Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование механизмов температура-зависимой актизации нейтрофилов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование механизмов температура-зависимой актизации нейтрофилов"

О.ЫКОЬОЬ 03. ЬЛсЗОГЛП'о

ыьжврш гюозйоьоьо&о . •

■ ТБИЛИССКИЙ ГОСУдаРСТБЕЫЫЛ УНИВЕРСИТЕТ :шЛ1.ДЕАВАХ:1ШВ1Ш1

е^пеор^об ожоЗпя Ка правах рукописи

еобобо ¿ппПзпЬ обдао СоООО^ ЦУЛАЯ Манана Георгиевна

ьоот&осзыь ¿эшвш ео&зобдехжо-

е^дРМПЗЗдССО бЗМООЗбЗдОЬ бч>0(МЗСЗЗЛ

Св. СО. 02 - дппцоВп^ ИССЕВДОЗЛЕИЕ ЖСАНЯЗЮЗ ТЙМШТАТУРА-

заажжой лктида неИтрозпюз

03.00.02 - биофизика

о зе по а в о о з со

Зог/ооб00^ ^ообо^йддос/о ¿об^одогоО Ьоосо^оабп ЬдбаЬЬг.Ь сгзОоЭодоЗооо

А Б I 0 Р Е 5 Е Р А Т

диссертации па соискание учскоГ: степени . кандидата б:;о.тогнческ;:х наук

1591

Работа выполнена в научно-исследовательской лаборатории физико-химической и молекулярной биологии Тбилисского государственного университета.

Каучико руководители:' доктор биологических наук,

профессор Б.А.ЛШСАДЗЕ . кандидат биологических наук М.Г.МЕЛШЕ

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор И.И.ИВАНОВ

доктор биологических каук

Д.Г.ШШВДЗЕ

-едущая организация: Ленинградский государственный университет.

1991

г.

диссертации состоится" "

ШИ." часов ка заседании Специализированного совета 157.03.19 при Тбилисском государственном университете -.'И й.Ддаахкившш по адресу: 380043, Тбилиси, ул. Универси-г-.ч, 2, биологический факультет 1ТУ.

С диссертацией иогно ознакомиться в библиотеке Тбилисского о с-У Лиственного университета.

Автореферат разослан

• 11

1991 г.

Ученый секретарь Специализированного совета ,октор'биологических наук

Н.Г.Котрикадзе

о*

ОЩЛЯ ШМТВРИСТИКА РАБОТЫ. .

Актуальность тем;. Нейтрофшш занимают одну'из наиболее активных позиций в системе гуморошю-клеточной кооперации крои« и соединительной ткани. Они являются универсальной шшеш.и и соответственно индикатором различных нарушений гомеостаза и гомеоктюзи.

Основной функцией кейтрофилов является уничтожение жшзпх объектов или'завершенный фагоцитоз. Завершенный фагоцитоз включает многие звенья эффекторного- потенциала клетки: рецепция, поглощение, активация метаболизма, секреторная дегрануляция, образованно пищеварительных вакуолей - фагосом. • -

Процесс поглощения во многом определяется структурном состоянием 'мембран нейтрофилов.

Шкробицидальная активность нейтрофилов в существенно;? степени обусловлена наличием НАДФН оксидазной ферментной системой, которая локализована в плазматической мембране и в последующем в фагоцитарных .везикулах. Активация этой системы в стимулированных нейтрофклах сопрововдается образованием леталышх окисдантов,предшественником которых является супороксид анион радикал (0~) ( по оХ., 1986).

Известно, что кратковременная обработка клеток и организмов при сверхоцтимальной температуре вызывает синтез малого набора полипептидов, называемых белка!,га теплового шока (Ьатагс&с еь п_1., 1985). Белки теплового шока, индуцированные во время сублетальшгх нарушений, вызванных теплом, включаются в гомеостагические фушецш клетки. В этой связи представляет интерес изучение механизмов ответственных за изменение функциональной активности нейтрофилов при тепловой обработке. .

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось исследование влияния сублетальннх высоких температур на функциональную активность нейтрофилов, а такие установление связи- меяду сгружтурнкмп и функциональными характеристиками фагоцитлрукщих клеток.

Были поставлены следующие задачи:

1. Изучить .способность нейтрофилов генерировать при действии стииулпрувдих агентов. .

2,- Исследовать в кон А стимулированных пейтрофилах зависимость образования от температуры инкубации-клеток в темпера-

турне»: интервале 35-43°С {близком к физиологическому и шоковому порогом).

3. Определить иоханизмн, ответственные за изменения фугасцио-нальяой активности нейтрсфмоя при тепловой обработке.

4. Исследовать образование белков теплового шока в нейтрофа-лах в условиях тепловой обработки.

5. Исследовать структурное состоите мембран нейтрофилов при фагоцитозе. •

G., Показать взаимосвязь медду фагоцитарной активностью нейтрофилов п структурным состоянием мембран фагоцитов.

Научная новизна и практическая ценность работы. Изучены механизмы активации нойтрофилов при действии стимулирующих агентов в условиях теплообработки. В интервале температур от 37°С до 39°С наблюдается двухкратное увеличение генерации Og.

