Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Первичная структура транспортных РНК, кодируемых бактериофагом Т5

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Первичная структура транспортных РНК, кодируемых бактериофагом Т5"

Б од

российская академия наук Институт молекулярной биологии ии. В.А. Энгельгардта

На правах рукописи

ШЛЯПНИКОВ МИХАИЛ ГРИГОРЬЕВИЧ

УДК 577.21

ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА ТРАНСПОРТНЫХ РНК, КОДИРУЕМЫХ БАКТЕРИОФАГОМ Т5

специальность 03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1994

Работа выполнена в Институте биохинин и физиологии микроорганизмов РАН

Научный руководитель: академик РАН А.А.Баев.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Т.В.Венкстерн доктор биологических наук А. А. Колесников

Ведущее учреждение: Институт биохимии им. А.Н. Баха

Защита диссертации состоится "1С" 1994 г. в час.

на заседании Специализированного совета Д 002.79.01 при Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 117984, Москва, ГСП-1, ул. Вавилова, 32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта

Автореферат разослан * 2£* 1994 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат химических наук

А-Н. Крицын

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Транспортные РНК явились первыми индивидуальными молекулами нуклеиновых кислот, для которых была определена первичная структура. К настоящему времени установлена нуклеотид-ная последовательность уже нескольких сотен тРНК. Однако, до сих пор во многом остаются неясными структурные основы специфичности их взаимодействия с различными белками и другими компонентами клетки. Особый интерес в последние годы проявляется к изучению элементов структуры, определяющих строгую селективность процесса аминоацилирования тРНК ("tRNA identity"), с использованием в качестве модельных систем, главным образом, тРНК и аминоацил-тРНК-синтетаз (АРСаз) E.colt. Исходным этаном такого рода исследований является поиск консервативных последовательностей в изоакцепторных тРНК, в пределах которых, очевидно, и располагаются искомые элементы. Очевидно также, что с увеличением числа сравниваемых изоакцепторов повышается и вероятность функциональной значимости указанных последовательностей. В случае E.coli, структурная база подобных исследований может быть значительно расширена за счет привлечения данных о структуре транспортных РНК, кодируемых бактериофагами, но использующих в ходе своего функционирования те же компоненты, что и тРНК клетки-хозяина. В этом отношении особый интерес представляет бактериофаг Т5, который кодирует тРНК, специфичные ко всем 20 аминокислотам, участвующим в белковом синтезе, а также ряд изоакцепторов, и информация о нуклеотидной последовательности этих тРНК может оказаться весьма полезной при решении рассмотренных выше проблем. Кроме того, определение первичной структуры является первоочередной задачей в изучении роли тРНК в ходе фаговой инфекции, их декодирующих свойств, особенностей процессинга и т.д. \

Цель и задачи исследования. Настоящая работа являлась частью комплексного исследования , проводимого в течение многих лет в ИБФМ РАН. Основная ее цель заключалась в изучении первичной структуры тРНК фага Т5 и их генов. В соответствии с данной целью были определены следующие конкретные задачи исследования:

- оптимизировать методы прямого секвенирования равномерно меченных in vivo фосфором-32 фагоспецифичных тРНК;

- определить первичную структуру некоторых тРНК фага Т5;

- определить нуклеотидную последовательность генов тРНК; фага Т5;

- провести сравнительный анализ структуры секвенированных в данной работе тРНК с тРНК Е.coli, фага Т4 и тРНК из других источников.

Научная новизна. Полученные в данной работе результаты имеют несомненный приоритетный характер. Впервые установлена первичная структура пяти тРНК, кодируемых фагом Т5, и показана применимость метода двумерной тонкослойной хроматографии (ТСХ) на целлюлозе для фракционирования различных смесей олигонуклеотидов в процессе секвенирования. Впервые определена нуклеотидная последовательность двадцати одного гена тРНК фага Т5. Проведенный анализ секвенированных фаговых тРНК выявил ряд интересных особенностей их строения с точки зрения обобщенной модели "клеверного листа",-а также в сравнении с соответствующими тРНК Ж. coli и фага Т4. На основании информации о структуре антикодонов, по аналогии с митохондриальными тРНК, выдвинута гипотеза о декодирующем потенциале тРНК фага Т5, особенность которого заключается в транслировании всех четырех кодонов несмешанных семейств одной тРНК с немодифицированным U в первом положении антикодона.

