Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологическая активность пептидогликана бифидобактерий

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биологическая активность пептидогликана бифидобактерий"



ч г

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА ПРИ ПРЕЗИДЕНТЕ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

МОСКОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ им. Г. Н. ГАБРИЧЕВСКОГО

БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ПЕПТИДОГЛИКАНА БИФИДОБАКТЕРИЙ

03.00.07 — Микробиология -/ 14.00.36 — Аллергология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

СИБИРЯКОВА Наталия Ивановна

Москва 1992

Работа выполнена на кафедре микробиологии Нижегородского государственного медицинского института и на базе Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор А. Н. Маянский, доктор биологических наук Г. И. Гончарова.

Официальные оппоненты:

' доктор биологических наук Е. А. Шмелева,

доктор медицинских наук, профессор В. Б. Гервазиева.

Ведущее учреждение — научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи.

Защита состоится « ¿¿¿¿¿^ _ 1992 г.

в _часов на заседании специализированного совета К 084.18.01

Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского по адресу: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского.

Автореферат разослан «___»__,_,_ 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат мед. наук

3. Н. Ермоленко.

л, л

-'мций

/ЗГГУАЛЪНОЗТЬ ТЕМЫ. Реактивность макроорпчигаиа к нормальной микр'

0(Цап гглрпнтористкка ра"отк.

флоре - пак№й компонент типологического гомеостпаа, 'Т-ормирутп"-гося под влиянием облигатних антигенов, то есть таких ряздрпгито-лвй, которис постоянно присутствуют я организме человека. В последние годы возрос интерес к изучению антигенного профиля иоптч-догликанов. Гто связано с тек, что пептидогликан является оспов-ньял компонентом клеточной стенки грамполотитолмик бактерии и обладает рирокки споктром биологичоскоЯ активности, глапиш образом в с^ере гуморального и клеточного иммунитета. на различиях модели" показано, что пептидогликаны способны оказывать эдъюваптннй, мито-геиний аффекты, активировать комплемент, индуцировать выработку специфических антител (Л.В.Бояринова и соавт.,1983; г.ост п!., 1075; оЬ п1., 1С80; '..'ег^еЗ.пто! оЪ п1., 19С6). Располагал

обеими детерминантами, пептндогликапы обладают наряду с стим и специфическими опитонами, которые способны проявить себя в определенных условиях п позволяют ди'.феритщировать их в масштабе родоят и даже вздовнх таксонов (Д.Г.Астарьев и соавт, . 0бг;и;'1 принцип структурной организации создает представление об антигенной общности всех пептидоглнканов. Особы;"! интерес представляют пептидогли-ланы наиболее типичных представителей нормальной микрофлоры толстого кишечника - бифидобактерий. Работ, посвяценных иммунологическим взаимоотношениям бнУлдобактерий с макрооргопизмом, практически нет (нам известна единотениая публикация на оту тему - З.Ч.Вершинина, 1961), хотя возможно именно их антигены могут бить использованы для функционального зондирования иммунологического гомеосга-за.' Кроме того, исследование данной проблемы дополняет сведения об иммунобиологических свойствах г:елтидоглмсанов, расширяя представления об их биологическом потенциале.

ЦКЛЬ РАБОТЫ - определить паряметрн кгаунологичесшос Б"о,га.;оот;юя:ений человеку V. пепгоглякшвщк бпрндобатстери" ,и установить их иначе-

кии для характеристики базального уровня иммунологической реактивности к нормальной микрофлоре. ЗАДАЧИ Р А Е О Т Ы :

I. Изучить особенности нейтрофилстимулируицих свойств пептвдогли-канов в прямых п опсонинзависнмых реакциях.

Научить реактивность лимфоцитов к пептидогликану бнфидобакте-рий в спектро иммунологической реактивности человека к бактериальным пеитидоглпканац.

3. Определить количество антител к пептидогликану бифидобактерий в спектре антител человека к пентвдогликанам различных бактерий,

4. Определить функциональную активность и диапазон иммунологической специфичности антител человека к пептидогликану бифидобакте-рнй на разных уровнях таксономии.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые с помощью высокочувствительного метода шмунохимического анализа (реакция энзим-меченых антител с солкбилиэироьанншн пептидогликанаыи) изучены количественные и качественные показатели антител человека к пептидогликану бифвдобактерий, определена их функциональная (опсоническая) активность. Определен диапазон антигенных взаимоотношений пептцци-гликаноь различных бифидобактерий мезкду собой и с пептидогликанаыи бактерий других таксонов. Б системах с пептидогликанами fi. Mi id ив И и s.aureur. ojm гм5 проведен сравнительный анализ специфичности "нормальных" антител разных видов животных (кролик, человек), а такке "нормальн!.к" и "гпперим:!у1шых" антител кролика. Н реакции лкшшюлзавкешой хомнлвминесценции обнаружена более високая реактивность нелтрофнлов человека к пептидоглинанам бифидобактерий по сравнение с аналогичным препаратами из других бактерий. По результатам изучение опсонофагоцптарных реакций с пептидоглшеанаш B.bi-ridun и з,aureus вскрити особенности взаимодействия различных пеп-гидсглш.чшои с комплементом, й реакцш( люмшголзаьисимой хешшлш-нисцонцни ••cTtiiioiUiuiia 'способность пептпдоглш-аиа бифлд^актерий

