Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизм опсониннезависимого взаимодействия в системе "нейтрофил-стафилококк"

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Механизм опсониннезависимого взаимодействия в системе "нейтрофил-стафилококк""

:» ими с т г. р с т в о : i ц ? л в о с ¡ х г- л и к ш t я р о lüüíErüPfJ ДС1САЯ МВЙИЦИНСКЛЯ АКАЯКМИЯ

Р Г Б ОД 'а п-,япах

2 2 СЕ;!

П Р !1 с Л л л Т а т i. ш i п В а л с р ь о n i ! a

у îî ii: о 1п- 0:")3/ - о о g

явхлшши опшшннезлвиашого взаимодействия

ft СИСТВНВ "НБИТРОбИЛ- СТАФИЛОКОКК"

liíí.OO.O/ - ;.t(í:nio<¡!io.'!<)rníí

д в т о (■ е ? к р а т лнссертшиш на соискшша ученой степени канлчппта мядининсгсих ünvic

Никшш Нопгопол 1097

Работа выполнена па кад>одре микробиологии Никогородски государственной медицинской академия имени С. ¡Л. Кирова.

Научный руководитель: доктор медпшшс.кик наук, процесс А. К. "аипский.

О у Я Ц II А Л Ь I! Ы Е ОППОНЕНТ Ы: Ликтор медицинских паук В.Г.Доробейчук

Лектор мсдициискик наук, профессор К.А.Добротине.

Ведущее учреждение - Нижегородский научнсисслсдоиатель-ский институт эпидемиологии и микробиологии

Защита состоится " С£.к.гтьос$рЛ 109 7г. с ___/_/____час

на заседании спеикалпипросанного Ученого Совета /К. 054. Зё. 0 Нижегородской .медицинской академии (Нижний Новгород, пл. Пппина, 1.).

Г. диссертацией можно ознакомиться и оийлиотоке акадеш: А е торейерат р а о о слан " _ __"____оА'ЗЛг&юд,___*9 9 7 г,

Ученый секретарь специализированного Ученого Совета кандидат медицинских наук А.В.Леонов

0БЕ1АЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность теми. В последнее десятилетие во веек экономически развитых странах отмечается значительный рост заболеваемости внутрибольничннми инфекциями, основная масса которых вызывается условнопатогенными микроорганизмами. Этиологическая структура госпитальных гнойно-воспалительных заболеваний включает около 200 видов микроорганизмов СР.Х.Яфаев, Л.П. Зуева, 1989]. Важное место в этиологии гнойно-септических осложнений занимают представители рода Staphylococcus СВ.Д.Беляков и соавт., 1985; Ю.Б.Врусина, 1998]. Согласно 9 изданию определителя бактерий Берджи род Staphylococcus объединяет около 30 видов. Наиболее патогенен для человека золотистый стафилококк (S.aureus), однако возросла роль эпидермального стафилококка (S.epidermidis) в этиологии госпитальных гнойно-септических инфекций С А.П.Красильников, Н.А.Семина, 1993; Л. С. Барбапаш, 1990; ЕЗ. А. Акатова и соавт., 1993; Noble et al., 1990; Davenport et al., 1986; Daiz-Mito-ma et al., 1987].

Патогенетической основой процесса, связанного с внедрением в организм пиогенных бактерий является нейтрофил-зависимое (гнойное) воспаление. При этом ключевую роль з реакциях противоинФвкционной защиты занимает система нейтройильно-го фагоцитоза СА.Н.Маянский, Д.Н,Маянский, 1989]. Микроби-цидный потенциал нейтрофилов реализуется при участии гуморальных факторов (опсонинов), опосредующих реакции между клетками и бактериями. Однако известны примеры эффективного взаимодействия фагоцитов с бактериями в отсутствии сывороточных опсонинов СА.Н.Маянский и соавт., 1986; Jonson et al., 1995; Sharon et al., 1991; Hoepelman et al., 1992]. Большинство из них основано на специфически, лиганд-рецеп-торных взаимодействиях мекду фагоцитами и бактериями, базирующихся на молекулярной комплементарности их поверхностных структур CAntal et al.,1989; Rodiger-Orteg-a et al., 1987; Ross et al., 1993; Salmon et al., 1989].

Особое внимание уделяется лектин-углеводным взаимодейс твиям, опосредующим прикрепление бактерий и пос-лвдующке этг пы реакции. Лектинопадобные белки и комплементарные углево; вкодят в состав различных структур бактерий (липополисахар! ды [Ohman et al., 19823, пептидогликаны [Ross et al., 19931 липотейхоевые кислоты [Ohshima et al., 1988], фимбр; [Jonson et al., 1995; Sharon et al., 1991] и йагоцитов ( ш тегрины [SauKkonen et al., 1991; Ross et al., 19933), E -рецепторы CKimberly et al., 1989; Salmon et al., 1987] неидентибицированные мембранные структуры CFarrell et al. 1990; Gordon et al., 19833). Описаны также и белок-белков! взаимодействия (например, RGD связывающий триплет интегринс [SauKkonen et al., 19913). Имеются данные о видовой и шта? новой вариабельности клеточного ответа, являющейся результ; том захвата бактерий фагоцитами через функционально рэвлш ныв клеточные рецепторы LOfek et- al., 1992j Jonson et al. 19953.

