серодиагностики зло-, качественных опухолей, содержатся в сыворотке здоровых доноров. Процесс злокачественного роста сопровождается лишь повышением уровня этих маркеров в сыворотке. Поэтому эти маркеры не могут быть использованы для скрининга. Их используют только для мониторинга терапии, обнаружения рецидивов. Дальнейшее развитие диагностики онкологических заболеваний связывается с выделением новых опухолеспецкфических МКА.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью работы является улучшение качества диагностики .за счёт расширения ряда маркеров для се-

родиагностики и создания экспресс-метода и диагностического набора для скрининга нового опухолевого маркера в сыворотке и цельной крови, а также иммуноферментной тест-системы для количественного определения нового опухолевого маркера. При выполнении работы были поставлены следующие задачи:

1. Разработать технологию получения высокоочищенных монок-лональных'антител ИКО-25 от гибридомы-продуцента.

2. Разработать технологию получения антигена мембран жировых глобул женского молока.

3. Разработать ИФА тест- систему количественного анализа нового опухолевого маркера в сыворотке крови.

4. Показать, что МКА ИКО-25 определяют антиген в сыворотке онкологических больных и не реагируют с сывороткой здоровых доноров.

5. Разработать экспресс-мотод для скрииингового теста, который может Сыть использован для оценки степени опасности радио-ционного поражения, картирования зон проживания с высоким риском канцерогенеза.. рандомизированного скрининга населения по отбору групп с. высоким риском онкологических заболеваний, мониторинга рабочих, занятых в потенциально канцерогенных производственных процессах, и раннего выявления опухолей.

6. Провести апробацию разработанных иммуноферментной и им-муноагглютинационной тест-систем на клиническом материале.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Выделен и охарактеризован новый мембранный антиген, экспрессированный на опухолях эпителиального генеза. Впервые разработан экспресс-метод для скрининга опухолезого маркера в цельной крови человека. На основе МКА. специфичных к новому маркеру опухолей эпителиального генеза. разработана ИФА тест-система для количественного определения нового опухолевого маркера в сыворотке крови.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. Экспериментально доказано, что МКА ИКО-25 узнают опухолевый антиген в сыворотке онкологических больных и не реагируют с сывороткой здоровых доноров. Разра^ ботаны.-технология получения высокоочищенных моноклональных антител ИКО-25 и технология получения нового мембранного антигена.

Установлен состав антигена, что необходимо для получения отраслевого образца стандарта антигена, с помощью которого можно оценить концентрации опухолевого маркера в сыворотке. Разработана иммуно-ферментная тест-система для количественного определения нового опухолевого маркера в сыворотке. Впервые разработан экспресс-метод для клинического определения опухолевого антигена в сыворотке и крови человека. Разработана и утверждена научно-техническая документация: 1. Лабораторный регламент(ЛР 64-13-3-90) на получение моноклоналышх антител к антигену мембран мембран жировых глобул женского молока.

2. Лабораторный регламент(ЛР 05800805-41-93) на получение реагента для прямого метода исследования опухолей молочной железы, яичников и легких.

3. Медико-технические требования на разработку и освоение моноклональных.антител для иммуноцитологической и гистохимической диагностики опухолей молочной железы, легких, яичника (Протокол N 5 от 17.09.1990 г.. Экспертная комиссия по реактивам Комитета по новой технике МЗ СССР).

ПОЛОЕЕНИЯ. ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Разработка технологии получения высокоочищенных моноклональных антител и характеристика их специфичности.

2. Разработка технологии получения высокоочищенного антигена мембран жировых глобул женского молока и изучение его структурных особенностей.

3. Разработка ИФА тест-системы для количественного определения нового опухолевого маркера в сыворотке крови.

' 4. Разработка иммуноагглютинационного экспресс-метода для определения маркера опухолей эпителиального генеза в цельной крови и сыворотке.

5. Сравнительный анализ разработанных иммуноферментной и иммуноагглютинационной тест-систем на образцах сыворотки и цельной крови больных с опухолями различной локализации, неонкологической патологией и здоровых лиц.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Диссертация апробирована на заседании Ученого совета НТЦ " Лекбиотех" АО "Биотехнология" 14 февраля 1996 г.

