Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование мутагенных свойств модифицированных олигонуклеотидов с помощью мутационной системы на основе бактериофага М13

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование мутагенных свойств модифицированных олигонуклеотидов с помощью мутационной системы на основе бактериофага М13"

j ъ

Йоат;оль ыйзшапщц)]

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ Р0СС5ЯС20Я ФЕЛЕРАПИИ НАУЧНО- ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ. НПО "ВЕКТОР"

?л прозах рукописи

лУБЬШЧЕЕА Галина Александровна

ИССЛЕДОВАНИЕ МУТАГЕННЫХ СВОГрТЗ ШЛЗ.'Г',СГ>1Г'С2.ЛН:-Эл ОЛИГОНУКЛЕОТИДОЗ С ПОМОЩЬЮ МПАЖОННОЛ С;:СТЕШ КА CCHOBÎ , БАКТЕРИОФАГА ШЗ

СО. 00.03 - Молекулярная Саазогия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

йзльцосо - 1352

îTii/zici выполнена в научно-исследовательском коксгрукторско-техколэгическом Уяогитуте биологически активных ветастЕ

Научные руководители

Официальные оппоненты -

доктор киикчвсккх наук Петренко В. А.

кандидат биологических наук Ильичев А. А. член-корреспондент доктор химических наук Власов B.R

кандидат биологических наук Куприянов O.k.

Бедуаая организация - Московский государственный

университет им. Ы. Е Ломоносоьа '.'екфакультетская проблемная лаборатория молекулярной бнологик к бсоорганкческой химки ем.А.H,Белозерского

Задита диссертации состоится " -3 " u-Qw^ 1992 г.

часов на sactдании специализированного совета' ьо LH/ffi молекулярной биологии Спос. Кольцово. Нопосибир-скал обл. ) " .

Дьторе$ерат разослан "V " ¿гчМ*г£ 1092 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной бяологки (пос-Ко-чьцовт, Новосибирская обл.)

Ученый секретарь специализированного Совета

Актуальность проблемы

В настоящее время среди молекулярных биологов популярна идея использования модифицированных олигонуклеотидов в качестве регуляторов экспрессии генов. В практическом плане эта идея предполагает создание терапевтических средств нового поколения - "генных" лекарств, представляющих собой модифицированные олигонуклеотиды (антисмысловые), комплементарные участкам нуклеиновых кислот и способные подавлять экспрессию вирусных генов, онкогенов или мутантных генов, являющихся причиной генетических заболеваний.

Однако, учитывая способность зтих веществ вмешиваться в процессы передачи генетической информации, необходимо рассматривать их и как потенциальные мутагены, которые в определенных условиях могут быть опасны для живой клетки, Исследование мутагенных свойств антисмысловых олигонуклеотидов является, поэтому,- необходимым этапом на пути создания ка их основе нового класса лекарств. Учитывая уникальность разрабатываемых препаратов и их высокую стоимость, нельзя рассчитывать на широкое использование для их исследования традиционных мутационных систем in vitro я in vivo,, например тестов Эймса, требующих значительных количеств'веществ. Кроме того, традиционные тест-системы дают очень скудную информацию о механизмах мутационных процессов, что не позволяет понять причины возникновения таких мутаций. Таким образом, актуальной задачей в области антисмысловых олигонуклеотидов является разработка специфических "молекулярных" мутационных тест-систем, не требующих больших количеств препаратов, и дающих возможность оценить потенциальную роль в мутагенезе всех структурных элементов модифицированных антисмысловых олигонукдзоги-дов.

Цель работы.

Целью-работы было создание мутационной тест-системы ка основе бактериофага М13 и исследование с ее помощью мутагенных свойств ряда олигонуклеотидов с различными модификациями сахаро-фосфатного остова, часть из которых исполь-зуется-шш может быть использована в конструировании анти-смксловых олигонуклеотидов.

Научная новизна и практическая значимость

На основе мутактных форм бактериофага М13 разработана мутационная система, обеспечивающая возможность наблюдения генетических эффектов, обусловленных модификацией сахаро-фрс-фзтного остова ДНК, и исследования мутагенных свойств модифицированных олигонуклеотидов.

Впервые исследованы мутагенные свойства олигонуклеотидов, несущих .в 'своем составе шрофосфагные, зтилекдиаыиновые, лизиновые, гексаметилендиаминовие * й фосфотиоатные шж-

нуклеотидные остатки, а также рибозильные остатки.

• Показана генетическая "безвредность" исследованных типов модификаций для ДНК прокариотической клетки.

Приведены экспериментальные доказательства гипотезы о возникновении мутаций при олигонуклеотиднаправленном мутагенезе через механизмы репарации гегеродуплексов.

Полученные данные были использованы при конструировании целевых мутантов в работах по темам НПО "Вектор".

Данные, подученные в работе могут быть использованы при разработке терапевтических средств нового поколения - "генных" лекарств.