Приведены единичные наблюдения о том, что на взаимс действие между бактериями и нейтро$илами могут влиять факте ры, активно или пассивно высвобождающиеся из клеток [Gab; et al. , 1993; Gans et al.,1987; Ginsburgr et al... 19813. Tpai лы нвйтройилов содержат комплекс факторов, которые, облад; катионными свойствами, связываются с бактериями и способ! вуют их уничтожению CSpitznagel et al. , 19903. Это происходит не только внутри фагоцитов, так как антимикробные бе; ки/пептиды могут активно или пассивно высвобождаться из кл!

ток, действуя на внеклеточные мишени [Ganz et al., 1990.

\

Gabay et al.. Grey et al., 19893. Их эффекторный потенцш весьма обширен, распространяясь на широкий круг прокариот! ческих и эукариотических объектов. Наряду с тем, извест] видовые и штаммовые различия в чувствительности бактерий катиониым пептидам, а также особенности мобилизации после; них в зависимости от условий стимуляции нейтро|илов, в час

ности от типа рецепторов, воспринимающих внвиние сигналы [А. Н.Мяянский., Д.Н.Мпянский, 1989], Кроме прямого биотоксического эффекта, сорбция катионннк белков может усиливать поглощение бактерий, то есть оказывать опсоническое действие СВ1пБЬигд вЪ а1., 1981]. Есть наблюдения, что такого рода аффекты отличаются известной специфичностью и, возможно, совершаются на лиганд-рецепторной основе CShafeг et а1., 1989].

В предыдущих исследованиях, проведенных на кафедре микробиологии НГМД с использованием метода люминол-зависимой хемилюминисценции нейтрофилов, были отобраны штаммы стафилококка, высокоактивные в опсониннезависимых реакциях с нейт-рофилами человека [Д.Л.Невмятуллин, 1988]. Одним из них был штамм Б. ер1с1егп11сИз 178М, высокая нейтрофилстимулирующая активность которого сочеталась с низкой гидрофобностью. Стимулятор, разработанный на основе этого штамма, прошел серию успешных клинико-лабораторных испытаний, связанных с изучением функциональных параметров нейтрофилов [Д. Л. Невмятуллин и соавт., 1987]. К началу настоящей работы нами было обнаружено, что взаимодействие между нейтрофилами и стафилококками (штамм 3, ер1с!егт1й[1з Г78М) может быть зарегистрировано по агрегации бактерий секреторными продуктами нейтрофилов.

Цель работы - изучение механизмов опсониннезави-симого взаимодействия между стафилококком и нейтрофилами.

Задачи исследования:

1. Изучить природу высокой нейтрофилотропности стафилококков и участие в этом феномене секреторных продуктов нейтрофи-ла.

2. Разработать модель для получения и изучения секреторных продуктов нейтрофила, агрегирующих стафилококки.

3. Изучить тропизм секреторный продуктов нейтрофила в отношении различных стафилококков и других бактерий.

4. Изучить природу и условия мобилизации фактора нейтрофи лов, агрегирующего Б.врШегшИИз 178М.

5. Проанализировать природу факторов стафилококка, определя ющих взаимодействие с нейтрофилаыи, опосредуемое их сек реторными продуктами.

Научная новизна. На модели стафилококков обн рукен феномен высокоизбирательного взаимодействия секретор ных продуктов нейтрофила с бактериями, который проявлялся агрегирующем и опс-оничвском эффекте по отношению к единс венному (3. ер!с1егт1с11Б 178М) из 69 изученных штаммов 13 ей дов стафилококка. На основании молекулярных параметров ак тивного фактора, его действия на стафилококки и отношения различным типам гранул нейтрофила сделан вывод о независи мости фактора от ранее известных антибактериальных продукто нейтрофила. Дана характеристика бактериальных структур, свя зывающих активное начало. Получены новые факты, характеризу ющие функциональные особенности оттсониннезависимого взаимо действия между нейтрофилами и бактериями.

Теоретическая и практическая значимость. Обоснована возможность высокоизбирател ного взаимодействия нейтрофилов с бактериями, опосредованнс го секреторными продуктами нейтрофила. Установлены штаммовь! особенности по отношению к бактериотропным факторам нейтрс фила. Получена информация, доказывающая возможность избирс тельной мобилизации различных типов гранул нейтрофила пс влиянием фагоцитоз-индуцирующих стимулов. Обоснована функцк ональная неоднородность рецепторов нейтрофила, воспринимаю

щих различные штаммы близкородственных бактерий. Разработан метод для изучения секреторных реакций нейтрофилов, сопровождающийся преимущественной мобилизацией секреторных гранул.

П о л о я о н и я, п и н о с и м н в на з а га и т у:

1. Продукты секреторных гранул нейтрофилов человека включают факторы, опосредующие высокоизбирательноэ взаимодействие со стафилококком.

2. Стафилококки различаются по чувствительности к бактериотропным факторам, мобилизуемым из секреторных гранул нейтрофила.

3. Способность стафилококков индуцировать секрецию бактерио-тропных факторов нейтрофила не коррелирует с их чувствительностью к этим факторам и связана с функциональными особенностями рецепторов, воспринимающих неопсонизированные бактерии.

Апробация работ». Основные положения диссертации доложены и обсуждены на XII Российской научной конференции "Оакторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях" (Челябинск, 1995г.); на II Нижегородской сессии молодых ученых Нижний Новгород, 1997).

П у б л и к а ц и и. По теме диссертации опубликовано 4 работы, 1 работа принята к печати. Список приведен в конце автореферата,

Объем л и с с о р т а ц н я. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 11 глав собственных исследований, заключения, выводов, указателя литературы, включающего 32 отечественных и 105 иностранных источников. Работа изло-

- б -

жена на 112 листан машинописного текста и содержит 23 рисун: и 3 таблицы.