Установлено, что тепловая обработка нойтрофилов приводит к увеличению потока мембраноассоцированного Са2+ во внутрь клетки. Такжо показано участие фосфолипазы. С и активированной протеинки-каз1;С(1ШС) в температура-зависимой генерации OJ.

Впервые'установлено образование протеинов теплового шока в стимулированных нейтрофилах в условиях тепловой обработки, с моле кулярным весом 27, 66, 94,7кДа. . .

Изучена взаимосвязь между структурной организацией мембран нейтрофилов и их функциональной активностью. Показано, что способ ность нейтрофилов поглощать чужеродные частицы в существенно^ сте пени определяется состоянием их липидов.

Показано, что в условиях генерации Og имеет место интенсификация перекисиого окисления липидов, что в свою очередь благоприятствует повышению фагоцитарной активности путем увеличения кон-| денсированной фазы в лкпидах клеточных мембран. I

Проведенные исследования расширяют представления о механизма] активации фагоцитов и генерации летальных оксидантов стимулиро- I ванными нейтрофзлаш и позволяют наметить пути коррекции активно! сти фагоцитирующих клеток. I

Апробация'диссертации. Результаты работы докладывались на мЛ факультетской конференции по естественным наукам (Тбилиси, 19821 на П республиканской конференции "Проблемы экологической биофизш ки" (Тбилиси, 1986), на У всесоюзной межуниверситетской конферсЯ цкп "-Биология клетки" (Тбилиси, 1987), на республиканской научЛ конференции биологов, посвяденнсй 70-летнк основания Тбилисское

государственного университета (Тбилиси, 1900) и на У1 межуниверситетской конференции "Биологические мембран» -в нормо и патологии" (Тбилиси, 1939). По материалам диссертации опубликован'6 научнш: работ.

06?,ем к структура работы. Диссертация иэлоиона на НО страницах машинописного текста, включая 16 рисунков,3 таблицн к список литературы•(185 источников). Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения и выводов.

..........СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение. Во введонии показана актуальность исследовшгая, сформулированы цель и экспериментальные задачи работы.'

■ Глава X. Б первой главе .дан обзор зкеперимеиталынк работ, ко-торае отражают состояние проблем, связаннее с выполненной работой и включает следующие раздели: Суперакскд анкон радикал-акгнвки.1 нктерэдциат кислорода, Ферментативные и неформентатавнне пути образования Участие активных форм кислорода в пере окисло шш ли-падов. Скотами, рэгулярующио МК (активные форм« кислорода) в яп-впх организмах. Фагоцитоз. Роль активных форм кислорода в процесса фагоцитоза. Механизм« образования 0£ в стпиулированних нойтро-¡тплах. Процосси активирукдае НАДШ- оксидазу. Роль активированной йосфолппази С, активированной ПКС и ненасыщенных яиринх кислот в активации НАДШ оксидазной система.

Глава 2. Материал» и методы. В настоящей работе объектом исследования служили исИтро&илы, полученные пз пернферзальной крови кролика, '

Выделение нойтройилов' проводили по модпф'.щированногду методу Стоселл к др. ( Зкоооо! о* а1., 1971). Гепаршшзированну» кровь сглсЕПвали с 0,2 объемом раствора, который содержал 7 ыг/мл , декстрап (молекулярный вес 500000) -50 мг/мл (рН - 7,4) и оставляли для седиментации при температуре 0°С в течение 45 шк.

Нейтрофшы собирала центрифугированием супернатанта (условия центрифугирования - 2000 об/мин, 10 ьг.шуг). Затем промывала 50 объвкэ&Х 15 ь:.! фосфатного буфера, рН - 7,4 в 0.15 ?.:М ИоС1 _ра. Лизис ¡эритроцитов вызывали добавлением дистиллированно;! водн. Кзотонноать достигши добавление!.! после 60 секунд ЕаСХ (36 иг/мл). Центрифугировали'(условия центрифугирования те ле) и суспензпро-

вали в Кребс-Рингор фосфатном буфере (рН-7,4). Конечная клеточка*! суспензия содержала примерно 85;» нейтрофилов.

Определение' фагоцитарной активности нейтрофилов"было основано на факте поглощения фагоцитами полистиролъных частиц, экстракции полистирола кз клеток и спектрофотометрическом определепки количо ства поглощенного полистирола (Roberta, Quaatal, ISS3). Фагоцитоз проводили при температуре 37°С на качающейся водной бане.^Кан доя проба содержала 5 мл среды Рингера, 10 мг глмсози, 1,2 Юь клетка/мл нейтрофилов, 200 мкг/мл частиц полистирола (0 - 1у ). Инкубацию проводил;! в течение 20 мян. После инкубации клетки соОл рали центрифугированием, промывали в 0.9^-ом MaCl до получения чистого от полистирола супергиганта.' Экстракцию поглощенного лож стирола проводили в 5 мл горячего дяоксана в течение 10 минут и с гавлялп в течение 2х часов в контакте с диоксаном при комнатной температуре. Клетки отделяли'центрифугированием ц измеряли интенсивность поглощения полистирола на спектрофотометре Deckman VV 5230 при длине волны 253 нм. В качестве контроля использовали кл< точный экстракт в дноксане свободный от полистирола. По' интенсив кости поглощения полистирола, экстрагированного из клеток, ношо судить о фагоцитарной акт;шности нейтрофилов.