Научно-практическая значимость результатов. Полученные в настоящей работе данные о нуклеотидной последовательности двадцати одной тРНК фага Т5 значительно расширяют структурную базу функциональных исследований тРНК в системе трансляции Ж. coli, из которых наибольший интерес представляют эксперименты по выяснению структурных основ специфичности взаимодействия этих макромолекул с различными белками и другими компонентами клетки. Кроме того, фаговые тРНК и их гены могут послужить удобной моделью для изучения процессинга, в частности, разнообразных биохимических реакций посттранскрипционной модификации тРНК. Созданные на их основе супрессорные тРНК могут быть использованы в работах по белковой инженерии, а фаговые тРНК, узнающие "редкие" для E.coli кодоны - для оптимизации трансляции определенных матриц in vivo или in vitro.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на IV советско - французском симпозиуме "Взаимодействие белков и нуклеиновых кислот" (Ташкент, 1977); EMBO-FEBS 'ЧИНА. Workshop" (Страсбург, 1980); IV двустороннем симпозиуме СССР-ФРГ "Структура и транскрипция генома" (Ереван, 1981); Всесоюзной конференции

"Вирусы микроорганизмов и растений" (Ташкент, 1986); Всесоюзной конференции "Новые направления в биотехнологии" (Пущино, 1986); 15th International tRNA Workshop (Кап-де-Агде, 1993); X российско - германском симпозиуме "Структура и функция генома" (Суздаль, 1993).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 статей.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ I. Определение первичной структуры тРНК фага Т5

Основой для данного раздела работы послужили выполненные главным образом С.И.Казанцевым исследования кинетики синтеза фагоспецифичных стабильных РНК в инфицированных клетках E.coli и разработка метода их фракционирования двумерным электрофорезом в полиакриламидном геле (ПААГ) (Рис.1). Определение первичной структуры равномерно меченных' in vivo фосфором-32 тРНК фага Т5 проводилось классическим блочным методом. Единственное существенное отличие заключалось в использовании двумерной тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинках с целлюлозой для фракционирования разнообразных смесей олигонуклеотидов. Указанный метод обладает следующими преимуществами в сравнении с обычно применяемой для этих целей электрофоретической системой Сэнгера: а) простотой и возможностью одновременного анализа большого числа проб; б) высокой чувствительностью с пороговым уровнем при радиоавтографии менее 50 импульсов/мин.; в) надежной воспроизводимостью, что существенно в процессе реконструкции молекулы тРНК; г) высокой

Leu

Gin

if

Pro Asn Л

Рис.1. Двумерный электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) фракции равномерно меченых in vivo фэсфором-32 4-5S РНК фага Т5. Первое направление - 10% ПААГ/ 7М мочевина/трис-борат (10 V/см, 15°С); второе направление - 20% ПААГ/ 4М мочевина/ трис-борат (20 V/см, 2б°С). Отмечены тРНК, структура которых установлена прямым секвейироваяием.

разрешающей способностью, позволяющей разделять сложные смеси олигонуклеотидов уже на пластинках 10x10 см.; д) высокой селективностью не только по отношению к нуклеотидному составу и любой модификации оснований, но и к положению некоторых оснований в олигонуклеотиде. При этом используются только две системы растворителей (Рис.2). Стратегия секвенирования состояла в определении структуры каждого олигонуклеотида из двух наборов, полученных в результате исчерпывающего гидролиза тРНК панкреатической РНКазой (р-олигонуклеотида) и РНКазой Т1(t-олигонуклеотиды), с последующей реконструкцией молекулы на основе анализа продуктов ограниченной фрагментации тРНК одной из указанных РНКаз. Для решения первой задачи использовались следующие подходы: а) определение нуклеотидного состава (РНКаза Т2); б) дальнейший гидролиз дополнительной РНКазой (РНКаза А для t-олигонуклеотидов и РНКаза Т1 для р-олигонуклеогидов); в) специфическое расщепление по адениловым остаткам РНКазой И2(только для t-олигонуклеотидов) с последующим анализом продуктов; г) частичный гидролиз фосфэди-эстеразами (ФДЭ) из змеиного яда или селезенки; д) полный гидролиз дефосфоршшрованных олигонуклеотидов ФДЭ змеиного яда. Структура большинства р-олигонуклеотидов и многих t-олигонуклеотидов может быть установлена на основании данных, полученных методами а) - в). В остальных случаях привлекались результаты по частичному гидролизу ФДЭазами исходных олигонуклеотидов или продуктов их расщепления РНКазой U2. Здесь, как правило, применялся так называемый анализ по сдвигу (mobility shift analysis), основанный на строго специфичном изменении хроматографической подвижности олигонуклеотида при отщеплении того или иного нуклеотидного остатка (Рис.2). Смеси олигонуклеотидов, не разделившихся при хроматографии панкреатических или Т1 - гидролизатов тРНК, дополнительно не фракционирва-лись. Во всех подобных случаях строение каждого продукта удавалось установить в ходе анализа их смеси с использованием указанных выше подходов. Структуру подтверждали секвенированием индивидуальных олигонуклеотидов, выделенных из крупщх фрагментов, содержащих только один из компонентов смеси, в поцессе реконструкции молекулы тРНК. Модифицированные нуклеотиды идентифицировали только по их хроматографической подвижности в стандартной двумерной системе (Рис.2в) в сравнении с многочисленными литературными данными.