Список сокращений:

Affi - агрегирующий фактор

ЙМА - форболмиристатацетат

ФАТ - фактор активация тромбоцитов

fMLP - формилметиониллейцилфенилаланин

ЛПС - липополисакарид

Содержание работы Материалы и метод к исследован и

Объем исследований. Исследованы нейт; филы 150 доноров, в реакциям с секреторными продуктами нейт; филов проанализированы 69 штаммов стафилококка 13 видов, : типовых штамма стрептококка, 2 музейных, 3 свежевыделенны штамма кишечной палочки и 2 музейных штамма Candida albican;

В работе использованы штаммы стафилококка, стрептокок ка, кишечной палочки, кандид, полученные из НИИЭМ им. Гамале АМН Рй (Москва), ГИСК им. Тарасовича (Москва), Нижегородс-ко го НИИ эпидемиологии и микробиологии, Института медицинско: и клинической микробиологии им.Зйкмана-Винклера (Утрехт, Ни дврлвнды), коллекции кафедры микробиологии Нижегородской го сударг-твенной медицинской академии.

Культуры стафилококка выращивали на плотной питательно среде в течение 18-20 часов при 37s С. Бактериальные взвес доводили по оптической плотности до 1x10s бактерий в 1 мл Гидрофобность стафилококков определяли по реакции соле вой агрегации в растворе сульфата аммония CLlndahl et all. 19813. Клеточные стенки и растворимые фракции бактерий полу чали путем дифференциального центрифугирования ультразвуке вых дезинтегратов бактериальных клеток.

Выделение нейтрофилов проводили на двойном градиент

плотности $иколл-верографин СПодосинников и соавт. 1981], с последующим лизисом эритроцитов колодным изотоническим раствором NH^Cl CKuijpers et al., 19893. Выделение моноцитов и эоэинофилов проводили соответственно методами tCamussi et al., 1995], и CKato et al., 1995].

Для изучения взаимодействия нейтрофилов и стафилококков нейтро^илы (5x10*/мл) смешивали в равный объемах с бактериями (1н103/мл), инкубировали ( 37е С, 30 мин), при постоянном встряхивании бхЮО"^ /мин. Результаты оценивали двумя методами: микроскопическим и туроидиметрическим. При микроскопии учитывали общее количество активных нвйтройилов (с-одеркащих 5 и болев бактерий) и отдельно Фракцию высокоактивных нвйт-рофилов (связавших более 30 бактерий). При турбидиметрии использовали модификацию метода [Kulipers et all., 1989]. Учитывали снижение оптической плотности (при 400нм) бактериальной взвеси после взаимодействия с нейтройилами или секреторными продуктами. Поглощенные от внеклеточных (связанных с поверхностью нвйтрофилов бактерий) дифференцировали в твете гашения флюоресценции бромидом зтидия бактерий, меченых изо-тиоционатом Флюоресцина CDrevsts et all,, 19913.

Основным методом получения секреторных продуктов нейтро-филов была стимуляция йорболмиристатацетатом (ФМА, 100нг/мл). В ряде экспериментов нейтробилы стимулировали оп-сонизированным и неопсонизированным зимозаном (1мг/мл), fMLP (10"еМ), ЗАТ (10*5М), ЛПС (100мкг/мл). Клеточные экстракты получали при разрушении нвйтройилов ультразвуком, многократным замораживанием-оттаиванием или обработкой тритоном Х-100.

Для определения заряда агрегирующего фактора (АО), су-пернатант ЗМА-стимулированных нейтрофилов инкубировали с ионообменниками - СМ-сефадексом С-25 (катионообменник) и DEAE-сефадексом А-25 (анионообменник)..Молекулярную массу AS изучали путем фильтрации супернатанта SMA-стимулированных

нейтрофилов через амиконовые фильтры с размером пор 10, 30 1 ЮОкДт.

Опсонический эффект секреторный продуктов нвйтрофило! изучали после обработки Б. ерЛйегтиНз 178М различными концентрациями ОМА-супернатанта (эксперименты проводили в буфе-

г- '

рв без Са }.

Лиминолзависимую хемилюминис-ценцию активированнык нейтрофилов измерили в кидкостностинцилляционном счетчике "Бета

Миелопероксидазную активность определяли методом люми-нолзависимой хемилюминисценции. Лизоцимную активность определяли нефелометрическим методом [В. Г. Дорофейчук, 19633.

Реакции нейтрофилов в условиям рецепторзависимой адгезии изучали на СЗЬ-сефадексе, 1дВ-се§арозе и цитодексв-; (гранулы свфадекса, покрытые коллагеном 1 типа).

При статистической обработке результатов использовал] следующие показатели: среднее квадратичвское отклонение, коэффициент корреляции, достоверность разности двух средни: величин (по критерии Стъюдента и по критерию Вилкоксона-Манна- Уитни) .

Результаты работы.

Основной феномен. Стимулом для исследований явилос: случайное наблюдение, сделанное при изучении прямого взаимодействия нейтрофилов и стафилококков. В реакциях с одним и; штаммов стафилококка (Б. ерШегтхсЯБ 178М) интенсивное связы вание бактерий нейтрофилами, регистрируемое морфологически сочеталось с визуально заметным просветлением бактериально: взвеси, которое было подтверждено спектрофотометрическ: (турбидиметрический тест). Это явилось причной более подроб' кого изучения данного йвномвна.