. Апробация работы

• Основные результаты опубликованы в 4-х печатных работах.

Материалы диссертации докладывались на Всесоюзном совещании по НК-дуплексам (Киев, 1939), Международном симпозиуме "Synthetic oligonucl eoti des : problems aid frontiers of practical appli'cation" (Москва, 1Q91), на научных конференциях НПО "Еектор".

Обьем работы и структура диссертации

Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста, включая 20 рисунков,, 5 таблиц и список цитируемой литературы (197 наименований); состоит из следуюетх разделов: введение, обзор литературы, результаты и обсуждения, экспериментальная часть (материалы и методы), еыводы.

Содержание работы Олигонуклеотиды и типы модификаций сахаро-фосфаткого остова.

В рамках настоящей работы исследована две серии модифицированных олигонуклеотидов: содержащих единичные и множественные модификации сахаро-фосфатного остова.

Серия 2-4-25-26-меров содержала единичные модификации са-харо-фосфатного остова (рис.1). ДЕа олигомера (I и II) содержали рибогуанозин вместо дезоксирибогуанозина, два (III и IV) - пирофосфатное межнуклеотидное звено, четыре - различные типы фосфоамидных межнуклеотидных связей. - этилендиаминовую (V), лизиновую (VI) и гексаметилендиамиковую (VII, VIII).

Олигонуклеотиды с множественными модификациями саха-ро-фосфатного остова представлены 17-мерами (рис.2). Олигоме-ры XII,XI11, содержали два этилированных межнуклеотидных звена, олигомер XI представлял собой фссфотисат.в котором каждое межнуклеотидное звено модифицировано.

В качестве.контрольных з каждой серии олигомеров использовали фосфодизфирные олигонуклеотиды: 25-мер IX и 17-мер X. •

Ё

*шассА1С*1мсМАгЬхта<£ех:с!Ггасм

ксса/.-сккх-сжашст-з

]

^.ЖССкАкДСССКиСИПКЛягЛ

3 йтмкмъдсслссшкг-? „

1 \jkcu Лсмсескхсшак.-

Р 1ЩЛ1СССМ-С№С> •СййаШШ'5'

ii £.1?

аг/сое /н*}<их-лаоън 9*лля

1 ! 7 I ТИ.ИТ эгиери- дшмадо лчг-»-

оешАен- ТЩЮР-Ъмшн-алз в/а

1 ^кссштссШтшт

• ж ^тюею&сктт

тх$ ¿-ктшшс-сстт

,ш ¿-мсеа/аж-асаммсг

Рис. 1.0лигонуклеотиды (1-1 К) и типы модификаций сахаро-фос-фатного остова.

Приведены структуры гетеродуплексных участков ДНК М13шр1:25-мер; ДНК М13тр1: 26-мер II; ДНК. М13тр1: 24-ыер (IV,VIII). Области делеций 19-го тимидина, 26-го и 27-го цитидинов отмечены треугольниками. гБ - рибогуаноеин; * - модифицированный участок.

Грммл) матч МП

М«тНаТ

__ Ш2' к

в 5' ...АТЙАСйШТ1АССЙШСМТ$СС...

стааткстдгстслсса

__ 21 с? 7

Г .5'.. .стшшт атасшАхтсАстсасс... АТАСТСаТА СТААТиС

V

А У - СоТрАрАрТр0рСр(1рТрАрарТЛ!2А(5СоС|за хх^ххххххххххУхх

"6 5'- АоТоАрСрТрСрарТрАрОрСрТрАаАрТрОэС

• нпшштш

Рис. 2. Структура модифицированных 17-меров и их комплексов с ДНК М13тр1. ^

А - олигомеров Х-ХГ1; Б - олигомвра XIII; х=У=0~ - для фосфодиэфирного ол^гомера X; х=У=Б~ - для фосфотиоата XI; х=ОТ У=0-СНд-СН5- для фосфотриэфирных олигомероз XII, XIII; В - комплекс олигомеров Х-XII с ДНК ШЗгор!: Г - комплекс олигомера XIII с ДНК М13тр1; А - место де-'леции 19-го тимидина; 7 - место вставки цитидина. Сверят приведена схема Бзаимопревращзний ДКК-матриц с помощью модифицированных 17-меров.

- Б -

Выбор в качестве объектов исследования олигонуклеотидов с именно такими модификациями сахаро-фосфатного остова обусловлен использованием некоторых из них в качестве антисмысловых (тиоаты,. этилированные, смешанные рибо-дезоксирибонуклео-тиды). Другие производные (фосфоамидные, пирофосфатные), ■ вследствие повышенной устойчивости к эндонуклеазной деградации, а также способности нести в своем составе группы, обеспечивающие 'липофильность, реакционномпособность и т.д., (фосфоамидные) могут рассматриваться как потенциальные антисмысловые последовательности.

Модельная система для изучения мутагенных свойств олигонуклеотидов с модификациями сахаро-фосфатного остова.