15 li

™ 13 • >

r-

• r

-V

t1 Gp t2 ITGp t3 pGp t4 CGp t5 AGp t6 CUGp t7 UAGp t8 DAGp t9 T®CGp t10 CUAUGp t11 AACDGp t12 AACDGmGp

t13 m6AU®CCGp t13' AUfCCGp t14 CCUUAGp t15 CCCCACCAOH tl6 ACAAUACGp t17 CUUAAAUGp ■118 UCUCCCUAGp

p1 Up p3 $p p5 ACp P7 GCp p9 GmGD p10 AGCp p12 AAAUp

p13 AGm6AUp p13' AGAUp p14 AGACp p15 GAGUp p16 GGAACp p17 pGGGGCp p18 GGGAGTp

p2 Cp p4 AUp p6 GUp p8 AAUp p9' GGDp p11 GGCp

Г»

u

k,....

9 «WWJ*

U ■

Рис.2. Двумерная тонкослойная хроматография на целлюлозе

(пластинки 16x16см) продуктов полного гидролиза 32Р-меченой

тРНКЪеи фага Т5 РНКазой Т1 (а), панкреатической РНКазой (б)

и РНКазой Т2 (в). Для (а) и (б) справа приведена структура

соответствующих олигонуклеотидов. Частичный гидролиз ФДЭ азой селезенки смеси двух олигонуклеотидов из панкреатичес-

кого гидролизата тРНК

Gin

(д). Двумерная ТСХ (10x1Осм)

продуктов совместного гидролиза панкреатической РНКазой и

РНКазой Т1 суммарной 32Р-РНК E.coll (г).

"А" - изо-масляная кислота / 0.5М НН40Н (5/3, 7/7, рН З.Т);

"В" - изо-пропанол / конц.НС1 / Н20 ( 68 / 17 / 15, 7/7 );

"С" - t-бутанол / 0.075М формиат аммония (рН 3.8) (1/1,

v/v, рН 4.8) при 15°С. Во всех случаях хроматографию в первом направлении проводили в системе "А".

г

д

Реконструкцию нуклеотидной последовательности тРНК проводили на основании анализа фрагментов, полученных ограниченным гидролизом тРНК панкреатической или Т^РНКазой в условиях стабилизации вторичной структуры с последующим их фракционированием двумерным электрофорезом в ПААГ. Указанный анализ заключался в сравнении t-и р-фингерпринтов фрагментов между собой и с фингерцринтами целой тРНК. Как уже отмечалось, хорошая воспроизводимость метода двумерной ТСХ позволяет надежно интерпретировать такое сравнение. С использованием рассмотренных в данном разделе подходов была установлена первичная структура пяти транспортных РНК фага Т5, специфичных к Asn, Asp, Gin, beu и Pro (Рис.3). Указанные аминокислотные специфичности секвенированных тРНК определены на основе структуры антикодонов. Только для TPHKAsp и тРНК1ви была показана соответствующая акцепторная активность in vitro.

2. Секвенирование генов тРНК фага Т5

Другое направление наших исследований заключалось в изучении структурно-функциональной организации области генов тРНК фага Т5 (проводилось совместно с В.Н.Ксензенко). Дистальная часть указанной области (примерно 6,5 т.п.н.) была клонирована преимущественно в векторах серии pUC в виде взаимоперекрывающихся фрагментов ДНК и секвенирована по методу Максама-Гилберта. При определении нуклеотидной последовательности проксимальной части области генов-тРНК фага Т5 мы столкнулись с рядом трудностей, связанных, главным образом, с наличием в ней большого количества сильных промоторов. Данная проблема была решена путем использования векторов на основе фага М13, специализированного плазмидного вектора для клонирования сильных промоторов pKWill, а также клонирования и секвенирования продуктов ПЦР, прямого секвенирова-ния ДНК фага и др. Нуклеотидаая последовательность проксимального участка (примерно 7,7 т.п.н.) была определена по методу Сэнгера. На основании характерных элементов вторичной структуры в секвени-рованной области были локализованы гены всех тРНК, идентифицированных ранее в лаборатории С.Вейса на основании данных по гибридизации аминоацил-тРНК с ДНК фага Т5 (Hunt et al.,1980). Первичная структура генов тРНК фага Т5 (исключая рассмотренные в разделе I.) приведена на Рис.3.

