Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование механизмов объем-зависимой регуляции "кислородного взрыва" в нейтрофилах человека

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование механизмов объем-зависимой регуляции "кислородного взрыва" в нейтрофилах человека"

Мш^совский Государственный Университет им.М.В. Ломоносова \ \ " Биологический факультет

На правах рукописи УДК 577.121: 612.112.91

КУЧКИНА Наталия Владимировна

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ ОБЪЕМ-ЗАВИСИМОЙ РЕГУЛЯЦИИ "КИСЛОРОДНОГО ВЗРЫВА" В НЕЙТРОФИЛАХ ЧЕЛОВЕКА

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1994

Работа выполнена в НИИ пульмонологии МЗ РФ и в лаборатории физико-химии биомембран Биологического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова.

Научный руководитель: д.б.н., профессор С.Н.Орлов.

Официальные оппоненты: чл.-корр. РАМН, д.б.н., профессор

В.А.Ткачук,

д.б.н., профессор А.А.Болдырев. Ведущая организация: НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН.

Защита состоится ^еУга^уЬ-'I 1994 г. в /У час.^

на заседании специализированного совета Д.053.05.32 Биологического факультета МГУ по адресу: 119899, г.Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан " //" И О <1 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

-I-ВВЕДЕШЕ

Актуальность проблемы. Необходимым условием участия нейтрофилов в иммунной реакции является активация этих клеток, сопровождающаяся перестройкой окислительного метаболизма. При этом наблюдается "кислородный взрыв", то есть резкое возрастание потребления клеткой кислорода и образование его высокореактивных метаболитов. Образование активных форм кислорода опосредуется активацией NADPH-оксидазы и играет главную роль в бактерицидном действии нейтрофилов (Thelen et al.,1993).

В последнее время получен ряд данных, свидетельствующих, что изменение объема клетки, происходящее в анизотонических условиях среды, играет существенную роль в регуляции некоторых клеточных функций, в том числе синтеза и метаболизма белков, пролиферации и програмируемой смерти клеток (Orlov et al.,1992; bang et al., 1993). В этой связи оказывается интересным вопрос о влиянии изменения клеточного объема на "кислородный взрыв" в нейтрофилах. Этот аспект важен прежде всего с патофизиологической точки зрения, поскольку в местах локализации нейтрофилов in vivo может происходить изменение осмотичности внеклеточной среды, связанное с протеканием воспалительной реакции (Hoffmann, Sirnonsen, 1989; Matsumoto et al.,1989; Widdicombe, Wine,1991).

В литературе иглеются единичные сведения, указывающие на возможность осмотической регуляции "кислородного взрыва" в нейтрофилах и практически отсутствуют работы, посвященные ¡^следованию механизмов такой регуляции. Учитывая вышеизлокешюе, были сформулированы цель н задачи настоящего исследования.

Цель и задачи исследования. Целью работы яеилось изучение

объем-зависимой регуляции "кислородного взрыва" в нейтрофилах человека и возможных механизмов, лежащих в ее основе. Реализация цели предусматривала решение следующих задач:

1. Исследовать влияние сред различной осмотичности на формирование реакции "кислородного взрыва" в нейтрофилах человека, индуцированной соединениями с различным механизмом действия.

2. Исходя из ключевой роли одновалентных ионов в формировании содержания внутриклеточной воды и объема клеток, оценить вовлеченность систем транспорта одновалентных ионов в объем-зависимую регуляцию "кислородного взрыва".

3. Исследовать роль Са2+ и Са2+-связывающего белка кальмодулина, а также фосфолипазы А2, 5-липоксигеназы и циклооксигеназы как основных сигнальных систем, опосредующих проведение активирующего сигнала на МАБРН-оксидазу, в механизме объем-зависимой регуляции "кислородного взрыва".

НаучнаяТговизнв-исслвдованийг____Впервые проведено

систематическое исследование влияния как гипоосмот5чёскгаГ~так-1ь гиперосмотических условий среды на "кислородный взрыв" в нейтрофилах человека при использовании широкого спектра активаторов различной природы и механизма действия.

Впервые исследована роль систем транспорта одновалентных ионов, Са2+ и кальмодулина, а также фосфолипазы А2, 5-липоксигеназы и циклооксигеназы в механизме объем-зависимой регуляции "кислородного взрыва".