В предварительный опытах изучено 12 других штаммов ста филококка, включая 4 штамма 3. вркЗегпИсйа. Снижение опти ческой плотности бактериальной взвеси после взаимодействия

:ейтрофилами наблюдали только в опытак с S. epidermidis 78М. Ни один из других штаммов не вызывал такого эффекта.

Б реакции с S.epidermidis 178М общее количество активах нейтрофилов (содержащих 5 и более бактерий) приближалось : 1007.. Более 702 из них составляли высокоактивные клетки, ¡.уквально нафаршированные бактериями (рис. 1А). Более 802 »актерий находились внутри нейтрофилов т.е. подвергались фа-■оцитозу. Показатели с другими штаммами были гораздо ниже, >собенно для фракции высокоактивных нейтрофилов, число кото->ых не превышало 307., а у четырех штаммов приближалось к ну-по. К этому следует добавить, что в реакциях даже с наиболее активными штаммами (S.xylosus, S.epidermidis ССМ2124, i.cohnii, S.hominis CCM 3474) отсутствовали "нафарширован-ше" нейтрофилы, которые были характерны для S. epidermidis .78М (рис.1Б).

Рис. 1А Рис. 1Б

Б.epideгmidis 178М Б. ер!йегп^1з ССМ 2124

Высокая способность Б.epideгmidis 178М вступать во вза-шодействие с нейтрофилами не зависела от такого важного для ззаимоотношения с фагоцитами признака как гидрофобность: 6 втаммов обладали одинаковой с ним гидрофобностью.

Добавление К1аР - ингибитора гликолиза, полностью блоки-

2+

ровало реакцию. В среде без Са турбидиметричес.кий тест был отрицательным. Удаление внутриклеточного не влияло на

результаты реакции.

В реакция« Б. ер1с1егт1сЛз 178М с моноцитами общий процент активных клеток был 73,7 + 3,27., высокоактивная фракция составляла только 6,0 + 1,57.. Эозинофилы не вступали во взаимодействие с бактериями.

Механизм положительного турбидиметрического теста. Как было описано выше, при взаимодействии нейтрофилов с. Б. ер1с1егт1с11з 178М наблюдалось значительное снижение оптической плотности бактериальной взвеси. На первый взгляд это можно было объяснить удалением бактерий, связавшихся с нейтрофилами, тем более, что Б. ер1с!егт1сНз 178М поглощался нейтрофилами гораздо интенсивнее, чем другие стафилококки. Однако даже если предположить, что каждый нейтрофил связывал 100 бактерий, та уменьшение количества клеток во взвеси не должно было превышать 507.. В действительности, снижение оптической плотности составляло 70-907.. Кроме того, только один штамм Б. ер1с1егппсЦБ 178М , давал положительный результат турбидиметрического теста; другие штаммы были неактивны, хотя некоторые из них довольно эффективно поглощались нейтрофилами. Это означало, что снижение оптической плотности бактерий в реакции между нейтрофилами и Б. ер1с1егппсЦБ 178М было обусловлено не только удалением связанных бактерий. При микроскопии мы обратили внимание на агрегаты бактерий, которые наблюдались только в опытах с Б. ерКЗегписНз 178М. На этом основании было сделано предположение, что взаимодействие между нейтрофилами и Б. ергйегписЦБ 178М определялось двумя факторами: (1) связыванием (в основном поглощением) бактерий нейтрофилами и (2) агрегацией бактерий продуктами, высвобождавшимися из активированных нейтрофилов.

Для проверки второго предположения казалось логичным проанализировать агрегирующую активность супернатанта, после

взаимодействия нейтрофилов и 3.ер1бегш1с!1з 170М. Для этого нейтрофилы инкубировали с бактериями, центрифугировали при низких оборотах (для удаления агрегатов) и супернатант спектрофотометрировали. Оптическая плотность бактериальной взвеси уменьшилась лишь на 10,0 + 3,5Х, т.е. агрегирующий эффект практически отсутствовал. Это могло быть связано с двумя причинами: (1) нейтрофилы не продуцировали агрегирующих факторов (АФ), или (2) А® выделялся нейтрофилами, но связывался с бактериями и поэтому отсутствовал в супернатан-те. Для выяснения этих вопросов аналогичные эксперименты были проведены с 7 другими штаммами стафилококка. Как было показано выше, некоторые из них, несмотря на достаточно интенсивное поглощение нейтрофилами, давали негативные результаты турбидиметрического теста. В связи с этим можно было думать, что такие бактерии не подвергаются агрегации во время взаимодействия с нейтрофилами, так как нечувсвительны к АО. Действительно, супернатанты, полученные в этой серии опытов, вызывали существенное снижение оптической плотности индикаторного штамма (Б. ериЗегт1сНз 178М), т.е. содержали факторы с агрегирующей активностью.

Высвобождение АО из нейтрофилов индуцировали все стафилококки, но активность разных штаммов была неодинаковой - от 44,4 +5,37. (Б. ер1с1еп1й<315 8.4) до 63,4 + 2,87. (Б.ЬогаИНз СС1-5 3474) .(р < 0,05). Зто могло быть обусловлено несколькими причинами: (1) стафилококки, которые наиболее интенсивно поглощались нейтрофилами, вызывали и более значительное выделение АЗ, (2) выделение АО не было напрямую связано с интенсивностью поглощения, а зависело от особенностей взаимодействия стафилококков с нейтрофилами, и (3) АФ частично сорбировался стафилококками, причем чувствительность к АЗ неодинаково выражена у разных штаммов.