к слабой неспенифической стимуляции лимфоцитов че/-дека.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ 31! А-Ч И М О С Т Ь. !!а основе отечественных реактивов и оборудования разработаны высокочувствительные тост-систеш, позволяющие регистрировать антитела к солябилкзиропаннш пептидегллканам. Полу-чэн бактерийный препарат с известным диапазоном антигенной специфичности, которш"; может быть использован и иммунологических исследованиях. Определены количественные и качественные показатели специфической реактивности здоровьк людей г: пептндоглтгану бифпдобактсрий. Получено авторское свидетельство У Т6В6372 СССР ККИ С,0.1 ц33/543 (публ. 23.10.91. б::л. 3?) "Способ определение активности ро!;опторов нейтро'филоз человека"; Предложен препарат для функционального зондирования системы фагоцитоза по реакциям кислородзаписимсго метаболизме, изйтро^клов. Результаты работ;,I ?ошли в методические рекомендации "Предупреждение осло.-гч-пий у новорозденпнх доте;; с гнойно-септическими и острыми песглпаторин-1.ж заболеваниями" (утвереглош КЗ РСТСР, ТГСС г.).

пело;:: ;; н и я, з ;.; н с и и з н а з а т у.-

1. Прямой (опсонпннезавпсимпй) контакт пептидогликапа Си-(фидобактерий с кейтрофилалк: человека со^ювогдаетсл их г-::г.:са-цией, которая впраг.ена сильнее, чем у ряда других бактерий и моу.ет быть обнаружена по усилению лкминолзавпсимоЛ хсмилюминес-ценции. Реакции опсонинзавиепмой стм.уляции нелтрофилов пептпдо-гликанаки бифидобактерпй не зависят от комплемента и определяются антитела;«!.

2. Пептидоглнкан бифгдобактерий вызывает неспецжфпческуи ( антигеннезазисинуи )стимуляцию лимфоцитов человека.

3. Нормальные антитела человека к пентпдогликанам бифидо-(itinTupiii: отралсают их антигенную общность с аналогичными кошо-нйнта\:и других бактерий, презде всего золотистого стафилококка.

4, Антигенные особенности пептидогликана бифидобактерий

не проявляйте« в условиях естественного контакта с иммушой системой, но могут бить обнаружены в условиях гипериммунизации.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ . .Основные положения диссертации доложены и обсувдены на девятой конференции молодо ученых и специалистов Нолго-Вятского региона (Горький, IS8Sr.) , на Рес-нуо'лшсанской конференции "¿акторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях" (Челябинск, 1990г.), lia III (Рига, 199Пг.) и 1У (Москва, 1992г.) совещании по проблемам хемилюминесценции, на У1 Всероссийском съезде микробиологов, эпидемиологов и паразитологов (Нижний Новгород, 1991г.) , на заседании проблемной комиссии "эпидемиология, микробиология и инфекционные болезни" Нижегородского медицинского института (1992г.) .

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 6 научных работ в центральной периодической печати и научных сборниках. Список приведен в конце автореферата.

ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ . Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, указателя литерартуры, включающего 33 отечественных и 66 иностранных источников. Работа изложена на 116 листах машинописного текста и содержит 30 рисунков и 4 таблицы,

Содержал;, з работы МАТЕРИАЛЫ К МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Проведено более 1000 реакций люминолопосредованпой хемилюминес-ценции нейтрофилоп и лимфоцитов, исследованы нейтрофилы и лимфоциты 149 доноров. Выполнено более 2000 иммуиохимических анализов, получено 10 серий препаратов пептидогликанов, проанализировано 9 серий коммерческого иммуноглобулина человека.

В работе использованы штаммы бактерий, полученные из коллекций МНЖМ им. Г.Н.Габричевского, КИИЭМ им. Н.'5.Гамалеи, Горьков-ского НЖ?!,: 1'3 PCÍCP, Казанского ККИГМ МЗ FC5CP.

Пепгидоглшсаны получали по методу Peteraоп et al., (1978,' из бактерий, разрушенных на механическом дезинтеграторе путем последовательной обработки клеточных стенок 0,2$ раствором доде-цилсульфата натрия, /ДС-азой, ИЕС-азой, трипсином, 4055-м фенолом и горячей (60°С) 20?5-й трихлоруксусной кислотой. 3 экспериментах по изучению реактивности нойтрофилов и лимфоцитов пептидо-•■ликанн использовали в корпускулярной форме (в конечной концентрации 10 .».«г/мл). Для опсониэацик пепгидогликэлов использовали цельную сыворотку человека (пул 50 здоровых доноров) и сыворотку, обработанную в различных режимах: I) инкубация сыворотки с пеп-тидогликаном 100 мкг/мл в течение 30 мин при 0-4°С (избирательное удаление антител боз инактивации комплемента); 2) обработка сн~ роротки 10 мМ ГДТА или прогревание при 56°С в течение 30 мин (общая блокада комплемента ). В ряде опытов использовали коммерчески,'! ими'тюглобулип человека (Горьковский Н1ЖГМ ПЗ PC'TCP) п концентрации 10 мг/мл. При опсонизации осадок пептидогликшга ( ЮОмкг ) инкубировали с исследуемой сывороткой или иммуноглобулином в течение 20 мин при 37°С, тритдн отмывали и ресуспецциро-вали в растр,оре J'cimca. В опытах с гестимуляцией нейтро^илов при-

миннли латекс С ПНИ синтетического каучука им. В.А.Лебедева, г. Ленинград) с диаметром частиц 1,92 мк в концентрации 0,3x10^ частиц/мл.