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликованы 2 статьи, тезисы.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы из источников. Работа изложена на 116 страницах, содержит 13 рисунков и 18 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Характеристика гибрвдоми 1ШО-25. ГиСридома-продуцент МКА ШО-25 к компонентам мембран ¡Кировых глобул(МЯТ) женского молока получена д.м.н.. профессором А.Ю. Барышниковым в Онкологическом научном центре РАМН совместно с Московским научно-исследовательски» онкологический институтом им. П.А. Герцена Минздрава РФ. В качестве иммуногена была использована фракция гликопротеинов цембран жировых глобул женского молока, полученная электрофокусировкой и предоставленная д.м.н. Р.И. Якубовской. Штамм депонирован.

Ввдашще и очист^ш ИКА-25. Методом гибридомной технологии в мышах линии Ва1Ь/с была получена асцитная шдкость. Антитела выделяли из асцитной жидкости осаждением иммуноглобулиновой Фракции сульфатом аммония в интервале 25-45% насыщения с последующим обессоливанием на акрилексе для отделения сульфата аммония и отрицательной сорбцией на целлюлозе ДЭАЭ 32 для отделения примесных белков. Из 30 мл асцита получено 85 мг МКА.

Характеристика ШСА НК0-25 по специфичности выявления опу-лолеЯ. Изучение специфичности МКА ИКО - 25 проводили совместно с ШИОИ им Л. А. Герцена Минздрава РФ и лабораторией гистологии АО "Биотехнология". Испытано 20 серий препарата МКА ИКО - 25 на 300 образцах нормальных и опухолевых тканей человека и 200 мазках клеток человека. МКА ИКО - 25 взаимодействуют с антигеном специфично, не обнаруживают неспецифических реакций в контрольных опытах, не взаимодействуют со стромальными элементами, клетками крови, эндотелием сосудов. Проведенное исследование специфичности МКА ИК0-25 на срезах тканей показало, что МКА ИК0-25 при иммуноф-люоресцентном и иммуноферментном окрашивании срезов ткани отлича-

ют злокачественные и доброкачественые опухоли. Выявлены три четко выраженных типа реакции, различающихся по интенсивности и распределению метки. Каждый тип характерен для определенной группы опухолей. В тканях злокачественных новообразований молочной железы, легкого и яичника не выявлены участки, полностью негативные по специфической реакции (Р.И.Якубовская. 1991).

Выделение и очистка антигена МЖГ. Общая схема выделения антигена мембран жировых глобул( МХГ) из женского молока представлена на рис. 1.

1-1

| ЖЕНСКОЕ МОЛОКО I

1-,-Н

I I .--, |

I КИРОВ Ы Е Г Л О Б У Л Ы| |-,

-----1 | МОЛОЧНАЯ ПЛАЗМА |

| | | 1-.

I I-1 I

1-11 Н И Р ||-1

I M а Г ||(флотат)|I АДСОРБИРОВАННЫЕ БЕЛКИ | Г (осадок) I1-Ч (супернатант) |

L.--J I--1

-т

-1,-1

АНТИГЕН МЖГ|| МЖГ | (супернатант)I| (осадок) |

11_I

—I-

- -,

АФФИННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ I на МКА - сефарозе |

-г

I

АФФНННООЧИЩЕННЫЙ АНТИГЕН MIT |

_I

Рис. 1. схема выделения антигена МЖГ.

Выделение МЖГ проводили по методу, описанному Якубовской

Р.И. (1986). Для получения мембранного антигена жировых глобул суспензию МЖГ в трис - буфере рН 7.2., содержали ингибиторы про-теаз, в присутствии 1 % дезоксихолата натрия (ДХН) подвергали воздействию ультразвука с последующим центрифугированием при 105000 ё. 4 0 С 1 час. Полученную смесь мембранных гликопротеинов подвергали аффинной хроматографии на колонке с ВгСН-сефарозой 6 В с иммобилизованными МКА ИКО-25. Были подобраны условия посадки антигена МЖГ на колонку с иммобилизованными на ВгСМ-сефарозе 6 В МКА ИКО -25. Посадку антигена ШАГ на аффинный сорбент проводили в 0.01 М трис-буфере рН 7.6; инкубировали три часа при комнатной температуре, отмывали аффинный сорбент 0.01 М трис-буфером рН 7.6 и затем злюировали антиген ИНГ 0.05 И трис - буфером рН 11.5 с добавкой о. 5 % ДХН (рис.2). Собранный-элиат для предотвращения инактивации немедленно нейтрализовывали 0.1 И глицином рН 3.0, затем диализовывали трое суток против 10 - кратно сменяемой дистиллированной вода, далее либо лиофильно высушивали, либо концентрировали в диализных мешках против фикола или ПЭГ 20000 -40000. Как в случае лиофильной сушки, так в случае концентрирования антиген МЖГ не инактивировался и был способен связываться с МКА ИКО-25.