Определение Oq образованного при стимуляции нейтрофилов■прав дили по методу Маркер? и др. (Markert ai,,' 1904). Кспользов mitt метод регистрации основан на факте восстановления цит.С (цитохром С) О^-ым радикалом,, что дает изменения в спектре поглс щения цитохрома С при Л550 нм. Оптическая плотность регистр«] валась на спектрофотометре Becicnan UV5230. В качество стимула г пользовали кон А, изотопный раствор KCI, мертвую культуру ста<1п: коков. .

Для определения брали Г,5 мл. суспензии нейтрофилов для ка-*; пробы. К контрольной пробе добавляли 20 шел (ЗО.мг/мл) супероко! диемутази (СОД) к остальным пробам 20 мкл воды. Пробы инкубиров; при 3?°С в течение 2-х мчиут. Добавляли 0,1 мл раствора цит.С (ЗС мг/мл) и 1,5 мл стимулятора. Пробы тщательно перемешивали и инкубировали" а течение желаемого времени (10-15 минут)'при соот, ветствующей температуре. Для остановленкя реакции пробирки перс оили на лед. Центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 минут при температуре 4°С. Измеряли восстановление цит.С при л 530-5?0 нм против пробирки, содержащей СОД.

Концентрация образованного a I мл реакционной смеси опрс

деляется ио формуле нмоль =47,7 • л А.

Реакционная среда при стимуляции нейтрофилбз глортвой культурой стафилококов состояла из 65 мкЫ цит.С, 5 мг/мл каталазп, 1,5 10 чейтрофилов/кл, 5 1.2.1 глюкозн в 3-х мл Кребс-Рингер фосфатного буфера рН - 7,5, температура 37°С.

В^ли использован» следующее Og генерлрувдие систеу.п: I ксантан-ксантиноксидаза, П фоназиикотсульфат (ОМС) - НАДИ.

Система ксантпн-ксантиноксидаза содержала 0,05 единицаДл ксан-тиноксиферазн и 0,33 ri.l ксантина в трис-ECI буфере (рп-7,5, t -37°С).

В системе й'Ю-ИАДН реакционная среда состояла т;з: 1,2 ¡м iia-пк-рофосОатного буфера (рН 0,3, Ы - 0,052), 0,1 ья ICG ык>.1 <)ЫС, -0,3 мл 65 цит.С, 0,2 ид 780 кй! HAJUI. Реакция начинается добавлением • ILAJZH (Kalckar, DaaBand, 1984).

Активность СОД определяла по ингибированиз восстановления ци-т охрила С экзогешшы Og -ом (Kakkar, DaaSand, 1984). В качестве источника Оо использовали систену ФМС-НАДН.

Сор;.:онхпнй препарат разбавляли в дпетилпровашюй воде до конечного обье:.:а 3-х ::л. Реакцию начинал1.! добавленном НЛДЕ1. В качество контроля использовали аналогичную систему без'ферментного про парата. 1'днш:цек фзркенгкой активности принято считать концентрации фермента, которая в течение одной минутн инглбирует воссгавленке цит.С ;:а 50^-03.

О степени переокпеления л-шпдов судили по накоплению шловдкалъ:.. гида (Стальная, Гариивилл, 1977).

Оценку г."1кровязкости мембран нейтрогилов проводили с помочьа •"хуорасцекгного зонда пирона. О скорости латеральной диффузии и, следовательно, о г.глкротьчзкостИ'-'макбрапи судили по окопмерпаоцпн пирена (Спирин и др., 1981).

Степень ог.оимеризацки пирона измеряется отношением / -интенсивности (¿¡луоресценцип оксиморон и мономеров пирена, соответственно. Визсто с увеличением концентрации пирена уменьшается вреул г-пзнп мОлекулн зонда в мономерной форма согласно уравнению Ктерна-;олъмзра. По углу наклона прямой, зависш.'.ости отношения от

.гопцонтрацпи пирона судил;; о латеральной дисЩузии зонда.

15::свобог.декпе у.ембраиоассоцпрованного наблюдали по измененк; интенсивности (флуоресценции хлортетрациклина (Korohak st ol., 1934 Койтрофуш инкубировали в кодифицированной среде Хенкса (124 j.Ji ИсС1

4 mM.HCI, 0,64. iM hoii2P04, 0,66 m KgHP04, 15,2 Ш UallCOjt I i,И MgCi2, I Ш CaCIg, 5 i,M глшсозы в 10 мМ Xeneca, pH 7,4) при температура 37°С в течение 10 минут в присутствии 100 wî.1 хлор-тетрациклина. Изменения в флуоресценции« регистрировали на флуоресцентном спектрофотометре гда-з Hitachi при Д флуор 560 нм, Д возб. флуор. 380 им.