Практическая значимость работы. Обнаруженная модификация реакции "кислородного взрыва" в анизотонических условиях среды, а также исследование молекулярных механизмов этого явления может

служить основой для более полного понимания регуляции функциональной активности нейтрофилов in vivo.

Исследование влияния различной осмотичности среды на функвдональную активность нейтрофилов может привести к выяснению роли этих клеток в некоторых патологических процессах (например, в случае бронхиальной астмы, воспалительной реакции, отечных состояний).

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на сессиях НИИ пульмонологии МЗ РФ ( Москва, 1992, 1993 ), на 12 Интернациональном конгрессе по нефрологии (Иерусалим, 1993), на конгрессе Европейского респираторного общества (Флоренция, 1993), на 4 Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 1994), на заседании кафедры биохимии МГУ ( Москва, 1994 ).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 235 ссылок. Работа изложена на 136 страницах машинописного текста и содержит 6 таблиц и 23 рисунка.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали свекую донорскую кровь, содержащую гепарин (50 Ед/мл). Выделение нейтрофилов проводили по методу Boyum (Boyum,1968) с некоторыми модификациями (Cheung et al.,1983; Gresham et al.,1986). Остаточные эритроциты удаляли изоосмотическим лизисом, используя 0,83% travel. Клетки суспендировали в среде А (140 мм NaCl; 5 ММ К01; 1 ММ СаС1?; 1 мм

MgCl2; 1 MM NagHPO^; 5 МЫ глюкозз; 10 MM HEPES-Трис, pH 7,4) и хранили во льду.

Образование активных форм кислорода в ходе реакции "кислородного взрыва" регистрировали методами люминол-зависимой хемилюминесценции (ХЛ) (TakahaBhi et al., 1991) или люцигенин-зависимой хемилюминесценции (Л-ХЛ) (Gyllenhammar,1987). Реакцию проводили при 37°С в 1мл среды различной осмотичности (рН 7,4), содержащей лшинол (Ю-4 М) и 2*105 нейтрофилов или люцигенин (5аЮ-4 М) и I06 нейтрофилов соответственно. Активацию " кислородного взрыва " индуцировали формиловым пептидом формил-Ме t-Leu-Phe - FMIP ( 10~5М ), форбол-12-миристат-13--ацетатом - РШ. (10_8М), Са2+-ионофором A23I87 (Ю_5М), опсонизированным зимозаном - oz (100 мкг/мл) и термоагрегированным IgG - agg IgG (300 мкг/мл).

Гипоосмотическую среду (200-300 мосМ) получали добавлением к среде А (320 мосМ) аналогичной среда, не содержащей NaOl, а тшвроемоттескую__(345-520 мосМ) - добавлением к среде А сахарозы. --_____________

Для изучения роли систем транспорта одновалентных ионов,

о.

Са и кальмодулина, а также фэсфолипазы А2, 5-лшоксигеназы и циклооксигеназы в активации "кислородного взрыва " использовали

с

ингибиторный анализ. Во всех случаях нейтрофилы (2*10 кл/мл) инкубировали в среде измерения ХЛ в присутствии соответствующих ингибиторов или без них при 37°С в течение 3 мин до внесения активатора.

Нагрузку нейтрофилов нефлуоре сцирущим хелатором внутриклеточного Са2+ - МАРТАМ - осуществляли по методу Korohak и соавт.(Korohak et al.,1988).

Для опсонизации зимозана использовали метод Roos и соавт. (Roob et al.,1981). Агрегацию igG проводили 30 мин при 63°С с последующим быстрым охлаждением во льду (Rosales, Brown,1992).

Для исследования са2+-индуцированных конформационных перестроек в молекуле кальмодулина регистрировали уровень тушения флуоресценции diS-Cy-(5) (Орлов и др.,1984).

Статистическая обработка результатов проводилась с помощью параметрического t-критерия Стьюдента. За достоверные принимались различия на уровне ЭЪ% (р<0,05) и 99% (р<0,01). Рассчитывались срздневрифметическив значения ( М ) и значения стандартной ошибки ( m ), полученные в 3 - 4-х различных экспериментах.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Исследование объем-зависимой регуляции "кислородного взрыва" в нейтрофилах человека

При исследовании объем-зависимой регуляции "кислородного взрыва" в нейтрофилах человека, регистрируемого с помощью метода лдаинол-зависимой хемилтаинесценции (ХЛ), нами было показано, что увеличение осмотичности среды инкубации от 320 мосМ до 520 шсМ или ее снижение до 200 мосМ не влияет на кинетику ХЛ-ответа, но оказывает модулирующее влияние на его интенсивность ( рис.1-2 ). Особый интерес вызывает наблюдаемая ярко выраженная дозовая зависимость амплитуда реакции от осмотичности, когда лишь небольшой сдвиг в сторону увеличения или снижения осмотичности ( на 25-40 мосМ ) оказывается достаточным для существенного изменения интенсивности активированной ХЛ.