Нейтрофшлы наделяли из венозной крови здоровых доноров на двойном градиенте плотности фиколл-верографин, концентрацию клеток доводили до 0,5хЮ6/мл. Хемилюминесценцшо нейтрофилов измеряли в иып/ыин па кидкостно-стинцилляцконном счетчике "Бета-1". В силиконировашшх флаконах смешивали I мл взвеси нейтрофилов, 0,05 мл раствора лшинола (10""%1) и 0,1 мл соответствующего стимулятора.

Лимфоциты въщеляли из фракции мононуклеаров крови доноров, полученной на градиенте плотности фиколл-верографин. Моноциты удаляли путем прилипания к пластиковой поверхности (СО мин при

37°С), неприлипшие клетки ресуспеццировали в растворе Хенкса и

£

доводили концентрацию до 1,0x10 /мл. Степень очистки лимфоцитов от моноцитов по встеразной метке составляла более 99.9?£. Для изучения хемилюминесценции лимфоцитов в силиконированнне флаконы вносили 0,8 мл взвеси лимфоцитов, 0,1 мл раствора лвминола( 10"%) и 0,1 мл пептидогликана. Дополнительным стимулятором служил фито-гемагглютинин "Р"(С1биа , 30 мкг/мл).

В опытах по изучению противопептидогликановых антител пептид огликанн использовали в солвбидизированной форме. Для гтого корпускулярный пептидогликан обрабатывали ультразвуком (22 кГц, 20 мА, 30 мин) , центрифугировали, осадок отбрасывали, а супер-натант стандартизовали по оптической плотности (Е^зо ^ Показатели доводили до 1,0 (длина оптического пути 10 мм) внесением забуференного физиологического раствора. Источниками антител служили коммерческий препарат иммуноглобулина человека, пул нормальных сывороток кроликов, гипериммушше сыворотки кролика, полученные- в условиях иммунизации животных гоптидогликанами В.ЪЛхйии N1

и ¡з.аигеця con «85 . Антитела определяли в реш;п< '•> гнэим-мечо-ннх антител. Меченые антитела (нонъюгат с перокси, ,чзой хрена) получали из иммунной сыворотки кроликов против иммуноглобулинов человека в условиях перйодатного окисления на базе Горьковсого ШИСМ t.!3 FCíCP. В ряде опытов кс польз опали коммерческие ко1гьюга-ты им. H.W.Гамалеи А!!Н СССР).

Реакцию энзим-меченых антител ставили на полистереногых штоках. Реакция включала обработку штоков пептидогликапом, бнчыш сывороточным альбумином, антителосодержащим субстратом и мочеными антителами; после каждого этапа проводили отмывку штоков 0,05^ твшюм-20. По окончании процедуры штоки помещали во флаконы с субстратной смесью (С,0Б4-Я лкминол и С,05"-'-я перекись водорода в соотнесении 3:1) и измеряли интенсивность хемилвминесценции на счетчике "Еета-1".

При статистической обработке результатов использовали рекомендации 1С.К.Иванова и С.Н.Погорел:с:;а (TCS0). Различия считали достоверней при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ. Взаимодействие пелтидогликанов с нентрофилаук изучали методом лкминолзависпмой хемилга.шнесцен-ции. С целью создания оптимальных условий для реакции была поставлена серия специальных опытов с пептидогликапом B.biíidun Н1, который был использован в качестве рвференс-препарата во гсех паиих исследованиях, Для этого в смесь нейтрофилов с лгминолом добавляли пептндогликап в коночной концентрации I ккг/мл, Змхг/мл, 10 мкг/мл, 30 мкг/мл и измеряли хемилпминесцентную активность проб. Учитывали максимальны.'* уровень хешшшшесценции, показатели фоновой хсмилкмжесценцпи (пробы без стимулятора) вычитали. Изменение дозировок пептидогликана от I до 10 мкг/мл сопровождалось возрастанием интенсивности хзмилвукнесценцки, дальнейшее по-

витание концентрации снижало уровень реакции. Во всех последующих опытах использовали пептидогликан в концентрации 10 мкг/мл.

Способность пептидогликана B.bifidum N1 взаимодействовать с нейтрофилами явилась основанием для сравнительного изучения нейтрофилстимулирующих свойств аналогичных препаратов из других бактерий. По нашим данным пептидогликаны из разных штаммов B.bi-Е1<1итблизки по нейтрофилстиыулирующим свойствам: показатели хе-милюминесценции колебались от 107,9*8,3x10^ имп/мин до 126,8* -16,0хЮ^имп/мин. При сопоставлении B.bifidum с тремя другими видами бифидобактерий.отмечались более значительные колебания активности: максимальные результаты получены для В.breve 79-38 (136,6-21,1x10^ имп/мин), мшшмаль!ше - для B.adolescentis ГО-13 (гб.З^.ЭхЮ4 имп/мин). B.bifidura М и B.lactentis 79-20 заншали промежуточное положение - соответственно ЮТ,9£ ±8,ЗхЮ4 имп/мин и 63,7-8,6x10^ имп/мин. Достоверные различия (р <0,05) относительно B.bifidum отмечены для B.lactentis й B.adolesceiitis.