0280 ЗГ

26 60 ' ' 75

Рис. 2. Аффинная хроматография антигена ММ" на сефарозе 6В с иммобилизованными ШСА ИКО-25. Сорбция в 0.01 М трис-буфере рН 7.6, элмирозание в 0.05 И трнс-буфер„ рН 11.5 с 0.5Я ДХН.

Характеристика антигена ИНГ.

1. Состав антигена ЮГ(таб. 1). Антиген МЖГ, специфически взаимодействующий с МКА ИКО - 25. является гликопротеином с содержанием 45 - 50 % углеводного компонента. Спектр аффиноочищен-ного антигена в 0.01 М трис-буфере, рН 7.6 показывает его белковую природу (рис.3).

Таблица 1.

Состав антигена НЯГ.

г—-Г— J Названия | Содержание 1 1

I компонентов | (%) г

S 1 1 Белог. (по Бредфорду) | 1 1 2.5 1 1 1 I

1 1 | ГЛШ1С032НШ1 1 I \

I (галаотозагяш) ! ! J 3.0 \ )

1 1 1 К-ацеташейракшюзая 1 1 S

I кислота S i 1 16.0 1

1 1 I Гексозы | 15.0 -20.0 i

1 / 1 1

J ДНК ! 0.13 ]

1 РНК | ! 1 0.18 i 1

2. Молекулярные свойства антигена МЕГ. На колонке с ультрагелем АсА 34 антиген MKT выходит одним широким пиком сразу же после фронта буфера (рис.4а). что соответствует молекулярной массе порядка 400 кДа. При электрофорезе в 7.5 % ПААГ в присутствии SDS(no Laemmll, 1970) антиген МЖГ не обнаруживается'при окрашивании геля красителем Кумасси. При. окрашивании фуксином обнаружена размытая диффузная полоса вблизи старта.

Рис. 3. Спектр аффинноочищенного антигена в 0.01 Ы трис-буфере рН 7.6.

/

3. Некоторые структурные характеристики антигена МЖГ. Для выявления природы антигена МЖГ. специфически связывающегося с МКА ИКО-25, он был обработан ферментами, и ферментативные гидролизаты были подвергнуты гель-хроматографии на ультрагеле АсА 34. При обработке нейраминидазой холерного рмбриона иммунологическая активность сохранялась, что свидетельствуемо стабильности антигенных детерминант антигена МЖГ (рис.46). При обработке смесью гликози-даз также обнаружено изменение хроматографических характеристик антигена МЖГ, однако антигенные детерминанты сохраняются и, напротив. размаскировываются после отщепления части углеводов. Обнаружено появление низкомолекулярных фрагментов антигену МЖГ. обладающих способностью связываться с МКА ИКО-25 (рис.4в). При ограниченном протеолизе протеиназой К. которая преимущественно расщепляет связи, образованные глицином, лейцином, аланином, разрушаются антигенные детерминанты антигена МЖГ, и значительно снижа- » ется его способность связываться с МКА ИКО-25 (рис.4г). Аналогичное изменение хроматографических характеристик антигена МЖГ происходит при обработке ого коллагеназэй Cl.hlstolytlcum. которая разрывает связи, образованные глицином и пролином. Обнаружено появление множества низкомолекулярных фрагментов, содержащих гексо-зы. Также, как и при обработке протеиназой, исчезает иммунологическая активность, тестируемая по связыванию с МКА ИКО-25.