3. Особенности структуры транспортных РНК фага Т5

Структурные особенности тРНК фага - Т5 необходимо рассматривать прежде всего с точки зрения ставшей уже классической обобщенной модели "клеверного листа" (Рис.ЗБ.). Данная модель учитывает наиболее.консервативные элементы первичной и вторичной структуры тРНК, обеспечивающие, как полагают, сходство пространственного строения последних, которое, в свою очередь, и определяет функциональное единство этих макромолекул в процессе биосинтеза белка. Все транспортные РНК фага Т5, кроме тРНК^®, jpj^Serg и Tpnn;prot шеют те или щщд отклонения от обобщенной модели, заключающиеся в: 1) замене инвариантных или полуинвариантных нуклеотидов; 2) отсутствии комплементарности оснований в шпильках; 3) вставке добавочных нуклеотидных остатков в некоторых участках молекулы; 4) увеличении размеров D-шпильки за счет нуклеотидов соответствующей петли. В большинстве тРНК встречается одновременно несколько аномалий в разных комбинациях. Наиболее существенные отклонения от обобщенной модели наблюдаются у тРНКТгр (замена Ug, нарушение комплементарное™ в позициях С^-А^д и T.j-Tyg, полное отсутствие D-шпильки) и тРНКа1у (замена U8 и а14, нарушение комплементарности в позициях С10-Сг5> С2?-С43 и Т4д-Сб5. дополнительная пара в D-шпильке C14-G21). В транспортных РНК из других источников подобные аномалии встречаются крайне редко и, как правило, не затрагивают более одного участка молекулы. Митохондриальные тРНК , которые еще в большей степени не соответствуют обобщенной модели, в данном случае следует исключить из рассмотрения, так как они являются частью уникального трансляционного аппарата митохондрий. В тоже время необходимо подчеркнуть, что тРНК фага Т5, тем не менее, сохраняют свою функциональную активность как в реакции аминоацилирования (показано в работах Вейса), так и в процессе трансляции in vivo в системе Е.соИ в виде амбер-супрессоров (наши предварительные данные). Очевидно, часть отмеченных выше отклонений от канонической модели не приводит к существенному искажению L-образной третичной структуры (пункты 2), 3) и, возможно, 4)), а отсутствие водородных связей в районе контакта D- и ТФ- ветвей в следствие замены консервативных оснований (пункт 1)) компенсируется, вероятно, другими внутримолекулярными взаимодействиями.

Другой аспект анализа тВНК фага 15 заключается в их сравнении с соответствующими изоакцепторными тРНК из различных источни-

щштш

ЕМШ 12345811

тРНК Asn

Asp

Gin

Leu

Pro

Гены Ala

Arg

Cys

Glu

Gly

Ilel

Ile2

Lys

il i;

G G II II С С G mm« G A G С U С

G С G А С С G il•ilt 1 GG G С II G t . t t

U G G G G A G i m il DA G С U U

G G G G С II A 1 1 1 111 < ВС С D G G

С G С С G A U 11 111 1 1 DA G С D С * . . .

тРНК

G G G С G A A i m t il TA G T G T . . . *

G G G G G T G HHIH TA G T С T . í . .

С G A С С G T 111 i 111 TG G CT G . . t

G T С С T G T 1111111 TA GACA

G С G G T T A « 11 1 t 11 AG CACA

A С T T С G G il m il TA GCTT

G G T T С T С ниш AA G С T С

G G G T T G С 1111111 TA G С T С

EMM* 10

D I I А1ТИЩ0ИА1

Ш1 1Ш |ИИШ| ЕШША I ПЕТЛЯ | ВШШ | 1! lit 16 A 13 A 21 33 35 tZT 23 31 33 3S 37 ¡33 41 13 <5 IT

OAAOUGGDU A

G С U U G G U А А AGCÜUGGCCUA

А А СI Htl G

А А 0 U G С С D А

С A G С G G G А

A A G G G A G

A A T GGCT Т

А А С Т G G Т А А

CG GGTT G

А С С CA Т С Т А

АТАТ G G Т А Т

22 24

G A G С

U G G U А t t . I

A A G С U

А С А А

G A G U А , t

26 23 30 G С A U С С О С С С

U С G G С - t -

и Л С G G С С А С С G

A G G С А . » .

A G G С G f . .