Для проверки двух первых предположений был определен козффицизнт корреляции между показателями турбидиметрии и

фагоцитоза. Он составил 0,-95 + 0,04, что соответствует прямой сильной корреляции. Единственным исключением бы/

з. ер1с1егт1с11Е ССМ 2124. Он обладал относительно высокой активностью по данным фагоцитарного теста (общий процент активный иейтрофилов 8В,0+5,5%, фракция высокоактивных нейт-рофилов - 30,0 +3,9%), но индуцировал сравнительно низкук продукцию АЭ по данным турбидиметрического теста с Б. ер1сЗегт1С(15 178М (44,4 + 5,32). Это достоверно ниже (р < 0,05) аналогичных показателей для других стафилококков с равноценной способностью к взаимодействию с нейтрофилами пс данным фагоцитарного теста (Б.ху1о5из ССМ 2738, Б. заргорЬуЬюиБ ССМ 2727, Б. ПопИШб ССМ 3474). Иными словами, для продукции АФ важны не только количественные, но т, качественные различия взаимодействующих компонентов (нейтрс филов и бактерий), Монно думать, что рецепторы, вступающие во взаимодействие с бактериями играют неодинаковую пусковук роль в активации клеток: не всякое связывание и не всякогс лиганда гарантирует развитие полноценного ответа [А.Н.Маянс-кий с соавт., 19883. Наиболее общим выводом этой серии экспс риментов является то, что для высвобождения АЭ не требуете интенсивного поглощения бактерий, так как А$-позитивные су-пернатанты удавалось получить в реакциях со штаммами, которые слабо взаимодействовали с нейтрофилами (Б. ер1с1егт1с11Б и. 8. 4,

и. 4.7, и. 4.30).

В связи с неодинаковой способностью к взаимодействии бактерий и нейтрофилов представят интерес результаты серш опытов, в которых для получения АФ-позитивных супернатанто! были использованы разные концентрации двух штаммов стафилококка - Б.хуЗозиз ССМ £738 (высокая способность к взаимодействию с нейтрофилами) и 8. еркзегпИсИз и. 8.4 (низкая способность к взаимодействию с нейтрофилами). В этих экспериментах выявилось две закономерности, общих для двух штаммов (рис.2). Во-первых, степень агрегирующей активности су-

пернатанха в определенном диапазоне зависела ох концентрации

бактриальнын взвесей. Для 3.ку1озиз ССМ 2738 это наблюдалось

в диапазоне 1x10 - 0,5x103 бактерий в 1 мл, для Б. еи1с!егп)1сИз 3 9

II. 8.4 - 0,5x10 - 1x10 бактерий в 1мл. Вторым общим признаком было то, что, начиная с определенной дозировки, увеличение концентрации не меняло активности супернатанта. В опытах с Б.ху1оБиз ССМ 2738 одинаковую активность имели супеонатанты,

За о

получанные с концентрациями 0,5x10 , 1x10 и 2x10 бактерий в 1мл; для 3. ерШегписИз и. 8. 4 одинаковые результаты наб-

9 9

людались при содержании 1x10 и 2x10 бактерий в 1мл. Если в последнем случае это было логично, так как увеличение бактериальной дозировки с 1х103 до 2x109 не сопровождалось усилением поглощения бактерий, то в опытах с Б.ху1о5из ССМ 2738 отмечена интересная особенность: почти двухкратное усиление показателей фагоцитоза в интервале 0,5x10* - 1х105 бактерий в 1мл практически не влияло на агрегирующую активность супернатанта, регистрируемую по турбидиметрическому тесту. При анализе этой серии опытов обнаружен еще один факт, который может быть истолкован с точки зрения функциональной неоднозначности фагоцитарных рецепторов, в данном случае для двух штаммов стафилококка - Б.ху1оБиз ССМ 2738 и Б.ер1бегш1-сИз и.8.4. Равноценные морфологические показатели реакции наблюдались при концентрации 1x10 /мл (Б.ху1озиз ССМ 2738 и 1х10^/мл (Б. ер1с1егт1ЕИз и. 8. 4) . Можно было ожидать, что и продукция АФ в этих условиях будет идентичной. Но это было не так: агрегирующая активность супернатанта от Б. ер1с!егт1сИз и. 8.4 оказалась значительно выше (р < 0,05). В целом это говорит о возможном значении качественных параметров нейтрофильных рецепторов, задействованных в реакции.

1005

80 |г

5. ху1ог-~

го о

.ПИ? - ! I

"Т— и

Рис.2. Агрегирующая активность супернатантов, получении; поело стимуляции нейтро^илов различными концентрациям! Э. ху1ониз С СМ 27 38 и Б. ерЫегпи сЦя и. О. 4. А - данные микроскопического теста; по оси ординат - общий % активных и высокоактивных (темные столбики) нейтрофилов. Б - данные турби-диметрического теста; по оси ординат 7. снижения оптическо! плотности бактериальной взвеси 3. ер1с1егт1<31Е 178М. Рамко! выделены опыты, где равным показателям интенсивности вэаим< действия нейтробилов с 3.ху1озо:з ССМ 2733 и Б. ер1с!егт1сН: и.8.4, соответствуют достоверно различные (р < 0,05) показатели выделения АФ (см. комментарии в тексте).