Для установления типа связи олигосахаридных цепей антигена |1ЖГ препарат был обработан 0.1 N NaOH и 1 M НаВЩпри 37°С в течение 25-часов с последующим разделением продуктов реакции на ультрагеле АсА 34. Отщепление углеводов, обнаруженное фенол-серным методом, свидетельствовало о том. что олигосахаридные цепи антигена МЖГ связаны.с полипептидным скелетом посредством 0-гликозид-ной связи. При этом иммунологическая активность снижается незначительно (рис.5). Для установления Факта участия углеводной группы антигена МЖГ в связывании с МКА ИКО - 25 препарат был обработан периодатом натрия. Обработка перйодатом, при которой происходит окислительный разрыв углерод-углеродной связи в гексозах, приводит к резкому снижению способности связываться с МКА ИКО-25 (рис. 6).

ш

»Хроматография аффннно очищенного виги гена МЖГ н> ультрагеле Ас А 34 (колонка 1:5*29 си) н «01 трис-буфере рН 1-4 (о), после обработки нейраминюшой (6), смесью гликозилаз («), протеиназои К и. коллагеназоИ (г). '

I — иммунологическая акт кость определяемая ткрдофамым И ФА, 2 — Селок по Бредфорлу. 3 — не тральные углеводы.

Опггоао* пютность иМ 1.5"

1.00.5 --

10 40 80 160 600 1000 3000 5000

Рис. 5. Зависимость связывания МКА ИКО - 25 от разведения ■ антигена МЖГ(1) и обработанного 0.1 М ИаОН и 1 М ЛаВНч антигена Ш5Г (2). 0 492

0 .5-1 I-1

3

0.4 -

0.3 -

0.2 -

0.1

Рис. 6. Влияние периодата натрия на тнвиость антигена МЖГ. 1 - иммунологическая МЖГ, обработшшого 0.08 М периодатом натрия; активность антигена ОТ, обработанного 0.2 М - иммунологическая активность антигена МЖГ, риодатом натрия.

иммунологическую ак-актнвность антигена 2 - иммунологическая периодатом натрия; 3 не обработанного пе-

I

Разработка нммуиоферментаой тест-системы для количественного определения антигена МЕГ в сыворотке крови и определение ее основных аналитических характеристик . В качестве основы для разработки тест-системы взят один из вариантов твердофазного ИФА, известный под названием "Сэндвич"-метод. Получен коньюгат МКА ИКО-25 и пероксидазы хрена(ПХ) по Hakane and Kawao(1974). При коньюгировании МКА и ПХ были подобраны оптимальные концентрации периодата натрия и соотношение МКА и ПХ. Затем произвели выбор условий по сенсибилизации планшета: 1. Предварительная обработка планшета 1% раствором сахарозы. 2.Предварительная обработка планшета МКА ИКО-25 в концентрации 25-35 мкг/мл. В результате получе-ных экспериментов стало ясно, что повышение чувствительности и снижение фонового уровня наблюдаются при обработке планшета 1% сахарозой. Все последующие эксперименты были проведены на планшетах, предварительно обработанных 1% сахарозой. Далее были определены основные аналитические характеристики тест - системы для количественного определения антигена МЖГ(табл.2).

Таблица 2.

ОСНОВНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТШШ Т&СТ-СИСТЕИЫ ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОПУХОЛЕВОГО МАРКЕРА

Измеряемый параметр

Характеристика

Принцип анализа

Диапазон измерения Твердая фаза Время анализа Чувствительность Воспроизводимость

(КВ. %) Линейность Открытие

Одностадийный, твердофазный, иммуно-ферментный на оскове МКА ИКО 25 6.0-40 мкг/мл полистироловые планшеты • 6.5 часов 6.49 мкг/мл

0.6- 1.8* 90 - 100% 94 - 109%

Таким образом, разработанная на основе МКА ИКО - 25 . тест - система для количественного определения эпителиального маркера, экспрессированного на опухолях молочной железы,' яичников и легких. обладает' высокой специфичностью, надежностью и точностью. Достигнутый уровень чувствительности позволяет отличить сыворотку онкологических больных от сыворотки здоровых лиц и лиц с неонкологической патологией (табл. 3). Разработанная нами диагностическая иммунсферме.чтная тест-система может быть использована и для скрининга опухолей.