Рисунок I. Влияние осмотичности среды на интенсивность ХЛ нейтрофилов человека, индуцированной РМА, А23187 и РМЬР (на рис. I - 2 за 100% принята интенсивность ХЛ в изоосштической (320 мосМ) среде).

интенсивность ХЛ, %

осмотичность среды, мосМ

Рисунок 2. Влияние осмотичности среды на интенсивность ХЛ нейтрофилов человека, индуцированной а^ з^С и опсонизированным зимозаном.

Экспозиция клеток в гиперосмотических условиях среды приводит к снижению ХЛ-сигнала вне зависимости от природы используемого активатора. Наиболее резкая зависимость при повышении тоничности раствора наблюдается в случае активации A23I87 и 0Z. Для этих соединений увеличение осмотичности от 320 до 420 мосМ приводит к уменьшению интенсивности ХЛ на 90 %. В аналогичных условиях ХЛ, индуцированная РМА, жьр и agg igG, была снижена на 40-60%. Уменьшение осмотичности среды до 200 мосМ приводит к 2-3-кратному снижению ХЛ-ответа при стимуляции МЕР, РМА и A23I87, но к увеличению ХЛ при стимуляции oz или agg igG на 60-80 % (рис.1-2). Согласно данным, имеющимся в литературе, экспозиция нейтрофилов в гипо- (180-210 мосМ) или в гиперосмотических (550 мосМ) условиях среды приводит, соответственно, к существенному (на 85-110 мкм3) увеличению или уменьшению клеточного объема по сравнению с условиями изоосмоса, которое достигается за 30 - 60 с и сменяется процессом регуляторного восстановления объема, длящимся 20-30 мин или более (GririBtein et al., 1986; Simch.owitz et al., 1993). В этой связи наши эксперименты позволяют ' непосредственно оценить влияние изменения осмотичности и, как следствие, клеточного объема на функциональную активность нейтрофилов, поскольку регистрация активированной ХЛ проводилась через 3 мин экспозиции клеток в анизотонических условиях, когда регуляторное восстановление объема практически отсутствовало.

При исследовании объем-зависимой регуляции "кислородного взрыва" мы дополнительно использовали метод люцигенпн-зависимой хемилдаинесценции (Л-ХЛ). Такая необходимость была связана с различиями в механизмах ХЛ и Л-ХЛ. Так, показано, что основной

вклад в ХЛ вносит реакция образования гипохлорной кислоты из HgOg, катализируемая миелопероксидазой (Brestel.1985), в то время как основной вклад в Л-ХЛ вносит образование Og , катализируемое NADPH-оксидазой (Gyllenhammar,1987). Согласно данным, полученным при использовании FMA и A23I87, экспозиция нейтрофилов в гипер-(346 - 620 мосМ) или в гипоосмотических (200 - 300 мосМ) условиях среды приводит к ингибированию по сравнению с условиями изоосмоса интенсивности Л-ХЛ. Лозовые зависимости этого ингибирования коррелируют с наблюдаемыми в случае использования для регистрации "кислородного взрыва" метода ХЛ (данные представлены в диссертации). Так, например, при 200 мосМ наблюдается ингибирование как Л-ХЛ-, так и ХЛ-сигналов, индуцированных A23I87, на 50%, а при 420 мосМ - на 90%.

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют, что изменение объема нейтрофилов в анизотонических средах приводит к резкому изменению интенсивности "кислородного взрыва". Форма ~кршюй_^|интвнсивность ХЛ - осмотичность среды" зависит от природы активатора нейтрофилов! Сопоставление—динамики—!!кисщродяого^ взрыва", регистрируемого методами ХЛ и Л-ХЛ, указывает на то, что объем-зависимое звено регуляции "кислородного взрыва" локализовано на начальных этапах проведения активирующего сигнала.