Для исследования мутагенных свойств модифицированных олигонуклеотидов мы разработали простую тест-систему на основе бактериофага М13. Она позволяет проследить за судьбой единичных модификаций сахаро-фосфатного остова в составе ДНК, и оценить, таким образом, потенциальный мутагенный зффект этих модификаций и олигонуклеотидов вцелом.

■ Принцип исследования заключается в следующем. Синтезируют олигон-уклеотид, содержащий в заданном месте модифицированное звено и способный индуцировать маркерные делеции в начале генаа(-пептидаД-галактозидазы (lacZ') фага М13шр1 или его производного. Олигомер используют как праймер для полимераз- ^ ной достройки второй цепм гетеродуплексной ДНК, которой тран-сфицируют компетентные клетки Е. coli JM103. По измененному фенотипу фаговых бляшек отбирают мутантов, содержащих маркерные делеции. Такие мутанты являются потомками цепи ДНК, несущей модифицированный участок, поэтому, определяя нуклеогидную последовательность ДНК в области маркерных делеций, можно проследить, к каким генетическим последствиям приведет наличие данной модификации в составе ДНК. В каждом варианте мутагенеза было отсеквенировано не менее 5 мутантных ДНК, а в

случаях гетерогенности мутантных вариантов - не менее 8.

Для того чтобы определить какие типы мутаций могут индуцировать модифицированные 24-25-26-мары, рассмотрим возможные типы превращения гетеродуплекса з клетке на примере варианта М13тр1: 25-мер. (рис.3). 25-меры обр&зуют на ДНК-матрице М13тр1 две области неспаренности и могут индуцировать две маркерные делеции: 19-го тимидина (ДТ19) и 26-го щгеидина ДС26) (рис.1). Модифицированный участок расположен в области неспаренности.против 26-го цигидина Репарация обеих областей неспаренности приводит к сохранению в потомстве "дикого" генотипа (рис.3, путь 1). Сцепленное или раздельное закрепление в потомстве маркерных делеций приводит к образованию мутантов (рис.3 пути 2,3,4). Наличие неприродного узла в составе ДКХ может привести при ее репликации к возникновению сложных мутаций : нуклеотидных замен, инверсий, делеций, вставок. При этом маркерная делецияДИЭ или возникает^ или нет, что так же расширяет спектр возможных мутантных вариантов. На рис. 3 эти гипотетические варианты обозначены как пути 5 и б.

Для фенотипического тестирования рассмотренных типов мутаций мы разработали систему ДНК-матриц на основе одноцепо-чечньи ДНК фага М13тр1 и его производных, отличающихся сдвигом рамки считывания 1асг'-гена на одну-две буквы (рис. 4). Очевидно, что двойная деледаяДТ19Д С26 или единичные делеции (&Т19 или'ДС2б) приводят к сдвигу рамки трансляции 1асг'-гена и могут быть обнаружены на матрице М13шр1. Ка матрице М13пб1 отбираются только мутанты с единичной маркерной делецией (ДТ19 илийСйб), а на матрице Ш.31из2 - мутанты, содержащие единственную маркерную делециюЛС2б. Более сложные мутации, если они возникают, могут.быть обнаружены на ДНК-матрицах Ш3шр1 или Ш3из2, причем, если такая сложная мутация не приводит к изменению фенотипа фаговой колонии М13тр1 то она тестируется как мутация сдвига рамки на Ы13пк2 (Ьас+-—1ас-) (см. рис. 4).

Рис. 3. Возможные пути превращения гетеродуплекса в клетке. 1 - репарация области неспгренкости, приводящая к . исходному генотипу; 2 - закрепление двух делеций Т19 и С25; 3,4 - закрепление одной из двух возможных делеций; 5,6 - возникновение сложной мутации в области неприродного узла при закреплении маркерной делеции 115 (5) или при ее отсутствии (5);■ I - область индукцииДТ19, I! - область индукции ДС25 •

ДНК-матицы ИЦпИ

."дтадссАТйлттАесамтсА..

...ДТЗАОСАТсооИзсддсиг.

..ЛТМССАТсдаиссдэеТСА.

м«шоиг ...ДтадсМТСАТТАСОЗАТоаа

Рис. 4. Система фенотипическсй селекции мутантов. Обозначены: -ч,— делеция 19-го тимиднна;

--вставка цитидика;----делеция 25-го штшша;

- делеция 26,27 цитидинов; -сэ- - сложная мутация, Зп. Зп=1 - число нуклеотидкых остатков в ней. Прописные буквы соответствуют нукдесгиднсй последовательности ДНК М13тр1: строчные - нуклестиднкы последовательностям ДНК мутантов'.

Исследование мутаг&нных свойств олигонуклеотидов, содержащих рйбоостатки й пирсфосфаткьа межкуклеотидные связи.