A G Т С А T G Т С A A G С A G A G С A

A A С f GGTTTA;GAGCA

С С A G A

Il U С U U A'A С U G U С A С С U U U G A A

С U 11 A G»°Aim С G E 1,

U U U G Gl GG

G G A G T

- - t

A A G G A CTACC С A G G С С T С G G С С С A G С T G G T

32 34 3S 33 40 12 Л

1АШЕЕШ1 ТФ i АКЦЕПТОРНАЯ |

петн i ШШШ ПЕТИ I mill 1ШШ j

В D f S J l H 48 50 S2 iî4 5( 53 60 62 61166 61 70 12 74 76

GfllGA G G G A G

G-PC 0 A

- t - - -

41 46 A С E G ! К H О CGi'cil A G A A

GAU

A G С D б A A A U G С G

CTTCTAAATTCC

С G G D G

T С Г G G

T T G С A A A С T T T С A A С T T С С A A С T G A T A A С T С A T A A С T T T T A A

T С С T T

ccrte

G С С T G

tag

T T T * T T T A GGTT G G t G A

CCGAGAGAT

j

gtgga'aggt

.... j

A С С A T|A G G T

49 51 53 55 57 59 161 63 65 67 69 71

G С В G G,m G A A D'C С A G С

: I

G U G G G A U U G G G G G A G G A A G G

G A G G G

G С A G G

» : :

G T G A G

i - -

G С G G G T A G G G G G G G G С СТА G G A С A G G

WAAAll T-Í-CAAAB TÍCGAGD TtGGAGD

T T С G A G T T T С G A A T

С С С AM

С С A A G С В С С С

С С 0 и С A D и G G A G А С С А

11 I 1111

ссстс

С С T G Т

ТТСАААТСТСАТ

ТТССАТС TTCGATT ТТТАААТ TTCGAAT TTCGAGT

: г (

С С С А С СССТС

СССТС

- : : t

ССТС CCTGT

A G G А А С С >1(1111

С G G U С G С

I 11 i < I I

А и С С С С V

i I « i « I

G A G С С С С

I II tII I

73 75 G С С А G С С А G С С А

Л с с л

TTTG7CCACCA 11 i i < i >

С А С С Т С G > i о 111

GCGGTCGTCCA

(Kill

ACAGGACGCCA i i i f « » »;

T A G С С G С << t i t I I

С С С S À с ? 111 и II

GGGGAGCC

I I II 4 M

G С A A С С С

Il I< < 11

ТССА »CC» АССА АССА

12 3 18 6 7 8 9

МеЬ ЛСТТАвТТС ниш

ГМеЪ тссссст

ним

РЬе С С А С С Т Т (»> 1111

БегЗ ССААСАА 1 » 11111

ТЬг с с т с с тА

< I«1111

11 13 15 17 1) 20 ССАСАСТ С С Т I

сис

ССТСАСАТ ССА . 1

Тгр ТССССТА С С

II II»!'

Туг б Б С С С |к Б »»»»»»»

Уа1 ССТСССТ шин

10 12 1и 18 А 11 А 21 23 21 >21 29 ¡1 3! 38 31 I» (1 (3 (5 (I В В ? а 3 Ь И 18 И и

И 46 А С Е С I К Я О .....

Т С Т ССТАСАСАТС

С С А Т Е С А Т САТА ТТСТ С Т А Т

22 2) А Т С С А

26 28 30 ССТСС

А А С ССТ ТСТТ ССТ

сст стистсс

А А Т ССС А

ТАССС » . . .

т т с с

А Т С С С С А А А ССА С СААС

12 34 36 31 <0 «2 ТТСАТАСССАСС

56 58 И И 61 !ь6

СТАСТ

- . - - +

с т т с с

ССАСА

сттсс тсссс

ЕСТСА »- - ♦ -

С С С С С

БАСТА А А А С А СТСААСАССТТСАСА.

С 1САТА А С СТА С

* ----

ТТССТАА С Т Т С Т А А С Т С С А А А СТСТААА ТТТАСАС

ТСТСТ

> - - +

С С А Т С А С С С А

ПАСТ » - - +

С С С С С

Т С А Т С А

ТСТСАТЮССАСТС ТТС

Обобщенная иодель тРНК

(9 81 83 85 Я 89 АСТССТТСАААТ

СТАСС

СТ1ССТТСААТТССААС

СССТТТСАААТАТАСССТ Т

61 (3 68 6! 69 71

70 12 К 18

СТССС

ССССС

* -- --

ААССТ

ССТСС

~ ♦ : - 1

САТАС

ССАСТАСТААСТАССА : г I » » I » » <

ССТССАСССССТТССА или

ТТССАТТ ТТССАТТ ТТССААТ ТТССАСТ ТТССАТТ

73 75

С С 1 А С

— + г

С С А Т С

: : + -

СТАТС

АСССТССАССА 1Н) >>1

ттсттсс

шин

ТСССАССАССА

I К I I I»