2. Исследование молекулярных механизмов объем-зависимой регуляции "кислородного взрыва" в нейтрофилах человека

2.1. Роль систем транспорта одновалентных ионов ■

При исследовании роли Ыа+,к+-АТРазы в активации

"кислородного взрыва" нейтрофилов было показано, что ингибирование этой системы ионного транспорта уабаином ( 2 мМ ) в изоосмотических ( 320 мосМ ) условиях не оказывает влияния на интенсивность ХЛ при использовании любого из активаторов (данные представлены в диссертации). Исследование роли ион-транспортирующих систем в механизме объем-зависимой регуляции "кислородного взрыва" проводилось нами в гипоосмотических условиях среды при 200 мосМ, а в гиперосмотических условиях среды при 420 мосМ. Согласно полученным результатам, ингибирование На+,К+-АТРазы также не влияет на формирование реакции "кислородного взрыва " при активации клеток в анизотонических условиях (данные представлены в диссертации).

При исследовании вовлеченности системы На+,К+,201~--котранспорта в формирование реакции "кислородного взрыва" наш было обнаружено, что ее ингибирование буметанидом ( 10 мкМ ) не оказывает влияния на интенсивность активированной ХЛ. Менее селективный ингибитор этой системы, а также На+-независимого к+,с1~-котранспорта - фуросемид (0.5 мМ) - приводил лишь к незначительному снижению (максимально на 8-12%) амплитуды ХЛ-ответа по сравнению с контрольной величиной. Использование комбинаций ингибиторов: уабаин + буметанид и уабаин + буметанид + + фуросемид такке оказалось неэффективным. Наблюдаемые эффекты буметанида и фуросемида сохраняются при активации в условиях различной осмотичности среды (данные представлены в диссертации).

Использование специфического ингибитора Иа+/Н+-обмена -этшшзопропиламилорида - егра (10 мкМ) - приводило к снижению хл--сигнала на 40-60% (рис.3). Аналогичная степень ингибирования достигалась в . наших экспериментах при использовании менее

специфичесного блокатора Ыа+/н+-обмена - амилорида - в кощентрации 0,5 мМ (рис.3), который при этом также полностью блокирует низкоселективные ионные каналы и Иа+/Са2+-обмэн (Каогогоивк! et а1.,1985). При исследовании влияния ЕЕРА и амилорида на интенсивность ХЛ, активированной при 200 или 420 мосМ, мы показали, что степень ингибирования ХЛ-сигнала аналогична наблюдаемой в условиях изоосмоса (рис.3).

интенсивность ХЛ, %

Рисунок 3. Влияние ингибиторов Na+/h+-обмена - eipa и амилорида* - на интенсивность ХЛ нейтрофвдов человека при активации в условиях различной осмотичности среды ( на рис. 3 - 5 за 100% ("контроль") принято значение ХЛ в среде соответствующей осмотичности без ингибиторов ).

Таким образом, на основании представленных данных можно заключить, что известные системы транспорта одновалентных ионов плазматической мембраны не вовлечены в механизм, лежащий в основе объем-зависимой регуляции "кислородного взрыва" в нейтрофилах.

1.2. Роль Са2+ и кальмодулина

Для изучения роли Са2+ в активации "кислородного взрыва" мы использовали проникающий в клетку хелатор Са2+- МАРТАМ, а также хелатор внеклеточного са2+- egta.

В присутствии мартам наблюдается существенное ингибирование интенсивности ХЛ, индуцированной FMLP, А23187, agg IgG и QZ в изоосмотических условиях ( рис.4. ). Степень ингибирования интенсивности ХЛ МАРТАМ-нагруженных клеток в гиперосмотической (420 мосМ) среде при активации РМЬР, PMA, agg IgG и 0Z не отличается от наблюдаемой в условиях изотонии (рис.4). Напротив, при активации в гипоосмотических (200 мосМ) условиях ХЛ-ответ, индуцированный FMIP в МАРТАМ-нагрукенных клетках, полностью блокировался, а при использовании рма, agg IgG и oz наблюдалось небольшое (на 11-14%), но статистически достоверное снижение величины ингибирования интенсивности ХЛ по сравнению с условиями изоосмоса. В случае активации A23I87 как в гипо-, так и в гиперосмотических условиях наблюдалось лишь незначительное снижение величины ингибирования, которое, однако, не являлось статистически достоверным (рис.4).