Ранее в нашей лаборатории били получены данные, характеризующие нейтрофилстимулирующие свойства пептидогликанов различных видов стафилококка, в ряду которых s.aureus ССМ 885 занимал одно из ведущих мест ОС.В.Лебедева и соавт., 1989). В наших опытах стимулирующий эффект бифидобактерий (за исключением B.adolescentis) оказался выше соответствующих показателей для стафилококков в том числе и для одного из самых активных -s.aureus . нашло отражение и при сравнении средних величин активности пептидогликанов: для совокупности всех ьидов бифидобактерий и стафилококков нейтрофилстимулйрующий эффект пептидогликанов бифвдобакте-рий оказался почти в 4 раза выше.

Для выяснения особенностей взаимодействия пептидогликанов

би^идобактерий и стафилококков с пеитрофилами бп,м "оставлены опыты с рестимуляцией. В основу их положены наблюдения о том, что стимулы, использущио одинаковио пусковые и медиаторные механизмы в системе респираторного взрыва, вызывают перекрестную деактивацию нейтрофила, в то ке время способность к рестимуляции гетерологичными раздражителями сохраняется ( 1С.В.Лебедева и соавт., 1989; Л.Л.Невмятуллин, 1909; Tomitn et ni.,'19?^ ; Пс l'imil et al.,103'0 . Опыты ставили по следующей схеме: первичную стимуляцию проводили пептидогликаном B.bifidum или 3.aureus , для рестимуляции использовали те же препараты ( в прямом и перекрестном вариантах), а такта латекс, который взаимодействует с г'лгоцитани через гидрофобные контакты и является "переценторным'' стимулом. Высчптш-.апп пвдек« относительно уровня хемилкмннесцен-ции не:'-трофилов, не подвергавшихся рестимуляции.

В опыта:: с латексом на ('оно первичной стимуляции нейтрофи-лоэ пептидогликгжаш B.bifidum и ¿.aureus получены близкие индексы ростимуляпии: 9,07 и 3,75. Рестимуляция пептидогликаном s.pureu,-. па фоне первичной стимуляции пептидогликаном B.bifi-dui-i была в 1,3 раза сильнее, чем в опытах с первичной стимуляцией гомологичные препаратом (3.aureus) . Разница мс:*ду рестшлуля-циоЯ гог'ологичнш и готерологичшла пептидогликанами особенно чет-го проявилась в опытах с пептидогликаном B.bifidum : в этом случае рестимуляция в гомологичном варианте (первичная и вторичная стимуляция пептидогликаном B.bifidum) практически отсутствовала, тогда как па '"оно активации стафилококком рестимуляция пептидогликаном B.bifidum вызывала трехкратное усиление хеми-лг'минесцеицин. Гти исследования позволяют сделать два основных вывода относительно взаимодействия с нейтрофилом трех изученных стимуляторов (латекс, пептидогликаны B.bifidum и 3.aureus) :

I) активирующие г>#енты латекса и пептпдогликанов развиваются на основе дискретных механизмов; 2) пути метаболической активации нейтрофила различными пептидогликанами могут бить неццентичш.

Взаимодействие пептидогликапов с лимфоцитами также изучали методом люминолзависимой хемилюминесценции (А.Н.Маянский и со-авт. ,1990 ).Реактивность к пептидогликану B.bifidum ^проанализирована в сравнении с пептидогликанами a.aureus ССМ 805, s.fae-caiis 6-3, E.coli М-17. Коэффициент стимуляции лимфоцитов (КСЛ - соотношение результатов опита п контроля) в опытах с в. bii'idum колебался от 1,3 до 3,3 (1,7-0,2), что было значительно ниже показателей для a.aureus и u.faecalis (р<0,05)и несколько выше (р>0,05), чем в опытах с пептидогликаном coli ,

Известно, что кроме специфических эффектов в системе иммунитета, пептпдогликаны способны вызывать неспецифическую ( поли-клональнук) стимуляцию лимфоцитов (Dziaraki, 1986) , Для выяснения природы наблюдавшейся нами активации лимфоцитов был проведен сравнительный анализ чувствительности к пептидогликанам (B.bifidum и Л.aureus) лшлфоцитов взрослых и новорожденных ( пупо-винная кровь ).

По сравнению с лимфоцитами новорожденных лимфоциты взрослых доноров значительно сильнее реагировали на пептидогликан золотистого стафилококка (р<0,05) .В опытах с пептидогликаном B»biri-dua реакции лимфоцитов новородценных достоверно не отличались от реакций лимфоцитов взрослых допоров, хотя и были выралены несколько сильнее <I,7-0,2 и 1,3-0,1). Интенсивность реакций на стандартный поликлональный митоген (фитогемагглютинин) была одинаковой. ¡Гто говорит о том, что слабые лпмфоцитарше реакции, которые фиксировались в нааей тест-системе с пептидогликаном В-biiidun , е основном имеют неспецифическую природу и, по-ви-

димому отражают обшую способность пентндоглитано'- • полшсло-нэльноп стимуляции лимЛоиитов. Напротив, в чувствительности к пепт.'.чогликану 3.aureus доминируют специфические ( антиген-зависимые) реакции. сто означает, что несмотря на количественное доминирование в нормально!'! микрофлоре, иммунологические контакты бифидобактерий с макроорганизмом минимальны и, как будет показано нит.е, могут определяться антигенными связями их пептидогликанов с другими бактериями, в частности со стафилкокками.