Анализ белков теплового иока проводили по методу Ландри и др. (Landry et al., 1982). Нойтрофилн обрабатывали при температуре 43°С в течение 30 мин. Включение меченной аминокислоты С^ лейцина (25 ci/mi ) в белки теплового шока происходило в течение 2-х часов при 37°С температуре. После включения метки илстяи инкубировали в среде, содержащей 0,1 r.i.i холодного лейцина. Общая фракция белков окстрагируотся следующим образом. Клетки пятикратно промывали в фосфатном буфере (137 ъМ MaCi , 2,7 ыМ KCl, 6,5 мМ NoHP04, 1,5 мМ 1ШР04, 0,9 мМ СаС12, 0,5 мМ %С1Й ). Экстракцию ' белков проводили в 1% водном растворе СДС и проводили в иглу 18 калиберного шприца. СДС-эксгракт кипятили при Ю0°0 в.течение 3-х минут и осаждали в 4-х объемах абсолютного этанола при температуре -Й0°0 в течение ночи. В этаноле нерастворимый материал сушили в вакууме и растворяли в пробном буфере (2,3$ СДС, 5% - мвртпто-этанол, 10% глицерол, 62,5 ыМ трис-НСГ /рН 6,8/ и 0,005? öpowje-нол синий). Электрофорез проводили в 0,75 мм толщины ICJÎ-ом по. лиакрилашдном гело по методу Лаеымлп (baemraly, 1970).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Генорзция Ор нейтрофилами при действии сгтаулируд'дих агентов. Трансдукция внешнего сигнала во внутриклеточные процессы включает последовательность ряда ответных реакций; К ним.относятся'реорганизация цитоскелета, изменение формы клетка, направленное движение секреция лизосомальннх энзимов, активация респираторного взрыва.

Одним из наиболее важных процессов, который запускается в- ней-трофилах в ответ на действие стимулирующих агентов, является респираторный взрыв. Респираторный взрыв (резкое повышение потребления кислорода) наблюдается как при действии различных мембраномо-

¡пцпругадах агентов (форбол-12-миргстат 13 ацст' т, дигитонтш, ¡истат, кирные кислоты, конканавалии Л), .так- и-по аре;,да Слго-•оэа ( Cabig et al., 1984, Seifort et al., I9U6, Sairley et ,, 1904).

Многочисленные литературные данные указывают, что сигналя,воз-сшацио от стимуляторов различной химической природы, в конечном >ге приводят к активации НАДФН оксидази, продудакглг.ой (Ба-зг et al., 1973, Badv/ey, KornowûJcy, 1930, Cabig ut al., 1964, ifort et al., 1986, Shirley et al., 1987).

На начальном этапе работы нм-была изучена способность пейт--¿млод генерировать аютвные интермедиаты кислорода при действии гмулируздих агентов.

Поскольку ряд экспериментальных данных по изучении стохиомет-,: образования активных интермедпатов Og в процессе стимуляции зток указывает на то, что первичным гатермедиатом в восстановло-

кислорода нейтрофпламз является супероксидный анион радикал akino et cl., 1986), о степени стимуляции нейтрофилов судили уровня генерированного ими (Ç.

Клетки стимулировали введением мертвой культуры стафилококов суспензию нейтрофилов.

Количество образованного 0J определяли по СОД кнгибпруемому сстановлошкэ цит.С. С первых канут фагоцитоза отмечается reiIQ-ЦИЯ ûg.

Известно, что кейтрсфилы являются фагоцктпрутакш • клетками, нозная.функция которых заключается в переработке поглощенной ктерик. Реиаюцая роль в этом процессе отводится OJ. Исходя из ого следует, что нейтрофилн должны содержать низкий уровень пероксиддисмутазы, так как она может нейтрализовать бактерацед-а активность фагоцита.

Ни постарались измерить активность СОД в интактных кейтрофи-х и при фагоцитозе. Об активности СОД в нейтрсфалах судили по :гибиро£ания) восстановления дат.С, "вызванного действием'окзоген-

1Г0 6р.

Б качестве систем генерирую®« использовали <1ЙС-НАДН и ¡антин-ксантнноксидазную систему.

Использованным методом не удалось регистрировать ахтив-)сть СОД. Полученные результаты соответствуют литератукгм дал-:м, согласно которым нейтрофилн практически не содержат

цитоплозматическуп СОД и встречается только матохондриальнкй i фермент (lost, Pridovlch, 1974).

Как отмечалось вние, при обработке клеток поверхностно arc кыкн веществами, наблюдаются те яе штаболитическио изменения что и при фагоцитозе.

В дальнейпих опытах в качестве растворимого стимула наш < использован конкакавалин (кои А). Инкубация клеток с кон А пр дила к повыаешш продукции Og. Количество образованного ув чивалось с увеличением концентрации кон А а пределах Ю-100 к Оптимальной стимулирующей концентрацией сочли 50 г,«кг/мл, ввид го, что при денной концентрации наблюдается высокий уровень к гоцитарной активности, тазе и генерации 0

Таблица I

Зависимость фагоцитарной активности нейтрофялов от концентрации кокканавалша А

Кокканавалия А мкг/мл Поглощенный полистирол

1лкг/2Л06 клетка

10 25

50 42 •

100 30.