Таблица 3.

ВЫЯВЛЕНИЕ ОПУХОЛЕВОГО МАРКЕРА, В СЫВОРОТКЕ

СШШОГНЧЕСШИ БОЛЬНЫХ КОЛИЧЕСТВЕННЫ?! ИЗ А.

■ I Юзгнико-мор^олагаческиЯ ! диагноз. I Содерзание антигена 1 ШГ. шсг/мл. ■ 1

1 Рад колотаоП аелезы: 1 стадия 1 (п=5) : 1 стадия 2 (п=8) : 1 стадия 3 (п=15); I • стадия 4 (п»15): 1 0-5 I 5-15 1 15-30 I 30-50

I Здоровые доноры (п»11) 1 0

I Лица с неонкологической | патологией (п«»13) • 1 0 1.........„...____________________— ... ■

Разработка имкуноагглютинационной тест-системы для скрининга нового опухолевого маркера и определение ее основных аналитических характеристик. Количественная иммуноферментная тест-система обладает высокой чувствительностью (рабочий диапазон по выявляемому компоненту от 6 до 40 мкг/мл). требует малого количества биопробы (50 - 100 мкл), однако среднее время анализа составляет 5 - 6 час. Один оператор средней квалификации в течение дня

может проанализировать при нынешней оснащенности российских диаг-. ностических лабораторий до 50 образцов сыворотки . В связи с необходимостью массового первичного анализа образцов сыворотки и крови, например, в экологически неблагоприятных районах проживания или вредных производств требуется разработка экспрессных методов анализа маркеров, обладающих высокой специфичностью и чувствительностью. Особенно важно иметь методы, работающие на образцах крови.

Именно разработке такого метода посвящен следующий раздел данного исследозания. Протекающая на молекулярном уровне реакция взаимодействия антигена с антителами должна приводить к развитию явлений, доступных наблюдению невооруженным глазом. Эту задачу удается решить, опираясь на факты множественности антигенных детерминант антигена МЖГ, а также на наличие двух областей связывания антигена у каждой молекулы антитела. Если частицы нагрузить антиилами, то в силу бивалентности антител происходит их связывание или агглютинация. Образование даже небольших агрегатов приводит к их быстрому и хорошо заметному осагщению из суспензии.

Это обстоятельство позволило разработать чувствительный метод обнаружения антигена в сыворотке и цельной крови. При смешивании разбавленной сыворотки или крови со взвесью таких поливалентных частиц даже ничтожная концентрация антигена достаточна для возникновения заметной агглютинации. В качестве частиц мы использовали гидрозоль оксида железа. Поверхность частиц гидрозоля нагружали МКА ИКО-25 (I. Zelikman and S.Hderten. 1938). Частицы гидрозоля железа служат носителями антител и при образовании иммунных агрегатов играют роль мостиков между молекулами поливалентного антигена. Аликвоту суспензии такого комплекса (гидрозольный реагент) прибавляли к аликвоте исследуемой сыворотки или цельной крови и тщательно перемешивали. Если в сыворотке содержался, антиген. то через 10-15 мин. образовывались мелкие, но хорошо видимые агглютинаты в виде точки красно- коричневого цвета. В случае образца, не содержащего антиген, гидрозольный реагент равномерно распределялся в виде осадка без агглютинации на дне лунки планшета,- образуя "зонтик".

Основные характеристики тест-системы для определения опухолевого маркера на основе иммуноагглютинационного теста приведены в таблице 4.

Таблица 1.

ОСНОВНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОПУХОЛЕВОГО МАРКЕРА НА ОСНОВЕ ИМНУНОАГГЛЮТИНАЦИОННОГО ТЕСТА.

Измеряег.щй параметр

Характеристика

Принцип анализа

Твердая фаза Диапазон измерения

Время анализа Обьем пробы анализа Чувствительность Выявление антигена

Одностадийный, твердофазный, агглгапшацнонкыП на основе МКА ИКО-25

Гидрозоль оксида :хелеза(Ш) 0.4-10 мкг/мл ( в расчете на сухую массу антигена МЖГ ) 15 кинут 50 ш 0.4 мкг

т%

Технологичность, простота и быстрота исполнения, возможность использования 1ельной крови делают удобной иммуноагглютина-ционную тест-систему на основе моноклональных антител ИКО-25 для скрининга опухолевых маркеров.