Исследованы 2 олигонуклеотида, содержащих в середине цепи единственный рибонуклеотидный остаток: 25-мер I и 26-мер 11. Нас интересовал вопрос о возможном влиянии ркбонуклзотид-ного звена з составе ДНК на точность процессов репарации и репликации. Вряд ли следовало ожидать появления каких-либо дополнительных мутаций, кроме контрольных, з результате попадания такого гетеродуплекса з клетку. Однако было согершенно неясно, будет ли рлбсостаток эффективно узнаваться и вы-*щеп-

гстеишшм ,шнты

5(1

иг*

литься системами репарации бактериальной клетки. Если это . происходит., то можно-ожидать, что новосинтевироЕанная цепь будет рвпарирована в области неспаренности в пользу исходной, и выход мутаций, заложенных в нуклеотидной последовательности прайыера, уменьшится по сравнению с фосфодиэфирным олигомзром IX, или они не будут появляться совсем. Если рибоостаток-в составе ДНК не узнается репарирующими системами клетки, тогда существенных отличий'от контрольного варианта мы получить не . должны. Эксперимент подтвердил первую возможность.

Исследование мутагенных свойств рибоаналога-26-мера II на двух матрицах (М13гар1 и Ш.ЗтзЗ) показало, что в обоих случаях образуется только один тип мутаций - маркерная делеция 19-го тишдина. Сам же рибоостаток в составе гегеродуллексной ДНК не вызывал каких-либо мутаций. Выходы мутантов били низкими и совпадали для обеих матриц (2,1 и 1%).

При исследовании мутантов, полученных с рибоаналогом-25-мером мы обнаружили любопытные отличия от контрольного варианта (табл. 1). Если фосфодизфирный 25-мер индуцирует на матрице М13тр1, главным образом, двойные делеции -.¿Т19йС2б, (4 ив 5 проанализированных вариантов),го все 5 мутантов, полученных на той же матрице с его рибоаналогом I несли только ту маркерную делецию (ДТ19), которая индуцируется областью нэсларенкости не содержащей рибонуклеотид. Область неспаренности, содержащая рибонуклеотид и'находящаяся на расстоянии всего б нуклеотидных.звеньег от первой, мутации не индуцировала.

Мы попытались найти делецию 26-ого цитидина в селектирующих условиях на матрице ЩЗпб1. Для природного 25-мера на этой матрице найдены оба типа единичных делеций - иДТ19 и ДС26, однако для олигомера I и здесь был обнаружен только один тип мутаций - делеция 19-ого тимидша.

Вовникает вопрос, можно ли с помощью влиронуклеотаднап-равленного мутагенеза получить в потомстве маркерную мутацию, если в область неспаренности ввести рибонуклеотид ? Для того чтобы ответить на него, мы проанализировали вариант М13:ге2:1

Таблица I

aiiBETzEHOCTb хутаговааа, ыадраБЛБНного кодк^ллировакншлл 25-мсрам на ЗЖ ыгтршшх М13ср1, U13ni1, к Шаг.

Оого кумеокзд ¡лнк- ¡ха^рица 1 lOdmee k-eov ! проанализированных ■Кол-во ксло-!кпГ. измененного ieHoTJua |Вкхог. мутан-(ТСЗ в *Г

X СраЗсалалог) 1031 27 2,С±:,1

12 (дирс^ссфатшм!) I262S 80S 6.0+3,6

7 (всжвдаылно-71- изаоЕовыС) 324? 7127 154 , 414 1,0+0,3 5.8+1,2

J3 (гексшегглон- ДНЯНКНОВЫй) IX (фо^ииэ^гршй! 1350 него 34 366 6.3+1,4 3,2+0,6

. I 4870 76 1,6+1,2

К ¿65« 24 0,2+0,1

1 Ш>в1 6300 . 19 0,3+0,1

7L 8175 22 0,3±0,1

7Д 16190" а 0,2+0,1

' IX 64СО 23 0,4±0,2

I 3S27 <16 1,2+0,4

0 Т 10200 12000 IS60 552 16.3*1,7 4,^0,6

Л 10050 653 6,6+0,6

ГА 4500 617 13,7±1.5

П. 3240 253 7,8jl,5

(см. табл 1), В этом случае образуется гетеродуплекс с единственной областью неспаренносги в районе рибогуанозина. Деле-цияДС26 была найдена, однако эффективность появления такой мутации в случае рибоаналога оказалась в б раз ншке, по сравнению с фосфодизфирныы 25-мером (1,27. против 7,8Х).

Очевидно, что присутствие рибэзы в составе гетеродуплексной' ДНК небезразлично для репарирующих систем клетки. Соео-чупность полученных данных свидетельствует о том, что такие Ш^ее ПШ§]ЭШМ р§8§фШР9Г по сравнению с обычными ''щифт"гнеспарэнностями. Тем ре ^энее не все рибонуклеотиды исгагочаются из состава ДНК. В некоторых редких случаях при-

родная цепь гетеродуплекса исправляется по новосинтезирован-ной, содержащей рибокуклэотяд, давая начало маркерной мутации. При этом присутствие самого рибозЕена не отражается на точности полимеразкого копирования ДНК и ье приводит к появлению каких-либо "случайных" мутаций.