Для изучодия сравнительной активности пептидогликанов и их антигенних г.питопов в реакциях гут/орального иммунитета был» использованы ирепартн различных видов бифидобактерий а также S. aureus ССМ 665, G.epidoraidis CCf' 2124, rj.coli М"17, Ь. plnntsrun И aoc.ili.4 6-3. Основным источником антител служил коммерческий гаддупоглобулин человека. Если учесть, что дан-i!ir'; препарат готовят из пула снпоротон мюгих доноров, то полученные нами результатм соответствует усредненным показателям на уровне популяции. Интенсивность реакции гнзим-меченьк антител оценивали по даминолзависшой хемилиминесценции и выражали в имп/мин.

Наиболее интенсивными были реакции спептидоглпканами стафилококков, сод,ерзание антител к которым примерно в 2-5 раз превышало их уровень к пептидогликанам других бактерий (27,0-2,4x10^-a.opvJer:ni<iis " ; 26,7*2,0хЮ5имп/мин - 3.aureus) . Бцфи-добактерии относились к числу бактерий, содержание антител к котор:м б}що шшимальнкм ( 5,5-0,9хЮ^имп/мин) . В о ту группу . входили такгсе J.fnecjjlia и L.planfcarum ( 4,8*0,4x10^

/ «• Г

1и..п/r.iiiiг у 4(5+qт0х10аимп/мин) . Полученные данные свидетельствуют о неодинаковом значении иммунологических механизмов для стабилизации взаимоотношений человека с различными представителями н^рмальной микрофлоры. Низкое содержание антител к пеп-

тидоглшсанаы лактобацилл, r-нтерококка, о'ифндобактерий может отражать гф;.ектиьность антигеннеэависимых механизмов в формировании взаимоотношений с этими бактериями, которые исключают необходимость вмешательства напряженных иммунных реакций.

принципиальная возможность обнаружения противопентидогли-кановых антител в препарате иммуноглобулина человека была использована для изучения диапазона антигенных взаимоотношений пептидогликана n.bifidum №1 с такими же препаратами из других бактерий (ь пределах вида, рода, с бактериями отдаленных таксонов). Метод основан на изучении реакции енэим-ыеченцх антител до и после истощения антителосодерхшцих субстратов пептидогликанами. Остаточную активность выражали в процентах относительно уровня реакции с цельным ( неистощенным ) субстратом. Для истощения иммуноглобулин (1 мг/мл ) инкубировали с равным объемом солюбилизированных пептидогликанов ( 0,40 по EggQ ) в течение 30 мин при 3?°С.

После истощения пептидогликаном b.bifidum И ( гомологичная тест-система ) остаточная активность иммуноглобулина составила 1,69». Истощение пептидогликанами гетерологи«ных штаммов того же вида (B.bii'iduu) снижало показатели до 8,W (ГО-4) , 6,l5ó (791), 5,55o (ЛВА-3). Взаимоотношения внутри рода бифидо-бактерий изучены для B.adoleccentis ГО-13, в.breve 79-38, B.lactentis 79-41, u.longum Я-3. Минимальные показатели остаточной активности иммуноглобулина отмечены при истощении пептидогликанами B.adolesccntis (1,б9б)и В.breve (T,75¿). В опытах с пептидогликаном B.lactentis активность иммуноглобулина снизилась до 6,0%, с пептидогликаном B.iongum до 6,2%. Полученные результаты показывают, что по имиунохимкчес-ким свойствам пелтидогликани би^идобактерий достаточно однородны. Гто относится как к.штаммам одного вида (3.bií"idu;n) ( так и

к разним видам родового таксона 3ifidobacterium .

Истощение иммуноглобулина пептидоглнканами стдалинных (от бт'.ндобактерий) таксонов снижало показатели до I,9?o ( ü.faeca-lis), ( .3.aureus) , 4,5fi (o.epidermiiiis) , (L.

plantarum ) , 31,794 ( ¡J.coli ) . Иными словами обнару-

жено максимальное родство нептидогликана бифидобактернй с пеп-тидоглнканами o.l'aecalis , a. aureus , S. epiderrai-dia и минимальное - с ü. coli и L. plantarum.

Антигенная близость пептидогликанов бифидобактернй с аналогичными препаратами стафилококков и энтерококка побудила к дополнительным исследованиям, в которых опыты с истощением пмму-ноглоОубыли поставлены в обратном порядке: на штоки сорбировали пептндогликаны 3.aureus и li.faecalia , а для истощения иммуноглобулина использовали препарат ß. biridum В ртих опытах остаточная активность для з. aureus составила 44,для 3. ГаесаИз - 2,1?=; в гомологичных системах эти показатели были соответственно 1,4% ч 0,9?*. Совпадающие результаты при перекрестном истощении иммуноглобулина В. bifidum и j. faooalia ( остаточная активность 2,1% и 1,9^) говорят об идентичности зпитопов, которые обеспечивают иммунологические взаимоотношения их пептидогликанов с человеком. Напротив, аналогичные опыты со стафилококком свидетельствуют о том, что его неп-тидогликан, копируя часть антигенного профиля пептидогликана би-фвдобактериЯ, располагает дополнительны).«! эпитопаыи, которые участвупт в формировании иммунологической реактивности человека. Вместе с отим можно било допустить и другое толкование: пепти-