ТАССТСТ > > » > г >

СТССССТ ИИИ +

А С С С А С Т

ш«и +

С С С А АССА АССА

ооооооо|1]о|С1|)о|АКо|НССо4<1к|ооК Т|о]о о о о а|т Цод»» о|оодоо|аоЛЛЛ14411111Л41411Т|ооооС|Т<РС^оТ|Соооо|ооооооо|оСС1

В

Рис.3. (А) Первичная структура транспортных РНК фага Т5 и их генов в форме развернутого "клеверного листа". Нумерация нуклеотидных остатков соответствует нумерации в дрожжевой гЛдаРПе. 1К5мвпамдатарн&1? ^шагании* ^ лпитдак' ^течюад' ряатчштй' ашш1 17155^ структурой, в-и пары во всех шпильках отмечены знаком +. Антикодоны подчеркнуты. (Б) Обобщенная модель тРНК в форме развернутого "клеверного листа". Указаны наиболее консервативные основания Ш=пурин; У=пиримидин); о - вариабельные нуклеотидные остатки, присутствующие во всех тРНК, ¿1 - остатки, встречающиеся не во всех структурах. Нумерация оснований и другие обозначения, как в (А).

ков, прежде всего с тРНК В.coli и фага Т4, поскольку они, по-видимому, используют одни и те же ферменты процессинга и функционируют в единой системе трансляции. Такое сравнение, кроме прочего, дает основу для выявления структурных элементов, определяющих специфичность взаимодействия транспортных РНК с различными белками, главным образом строгую селективность процесса амино-ацилирования. Общая гомология изоакцепторных тРНК из указанных источников не высока - около 60% (исключение составляют только лизиновые тРНК фага Т5 и E.coll - 76% гомологии, а также тРНКгго и тРНКС1п фагов Т4 и Т5 соответственно 70% и 69%). Данное обстоятельство повышает вероятность функциональной значимости нуклеотидных остатков, консервативных для конкретного изоакцепто-ра, и она, очевидно, тем выше, чем больше число сравниваемых структур. Распределение идентичных оснований в каждом случае достаточно специфично. В этом отношении общим является только консервативность во всех тРНК, кроме iPHKÍMet, так называемого дискриминаторного основания в положении 73. Тем не менее, можно выделить наиболее часто встречающиеся участки гомологии: начало акцепторной шпильки, антикодоновая петля, некоторые положения в D- и ТФ-ветвях. Существенно, что, за исключением ТФ-ветви, это как раз те фрагменты "клеверного листа", в которых обычно обнаруживаются элементы структуры, определяющие специфичность тРНК в реакции аминоацилироования. Такие элементы к настоящему времени установлены уже для многих тРНК E.coli и все они также присутствуют в соответствующих изоакцепторах фага Т5 (исключение составляет фаговая TPHKPhe, содержащая только три из десяти предполагаемых элементов специфичности). Обращает на себя внимание несовпадение во многих сравниваемых тРНК количества нуклеотидных остатков в вариабельных участках молекулы (см. Рис.ЗБ), что, с неизбежностью, должно приводить к определенным различиям в структуре так называемого "вариабельного кармана"-центральной части молекулы тРНК, взаимодействующей с аминоацил-тРНК-синтетазой. Кроме того, очевидные изменения в конформации соответствующее элементов третичной структуры вызывают и отмеченные выше в тРНК фага отклонения от обобщенной модели "клеверного листа". В ряде работ показано влияние даже незначительных вариаций в конформации тРНК на кинетические параметры реакции аминоацилирования. Учитывая сказанное, можно полагать, что детальное изучение функциональной активности транспортных РНК

фага Т5 позволит значительно расширить наши представления о структурных основах строгой специфичности указанной реакции.

4. Минорные основания в тРНК фага Т5

Анализ первичной структуры секвенированных тРНК, а также данные по нуклеотидному составу других тРНК, полученных при фракционировании двумерным электрофорезом в ПААГ фагоспецифичных 4-5S РНК (Рис.1), позволяют сделать вывод о низком содержании в них модифицированных оснований. Во многих случаях отсутствуют какие либо другие минорные компоненты кроме т и как например в TPHKAsp и TPHKGln. Кроме того, большинство из этих оснований имеют уровень модификации в пределах от 10 до 80$. Данное обстоятельство, по-видимому, связано с отмеченными в предыдущем разделе аномалиями в структуре, приводящими к тому, что соответствующие тРНК либо полностью перестают узнаваться разнообразными модифицирующими ферментами В. colt, либо скорость их модификации в той или иной степени снижается.