Имуноагглютинадаонная тест-систеМа, апробирована на образцах крови онкологических больных, крови здоровых лиц и больных с неонкологической патологией(табл. 5,6).

Выявление опухолевого маркера в цельной крови онкологических больных и здоровых доноров иммуноагглвтииацнонным методом (НАГ).

1-г 1 »

I N/N1 Больной Результат НАГ| Диагноз |

\ 1. 1 Больной Г. (-> 1 Рак гортани. 1

1 2. | Больной Л. (+/-) 1 Периферический рак лег|

кого |

1 3. | Больной Г. (*) 1 Рак шейки матки, 1

1 4. | Больной 3. (+) 1 Рак легкого |

(разрастание мелкокле-|

точного рака). |

1 5. | Больной П. <+) 1 Рак легкого |

(периферический, шюс-1

кокпеточннй). 1

1 6. | Больной Л. <+) 1 Рак легкого |

(плоскоклеточный). |

1 7. 1 Донор К. (-) 1

1 8. | Донор ф. Н 1

1 9. | Донор Щ. <-) 1

110. I Донор Б. <-> 1

111- 1 1,..........1 Донор К. (-) 1 1 . I >

Таблица 6.

Выявление опухолевого маркера в цельной крови больных с неонкологической патологией иммуно-агглятинационным методом (ИАГ).

1 н/н г ..... I Больной т-г I Результат ИАГ 1 1 1 Диагноз |

1 1. 1 2. 1 з. 1 4. 1 5. 1 I Больной И. 1 I Больной В. | Больной 1С. | Больной Д. ! Больной с. 1 <-) 1 1 1 ] ] Заболевания нервной | системы. | я

1 в. 1 7. 1 8. 1 9. 1 I Больной С. 1 | Больной Д. | Больной X. | Больной Т. I 1 1 1 Заболевания сердечно! сосудистой системы. |

1 10. 1 11. 1 12. I 13. 1 Н. 1_ 1 | БОЛЬНОЙ Б. 1 | Больной П. I Больной Е. | Больной 3. | Больной А. « 1 1 ! (-) 1 • « Заболевания мочепо- 1 ловых органов. | ( 1

Сравнительный анализ тест-систем, основанных на ИФА и иымуноагглютинационном тесте.

Для сравнения данных тест-систем проводили исследование образцов сывороток и цельной крови больных с различными онкологическими заболеваниями, больны^ с неонкологической патологией и здоровых доноров.

Онкологические заболевания были представлены такими заболеваниями, как рак молочной железы (РМЖ). рак легкого (РЛ). рак : яичников (РЯ). рак.шейки матки (РШМ) и другими заболеваниями. Было проведено исследование сывороток этих больных на наличие опухолевого маркера методом ИФА и с помощью ишуноагглютннациояного теста (ИАГ). Результаты исследования представлены в таблице 7.

Неонкологическая патология была исследована на образцах сывороток больных с заболеваниями сердечно-сосудистой (ишемичес-кая болезнь сердца, кардиосклероз и т. д.) и нервной систем. Результаты исследования представлены в таблице 8. Результаты исследования сывороток здоровых доноров представлены в таблице 9.

Как видно из таблиц 7.8,9 результаты, полученные с помощью данных тест-систем совпадают, т.е. полоясительный результат в им-муноагглютинационном тесте соответствует положительному результату ИФА и наоборот.. Причем опухолевый маркер у здоровых доноров и у больных с неонкологической паталогией не обнаружен. Для больных с онкологической патологией процент выявления антигена МЖГ от 60 % до 80 % при различных заболеваниях (табл.10,11).

ОБНАРУЖЕНИЕ ОПУХОЛЕВОГО МАРКЕРА В СЫВОРОТКЕ ПАЦИЕНТОВ С ОПУХОЛЯМИ РАЗЛИЧНОЙ ЛОКАЛИЗАЦИИ И РАЗНЫХ СТАДИЙ С ПОМОЩЬЮ ДВУХ

ДИАГНОСТИКУМОВ:ИММУ

ЮАГГЛЮТИНАЦИОННЫМ И ИММУНОФЕРМЕНТНШ

т

(1/п

Болыше

Результат НАГ

Результат!