При исследовании роли внеклеточного Са2+ в активации "кислородного взрыва" измерение интенсивности ХЛ проводилось нами в присутствии 5 мм egta. Полученные результаты свидетельствуют, что при 320 мосМ существенное ингибирование интенсивности ХЛ наблюдается лишь в случае активации A23I87 и oz, а при использовании гаьр, РМА и agg IgG отмечается лишь небольшое снижение ( максимально на 15% ) интенсивности ХЛ по сравнению с контрольной величиной (рис.5). Согласно результатам, приведенным на рис.5, при 200 мосМ влияние egta на интенсивность ХЛ,

интенсивность ХЛ, %

а контроль ЕЯ А 2318? СЗ РМЬР Ш РМА ет agg ^ ш 02

Рисунок 4. Влияние хелатора внутриклеточного Са2+ - МАРТАМ (105 мкМ ) - на интенсивность ХЛ нейтрофилов человека, индуцированной при 320, 200 и 420 МОСМ.

интенсивность ХЛ, %

а контроль ЕЯ А 23187 ПЗ РМЫ3

ш РМА ш аёе ^ ш ог

Рисунок 5. Влияние хелатора внеклеточного Са2+ - ЕСТА ( 5 мМ ) -на интенсивность ХЛ нейтрофилов человека, индуцированной при 320, 200 и 420 мосМ.

индуцированной рмьр, рма, agg igG и oz, не отличается от наблюдаемого при 320 моем, однако в случае A23I87 чувствительность реакции к удалению внеклеточного Са2+резко снижается по сравнению с изотоническими условиями. В противоположность этому при 420 мосМ влияние EGTA на ХЛ, индуцированную A23I87, сопоставимо с наблюдаемым в изотонической среде. При использовании РМЕР, PMA, agg igG и oz отмечается повышение чувствительности ХЛ к удалению внеклеточного Са2+.

Представленные нами данные свидетельствуют, что в изоосмотической среде Са2+ играет важную регуляторную роль в активации "кислородного взрыва", причем основной вклад в активацию вносит мобилизация Са2+ из внутриклеточных пулов, а вход внеклеточного Са2+ не играет при этом существенной роли. Отметим, что снижение oz-индуцированной ХЛ в присутствии egta, вероятно, обусловлено зависимостью связывания oz с рецепторами от концентрации Са2+ и Mg2+ в среде (Roos et al.,1991). Уменьшение осмотичности среды до 200 мосМ или ее увеличение до 420 мосМ приводит к изменению относительного вклада входа внеклеточного Са2+ и его мобилизации из внутриклеточных пулов в активацию "кислородного взрыва".

Поскольку результаты наших экспериментов свидетельствуют о повышении чувствительности реакции "кислородного взрыва" к внеклеточному Са2+ в гиперосмотических условиях, мы предприняли попытку исследования возможного механизма, лежащего в основе этого явления, используя ингибитор потенциал-зависимых Са2+--каналов L-типа - нифедипин. Согласно полученным данным, нифедипин оказывает ингибируюищй эффект на ХЛ, индуцированную при 320 мосМ РМА (табл.1), A23I87 или OZ (данные представлены в

диссертации), и в концентрации 10 мкМ приводит к снижению интенсивности ХЛ на 50-60% в случае использования любого из активаторов.

Таблица I

Влияние шфедипина на интенсивность ХЛ нейтрофилов человека при активации в условиях различной осмотичности среды

Осмотичность Интенсивность ХЛ, % от контроля при Активатор среды, концентрации нифедипина, мкМ

мосМ 12 5 10

320 97,1-2,4 73,3*4,1 46,6*3,7 39,6*4,2 РМА 200 97,4*1,7 77,7*5,4 54,8*4,1 46,8*5,7

420 92,3*3,6 79,6*4,3 49,1*5,1 47,1*3,6 Примечание. В табл. I и 3 за 100% принята интенсивность ХЛ при 320, 200 и 420 мосМ в отсутствие ингибитора.

Известно, что в концентрации I мкМ производные дигидропиридина полностью 1Шжируют-преницаемость_!'классических" Са^-каналов L-типа, обнаруженных в миоцитах (Janis.Triggle,1983; Scarborough,Carrier, 1984). Поскольку в наших экспериментах нифедипин не оказывал влияния на интенсивность ХЛ в концентрации I мкМ, можно предположить, что потенциал-зависимые Са2+-каналы в нвйтрофилах по своим фармакологическим свойствам отличаются от Са2+-каналов L-типа миоцитов. Однако более вероятно, что наблюдаемое ингибирование связано с побочными эффектами нифедипина (Karnad et al.,1990, Nalini et al.,1990).