5. Декодирующий потенциал транспортных РНК фага Т5

Анализ структуры антикодонов всех тРНК фага Т5, включяя и нерассматриваемые в данной работе TPHKSer1, TPHKSer2, TPHKHis, показывает строгие закономерности встречаемости конкретных оснований в позиции 34 (wobble-положение) (Рис.ЗА). Исходя из этих закономерностей и современных представлений о кодон-антикодоновом взаимодействии, сформировавшихся главным образом на основе изучения митохондриальных тРНК, можно предсказать декодирующие свойства тРНК фага Т5, суммированные в Табл.1. Основная их особенность, характерная также для транспортных РНК митохондрий, Mycoplasma capricolm и, по-видимому, метанококков, заключается в транслировании всех четырех кодонов несмешанных семейств одной тРНК с ^модифицированным и в первом положении антикодона. Отсутствие такой модификации установлено в фаговых тРНК, специфичных к Gly, Leu, Serl, Pro, и предполагается в остальных случаях. Наличие изоакцептора Ser2(gga) не приводит к исключению из данного правила, поскольку эта тРНК, вероятно, функционально неактивна вследствие замены остатка G7, - одного из основных элементов

Таблица I.

Декодирующей потенциал транспортных РНК фага Т5

позиии-н колона

а о и S S S s

V С A ■ ■ 0

II

Phe GAA Ser2 GGA Tyr GUA Cys GCA

Ü Serl UGA

(Leu U«AA) Stop Stop A

Тгр CCA G

V

His GUG

(Arg UCG) -С '

О Leu UAG Pro UGG

> - Gin UUG 0-

XI

Ilel GAU Asn GUU Ser3 GCU

А Thr UGU

Ile2 C»AU A

Lys U«UU Arg WCU О

Met CAU

.........и.....

Asp GUC ■С "

G Val UAC Ala UGC Gly UCC

Glu WUC G ■

Двойной рамкой выделены так называемые 4-х кодоновые (несмешанные) семейства ("family boxes"). В скобки помещены антикодоны тРНК, гены которых пока необнаружены. и*-предположительно модифицированный U, способный узнавать только А и G. С*- предполагаемая модификация, обеспечивающая строгую специфичность к кодоцу aua (возможно "лизидин" как в TPHKIle(CAU) E.colt).

специфичности сериновых тРНК E.colt в реакции аминоацилирования. С точки зрения отмеченной особенности декодирующих свойств тРНК фага Т5 весьма странной представляется ситуация с тРНКС1п, у которой также отсутствует модификация и34> Во всех подобных случаях, т.е. в тРНК, специфичных к аминокислотам с кодонами, заканчивающимися на пурин и принадлежащими к смешанным семействам, уридин в указанном положении всегда тем или иным образом

модифицирован, что, как полагают, предотвращает ошибочную трансляцию других кодонов семейства. Остается открыт™ вопрос, возможно ли в реальных условиях конкуренции ошибочное узнавание гистидиновых кодонов CAY тРНКс1п, или существуют другие (помимо кодон-антикодоновых взаимодействий) механизмы дискриминации тРНК в A-сайте рибосомы.

По своему декодирующему потенциалу тРНК фага Т5 практически идентичны тРНК митохондрий позвоночных,.а также тРНК Mycoplasma caprtcolum и, вероятно, метанококков. В частности, различия между фагом и митохондриями касаются только четырех антикодонов: в последних отсутствуют изоакцепторы ser2(GGA), iie2(CAU) и Arg(ucu), а антикодон для тгр - uca вместо сса, причем последние три различия объясняются отклонениями генетического кода митохондрий от универсального, используемого фагом. Очевидно, что во всех рассматриваемых случаях эволюция в направлении отбора минимально необходимого набора тРНК является следствием общей тенденции к экономии генома. В тоже время, отсутствие какой либо достоверной информации о функциональной роли тРНК в фаговом развитии и эволюционном происхождении области их генов не дает оснований более определенно говорить о конкретных механизмах такой селекции в случае фага Т5, тогда как для свободноживущих организмов высказывается предположение о согласованной эволюции генетического кода (частоты встречаемости кодонов) и декодирующего потенциала тРНК (структуры антикодонов) под действием главным образом мутационного давления в направлении изменения GC/AT-состава ДНК.

ВЫВОДЫ.

1. Определена нуклеотидная последовательность двадцати одного гена тРНК бактериофага Т5.

2. Прямым секвенированием РНК установлена первичная структура пяти тРНК, кодируемых фагом Т5 и имеющих антикодоны, соответствующие аспарагиновой кислоте, аспарагину, глутамину, лейцину, пролину.

