Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологическая активность пептидогликана золотистого стафилококка в опсоно-фагоцитарных реакциях

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биологическая активность пептидогликана золотистого стафилококка в опсоно-фагоцитарных реакциях"

РГ6 ОД

- 9 ЛБГ

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ НИЖЕГОРОДСКИЙ МЕДИЦИНСКИИ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

ФОКИНА ЮЛИЯ ВИКТОРОВНА

БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ

ПЕПТИДОГЛИКАНА ЗОЛОТИСТОГО СТАФИЛОКОККА В ОПСОНО-ФАГОЦИТАРНЫХ РЕАКЦИЯХ

03.00.07—Микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Нижний Новгород, 1993

Работа выполнена на кафедре микробиологии Нижегородского государственного медицинского института.

Научный руководитель — доктор медицинских наук, профессор А. Н. Маянский.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Н. А. Добротина, доктор медицинских наук, профессор К. Я. Соколова.

Ведущее учреждение—научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи.

на заседании специализированного совета К 084.39.02 Нижегородского государственного медицинского института по адресу: 603005, Нижний Новгород, пл. Минина и Пожарского, д. 10/1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Нижегородского медицинского института.

Автореферат разослан «_» _1993 г.

Защита состоится

часов

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат мед. наук

А. В. Леонов.

Общая характеристика работы

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕГЛЦ. Пептидогликаны принадлежат к числу важнейших структурных компонентов грамполакительных бактерий. Это своеобразный гетерополимер, который, являясь уникальным для прокариотов, определяет механические свойства их клеточноР стенки и служит основой для включения в ее состав других элементов.

В системе микро-макроорганизм пептидогликаны не являются инертшми веществами. Подобно липополисахаридам гршлотрицательных бактерий, они воздействуют на различные звенья гомеостаза. Большой интерес вызывает участие пептидогликгнов в реакциях иммунитета. На различных моделях доказана способность пептидоглика-нов и их дериватов индуцировать гаперчувствительность замедленного типа и образование антител, вызывать адъювантный эффект, не-специгТически стимулировать лимфоциты, активировать комплемент .( Dziaraki, 19В6; Parant, Chsdid, 1906; Seidl, Shleifer, 1986 ). Значительная часть биологической активности пептидогликанов транс-ipoptwpyeTcn через систему фагоцитоза, включая его клеточное и гуморальное звено.'Это нашло отражение в многочисленных работах, посвященных изучению влияния пептидогликанов на моноциты и макрофага. Воздействие пептидогли--шов на систему нейтро^ильногс Фагоцитоза и их роль в патогенезе острого гнойного воспаления исследованы гораздо слабее.

Посвящая работу изучению пептидогликанов, мы выбрали в качестве объекта исследования, золотистый стафилококк. Это связано с несколькими причинами. Во-первых, золотистый стафилококк является классическим индуктором острого гнойного воспаления. Во-вторых, пептидогликаш стафилококков, детально изученные к настоящему времени в плане структурных и антигенных характеристик, представляют наиболее интересный модельный материал для изучения биологи-

ческих свойств этого субстрата. В-третьих, несмотря на то,что. ста^ лококк остается одним из ведущих гтиол.огических факторов септических заболеваний, ишунопатогенез стафилококковых инфекций до конца не раскрыт.'О атом плане представляется ва/кным изучение прямого и опосредованного взаимодействия пептидогликанов и их дериватов с эффект ордами механизмам! иммунитета и воспаления. Б комплекс вопросов, объединенных этой проблемой, входят качественная и количественная характеристика опсоншюв, активация и кондиционирование (Тагоцитов, стимуляция цитокинообразования, влияние на кооперацию клеток. Именно эти позиции, с которыми во многом связана эволюция взаимоотношений в системе "хозяин - паразит", определили основные направления нашей работы.

ЦЕПЬ РАБОТ..! - изучить биологические двоГства пептидогликана золотистого стафилококка в реакциях, определяющих функциональную ак-тиьность системы фагоцитоза. ЗАДАЧИ РАССТИ :

т Изучить нейтро^илстимулируицие свойства пептидогликанов стафилококка на основе люминолзашсимой хемилю^шесценции.

2. 'Изучить реактивность нейтрофилов к пептидогликану золотистого стафилококка в системе опсонической кооперации.

3. Изучить количественные параметр.! антител различных классов в сравнении с их функциональной (опсонической) активностью у здоровых и больных с пиогенной инфекцией.

4. Изучить влияние пептидогликана золотистогр стафилококка на взаимодействие нейтрофилов и эндотелиоцитов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые пр! помощи высокочувствительного и объективного метода оценки кислородзависимого метаболизма, люминолопос^едованно" хемилюминесцениии, обнаружена неодинаковая нейтрофилстимулирукщая активность пептидогликанов представителей рода BtaphylDcoccus . В опытах с рестимул;1цией нс'й -

тро'Тилов пептидогликанами различных видов стафилококка и латексом установлено, что механизм.! возбуждения хемилгамИнесценции однотипны для разных пептидогликаиов, но отличаются от хемилюми-несценции, индуцированной через неспирИические (гидрофобные) контакты» При изучении опсоно-фагоцитарннх решияй обнаружены не связанные с антителами и комплементом опсонины с антипептидо-гликановой активностью, установлено усиление нейтрофилстимули-мулиругацих свойств пептидогликана золотистого стафилококка после его обработки Яибронектином. Отмечен низкий уровень антитело-зависимой опсонической активности сывороток больных с хирургической гно?;кой патологией на в'оне повышенного содеркания в них антипептидогликановых 1ёЗ -антител; высказано предположение о том, что недостаток функционально полноценных антител макег способствовать хронизации пиогенного процесса. Получены доказательства того, что пептидогликаны стафилококка усиливают адгезившв реакции в системе "нейтрофил - эндотелий", стимулируя неГ:трофилн и эвдотелио!51Ты; эта активность неодинаково выракена для разных видов стафилококка,