догликан бифидобактернй обладает не менее сложным набором антигенных ( в том числе специфических) детерминант, но их активность не проявляется в условиях "нормального" ( естественного)взаимодействия с человеком; ото ведет к доминированию эпитопов, общих

для всех пептидоглшгапов, причем антитела к ним могут быть результатом реакций, спровоцированных не бифидобактерпями, а другими бактериями, для проверки этого предположения были использованы два дополнительных подхода: I) сравнительное изучение специфичности "нормальных" антипептидогликановых антител человека и кролика; 2) сравнительное изучение "нормальных" и "ги-перим?;унннх" антнпептидоглихановкх антител кролика (нормальная сыворотка, сыворотки, полученные в условиях иммунизации кроликов пептидогликанами з. ъз.П/'.ип И и J. пигспшСОМ 835 . В последнем случае рассчитывали на включение в иммунологический ответ максимального числа поптидогликановнх зпитопов и,соответственно на получение максимально полноценного спектра антипеп-тидогликановых антител.

Истощение нормальной сыворотки кролика (пул сывороток 5 животньк) проводили в следующем режиме: равные объемы сыворотки (1:5) и пептидогликана (0,40 по F^q) инкубировали 30 мин при 37°С. Анализировали две тест-системы. в одной из них индикаторным антигеном служил пептидоглккан в. bifidun , чо второй -S. aureus • В первой тесг~е;:стг;ме остаточная активность сыворотки после истощения пепт:'.*оглкканами би! идобактерий и стафилококка составляла соответственно 12,6-2,1/5 и 2C.,6-3,2?i; соотношение между результатами опытов с гетеролсгичнкл и гомологичным ингибиторами равнялось 2,7^0,6. Во рторо;"; тест-системе ( индикаторный антиген з. аигсия ) остаточная активность после истощения пептидогликаном стафилококка составляла 9,4^0,4^ для опытов с гетерологичным ингибитором (В. bifidun ) аналогичный показатель равнялся 19,3-1,4$; соотношение между гетерологичным и гомологичные тормотхениом - 2,0-0,1.

Дли доставили максимального истощения гнп8р1)м!!унных сывороток оказалось необходимым их разведение ро 1:60. Истощение проводили равным объемом пептидогликанов в концентрации 0,40 (Eggg) 30 мин, С. Б опытах использовали две тест-системи. В первой системе в качестве индикаторного антигена использовали пептидоглпка.ч в. bifidun , в качестве антителосодеркащего субстрата - 'сыворотку кроликов, иммунизированных тем ле препаратом. Во второй тест-системе ивдикаторнш антигеном служил пептгдоглпкан 3. aureus , источником антител - сыворотка кроликов, иммунизировании* пептидогликаыом золотистого стафилококка.

Остаточная активность сыворотки в первой тест-системе (индикаторный антиген 3. bifidun ) после истощения пептпдогликаном 3. bifidua составила 19,5-4,65», после истощения пептпдогликаном a. aureus - 72,6-1,595; соотношение в системах с гетерологичнии и гомологичным ингибиторами равнялось 4,8-1,2. Во второй тест-системе (индикаторный антиген a. aureus ) показатели составили: 4,9*1,(гомологичный ингибитор), 71,4* -11,2% (гетерологичный ингибитор), соотношение между ними -- 14,9-0,7.

Результаты проведенных исследований показывают, что пепти-догликан В. bifidum располагает шлюпами, иммуногегаюсгь которых не проявляется в условиях естественного (нормального) контакта с иммунной системой, но может быть обнаружена при ги-перипмунизации. Об етом свидетельствуют особенности реакцш"; пспткдогликгша В. bifidun с иммуноглобулином человека и пшеримпунной сывороткой кролика поело истощения гомологичным и готерологичнш препаратами: антигенное своеобразие пептидогли-кана бифидобактернй (относительно 3. aureus ) заметно про-

явилось лишь в опытах с гипериммунной сывороткой. Гто говорит о том, что пептидогликан бифпдобактерий обладает специфическими гпитопнмп, но они не вызывают образования антител у человека. С гточ точки арония, взаимодействие пептидогликзна бифпдобактерий с нормальной сывороткой человека и в меньшей степени кролика могло быть результатом перекрестных реакций с антителами против общих иептидсгликановых рпитопов, индуцирорашпк другими бактериями.

Исходи из сравнительно." характеристики трех' знтителосодер-гащих субстратов Антитела нормальной сыворотки человека - коммерческий препарат иммуноглобулина, антитела нормально"; сыворотки кролика,антитела гипорпмгуиних сывороток кролика) , на;'1п опыты дают основание проанализировать вопрос о реализации активности дискретных ( специфических и общих) снитопов гюптндоглпка-нов в различных иммунологических системах. Активность видоспе-цифичоских антигенных детерминант поптпдоглпкяпа з. ъ^ГЫига в условиях "нормальных" взоикоотпошени" с и; и/пю/ системой человека и кролика выражена слабо. Сб гто:.; свидетельству} т соотношения ме;кду результатами опытов с г&теролопгчным и гомологичным истощением в отих системах ( 1,4*С,4 и Й,7-0,6; р) 0,00) . Достоверно более высокий показатель получен в опытах с гипериммунной сывороткой - 4,8*1,2 (р<0,05). Иначе, г од от себя пептндогликан стафилококка. Обладая высоко." активность» в е-ст^стион-ннх взаимоотношениях с человеком ( 2по?:чт>ияо могду гетсроло-гичным и гомологичным истощением ,сго сиецп.'и"еские