. Дальнейшее увеличение концентрация кон А вызывало аглютш клеток.

Стимуляция нейтрофилов вклвчает гидролиз фосфатидил иноз! 4,5 бифосфата, вследствие активации фосфолипазн С. Продукты : лиза инозптол .1,4,5 трифосфат (ИОз) и диацилглицерол играют : вуи роль в транедукции сигнала: инозитол. 1,4,5 трифосфат д&й в качестве вторичного•посредника в мобилизации Са2+ из зядоп ткческого ретикулума и дкацилглицэрвд активирует Са^+ и фосф зависимую ПКС. Конечным процесса!.«!, которые активируют НАД*, сидазную систему является фосфорилирование некоторых компоне оксидаз или некоторых регуляторных белков.

Предполагается, что в активации НАДФН оксидазной сисгег-в ванной стимуляцией метки центральную роль играет активирова ПКС. Это предположение нашло подтверждение к в натих эксцори Добавление ингибиторов ПКС-ТФП (трифлуорперазин), Нг, (I—/5-е сульфонил/~2-метилшперазин) до стимуляции к (кон А стимулу

ним) нейтрофилам вызывало угнетение генерации (рис.1). нМ (1-Ю6 кл/ыл/10 мин)

12

■ 4

Рис.1. Влияние ингибиторов протеинкиназы С на генерацию Оо

в конканавалин А стимулированных нейтрофилах. Контроль (I); Конканавалин А (50 мнг/шг) 37°С (2); Конканавалин А (50 мкг/ш) 39°С (3); Трифлуорперазин (50 гас!") конканавалин А (50 мкг/вд) 37°С (4); Трифлуорперазин (50 мк1.1) конканавалин А (50 мкг/ш) 39°С (5); Ну (25 ыкМ) кошсанавалин А ■ (50 мкг/мл) 37°С (6); Ну (25 мкЮ конканавалин А (50 мкг/шг) 39°С (7).

На следующем этапе работы изучали участие фосфолипазы С в раз-, витии ответных реакций в сталированных нейтрофилах. С этой целью клетки инкубировали с НаР. Опираясь на результаты кзло и других ( КЗЛо с! а1., .1936), которыми было показано, что НаР ингибирует образование инозитол 1,4,5"трифосфатаиз инозитол 4,5 бифосфата.ичто этот процесс обусловлен угнетением активности фосфолипазы С по отношению инозитол 4,5 бкфосфата.

, Преинкубация клеток с. 5 иШ наР . в течение 3-х минут при температуре 37°С. приводила к угнетению генерации Оо в кон А стимулированных нейтрофилах (рис.2).

Влияние температуры ишсубацни на уровень генерации Оо стимулированными ней

Известно, что аазнь яивых организмов большей частью ограничивается узким интервалом температур, от нескольких градусов низе точки замерзания воды до примерно 50°С. Толерантность по отношению температуры" монет изменяться со временем

I2 OJ пМ (Г-ЮЬ кл/мл/Ю мин)

. Рис.2. Влияние ингибитора фосфолипазн С на генерации

в кон.Л стимулировании нейтрофклах. Контроль (I); Конканавалнн А (50 мкг/мл) 37°С (2); Конканава-шш А (50 мкг/мл) ,39°С (3); НаР (5 мМ)-кокканавалин Л (50 ют/мл) 37°С (4); НаУ (5 !.й)-конканавал!Ш А( 50 мкг/мл) 39°С (5).

и возможна некоторая степень адаптации.

В некоторых случаях экспозиция при окололетальной температуре вызывает степень адаптации, при которой ранее летальная температура становится толерантной. Представляет интерес изучение молекулярных основ достижения термотолерантности. Ответ на тепловой шок кйо-ет место з бактериях и в растениях, такяе как и в животных и явля-^ ется быстрым, но временным рецрограммщюванием клеточной активности, обеспечивающей вккивание в течение стресс периода, защищает ' существенные клеточные компоненты от терлового повреждения и допускает быстрое возобновление клеточной активности в течение восстановительного периода.'

Недостаточно изучены начальные механизмы взаимодействия тепла с клеткой.

Нами было изучено влияние температуры инкубации на уровень генерации кон к стимулированными нейтрофиламз. Бил исследован температурный интервал 35-43°С (приближенный к физиологическому и' шоковому порогам). Уровень генерации в стимулированных нейтрофи-лах суиясгйокчо зависит от температуры инкубации клеток. При этом интересно отметить, что .резкое увеличение генерации Оо "(примерно 2-х кратное) наблюдается в интервале от 37° до 39°С.

На следующем этапе нашей работ» мы постарались выяснить механизм, ответственный за температура-зависимое увеличение гинорацп.; в ксн А стимулированних клетках.