ИФА, | мкг/мл I

Диагноз, проводимое лечение

1.

2.

3.

4.

5.

6.

Больная Д.

Больная И. Больной А.

Больной 3. Больная Б.

Больная М. Больной Н.

+/-

О |Рак молочной железы, |Ш-б стадия, после Iоперации.

30.0 I Paie молочной железы, |Ш-б стадия.

1.0 |Рак легкого, II1-6 I стадия, после курса |4 циклов хим. терапии

3.0 |Рак легкого. IV ста-|дая, после хим.терап.

8.0 |Рак яичников, 111-а I стадия, операция в |1994г.

3.0 1Рак яичников, Ш-б , (стадия, после опера-|цки, 11 циклов хим. I терапии.

4.0 |Рак легкого, IV ста-• |дия, после трех циклов хим. терапии.

I_!_

+

+

+

S

+

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОПУХОЛЕВОГО МАРКЕРА В СЫВОРОТКЕ БОЛЬНЫХ С НЕ0НК0Л0ГИЧЕСК0Й ПАТОЛОГИЕЙ С ПОМОЩЬЮ: ИММУНОАГГЛНтШАЦИОННОГО (ИАГ) И ИММУНОФЕРМЕНТНОГО (ИФА) ДИАГНОСТИКУМОВ

1 I Н/п 1 --- 1 Больные 1-г 1 Результат 1 1 ИАГ I 1 1 Результат ( ИФА |

1 1- 1 Больной- А. 1 1 0 !

I 2. 1 Больная Б. | ( 0 1

1 з. (Больная В. | - | 0 1

1 4. 1Больная Г. 1 • - 1 0 1

1 5. 1 Больная Д. I - 1 0 1

1 6. {Больной Д. | | 0 |

1 7. !Больной Е. 1 - 1 0 |

1 8. 1Больная 3. 1 ~ 1 0 )

1 9. 1Больная И. 1 - 1 0 1

1 10. 1Больная П. 1 - I 0 1

I 11. I Больной С. 1 - 1 0 (

I 12. ¡Больной С. 0 I

I 13. IБольной X. I - 1 0 (

1 14. (Больной Р. I - 1 0 |

I 15. 1Больной К. 1 - 1 0 I

1 16. (Больной Т. | - | 0 1

1 17. |Больной С. 1 - 1 0 1

I 18. (Больной В. 1 - I 0 I

| 19. (Больной Н. 1 - I 0 I

I 20. 1 Больной В. о 1

I 21. 1 1Больной С. 1 1. . . л о 1 ._ ________________1

Таблица 9

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОПУХОЛЕВОГО МАРКЕРА В СЫВОРОТКЕ ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ С ПОМОЩЬЮ НММУНОАГГЛЮТННАЦИОННОГО (ИАГ) И тШУНОФЕРМЕНТНОГО(ИФА) ДИАГНОСТИКУМОВ

1— — 1 и/11 г- г Здоровые | 1 Группа 1Результат ,,..... „. ,,... |Результат |

доноры | 1 крови | НАГ I 1ЮА 1

1 1. 1 Донор 1С. | 1 0(1) I - 1 0 |

1 2. Донор К. | Ш1У) I - ! 0 1

1 з. Донор К. | Л(П) | - 1 0 I

1 4. Донор М. | 0(1) | - 10 1

1 5. Донор П. | В(Ш) | - Г 0 |

1 с. Донор Т. 1 В(Ш) | - 1 0 |

! Донор Щ. | В(Ш) | - 10 |

1 а. Донор м. 1 0(1) I - 1 0 I

1 о. Донор Л. | А(Ш | - 1 0 I

1 10. Донор И. I ВЦП) | - I 0 I

1 11. Донор С. | 1 АВ(Ш * -< 1 0 1 ■ •

Таблица 10

ВЫЯВЛЕНИЕ ОПУХОЛЕЙ АНАЛИЗОМ СЫВОРОТКИ ИФА-НЕТОДОМ НА ОСНОВЕ МКА ИКО-25

1--- ■ ■ I Юшнико-морфологический I диагноз Т-1 IЧисло положитель-| |ных случаев к об-| |щему числу иссле-| 1 дованых |