опитоин инертны для кролпка(Я,0*С,1); гипериммунпзагия способствовала выявлению г тих дотер; ¡::гк*нт С 14,9*0,7) .Особенности во взаимоотношениях с пэптидогликанами мог.;т быть связаны с видовым своеобразием микрогкологии либо с неодинаково'; реактивно-

стью различных животных к дискретным зпитопам пептидогликанов. Это, в частности, означает, что, исследуя антигенные параметры пептидогликанов, не следует ограничиваться анализом единственной иммунологической системы.

Пептидогликаны рассматриваются как один из важнейших компонентов, ивдуцирующих опсонинзависимый фагоцитоз бактерий (?е-terson gt el., -1978; Verhoef et al.,1979) . Главную роль в оп-сонизации пептидогликанов играют антитела и комплемент, который активируется по классическому и/или альтернативному пути С II.А. Азов, I98G; Л.Ы.Вавилова и соавт. ,1990; Wiikinsoü et al.,'l9¡31 ).

Можно полагать, что их относительный вклад в общий опсоничекий аффект зависит от' количественного содержания антител и прямой антикомплементарной активности пептидогликана. Оба признака варьируют для разных пептидогликанов, отражая особенности их взаимодействия с иммунной системой макроорганизма.

Нами изучено взаимодействие нейтрофилов с пептидогликаном бифидобактерий после его обработки цельной сывороткой человека и сывороткой, из которой избирательно удаляли антитела и/или инактивировали комплемент. В серии дополнительных опытов исследовали опсонические свойства антител, содержащихся в коммерческом иммуноглобулине человека. Опсонизированный и неопсонизирован-ный пептидогликаны тестировали в реакциях люминолзависимой хе-милюминесценции нейтрофилов. Кроме того, исследовали способность неопсонизированного пептидогликана стимулировать нейтрофилы в составе нефракционированной крови (разведение I:ñ). Известно, что в этом случае практически вся хемилшинесценция зависит от активированных нейтрофилов ( Tono-Oka et al., 19S3). Для сравнения в параллельных опытах анализировали пептидьгликан золотис-

тсго стафилококка.

3 реакциях с чистыми нейтро<'илами более высокая активность зарегистрирована у пептидогликана бифидобэктерий. Напротив, при стимуляции "не;ракционированных" нейтрофплов реакция на н-лгги-догликан золотистого стафилококка значительно превосходила уровень ответа на препарат из бифидобактери;". Гто но'ино было объяснить тем, что в крови реакции нсйтро^илов трансформировались через систему опсонической кооперации, причем опсоническип рф-(]е<ст сылоротсчшк факторов был сильнее вира»ен для пептидогликэ-на золотистого стафилококка, для проверки данного предположения били поставлены опыты с пептидогликанами, обработанными сывороткой человека. После такой процедуры побтро^дот^лидоэдме свойства препаратов значительно возрастали: реакция на пептидогли-кан бифидобактерий повивалась примерно в 2 раза, опсонизирован-нчй г.ептгдоглпкан стафилококка стимулировал нейтро'иль: почти в Г> раз сильнее. Далее был исследован раздельны'"; опсоиичесщ:;: эффект антител ;; ксмпле:.:ента. В реакциях, где для слоонкзацга использовали иммуноглобулин, активность пептпдогликана би^ндобак-тори;': менялась недостоверно, тогда как реакции' на пептидегликан стафилококка усиливались в 3,4 раза ( р <С,Со) . Удаление антител сн;г:&ло опсоничеспую активность сыворотки, но если в реакциях с пзптидогликаном стафилококка кейтро^клеткиулиругспк' с="""ект оставался значительным, то в опыта:: с препаратом из бифндобакте-рпЧ усиления стимуляции не"трофклов ( по сравнении с реакциями, в которых использовали нволсояк^рог-аи;-!? поптидоглккан) практически не наблюдалось, -"то монно сбьяснить инертностью пепти-дегликаиа бнфидобактерий в реакциях с комплементом. Напротив, пептидогликан золотистого стафилококка, обладая способностью вступать в прямое Сантителонэзавпсимое) ззаимодеГствио с комп-

лементом, обеспечивал реализацию его опсонического резерва. Обращает на себя внимание, что после удаления антител и инактивации комплемента сыворотка сохраняла способность усиливать взаимодействие стафилококкового пептидогликана с нейтрофилани. Ето говорит о присутствии в ней дополнительных ( минорных ) опсонинов, не связанных с антителами и комплементом ( Ю.В.Лебедева, 1969) . В отл.мне от стафилококка пептидогликан бифидобактерий не реагировал с антитело- и комплекентнезависимыми опсонинами. Проведенные исследования иллюстрируют дополнительное проявление неоднородности пептндогликанов, связанное с различной способностью к прямому взаимодействию с системой яомпиемента: пептидогликан оифидобактерлй не активировал комплемент и, вследствие этого, не опсонизировался сывороткой, лишенной специфических антител. сто отличает бифидсбактерии не только от стафилококков, но и от других бактерий, которые обладают такой активностью. В целом, это можно рассматривать как одно из отражений низкой "иммунологической агрессивности" бифидобактерий. Анализируя причины различной биологической активности пептидогликанов, следует помнить об их структурных особенностях, которые могут тлеть функциональные, последствия. Слабая активность пептидогликанов в опсонофагоцитарнсй системе снижает флогогенный потенциал бактерий, подчеркивая их относительную инертность в инициации воспалительных реакций и во взаимоотношениях с ыакроорга-низмом в целом.