По аналогичной схеме исследовали 25-мер III и 24-мер IV, содержащие в середине цепи единственный пирофосфатный межнук-леотидный остаток (рис.1, табл.1). Для пирофосфатного звена в 24-мере брешь расширена до двух нуклеотидов.

По типу индуцируемых мутаций эти олигояуклеотиды не отличались от фосфодиэфирного гомолога. В различных вариантах мутагенеза были найдены только маркерные делеции. Среди них преобладали двойные и более'редко встречались единичные. Увеличение бреши до двух нуклеотидов принципиально не сказывалось на этом распределении. Наличие прирофосфатного остатка, в-25-мере III увеличивало, однако, выход контрольных мутаций В вариантах ШЗтр1:Ш и Ж3тз2: III (см. табл.1) выход мутантов был по крайней мере в два раза выше по сравнению с фссфо-днэфирным гомологом (8,9% против 3,2% и 16,3% против 7,3%, соответственно). Ниже мы более подробно рассмотрим возможные причины гокого повышения. Здесь же только отметим, что это, по-видимому, связано с действием систем репарации и известной устойчивостью гшрофосфатноГг связи к эндонуклеазам СПурмаль и др. , 1984].

Таким образом, в ходе исследований было показано отсутствие мутагенных эффектов для пирофосфатной модификации саха- . рофосфаткого остова и остатка рибозы в составе ДНК.

Исследование мутагенных свойств олигонуклеогидоЕ, содержащих фосфамидные связи.

Исследованы мутагенные свойства 4-х олигомеров, содержащих вместо дезоксирибонуклеотида различные типы фссфоамидных остатков. Олигомер VI содержал сильно основное лизиновое звено, олигомер V - незаряженное этилендиаминозое, олигомеры VII

и VIII - незаряженное гексаметилендиаминовое (см. рис.1). Изучение мутагенных эффектов згой группы олигонуклеотидов представлялось интересным, поскольку входящие ь их структуру некуклеоткдные остатки по длине соответствуют куклеотидным звеньям и могут рассматриваться как аналоги, моделирующие алуриновый/апириыидиноЕые сайты, индуцирующие образование встаЕОК нуклеотидов (Loeb et al,1986, Lawrence et al, 1990). Нельзя было исключить также и появление в области фосфамидкого звена более сложных мутаций (обширных делеций, вставок, замен, инверсий) в результате.репарации или торможения ДНК-полимеразы на этом участке во время репликации (Lawrence et al, 1990V

Результа'гы анализ, мутантов, полученных с фосфоамид-ньпл5 25-мерами суммированы в табл. 1. Как следует из данных этой таблицы для всех типов фосфамидньк 25-мероЕ ни в одном варианте не зарегистрировано встзеок нуклеотидов или каких-либо иных мутаций, кроме контрольных делеций. Как и в случае пи-рофоефатных производных в большинстве своем ато были двойные маркерные делеции и более редко встречались единичные, причем иД?19 иДС2б были представлены среди м'утантного потомства в равной степени.

Аналогичные результаты были получены в экспериментах с гзксаметиленовым 24-мером VIII, .когда брешь для гексаыетилз-нового звена расширена до двух нуклеотидньк остатков. Здесь также были идентифицированы только маркерные и никакие другие мутации.

Шс-бычные мутанты были получены только в одном эксперименте при исследовании гексаметиленового 25-мера на ДНК-матрице Ш.Зпе1. В первом из 4-х поставленных опытов • было отмечено увеличение выхода колоний по сравнения с обычным уровнем для единичных делеций (с 0,3% до 1,8%). Исследование восьми ^утантньк колоний показало, что одна из них несет де-лзишоА^й, gpyp-ag-. = , а в остальных шести случаях наряду с закреплением обеих маркерных делеций, появляется дупликация

13-ти нуклеотидных звеньев, располагающаяся в области, непосредственно примыкающей к 5'-концу,олигомзра-праймера. Однако в последующих экспериментах с фосфоамидными олигонуклеотидами такой мутации обнаружить не удалось.

Анализ всей совокупности данных, полученных при изучении гексаметмлендиаминовых производных свидетельствует о.том, что индукция протяженных дупликаций не является характерной чер-. той таких олигомзров. Скорее всего найденная наш дупликация возникла в ходе аномального завершения полимеразного синтеза in vitro второй цепи ДНК. Тем не менее, обнаружение такой мутации свидетельствует о высокой чувствительности разработанной нами системы анализа модифицированных олигонуклеотидов.