Для проверки третьего предположения (о возможности частичной сорбции А£) бактериями) была проведена серия экспериментов с истощением Ай-позитивных супернатантов различным! штаммами стафилококка. Они не только сами не агрегировались йМА-супернатантом, но и не сникали его способности агрегировать 3, ер1йегш1й11з 178М. Истощающей активностью облада, единственный штамм - Б, ер1с1эгт1сИв 178М.

Агрегация 3.ор!йогт1й1з 178М супернатантом стимулированных нейтробилов. Продукция фактора, агрегирующеп Б. ер1с!егт1сЦз 178М, была подтверкдена экспериментами с нейт-

рофилами, стимулированными ФМА, мощным Ca - независимым индуктором дегрануляции фагоцитов. Нераэведенный ФМА-супер-натант вызывал агрегацию S. epidermidis 178М, оптическая плотность бактериальной взвеси снижалась на 75,0 + 7,27.. Агрегация S.epidermidis 178М была дозо-зависимой: агрегирующий эффект исчезал при разведении ФМА-супернатанта в 4 раза.

Кроме ЙМА высвобждение АФ наблюдали в опытах с рядом других стимулов: опсонизированный зимозан (1мг/мл), ЛПС (1Омкг/мл), fMLP (i О"6 М),

Активность агрегирующего фактора по отношению к различным штаммам стафилококка. Агрегирующий эффект супернатанта, полученного после стимуляции нейтрофилов ФМА, позволил нам провести анализ чувствительности различных штаммов стафилококка к секреторным продуктам нейтрофилов. Изучено 69 штаммов стафилококка, включая типовые штаммы S.epidermidis ССМ 2124, S.aureus ССМ 885, S.saprophyticus ССМ 883, 2727, S.xylosus ССМ 2738, S.hyicus ССМ 2368, S.cohnii ССМ 2736, S.haemolyticus ССМ2729, S.hominis ССМ 3474, S.warneri ССМ 2730, S.intermedius CCM 5729, S.simulans CCM 2705, S.sciuri CCM 3473, S.lentus CCM 3472, 37 неидентифицированных коагу-лазонегативных стафилококка, 15 штаммов S.epidermidis и два свежевыделенных штамма S.aureus, три музейных штамма Е.coli, и два типовых штамма бактерий рода Streptococcus: St.sal ivarius 80225 и St.sanguis 26/69, два штамма кандид: С.albicans 41, 78. Реакция с S. epidermidis 178М служила позитивным контролем. За исключением S.epidermidis 178М не обнаружено ни одного штамма, чувствительного к АФ.

Свойства агрегирующего фактора. АФ имел положительный заряд так как сорбировался катионообменником (СМ-сефадексом С - 25) и не сорбировался на анионообменнике (DEAE - сефадексе А - 25). Молекулярная масса превышала 100 кД. Супернатант, содержащий АФ полностью терял агрегирующую активность после прогревания при 100"С в

течение 5 мин, но оставался активен после пятикратного замораживания - оттаивания и обработки ултразвуком.

Мобилизация агрегирующего фактора из нейтрофилов. Для получения клеточный экстрактов нейтрофилы разрушали ультразвуком, многократным замораживанием-оттаиванием или лизировали тритоном Х-100. Супернатанты исследовали на способность агре-гироватьБ. ер:с!егппсЛз 178М.

При обработке нейтрофилов ультразвуком и многократным

замораживанием-оттаиванием агрегации не наблюдалось. Чтобы

исключить возможность того, что это но было связано с недос-

с

таточным содержанием нейтрофилов 5к10 /мл, концентрацию клеток повышали в 5 раз по сравнению с дозировкой, применявшейся в опытах со стимуляцией нейтрофилов ФМА, то есть 25x10 /мл. Но и в этом случае агрегирующей активности супер-натантов после разрушения нейтрофилов не выявлялось.

"Пассивного" высвобождения АФ удалось добиться при использовании неионного детергента тритона Х-100. Агрегирующая активность выявлялась в супернатанте, полученном при обработке стандартной взвеси нейтрофилов (5х106/мл) и соответствовала активности супернатанта ФМА-стимулированных нейтрофилов. Это говорит о том, что АФ преформирован в нейтрофи-лах, а его отсутствие в экстрактах клеток, полученных при обработке ультразвуком и многократном замораживании-оттаивании, можно объяснить прочной фиксацией АФ на внутриклеточных мембранах.

С учетом относительной специфики дегранулирующего эффекта различных активирующих воздействий на нейтрофилы (К1Л,;регз Т. IV. , еЬ а1. 1989) были использованы следующие стимуляторы: ФМА - секреторная реакция специфических и секреторных гранул, но слабая реакция азурофильных гранул; £МЬР преимущественная мобилизация секреторных гранул; СМЬР в комбинации с ФАТ - усиление дегрануляции специфических гранул и ГМ1.Р в комбинации с цитохалазином В - усиление дегра-

нуляции веек типов гранул. Агрегирующая активность выявлена во всех сериях опытов, Наибольшей активностью обладал ФМА-супернатант, Стимуляция fMLP вызывала сопоставимую, но менее интенсивную реакцию (р < 0,05). Добавление к fMLP SAT или цитохалазина В повышало выделение AS. Повышение было достоверным для цитохалазина В (р < 0,05) и незначительным (р > 0,05) для ЗАТ. Эти данные позволяют говорить о том, что основная часть А§ сконцентрирована в секреторных гранулах (везикулах); специфические и азурофильные гранулы содержат небольшое количество A3.