Изучение влияния ингибиторов фосфолипазп С и ЖС на температура-зависимую генерацию О^-в кон" А стимулированиях нейтрофалзх показало, что ингибированио как фосфолипа'зн С, так и протеинюшазы С, практически полностью предотвращает увеличение генерации в кон А стимулированных нейтрофилах, вызванные воздействием тепла.

Влияние температуры инкубации на высвобождение мембраноассоци-рованного Са в стимулированных нейтрофилах. Известно, чго одним из ранних проявлений ответных реакций в активировашат нейтро^лпю является быстоое (обратимое) повышений концентраций ццтозолышго свободного Са2+, что, по всей видимости, вовлечено ь раде последующих клеточных реакций. Было показано, что первой ступенью, ведущей к изменению концентрации цктозольного (Са2+), является высвобождение Са2+ из внутриклеточных депо, что должно быть штудировано ИФз-ом, образованного вслед за агоиисг роцоптор-окупацией. Увеличение концентрации цитозольиого Се?+ должно 'вызывать впево-

о

боадснио Са'■ из мембран, вследствие обратимого открытия Си~+ проводных ионннх каналов в мембране, через которые все больше ионов

• Са2+ поступают в цитоплазму. Через некоторое время (1-2 мин), концентрация цитозольиого Са+/шояь восстанавливается. Эти неселективные каналы, которые проводят Са"1", активируются вслед за повышением цитозольиого (Са''+), но не непосредственно И^з-ом или стимуляторами типа и-чроршлметионил-леицил^анмалшшн (Уоп ТвсЬаг-

• пег о г а1., 1906).

Таким образом можно заклнчить, что изменение концентрации мем-

• браноассоцированного Са2+ адекватно отражает изменения свободного цитозольиого Са2+.

Исходя из изложенного вкие, для нас представлял определенный интерес проследить за изменением мембраноассоцированнсго Са4"1" в условиях активации нейтрофилов.

За изменением"мембраноассоцарованного Са2+ наблюдали при города флуоресцентного зонда хлортетрациклина. Флуоресценция хлортиг-■ рациклина отражает локальные изменения в уровне ^ыембраноассоцлро-ванного Са2+. Для стимуляции нейтрофилов был использовш. кон А (50 мкг/мл) и изотонный раствор КС1.

Введение стимуляторов в инкубадаонную среду нойтрофилоз выдавало быстрое высвобождение мембраноассоцированного Са"^ лак пр'л . 37°С, так и при ЗгсРС (рис.3), при температуре 39 С высвобождение

мамбраиоассоцированного примерно 2 ргза превышало анало-

гичные параметры при температуре 39°С.

■ Введение в инкубационную систему ингибитора фосфолнпазн С (Half ) подавляло высвобождение мембраноасс очарованного Сд2+ как при 37°С, гак и при 39°С тешерагуре (рис.З).

1фл

кон А ^ KCI ___ С

__b

— а

I мин -с->.

Рис.З. Измене1те интенсивности флуоресценции хлортетрациклина-

фл - 560 шК возб - 380 ммк

I В конканавалин А (50 мйг/мл) стимулированиях нейтрофилах П В ;.КС1 (изотопный) отполированных нейтрофилах . 39°С (а); 37°С (ъ); На? (5-1«) (с) ■

Образование белков теплового пока в стимулированных нейтрофилах в условиях температурной обработки. Известно, что существует значительная корреляция медду развитием термотолерантности и синтезом протеинов теплового пока. Предполагают, что стресс протеины индуцируются в ответ на повреждения или метс-болитические пертурбации, вызванные взаимодействием стресс факторов с клетками и эти протеины тлеют гомеостатические функции.

Для нас представлял интерес изучить обргзование стресс протеи| нов в нейтрофилах. Обработку клеток производдла при температуре 43°С в течение 30 ганут. Включение С^-лейцина в протеины тепло-| вого пока происходило в течение 2-х часов при 37°С температуре. Согласно исследованиям Дандри и соавторов на Моррис гепатома 771 клетках в данном те?лпературном режиме (30 мин. сок и 2 часа инку! бация г.ри температуре 37°С) отмечается максимальный синтез стрес!

совых белков и усиление термотолерантности.

Посредством электрофореза в СДС полиакриламидном геле и последующей авторадиографии наги било показано, что в условиях 30-шнут-ного температурного шока при 43°С в кон А стимулированных нейтро-филах появляются фракции стрессов!« белков с молекулярным весом 66, 94,? и 29 кило дальтон (рис.4). 66:Ю3Д и 97,4-Ю6Л относятся к белкам теплового пока объединенных к группе 70-Ю^Д. Фракцию 29'Ю^Д можно отнести к белкам теплового шока с низким молекулярным весом 27-103Д.

27 кМ ;;

66 кДа . - •>: '

94.6 кДа ■<—' ;

1

: ; 1 : 1- 1- '

Рис.4. Профиль общих белков нейтрофилов. Конканавалин А (50 мкг/мл) 43°С (I); Контроль .43°С (2); Конканавалин А (50 ыкг/гл)-37°С (3); Контроль 37°С (4).