Таким образом, в ходе исследования фосфоамидных производных было установлено, что наличие этилендиаминового, лизи-ноеого и сег.саметилендиашнового межнуклеотидных звеньев в составе олигомеров не приводит к появлению вставок нуклеоги~ дов, а также каких-либо других специфических или неспецифических мутагенных-эффектов и не_ влияет на точность полимеразного копирования в прокариогической клетке. По-видимому, зги типы межнуклеотидной связи не воспринимаются клеточными системами репарации и как повреждения а неспаренности, их содержащие, репарирушся по типу обычных "шифт"-неспаренностей.

Заключение по мутагенным-свойствам олигонуклеотидов с единичными модификациями сахаро-фосфагного остова

Итак, с помощью методов олигонуклеотидналравленного мутагенеза мы-исследовали ряд производных олигонуклеотидов,. содержащих едничные модификации сахаро-фосфатного остова. Из полученных экспериментальных данных следует, что все исследованные производные ндуцируют только три типа мутаций: двойные (ДТ19ДС26) и единичные маркерные делеции (ДТ19 илиДС26). Использование ДНК-матрицы Ш3тр1, на которой фенотилически теструются все три типа мутаций, и ДНК ML3msl, где селектиру-

ются только единичные делеции, позволяет вычислить долю каждого из этих типов в общем процессе мутагенеза.

Если выход всех мутантов на ДНК Ш3шр1 составляет х%, а единичных на М13тБ1 - у%, то доля единичных делеций среди общего числа мутаций определяется формулой 2=100%(у/х). Доля каждой из них составляет 0,5г, т.к. в большинстве случаев наблюдается равное соотношение обоих типов единичных делеций среди мутантов, полученных на ДНК М13пе1.

Таким образом, еся совокупность данных по 25-мерам может быть представлена в виде диаграммы (рис.5). На ней показано,

УОСФОДИЗФИРНМ

V 25 у СООН

ЛНаНИОВЛЯ

-мнлл^мн-

ЭТНДЕНДИАМИНОЬАЯ

он

РИБОНУШОТИД

-КНАМ/НН-

ГШМЕТМЩШИШЯ_ о о

П II

-о-р-о-р-

' . О" 0-ПНРОФОСФАТНАЯ

Рис. 5. Типы мутаций, индуцированные модифицированными 25-мерами. 1

Цифрами обозначены преобладающие типы мутаций в х процентном отношении к их общему числу; двойная делеция; делеция 19-го тимидина О- делеция 26-го цитидина.

какие типы мутаций и в каком соотношении индуцируются каждым 25-мером. 25-меры, содержащие в своем составе этйлендиамино-вый, лизиновый, гексаметлендиаминовый и пирофосфатный остатки, равно как и их природный гомолог, индуцирует только те маркерные мутации, которые предопределены их нуклеотидными последовательностями. Большая их часть (77-93%)-мутации, полностью соответствующие нуклеотидной последовательности олиго-мера. Меньшую часть (1-23%) составляют мутации, в которых

- 15 - ■

один из селективных маркеров "потерян". Сами по себе модифицированные участки сахаро-фосфатного остова не индуцируют каких-либо 'дополнительных мутаций.

Присутствие рибозного остатка такав не приводит к ка-¡сим-либо генетическим эффектам, однако меняет картину распределения маркерных мутаций. Больную их часть составляют мутанты только с одним селективным маркером, второй, расположенный в непосредственной близости от рибозного остатка, теряется, по-видимому, в результате усиленной репарации таких участков.

Разработанная нами молекулярная модель позволила точно определить положение модификации в составе ДНК и оценить ее потенциальный мутагенный эффект. В пределах изученного ряда производных таких эффектов не найдено, что позволяет надеяться,. что круг генетически безопасных модификаций сахаро-фсс-фатного остова в ДНК может быть достаточно широк.

Исследование мутагенных свойств олигомеров с множественными модификациями сахаро-фосфатного остова. Зосфотризфирные и тиопроизводные.

Исследование мутагенных свойств фосфотриэфирных и тио-произеодных олигонуклеотидов, которые в настоящее время активно используются как антисмысловые последовательности, проводили на 17-мерах (рис.2). Для изучения мутагенных свойств мы использовали аналоги XII и'XIII, в которых две верифицированные межнуклеотидные связи расположены на расстоянии 3-4-х нуклеотидоЕ от концов олигомера и с двух сторон от области неспаренности в гетеродуплексе (рис.2). Тиоаналог 17-мер XI имел типичное строение для антисмыслового олигонук-леотида, в нем каждая межнуклеотидная связь была модифицирована

Принципиальная схема исследования 17-меров с множественными модификациями'сахаро-фосфатного остова была такая же как для 25-меров с той лишь разницей, что в нуклеотидную последовательность 17-мероз была заложена только одна маркерная му-

тация : для олигомеров X,XI,XII - деления 19-го тимидина, для олигомера XIII - вставка цитидина в третий кодон 1асг'-гена М13тр1 (рис.2). Гдждый олигонуклеотид исследовали на двух ДНК-матрицах : X,XI,XII - на М2тр1, ЖЗпб!, XIII - на Ш. 3rr.pl, №13тр1ДТ. Полученные данные суммированы в таблице 2.