Дополнительные подтверждения локализации A3 в секреторных гранулах были получены в опытах, где выделение A3 из стимулированных нейтрофилов сравнивали с мобилизацией маркерных ферментов оэурофильннх (миелопероксидаза) азурофиль-ных/специфических (лизоцим) гранул, В одной из серий опытов нейтройилы подвергали стимуляции ЭМА и бактериальным ЛПС (Е.coll 0127). Оба стимула индуцировали выделение сопоставимого количества А§ и миелопероксидазы. В то же время, лизо-цимная активность выявлялась только в ЭМА-супернатанте. Это говорит о возможности мобилизации AS без участия азурофиль-ных и специфических гранул.

Такой же вывод следует еще из одной серии опытов, в которых параллелное определение агрегирующей активности и маркерных ферментов азурофильных/специфичэских гранул проводили после взаимодействия нейтрофилов с одним из АФ-нечувстви-тельных штаммов стафилоккока, S. Bplciermidi3 U.8.4. В этом случае агрегирующая активность супернатанта определялась на фоне практически нулевых показателей лизоцима и миелопероксидазы.

Соотношение меяйУ зня^ленивм огрвгирувдвго бактора и активацией роспираторного взрыва неИтро|яяов. Одним из наиболее универсальных и чувствительных индикаторов активации нейтрофилов является респираторный взрыв, регистрируемый по

люминолзависимой хемилюминисценции.В связи с зтим было инте рес-но сравнить возбуждение нейтрофилов по данному признаку показателями выделения АО в реакциях с различными стимулами Самым сильным активирующим воздействием на кислородный мета болизм обладал ОМА, он же индуцировал наиболее интенсивну секрецию АО. Опсонизированный зимозан вызывал высвобокдени АО, сравнимое с показателями стимуляции ОМА, но менее актив но стимулировал респираторный взрыЕ. Стимуляция неопс-онизи рованным зяыозаном характеризовалась низкими показателям активации кислородного метаболизма и выделения А§. При сти муляции • ЛПС показатели люминолзависимой хемилюминисценци были нулевыми, тогда как выделение А§ достигало 73,0 +_ 6 ®МА.

Это означает, что респиратонрный взрыв и выделение А можно воспроизвести независимо друг от друга, подтперкда положение о том, что активация клеток носит сложный харак тер, возбуждаясь через дискретные системы рецепторов, внут риклеточных медиаторов.

Такой не вывод можно сделать из другой серии наших опы тов, в которых исследовали реакции нейтрофилов, адгезирован них на различных сорбентах: СЗЬ-сефадекс-е (взаимодейс-тви через CR-рецептороы), IgG сефарозе (взаимодействие через F -рецепторы) и цитодексе-3 (рецепторы для коллагена 1 типа представители семейства интегринов). После контакта клеток СЗЬ-сеФадексом и ¡в'З-сефарозой люминолзависимая хемилюминис ценция резко возрастала уже через 5 мин, на цитодексе-3 ре акция отсутствовала, Супернатанты, полученные после 30-ми нутной инкубации нейтрофилов со всеми сорбентами, не вызыва ли агрегации S. epidermidis 178М т.е. в них отсутствовал А§ В токе время, как было показано в аналогичных экспериментах проведенных ранее в лаборатории кафедры микробиологии НГМ (Конышкина Т.М., 1988) на СЗЬ-сефадексе, IgG-сефарозе, адге зия нейтрофилов сопровождалась выделением лизоцима и миело

пероксидазы, ферментов специфических и азурофильных гранул. Это подтверждает сделанный выше вывод о преимущественной локализации АО в секреторных гранулах, в которых отсутствует миелопероксидаза и лизоцим.

Опсоничаскпй эЦокт секреторных продуктов нойтройилоп в системе с S,opidornidiB I78M. Исключение агрегирующего эффекта (например, при снижении концентрации нейтрофилов, в среде без Ca ) резко сникало интенсивность фагоцитоза S. epidermidis 178Н. В то не время показатели реакции с A'3-нечувствительннми штамми (S.xylosus ССМ 2738, s. hominis ССМ 3474) были примерно одинаковы в агрегирующих и неагреги-рующих условиях. Добавление в "неагрегирующую" систему ФМА резко усиливало поглощение, приближая показатели реакции к результатам, полученным в присутствии Са2+. Напротив, фагоцитоз A3-негативных штаммов стафилококка при добавлении в систему ФМА повышался умеренно (в 2-2,5 раза). Это позволяло думать о том, что связывание АФ S.epidermidis 178М сопровождалось опсоническим эффектом в реакциях с нейтрофилами.

Косвенные наблюдения об опсоническом эффекте АФ были подтверждены опытами, в которых S.epidermidis 178М обрабатывали различными концентрация!«! с-упернатанта ФМА- стимулированных нейтрофилов. Посла обработки бактерии тщательно отмывали и затем инкубировали со свеяевыделеными нейтрофилами; каждый этап проводили в среде, лишенной Са2+. Обработка S.epidermidis 178М препаратами, содержащими АФ, вызывали до-зозависимую опсонизацию бактерий, т.е. сопровождались многократным усилением реакции в опытах с цельным и двухкратно разведенным ЭМА-супернатантом.

Опсонизацин не проявлялась в реакции с S.epidermidis 178М, обработанным проназой. Это сочеталось с исчезновением агрегирующего эффекта, так как после обработки проназой бактерии не связывали A3 (см. нияе).