Сопоставляя приведенные нами результат с литературными данными, можно предположить^ что клеточная мембрана является пврв:-'ч-

ним мостом температурного воздействия, и что температурные эффекты в нейтрофилах должны быть опосредованы таким го образом кшс и трансдукция внешнего сигнала во внутриклеточные процессы. Т.е. на первой ступени тепловая обработка■индуцирует распад полифосфоино-зитов п образование Са2+ мобилизируюяего вторичного месендаера ИФз. Этот начальный эффект может бить ассоциирован с плеотрошшлг ответш,я, такими как индукция стрессов!« белков. Более продолжительные прогревания вызывают разрушение полифосфопкозитидов и гибель клетки.

Роль активных интермедпатов кислорода в реорганизации ц-ембран'' нейтрофилов. .при фагоцитозе . Внсокореактгашыо интермедиа™ кислорода, образованные в стимулировании фагоцитах доллнн играть ключевую роль в механизме уничтожения фагоцитируемых шкроорганиз-мов. Учитывая высокую реакционную способность кислородных радпка-.лов в шгациировании реакция свободно-радикального окисления липи-дов могло предположи, что активация нейтрофилов должна сопрозоя-даться интенсификацией перекисного окисления мембранных липидов.

Нами было'изучено переокисление липидов в процессе фагоцитоза. О фагоцитарной активности нейтрофилов судили по количеству поглощенного ими полистирола. Экстракцию полистирола производили дпок-саном и измеряли количество полистирола по поглощению при Х-253 ,нм. В пределах концентраций 20-200 мкг/мл наблюдается линейная зависимость интенсивности поглощения от концентрации полистирола. Из этого следует, что по интенсивности поглоцзния экстрагированного полистирола можно судить о ого концентрации.

В процессе фагоцитоза наблэдалось повышение уровня перекисного окисле 1Шя липидов мембран нейтрофилов. Степень окисления липидов

Время протмшния фагоцитоза

Концентрации МДА з мкП

О 3 10 15 20

0.60 1.65 1.70 1.72

1.СО

В дальнейших экспериментах наш била предпринята попытка определить влияет ли интенсификация ипрокисного окисления липидов на поглотительную способность нейтрофилол. Липиды нейтрифклои иодиерга-ли перекисноцу окислению до начала фагоцитоза и в последуадем измеряли поглотительную способность неПтрофилон.

Предварительное окисление липидов нейтрофилоь повмпало нх оно— сооность поглощать чужеродные частицы, причем поглотительная способность нейтрофилов корродировала со степенью окисления их липидов (табл.З).

Таблица 3

Влияние перекисного окисления липидов на фагоцитарную активность нейтрофилов

Инициация перекисного Поглощенный полисти- Концентрации /"HAr.'rfil окисления рол мкг/ 2.10° кл до начала фаго-

ритоза

Контроль 20 • 0.45

Ре304 (10~^Ы)+ас- 40 , 1.2

корбат (Ю-3!.!)

(;<ШС +НАД11 )0g 65 1.9

Кон.А 50 исг/ил 42 1.25

СОД НАМ 30 0.5G

Добавление СОД '(I акт. ед/мл) ингибировало как накопление Ь'ЛД в нейтроф.илах, так и их фагоцитарную активность- '

Извеотно, ч:^ фагоцитоз сопровождается быстрой и существенной

• реорганизацией мембран нейтрофилов, что заключается в уменьшении шкровязкости, плотности, лектиновых рецепторов остаточной мембра-

• ни (Oliver et el., 1974), тогда как функции мембранного транспорта сохраняются (Твои, Berlin, 1971).

Берлином и Фора была выдвинута гипотеза латерального фазового разделения, согласно которой фагоцитоз может индуцировать распространение микротубул-зависимых региональных фазовых изменений. Ре~ .•гнон более конденсированный или менее текучий соответствует той области мембраны, которая обвалакив'ает фагоцитарную частицу. Зта ' ■ область интернализируется и удаляется, оставляв остаточнук цито-штзттическую мембрану с низкой шкровязкостью.

В дальнейших опытах ш постарались установить связь между ¡.шкровязкостью мембраны нейтрофилов и их фагоцитарной активноеп /з О латеральной диффузии и следовательно о микровязкоста м-г«бргну

судили по эксимеризации пирегга.

Для модификации шкровязкости мембраны проводили инициации перекисного окисления ионами двухвалентного келеза и О^-. Вследсг-вие перекисного окисления лиггадов мембран нейтрофилов имеет место уменьшение латеральной диффузии пиреяа (рио.5).

Рас.5. Изменение Рн в зависимости от концентрация пирена

з нейтрофилах. ( з?э - интенсивность флуоресценции зксиме-ра зонда пирона, ? - интенсивность флуоресцешдии мономера зонда пирона). Контроль (2.10® кл./мл) (I); В результате переокиелеггая вызванного (2); В результате стимуляции клеток копяанавалпном А (3)

Как отмечалось, генерация в значительной степени зависит от температуры инкубагрга. При увеличении температуры инкубации з интервале 3?-39°С отмечается розное повышение генерации ИсхО' дя из отого, для нас представлял интерес измерить латеральную дта фузию пиреяа в нейтралах стимулировашгых коп А как при 37°С, та и при 39°С. Млкроалзкость мембраны увеличивается вместе с уволим нием концентрации образованного 0^, что долгло являться результа том.перекисного окисления липидов, вызванного действием активных интерд-едиатоп кислорода.