3. В структуре всех тРНК фага Т5 (кроме тРНК^8, TPHKSer3 и тРНК:Рго) отмечен ряд существенных отличий от обобщенной модели "клеверного листа", заключающихся в замене некоторых инвариантных и полуинвариантных оснований, нарушении комплементарности

в шпильках, изменении количества пар в последних и других отклонениях от канонических параметров модели. Характерной особенностью этих тРНК является также малое содержание модифицированных оснований.

4. Транспортные РНК фага Т5 имеют невысокий уровень гомологии с соответствующими изоакцепторными тРНК E.coli и фага Т4 - около 60% (исключение составляют только лизиновые тРНК фага Т5 и E.coli - 16% гомологии, а также тРНКРго и тРНКа1п фагов Т4 и Т5 соответственно 70% и 69%) со специфичным распределением идентичных оснований, сосредоточенных чаще всего в начале акцепторной шпильки, антикодоновой петле, а также в некоторых положениях D- и ТФ- ветвей.

5. На основании информации о структуре антикодонов и современных представлений о кодон-антикодоновом взаимодействии, по аналогии с митохондриальными тРНК, выдвинута гипотеза о декодирующем потенциале тРНК фага Т5, особенность которого состоит в транслировании всех четырех кодонов несмешанных семейств одной тРНК с немодифицированным U в первом положении антикодона.

6. Продемонстрированы возможности использования двумерной тонкослойной хроматографии на целлюлозе для фракционирования различных смесей олигонуклеотидов при установлении первичной структуры РНК на радиохимическом уровне.

Список статей, опубликованных по теле диссертации,:

1. Казанцев с.И., Чернов А.П., Шляпников М.Г., Крюков В.М., Баев А.А. Фракционирование и физическое картирование 4S РНК бактериофага Т5. Доклады АН СССР, 1977, т.232, №4, с.953-956.

2. Казанцев С.И., Чернов А.П., Шляпников М.Г., Крюков В.М., Баев А. А. Характеризация и картирование стабильных РНК, кодируемых делетабелыюй областью ДНК бактериофага Т5. Доклада АН СССР, 1979, т.247, №з, с.744-748.

3. Ksenzenko V.N., Kamynina Т.Р., Kazantsev S.I., Shlyapnikov M.G., Kryukov V.M., Bayev A.A. Cloning of genes for bacteriophage T5 stable RNAs. Biochim.Biophys.Acta, 1982, v.697, p.235-242.

4. Shlyapnikov M.G., Kaliman A.V., Kazantsev S.I., Kryukov V.M., Bayev A.A. The nucleotide sequenoe of bacteriophage T5 glutamine transfer ВДА. Biochim.Biophys.Acta, 1984, v.782, p.313-319.

5. Shlyapnikov M.G., Kazantsev S.I., Kryukov V.M., Bayev A.A. The nucleotide sequence of bacteriophage T5 leucine tRNA. FEBS Lett., 1985, v.192, №2, p.299-302.

6. Shlyapnikov M.G., Ksenzenko V.N., Kryukov V.M., Bayev A.A. Nucleotide sequence of bacteriophage T5 DNA fragment which contains the gene for tRNAAsp. Eur.J.Biochem., 1986, v.156, p. 285-289.

7. Ксензенко B.H., Шляпников М.Г., Крюков B.M., Баев А.А. Организация генов транспортных РНК бактериофага Т5. Доклады АН СССР, 1986, т.288, №2, с.474-477.

8. Шляпников М.Г., Крюков В.М., Баев А.А. Первичная структура TPHKAsn бактериофага Т5. Биоорг. химия, 1987, т. 13, №4, с.533-538.

9. Шляпников М.Г., Калиман А.В., Крюков В.М., Баев А.А. Первичная структура пролиновой тРНК бактериофага Т5. Биоорг.химия, 1987, т.13, №4, с.559-561.

10. Ksenzenko V.N., Shlyapnikov M.G., Azbarov V.G., Garcia 0., Kryukov V.M., Bayev A.A. Nucleotide sequence of the bacteriophage T5 DNA fragment containing a distal part of tRNA gene region. Nucl.Acids Res., 1987, v.15, N-13, p.5480-5481.

11. Ksenzenko V.N., Shlyapnikov M.G., Azbarov V.G., Garcia O.F., Kryukov V.M., Bayev A.A. Sequence organization in the bacteriophage T5 tRNA region. Mol.Gen.(Life Sci.Adv.), 1987, v.6, p. 193-198.

12. Ksenzenko V.N., Wilkens K., Rueger W., Shlyapnikov M.G. Nucleotide sequence of the phage T5 DNA segment containing six tRNA genes. Nucl.Acids Res., 1992, v.20, №22, p.6104.

29.03.94 г. Зак.6045Р. Тир. ТОО экз. Уц-изд.л. 1.0 Отпечатано на ротапринте в ОНТМ ПЫЦ РАН