Согласно полученным результатам, при активации нейтрофилов в условиях гипо- и гиперосмоса наблюдаются лишь незначительные

отличия в степени ингибирования нифедипином интенсивности ХЛ по сравнению с условиями изоосмоса как при использовании РМА (табл.1), так и при использовании А23187 и ог. В силу этого можно заключить, что в независимости от механизма действия нифедипина, ингибируемые им пути сигнализации не вовлечены в объем-зависимую регуляцию "кислородного взрыва".

Обнаруженная нами модификация зависимости реакции "кислородного взрыва" нейтрофилов от Са2+ в условиях гида- и гиперосмоса явилась причиной исследования роли Са2+-связываклцего белка - кальмодулина - в объем-зависимой регуляции "кислородного взрыва". В присутствии одного из наиболее эффективных антагонистов кальмодулина - И24571 - наблюдалось концентрационно--зависимое ингибирование ХЛ, индуцированной при 320 мосМ А23187, а также РМА или оЪ (данные приведены в диссертации). Экспозиция клеток в гипо- или гиперосмотических условиях среды приводила к модификации концентрационной зависимости ингибирования ХЛ под действием Н24571. При этом "кислородный взрыв", индуцированный при 200 моем, оказывался менее чувствительным, а индуцированный при 420 мосМ, наоборот, - более чувствительным к ингибированию И24571. Концентрации И24571, приводящие к 50% ингибированию интенсивности ХЛ (Ю50), индуцированной в условиях изо-, гипо- и гиперосмоса, суммированы в табл.2. Наблюдаемый эффект зависит от природы и механизма действия активатора и в наибольшей степени выражен в случав индукции "кислородного взрыва" А23187 (табл.2).

При использовании антагониста кальмодулина №-13 мы также обнаружили концентрационно-зависимое ингибирование "кислородного взрыва", индуцированного РМА при 320 мосМ (табл.3). В этом случае величина 1СВ0 составляла 43,5 - 3,9 мкМ. Наблюдаемое различие в

Таблица 2

ю^0 для ингибирования ХЛ под действием 1124571

Осмотичность среды, 1С50 < в мкМ) для ХЛ, индуцированной

мосМ А23187 РМА ог

320 _ 0,3 ± 0,04 0,85 ± 0,07 1,7 ± 0,12

200 3,2 ± 0,3** 1,6 ±0,1** 3,8 ± 0,35**

420 0,07 ± 0,01 ** 0,5 ±0,06** 0,9 ± 0,08**

Примечание. В табл. 2-6 * - р < 0,05; ** - р < 0,01 ( по сравнению с данными, полученными при 320 мосМ ).

селективности ингибирования мевду 1*24571 и №-13 также подтверждается результатами экспериментов по исследованию влияния 1124571 и У/-13 на Саг+-индуцированные конформациокные перестройки молекулы кальмодулина, регистрируемые по изменению флуоресценции <31В-с3-(5). Как следует из данных,приведенных на рис. 6, 50%

ЗшгйСирование-конформационных перестроек наблюдалось при

использовании 1*24571 и >7-13 в концентрациях о7? й В ШсМ— соответственно.

В условиях гипер- и гипоосмоса "кислородный взрыв", индуцированный РИА, характериризовался резким повышением чувствительности к ингибированию \ыз по сравнению с условиями изоосмоса в противоположность результатам, полученным при использовании Е24571 (табл.3). Возможно, что наблюдаемое при 200 и 420 мосМ действие умз связано с побочными эффектами этого соединения. Это подтверждают эксперименты с использованием \У-5 -аналога, характеризующегося слабым ингибиторным действием (рис.6; Мйака et а1., 1381). у?-5 в концентрации от 10 до 80 мкМ не

Таблица 3

Влияние я-13 и н-5 на интенсивность ХЛ нейтрофилов человека при

активации ША в условиях различной осмотичности среда Ингибитор Осмотичность Интенсивность ХЛ, % от контроля при