Таблица 2

Эффективность мутагенеза, направленного 17-мерами Х-XIII.

Тип мутагенеза Вектор: олигонуклеотид Изменение фенотипа бактерий при мутагенезе Выход мутантов. в %,*

вставочный MiSmpl: XI11 М13тр1ДТ: XIII Lac+~-Lac~ Lac-—-Lac^- .7,7— 0,16,7 -2,5

делеционный MlSrnpl : XII M13msl: XII Lac+—Lac-Lac-—Lac+ 11,2^2,2 . 17,3- 3,1

делеционный M3npl:X MISîisl: X Lac+->- Lac-Lac-—1-Lac+ 1,3^0,2 5,0=^2,0

делеционный Ml 3mpl : XI М13ПБ1: XI- Lac-t—Lac" Lac-—-Lac+ 3.0^=1,3 1,8 — 0,1

делеционный pMMl:XII Lac -*-Lac+ 3,3±2,0

* Среднее - арифметическое и стандартная ошибка по результатам не менее 3-х независимых опытов.

Секвенирование мутантов доказало, что все типы 17-ыеров, независимо от структуры сахаро-фосфатного остова индуцировали тодькр маркерные мутации и'никакие другие. .

Т&01М §§РЙ§8М, к ррлее изученому ряду мутагенно-безопасных моанфикздий сахаро-фосфатного остова в ДНК мы модам при-

соединить фосфотризфирные этилированные и фосфотиоатные меж-нуклеотидные связи.

Репарационный путь закрепления мутаций при слигонуклео-тиднаправленном мутагенезе на природных и модифицированных олигонуклеотидах.

Попарное сравнение вариантов мутагенеза с этилированным (XII) и фосфодизфирным (X) олигомерами показывает явное увеличение выхода мутантов в случае фосфотриэфирных производных: 11,2% против 1,3% для ДНК-матрицы MISmpl и 17.3Х против 5% для ДНК MiSirsl (табл.2) Увеличение выхода мутантов при использовании этилированных производных показано ранее (Петренко и др.,1936,1988,1990). Вспомним, что такое же увеличение мы наблюдали для пирофосфатных производных (см. выше).

Петренко была предложена модель, объясняющая увеличение выхода маркерных мутаций для фосфотризфирных производных (Петренко и др. ,1988). Согласно этой модели мутант мотет образовываться двумя путями: через репарацию молекулярной гете-розиготы, что приведет к возникновению гомозиготной мутантной колонии, и через независимую репликацию обеих цепей гетеро-дуплекса, что приведет к возникновению мозаичной колонии. Авторы предположили, что прирост в выходах мутантов, наблюдаемый для фосфотризфирных производных происходит за счет гомозиготных колоний. Это происходит вследствие предпочтительной репарации немутантной цепи гетеродуплекса, т. к. мутантная в области неспаренности содержит устойчивые к зндонуклеазам ' участки - этилированные мекнуклеотидные связи.

Авторы разработали'эту модель на системе, когда исходная ДНК-матрица генерировала доминантный Ьас+-фенотип, а мутант -рецессивный Lac-, поэтому реальный вклад в мутагенез реялика-тиьного пути,- когда гетерозиготные колонии не тестировались фс-ногипически, оценить было трудно.

Для оценки достоверности предложенной модели и роли каждого из рассмотренных путей в возникновении мутаций мы прове-

ли дополнительное исследование. Для нас оно имело принципиальное значение, поскольку система анализа для модифицированных 24-25-26-меров была построена на феноткпическом тестировании.

На основе уже изученных 17-меров, генерирующих только маркерные мутации, мы разработали мутационную систему, позволяющую тестировать по фенотипу как гомо- так и гетерозиготные мутантные колонии. Система, включала в себя четыре варианта фага, два плазмидных аналога фагов (рШ1 и рШЗ), два фосфот-риэфирных олигонуклеотида XII и XIII и фосфодиэфлрный олиго-мер X. Плазмида рШ1, аналог фага ML3msl была получена замещением PvuII-фрагмента в püCIS на аналогичный из РФ ДНК M13msl, содержащий неактивный lacZ'-ген. Схема взаимопревращений фагов и плазмид с помощью олигонуклеотидов представлена на рис. 2 сверху. Проводили два типа мутагенеза : вставочный и делеционный. Кроме того, представлялось интересным последовать, влияет ли на характер закрепления мутаций природа генетического материала ДНК.: в одном случае это были бактериофаги, в другом - двухцепочечная плазмида.