1 Par молочной железы 1 1 I 43/60 |

I Рак легких 1 И/15 J

| Рак яичников 1 4/7 |

I Рак шейки матки I 2/3 I

I Злокачественная лимфома 12/3 |

I Лимфобластная лимфосаркома 1 2/2 |

| Рак кожи 1 1/1 1

1 Рак прямой кишки 1 1/1 1

I Рак почки 1 4/3 |

I Злокачественная лимфома 1 2/3 |

I Миелома 1 0/2 |

1 Рак гортани 1 0/1 1

I Саркома 1 3/4 |

I Лимфогрануломатоэ 1 1/4 1

I Рак мочевого пузыря • 1 1/1 1 > •

Таблица 11. Процент выявления для больных с онкологической патологией

I-Т"-1

IКлинико-морфологический| Процент | I диагноз | выявления 1

I--Ь-;-:-1

|Рак молочной железы | 72.7 I |Рак легких } 80.0 |

|Рак яичников | 60.0 ' |

I---I_I

выводи.

1. Разработана технология получения МКА ИКО-25 от оригинальной гибридомы-продуцента и изучена их специфность.

2. Разработана технология выделения и очистки антигена мембран жировых глобул женского молока. Установлено, что антиген МЖГ является гликопротеином, с молекулярной массой около 400 кДа, состава(в процентах к сухому веществу): белок - 2.5; гексозамины

- 8; Я - ацетилнейраминовая кислота - 16; нейтральные сахара -20: ДНК/РНК - 0.18.

3. Определены структурные особенности антигена ШГ: антигенные детерминанты находятся на полипептидном скелете: олигоса-харидные цепи антигена-№ связаны с полипептидным скелетом посредством О-гликозидной связи; углеводные группы участвуют в формировании антигенной структуры; достаточно прочные агрегаты мни-на, по всей видимости, формируются за счет М-ацетилнейраминовой кислоты.

4. Разработана иммуноферментная тест-система для количественного определения в сыворотке маркера опухолей эпителиального генеза со следующими характеристиками: диапазон измерения - 0-40 ыкг/мл; время анализа - 6.5 часов; чувствительность - 6.5 мкг/мл.; воспроизводимисть (КВ) - 0.6-1.8%; линейность - 92-110%; открытие - 94-109%.

5. Разработан иммуноагглютинационньй экспресс-метод для определения маркера опухолей эпителиального генеза в цельной крови или сыворотке со следующими характеристиками: диапазон измерений - 0.4-10 мкг/мл; время анализа - 15 шн.; обьем пробы для анализа - 50 мкл; чувствительность - 0.4 мкг; выявление антигена

- 100!?.

6. Показано, что с помощью разработанных ИФА и ИАГ тест-систем маркер опухолей эпителиального генеза выявляется в сыворотке онкобольных и не обнаруживается в сыворотке доноров и пациентов с неонкологической патологией.

7. Процент выявления нового маркера опухолей при-раке молочной железы - 72, 7, при раке легких - 80, при раке яичников -60.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. O.A. Полетаева, Г. В. Виха, A.D. Барышников. Р.И. Якубовская /Получение моноклональных антител ИКО-25 в условиях пристеночного культивирования//Сб. "Современные направления развития биотехнологии" под редакцией Р.Г. Василова. М.. 1991. стр. 31.

2. Г.В. Виха, O.A. Полетаева. Р.Г. Василов /Характеристика муциноподобного антигена, эскпрессированного на. опухолях эпителиального генеза//Бюллетень экспериментальной медицины и биологии. 1994, N 10, стр. 429-432.

3. o.a. Полетаева. А.Г. Мешандин, Г.В. Виха/Иммуноагглю-тинационный диагностикум на основе моноклональных антител для скрининга эпителиального опухолевого маркера в цельной крови онкологических больных//Биогехнология. 1995, N 3-4. стр. 50-51.

Участок множительной техники ОНЦ РАМН

Подп. к печати

Тираж 'l 00 экз

Заказ б 7-