№-13

среда, концентрации ЯМЗ (№-5) , мкМ

мосМ 15 30 50 80

320 92,3-3,6 70,6-3,1 36,2±8,9 16,4-2,8

200 68,3-9,2** 45,2-7,1** 19,6±3,3* 12,8-4,1

420 36,2-7,9** 21,8-6,9** 12,3±4,7** 8,1-3,8'

320 101,3-2,6 Ю2,6±3,2 105,1-3,8 103,3±5,1 №-5 200 104,3-5,1 102,4-7,1 79,2±4,2** 57,1±3,4**

420 98,2-3,6 95,1-4,8 81,3±5,2** 56,2±3.9**

120 100 80 60 40

го о

изменение флуоресценции, %

_и

-7.5

-6.5 -в -5.5 -5

18[С]. М

-4.5

Ж-5

1*24571

ТГ-13

-4

6. Влияние И24571, V-13 и УУ-5

на

Рисунок 2+

Са -индуцированного изменения флуоресценции <Иа-с3-(5)

величину в

кальмодулине. ( за 100% принята величина изменения флуоресценции в отсутствие ингибиторов кальмодулина ).

оказывал влияния на интенсивность ХЛ. активированной РМА при 320 мосМ, однако приводил к существенному ингибированию ХЛ-сигнала цри 200 и 420 мосМ (табл.3).

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют, что Са и кальмодулин вовлечены в объем-зависимый механизм модуляции "кислородного взрыва" нейтрофилов человека.

III.3. Роль фосфолипазы &.2, 5-липоксигеназы и циклооксигеназы.

При исследовании роли фосфолипазы А2 в активации "кислородного взрыва" в нвйтрофилах, индуцированного РМА, А23187 или ог при 320 мосМ, нами было показано, что в присутствии ингибитора этого фермента - 4-бромфенацилбромида - наблюдается концентрационно-зависимое снижение интенсивности ХЛ ( данные представлены в диссертации ). Концентрационные зависимости ингибирования интенсивности ХЛ в условиях гипоосмоса не отличаются от наблюдаемых в условиях изоосмоса. В условиях гиперосмоса наблюдается модификация концентрационных зависимостей^ Так~| "гакГлбродный—взрыву—итгдупщюваншй РМА ^и^ А23187, характеризуется снижением чувствительности, а индуцированный ог, наоборот, - повышением чувствительности к ингибированию. Концентрации 4-бромфенацилбромида, приводящие к. 50% ингибированию ХЛ в условиях различной осмотичности среды, суммированы в табл.4.

При исследовании влияния ингибитора 5-липоксигеназы -кверцетина - на "кислородный взрыв", индуцированный РМА, А23187 и оъ, в наших экспериментах наблюдалось концентрационно-зависимое снижение интенсивности ХЛ в условиях изоосмоса ( данные представлены в диссертации ). Ингибирующий эффект кверцетина

Таблица 4

ю,-0 для ингиОирования ХЛ под действием 4-бромфенацилбромида

Осмотичность среды, 1С50 (в мкМ) для ХЛ, индуцированной

мосМ A23I87 РМА 0Z

320 2,3 ± 0,16 17,2 ± 1,2 21,3 ± 1,8

200 2,1 - 0,19 15,8 ± 1,4 20,8 ±1,5

420 3,5 ± 0,25** 27,2 - 1,9** 5,3 ± 0,5**

сохраняется в условиях гипо- и гиперосмоса. При этом концентрационные зависимости ингибирования не отличаются от наблюдаемых в изоосмотических условиях как при использовании рма, так и в случае А23187 и оя. Величины 1С^0 для ингибирования кверцетином интенсивности ХЛ приведены в табл.5.

Таблица 5

1С(-0 для ингибирования ХЛ под действием кверцетина

Осмотичность среда, ю50 (в мкМ) для ХЛ, индуцированной

MOCM ' A23I87 PMA OZ

320 0,8 - 0,04 1,9 - 0,11 2,5 - 0,21

200 0,8 ± 0,06 1,9 - 0,13 2,3 ± 0,18

420 0,9 ± 0,07 1,8 - 0,14 2,4 - 0,16

При исследовании влияния ингибитора циклооксигеназы -меклофенамовой кислоты - на "кислородный взрыв", индуцированный рма или а23187, мы также продемонстрировали концентрационно--зависимое снижение ХЛ-сигнала в условиях различной осмотичности среды. Однако реакция, проводимая при 200 мосМ, характеризовалась

-га-

снижением чувствительности, в при 420 мосМ, наоборот, повышением чувствительности к ингибированию по сравнению с изоосмотическими условиями. Концентрации меклофенамовой кислоты, приводящие к 50 % ингибированию ХЛ-сигнала в условиях различной осмотичности среды, суммированы в табл.6.