ВЫВОДЫ

I. Пептвдогликаны бифидобактерий способны стимулировать люми-нолзависимую хемилюминесценцию нейтрофилов человека. По этому

признаку штаммн одного и того же вида бифидобактерий ( в, bifi-dum) близки меэду собой и превосходят аналогичный показатель для стафилококков, включая наиболее активный из них - з. aureus- . Нейтрофилстимулирующая активность разных видов бифидобак-терий выражена неодинаково.

2. В опытах с перекрестной ресгимуляцией нейтралов пептидогли-канами в. bifidun и s. aureus установлена дискретность механизмов взаимодействия пейтрофилов с разными пептидогликана-ми. Механизм стимуляции латексом отличается от механизмов активации нейтрофилов пептпдоглпканами.

3. В реакциях опсонинзависимой стимуляции нейтрофилов установлено, что пептндогликан бифидобоктерий не активирует комплемент, не опсонизируется сывороткой, лишенной специфических антител,

не реагирует с. "минорными" антитело- и комплементнезаписимыми опсонпнами.

4. В спектре антител человека к пептидогликанам различных бактерий (.0. aureus, 3. epidermidi:;, E.coli, L.planteruin, 3. faecalis) антитела к пептидогликану г.. bifidim представлены в минимальном количестве.

5. По данным реакций с "нормальными" антителами человека, пеп-тидогликаны различных штаммов B.bifidum близки по антигенным свойствам и не отличаются от пептидогликанов друпж видов бифи-добпктерий. В реакциях с пептидогликапом u.bifiduni истощение иммуноглобулина человека пептидогликанам! различных бактерии снижало показатели его активности до 1,696 (B.bifidun- гомологичная система), 1,9% (¿.icwlio),2,0< (з.оигои.ч) , 4,5«: (;;. opidertnidis) , Zi-,9< CL.plr'.nfcnrun), 31,7ч« (H.ooli).

G. При анализе антигенных взаимоотношений пептидогликанов i;. bifi-

иа и З.аигоиа в реакциях с "гппернммуннкми" антителами кролика установлено, что пептидогликан в.ыгЫиа располагает вгштопами, ногенность которых не проявляется в условиях естественного контакта с иммунной системой, но мокет быть обнаружена в условиях гипериммунизации.

8. Пептидогликаны располагают опитопами, иммуногенност.ь которых неодинаково проявляется в условиях естественного контакта с иммунной системой разных видов животных (кролик, человек).

9. Пептидогликан бифвдобактерий вызывает слабую стимуляцию лк-ми-нолзависимой хемилюминесценции лимфоцитов человека, в основе которой ли'-.ит неспецифическнй (антигеннезависимый )еффект.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Сибирякова Н.И. НеЯтрофилстиыулируюцая активность пепти-догликана бифидобактерий // Тез. докл. IX науч. конф. молодых ученых и специалистов Волго-Вятского региона, г.Горький, 19С9г. -С. 278.

2. Сравнительная характеристика нейтрофилстимулируищей активности пептидогликанов бифидобактерий и стафилококков / Н.И.Сибирякова, Ф.З.Ооккна', Г.К.Гончарова, й.А.Ккимкчева // Моделирование и клиническая характернотика фагоцитарных реакций: Респ. сб. науч. тр. - Горький, 1989. - С.69-74.

3. Диапазон антигенной специфичности пептидогликана бифидобактерий / Н.И.Сибирякова, Д.Г.Астафьев, И.В.Маянская, Г.И.Гончарова, Л.М.Лянпая /А'урн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. -1991. - К? б. - С.2-3.

4. А.с. 1605372 СССР. 1.1КИ в01 II 33/543. Способ определения активности рецепторов нейтрофилов человека /А.Н.Каянский, И.В. Чеботарь, Ю.В.Лебедева, А.Л.Невмятуллин, Н.И.Сибирякова, Т.М.Ко-нышкина.. //Публ. 23.10.91. Бюл. !1Л 39.

5. Характеристика поптидогликана 81;ярЬу1ососоиа аигеиз

в чггектро реактивности лимфоцитов человека к бактериальным пеп-тидогликанам / О.А.Осипов, Н.И.Сибирякова, Д.Г.Астафьев и др. // Курн. мнкробиол. онидемиол. и иммунобиол. - 1991. - Р 9. -С. 60-62.

6. Антитела к бактериальным пелтидогликанам как отражение механизмов гомеостаза в геологической системе макро-микроорганизм / А.Н.Мапнс.кий, Н.И.Сибирякова, Д.Г.Астафьев и др. // Тез докл. У1 Всероссийского съезда микробиологов, эпидемиологов и паразитологов, г. Никни:! Новгород, 1991г. - М., К91. - 0. И2-ИЗ.