С помощью одного и того же олигонуклеотида в одном случае получались доминантные Ьас+-колонии, а в другом - рецессивные Lac-, Как следует из данных табл. 2, выходы мутантов в обоих случаях сущестЕено не отличаются мевду собой, что свидетельствует о' гомозиготности колоний, получаемых в обоих вариантах. Прямое титрование мутантных Lac+-колоний показало, что большинство из них являются гомозготными, независимо от того, какой тип мутации (делеция или вставка) образуется, происходит ли мутагенез на плазмкде или бактериофаге. В каждом варанте было оттитровано по ?.0 мутантных колоний.

Мы провели титрование Lac+-мутантных колоний, полученных на матрице М13трШГ с фосфоамидным и пирофосфатным 24-мерами, и L&C+-колоний, полученных с помощью 25-мера-рибоаналога ка ДЩ- матрице M13msl' и получили аналогичные результаты.

Полученные данные полностью подтверждают гипотезу Петренко о путях образования маркерных мутаций. Мутации, индуци-

рованные пирофосфатными, фосфоамидными, фосфотризфирными и рибоаналогами олигонуклеотидов а также фосфодиэфирныыи олиго-нуклеотидами образуются репаративным путем. Повышение выхода таких мутаций в случае фосфотриэфирных и пирофосфатных-производных может объясняться блокированием одного из путей репарации. ' •

ВЫВОДЫ

1. На основе мутантных форм бактериофага М13 разработана мутационная система, обеспечивающая возможность наблюдения генетических эффектов, обусловленных модификацией сахаро-фос-фатного остова ДНК., и исследования мутагенных1 свойств модифицированных олигонуклеотидоЕ. , '

2. Исследованы мутагенные свойства олигонуклеотидов, способных индуцировать маркерные мутации, обусловленные их нук-леотидными последовательностями, и несущих в своем составе ряд модификаций сахарофосфатного остова Наличие в составе олигонунлеотида пирофосфатногс, этилендизминового, лизиново-го, гексаметилендиаминового, этил- или тиофосфатного мехнук-леогкдньк звеньев, а также рибонуклеотидного остатка не изменяет их специфических мутагенных свойств и не приводит к возникновения каких-либо других мутаций.

3.В ходе репарации гетеродуплексных районов ДНК, содержащих две области неспаренности и образованных с участием пирофосфатных, фосфамидных и фосфодиэфкрных олигонуклеотидов, с. низкой вероятностью возникают мутанты с.потерей одного .из генетических маркеров,

4. Наличие в области генетического маркера неспаренйости, содержащий рибазильный остаток в составе ДНК, приводит к уси- ' лению репарации этого участка и потере данного генетического маркера.

5. Мутации, индуцироганные нуклеотидными последователь-костями пирофосфатных, фосфоамидных, фосфотриэфярных олигонуклеотидов а ташке рибоаналогами и фосфодйзфирными олигонук-

леогидами »вкрапляются в фаговом потомстве как гомозиготные

варианты и образуются репаратиЕным путей.

Основное содержание диссертации изложено в работах

1. Петренко В. L , Кузьютчева Г. А.-,ТатькоЕ С. IL ,Краснс£ог-ов И. К. , Поздняков П. И. , Ильичев А. А.. Батурина К. И. , Хомзв Е Б. Исследование механизмов мутагенеза, направленного фссфотри-эфирными аналогами олкгонуклеотилов. Роль репарации ъ закреплении мутаций.//Молекуляр. ' биология 1ЭЭ0. Т. 24 С. 450-466.

2. Петренко Е А., Кузьмичева Г. А , Татьгав С. И., Краенсбсрсв И. II , Ильичев А. .А. , Батурина К. И. , Майстренко Е О., Цитович А, Е , Долинная Н.Г.. Шабзрова 3. А. Мутагенез, направленны;! кепрп-родными аналогами олигонуклеотидов. I. Участие рпбснуклестид-ных звеньев в репарации и репликации ДИК. //Молеку—ip. биология. 1990. ?. 24. С. 1322-1338.

3. Петренко Е А. , Кузьмичева Г. А., Татьков С. И. , Краснобсрсв И. ]{. , Ильичев А. А. , Друца R JL . ¡Ьбарсва 3. А. Исследование мутагенных свойств одигонуклеотвдов, содерх&дих пирофосфатнсе звено, с помощью мутационной системы на ochoeo фага ШЗ. //Модекуляр. биология 1991. Т. 25. С.

4. Петренко R А. , КузьмичеЕа Г. А. .Татьков С. И. Исследование мутагенных свойств модифцированних олигснуклеотндоЕ.. //Всесоюзное совещание по КК-дуплексам. Сборник тезисов. Киев 19С9.

Б. Petrenko V. А. , Kuzracheva G. А.. Karpenko L. 1. , Tatkov G. I., Ilyichev A.A. Investigation of mutagenic properties of oligonucleotide anal ogues.//"Synthetic ol i gonucl eoti ces : probl ems and f ronti ers of practl cad appl i cati on" Mcskow. USSR. June 23-30. 1991. P. 95.

Отпечатано во 23" ЧБ Заказ 165 тара* ICO