Таблица 6

Ю(-0 для ингибирования ХЛ под действием меклофенамовой кислоты

Осмотичность среды, 1G$o Л*555 индуцированной

мосМ РМА A23I87

320 4,0 - 0,3 1,7 - 0.11

200 8,8 - 0,7** 2,8 ± 0,21**

420 1,0 ± 0,16** 1,1 - 0,08**

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют,что в механизм, лежащий в основе объем-зависимой регуляции "кислородного взрыва41—нейтрофилов^__вовлечены фосфолипаза А2 и циклооксигеназа, а 5-липоксигеназа не играет при этом существенной роли.

ВЫВОДЫ

1. Изменение осмотичности среды, приводящее к изменению клеточного объема, оказывает существенное модулирующее влияние на формирование реакции "кислородного взрыва" в нейтрофилах человека.

2. Форма зависимости реакции "кислородного взрыва" от осмотичности среды определяется природой и механизмом действия активатора нейтрофилов.

-213. О помощью ингибиторов На+,к+-АТРазы, ^+,К+,2С1~--котранспорта, к+,С1~-котранспорта и На+/н+-обмена установлено, что эти ион-транспортирующие системы не вовлечены в механизм объем-зависимой регуляции "кислородного взрыва".

4. Показано, что изменение осмотических условий среды приводит к модификации относительного вклада входа внеклеточного Са2+ и его мобилизации из внутриклеточных пулов в активацию "кислородного взрыва".

5. С помощью ингибиторного анализа установлено, что в механизм объем-зависимой регуляции "кислородного взрыва" вовлечены Са2+- связывающий белок - кальмодулин, фосфолипаза А2 и циклооксигеназа.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Кучкина Н.В., Орлов С.Н., Покудин Н.И., Чучалин А.Г. Влияние осмотичности среды на хемилюминесценцию нейтрофилов человека. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1993,Т.115, N.4, стр.360-362.

2. Кучкина Н.В.,Орлов С.Н., Чучалин А.Г. Роль ионтранспортирунщих систем в активации "кислородного взрыва" нейтрофилов человека: влияние осмотичности среды. Биологические мембраны, 1994, Т.II, N.2, стр.174-179.

3. Кучкина Н.В., Орлов С.Н., Чучалин А.Г. Активация "кислородного взрыва" нейтрофилов человека в анизотонических условиях среды: роль вне- и внутриклеточного кальция. Тезисы 4 Национального конгресса по болезням органов дыхания, Москва, 1994, стр.72.

4. Кучкина Н.В., Орлов С.Н., Чучалин А.Г. Голь фосфолипазы А2,

5-липоксигеназы и циклооксигеназы в активации "кислородного взрыва" нейтрофилов человека: модулирующее влияние осмотичности среды. Биохимия, 1994, Т.59, N 7, стр.1034-1041.

5. Кучкина Н.В., Орлов G.H., Чучалин А.Г. О роли кальция в регуляции "кислородного взрыва" в нейтрофилах человека, индуцированного в условиях гипо- и гиперосмотичности. Биологические мембраны, 1994, Т.II, N.5, стр.554-567.

6. Orlov S.N., Kuohkina N.V., Pokudin N.I., Chuohalin A.G. Volume-dependent regulation of phorbol myrietate acetate (PMA)-, f-Met-Leu-Phe (PMLP)-, opsonized zymozan (OZ)-, agg IgG-, and A 23187-induoed oxygen buret in human neutrophils. X11th International congress of nephrology, Jerysalem, 1вгае1, 1993, P.280.

7. Kuohkina N.Y., Orlov S.N., Pokudin N.I., Chuohalin A.G. Effeot of medium osmolality on the respiratory burst of human neutrophils. The European Respiratory Journal, 1993, Vol.6,

8. Kuohkina N.V., Orlov S.N., Pokudin N.I., Chuohalin—AtG;— Volume-dependent regulation of respiratory burst of activated human neutrophils. Experientia, 1993, Yol.49, N.11, P.995-997.