Сопоставление фагоцитарной активности и мпкрозязкости мембрг нейтрофилов показывает, что фагоцитарная акттгвность высока в тс: условиях, где отмечается увеличение шкровязкостя.

1!риведонные наш экспериментальные данные указывают, что пр тексте реакции перекисного окисления липидов в мембранах нойтр фллоз яозкпает их фагоцитарную активность. 1.",ы предполагаем, что

иаблвдаошй сффекг связан с увеличите» дола ковдеиоироиаиноЁ фазы липидов, которая согласно рассмотренной вкие гипотезе доляня преимущественно вовлекаться в фагоцитарную везикулу.

Таким образом, акт1,анис интермедкатн кислорода, которые обра -зуются при стимуляции пейгрофялов и обусловливают их бактернцидлуа активность, также способствуют процессу захвата мшрооргшшзыов путем увеличения доли окисленных липидов в плазматической мембране.

в ы в о д и

1. Изучена зависимость интенсивности генерации от хоццент-1 рации стимулятора в пределах 10-100 мкг/мл в коп Л в сткцулкрииаи-1шх нейтрофилах. Показано, что оптимальной стимул;, рувдей концентрацией является 50 мкг/мл, таз: как при данной кс:,г,:лтрации иао/х--даотся как высокая интенсивность генерации 0^, тш; , высока фагоцитарная активность.

2. Установлено, что уровень генерации в кок А сгимулнроьл'г: -них нейтрофклах ь значительной степени зависит от' темпс^турп инкубации клеток. При повышения температуры инкубации от 37°С до З'Л отмечается двухкратное увеличение количества образованного

3. Установлено, что изменение температуры инкубации от 3?сС до 39°С вызывает значительное увеличение потока мекбраноассопи-роваиного Са^4 во внутрь ¡шетг.и и этот процесс пнгибнруется подавлением метаболизма фосфо'.шознтов.

4. Показано, образовало белков теплового коха в стимулированиях нейтрофилах с молекулярным весом 2?, 66, 94,7 к$з в условиях тепловой обработки клеток.

5. Показано, что процессу фагоцитоза в нейтрофилах сопутству-от интенсификация переписного окисления липидов мембран нейтрофа-лов. Установлена корреляция между степенью переокисления липидов и фагоцитарной активностью нейтрофилов.

6. Изучено изменение шкровязкости мембран нейтрофклов в условиях генерации О^Г Показана взаимосвязь мекку шкровязкосп.» шай-ран ыейтрофилов и их фагоцитарной активность«.

■ ' 7. Показано, что активные интермедиаты кислорода способсть/юг процессу фагоцитоза путем'уьеличешш доли конденсирован:«:: фаьы в лтгадах клеточных мембран.

ПО та® ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ СЛЕДУЮЩИЕ РАБОТЫ:

. I. Меладзе М.Г., Ратишга К.Н., Шавлакадзе Т.Л., Цулая М.Г. Активные формы кислорода в биологических системах // Материалы ■ ыекфакультетской конференции по естественным наукам. - Тбилиси, 1904. - С.133-135.

2. Меладзе М.Г., Цулая М.Г., Гогитидзе U.M. Влияние перекис-ного окисления липидов на поглотительную способность полиморфо-ядерннх лейкоцитов // Труды П республиканской конференции па те-usy "Проблем! экологической биофизики". - Тбилиси, 1906,-С. 122-123.

3. Цулая М.Г., Меладзе М.Г., Царцидзе М.А. Изучение структурно-функционального состояния мембран нойтрофилов при действии еттдулируицих агентов // У Всесоюзная межуниверситетская копфо-ренция "Биология клетки". - Тбилиси, 1937. - Труды. Часть I, -

С.145-146. ;

4-. Цулая М.Г., Меладзе М.Г., Царцидзе М.А., Ломсодэ'е Б.А. Влияние перекисного окислешя липлдов на фагоцитарную активность нейтрофялоз // Сообщения Академии наук Грузинской ССР. - 1988.-T.I3I,'Л 3. - C.I59-I6I. • •

5. Меладзе М.Г., Натрошвилп Т.Г., Табатадзе Л.Г., Цулая М.Г. Метаболитический ответ полиморфоядерннх (ГШ) лейкоцитов на стимуляции кокканавалнном А // Материала республиканской конференции биологов, посвященной 70-летию основания Тбилисского государственного университета. - Тбилиси, 1988. -tl.44-46.

6. Натроивили Т.Г., Табатадзе Л.Г., Меладзе М.Г., Цулая М.Г. ' Возможная роль протеинншгазн С в активации шшшрфноядортле .лейкоцитов // Труды межуниверситетской конференции па тему " Биологические мембраны в норме и патологии". - Тбилиси, 1989. - С.159 - 161.

4fx