На основании этих экспериментов можно сформулировать

схему двухэтапного взаимодействия бактерий с нейтрофилам!

i'-i

На первом этапе реакция зависит от внеклеточного Са и той или иной степени проявляется для большинства стафилоко! ков. Одним из функциональных последствий этого является cet реция аутоопсонинов (в нашем случае АО), которые адсорбир^ ются бактериями, меняя их взаимоотношение с нейтрофилам! Это определяет вторую (опсонинопосредованую) волну реакцш Она не зависит от внеклеточного Са2+ и по интенсивности npt восходит результат первого этапа.

Свойства S.Gpidernidis 178М, определяющие взаимодош твие с агрегирующим фактором. Для характеристики фактот S.epldermldls 178М, ответственного за взаимодействие с Ас бактерии подвергали обработке в разных режимах и затем изз чали их способность вызывать ослабление агрегиующей актш ности супернатанта SMA-стимулированных нейтройилов. Прогрс вание при 80°С незначительно сникало способность бактер! сорбировать АО, обработка при 100е С существенно ослабляв AS-сорбирующую активность, но не вызывала ее полного пода! ления даже после 80- минутного прогревания бактерий на киш щей водяной бане. Трипсин сникал AS-сорбирующую активное: на 207., проназа полностью лишала бактерии способности связь вать AS. Нейраминидаза не оказывала эффекта, но общее paapj шение углеводов перйодатом сопровождалось значительным t (30£) снижением сорбции АФ. Эти данныв позволяют думать гликопротеиновой природе AS-связывающего фактора S,epiderm] dis 178М, который отличается значительной термоствбил! ностью.

Для выяснения вопроса о том, какие структурные компс ненты S. epldermldis 178М ответственны за агрегацию, былг проведены эксперименты по истощению AS клеточными стенками растворимой фракцией бактерий, полученной после осакдет клеточных стенок. Истощающая активность клеточных стенок сс ответствовала цельным бактериям (р > 0,05). Обработка АФ-пс

зитивных супернатантов растворимой фракцией бактерий не влияла на их агрегирующую активность.

Выводы

1. В секреторных продуктах нейтрофилов человека обнаружен фактор (АО), который избирательно связывался с одним из штаммов зпидермального стафилококка (S.epidermidis 178М). Ни один из 69 других штаммов 13 видов стафилококка (включая 15 штаммов S.epidermidis) не взаимодействовал с АО. Зозинофилы и моноциты не продуцировали АО.

2. АО нейтрофилов не вступал во взаимодействие со стрептококком (St. salivarlU3, St. sanguis), E.coli, C.albicans, зимозаном и липополисахаридом наружной мембраны (эндотоксином) грамотрицательных бактерий (E.coli 0127),

3. Способность индуцировать выделение АО в процессе Са -зависимого фагоцитоза являлась универсальным свойством стафилококков независимо от их чувствительности к этому фактору.

4. Связывание AS штаммом S.epidermidis 178М сопровождалось агрегацией бактерий и повышением их чувствительности к фагоцитозу.

5. На основании опытов с субклеточными компонентами бактериальных клеток, а также бактериями, обработанными в различных режимах (протеолитичвские ферменты, прогревание, перйодат), установлено, что бактериальный фактор, ответственный за связывание А®, является относительно стабильным гликопротеи-ном клеточной стенки.

6. AS нейтрофилов имел молекулярную массу более 100 кД, положительный заряд, и высвобождался при разрушении клеток тритоном К-100. Секреция А3 не зависела от активации кислородного метаболизма, нейтрофилов, а также выделения лизоцина и миелопероксидазы.

7. На основании опытов с избирательной мобилизацией различ-

ных типов гранул и ик маркерный ферментов сделано заключен« о преимущественной локализации АЁ в секреторный гранул; нейтрофила.

8. Совокупность полученных данным (штаммовая специфичность высокая молекулярная масса, преимущественная локализация секреторный гранулах) позволяет говорить о ранее неизвестнс типе антибактериальных продуктов нейтрофила.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Маянский А.Н., Коликова Т.В., Невмятуллин А.Л., Сибиря-кова Н.И., Салина C.B. Аутоопсонический эффект активироваь ных нейтрофилов // Оакторы клеточного и гуморального иммуш тета при различных физиологических и патологических coctos ниях: Сб. научн.тр. (Тез.докл. к XII Российской научно; конф.) / - Челябинск. - 1996. - С. 80-81.

2. Коликова Т. В. Агрегация стафилококков секреторными прс дуктами активированных нейтрофилов // Нижегородский не; журн. - 1996.- N 4. - С. 42-44.

3. Маянский А.Н. , Коликова Т.В., Маянский H.A., Невмятулл; А.Л., Сиоирякова Н.И., Р.ван Цвитен, Росс Д. йеномен высокс избирательного взаимодействия между нейтрофилами человека стафилококком // Иммунология. - 1997, - N 3. - С.£5-20,

4. Присада Т.В., Маянский А.Н., Невмятуллин А. Л., Сибиряков

H.И., Зеленова Е.Г. Высокоселективное взаимодействие меж; нейтрофилами человека и стафилококком // Факторы клеточнoí и гуморального иммунитета при различных физиологических патологических состояниях: Сб.научн.тр.(Тез.докл. к XII Российской конф.)/ - Челябинск, 1997.- С.128

Список работ, принятых к печати:

i. Маянский А.Н., Присада Т. В. , Невмятуллин А. Л., Р.ван 1|bi тен, Росс Д. Опс-ониннезависимое взаимодействие между нейтрс филами человека и стафилококком, основанное на высокоизоирг тельном бактериотропноы аффекте секреторных продуктов Hefn ро$35лс® // ЗШЗК.