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Материалы работы содержат новую информацию об т.мунобиологических свойствах основного структурного компонента клеточной сткнки стафилококков - пептидогликана. Получен препарат для функционального зондирования системы фагоцитоза по реакциям кислородзависимого метаболизма нейтройялов. Определены количественные показатели реактивности здоровых лвдей к пептидо-гликану золотистого стафилококка, которые могут служить ориентиром в клинико-диагностической практике. Разработана тест-система" для исследования адгезии нейтрофилов на эндотелии. Получено автою-ское свидетельство И686372 СССР МКИ 001»!33/543 (публ. 231091.. Бгол.

85 39) "Способ определения активности рецепторов нейтрофилов человека". Результаты работы вошли в методические рекомендации "Предупреждение осложнений у новорожденных детей с гнойно-септическими и острыми респираторными заболеваниями" (утверждены МЗ РСФСР, 1989 г.) . Сделано два рационализаторских предложения: I)"Многократное использование градиента плотности ^иколл-впрогруфин для фракционирования клеток крсви"( li- I2II от 9.02.88); 2)"Сгюсоб оценки неспеци'ической (гидрофобной) адгезивности нейтро-Тилов" (•!!? 1384 от 16.04.91 ).

ПОЛОЖЕНИЯ, Б H И О С И 1.1 Ц Е НА ЗАЩИТУ;

1. Участие пептидогликаноь в эволюции пиогенного воспалительного процесса может быть связано с их прямым воздействием на функциональные параметры нейтрофилов, а также с усилешем нейтроуилопо-средованных реакций через гуморальные (опсонины)и клеточные (вн-дотелиоциты) Лакторн.

2. Комплексное определение функциональных и количественных параметров антипептидогликановых антител позволяет судить о дефектах в системе опсоно-фагоцитарной защиты и эффективности иммунологического ответа.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на восьмой научной конференции молодых учеши Волго-Вятского региона (Горький, 1988), на I Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы теоретической и пржладной инфекционной иммунолоши" (Москва, 1987), на II Всевоюзной конференции "Актуальные вопросы клинической микробиологии в неинфекционной клинике" (Барнаул, 1938), на IX межинститутской конференции "Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических с стояниях" (Челябинск, 1988), на заседании проблемной комиссии "Эпидемиология, микробиология и 'инфекционные болеэни" Нижегородского медицинского института (1992).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано II научных работ в центральной периодической печати и научных сборниках. Список приведен в конце автореферата.

ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, указателя литератур?, включагацего 27 отечественных и 127 иностранных источников. Работа изложена на 118 листах машинописного текста и содержит 33 рисунка и 5 таблиц.

Содержание работы

МАТЕРИАЛЫ И >1 Е Т U Д Ц ИССЛЕДОВАНИЙ. Проведено более 900 реакций лгаотнолопосредованной хемилюминес-ценции нейтрО'Тилов, исследованы нейтро<1илы 125 доноров. Выполнено более 1000 иммунохимических анализов, изучены сыворотки 17 здоровых и 26 бальных с хирургической гнойной патологией. Получено 18 серий препаратов пептидогликанов.

В работе использованы штаммы бактерий из коллекций HHwM им. Н.Ф.Гамалеи, МНИИЕМ им.Г»Н.ГаСоичевского, Горьковского НИИЭМ МЗ PCSCP, Назанского ШИЗМ ¡.Г ' .'СР.

Иептидогликаны получали по методу Peterson et al. (1978) путем последовательной обработки клеточных стенок бактерий доде-цилсульфатом натрия, ДНК-азой, РШ-азоЯ, трипсином, AiTA-u фенолом и горячей ( 60°С) 2СЙ-Й трихлоруксусной кислотой. В экспериментах по изучению реактивности нейтро^илов пептидогликан использовали в корпускулярной форме в конечной концентрации 10 мкг/мл.

Нейтрог|илы выделяли из венозной крови здоровых доноров на двойном (1,115 и 1,077) градиенте плотности ^иколл-всрогра^яна, концентрацию клеток доводили до 0,5хЮ6/мл. Хемилюданесценншо нейтрофилов измеряли в имп/мин на жидкостно-стинциллящонном счетчике "Бета-I". В силикоцированнкх флаконах смешивали I мл

взвеси иейтро?илов (0,5хЮ®/ыл), 0,05 мл раствора люминола ( Ю~4М) и 0,1 мл соответствующего стимулятора ( неопсонизированний и опсо-низированный пептидогликан, латекс). Учитывали максимальшй показатель, фоновые значения (хемилюминесценция нестимулированных клеток) вычитали.

Для опсонизации пептидогликана использовали цельную сыворот-. ку человека ( пул 30 здоровых дсоров) и сыворотку, обработанную 'в различных режимах: I - инкубация сыворотки с пептидогликаном (100 мкг/мл) в течение 30 мин npi 0 - 4°С (избирательное удаление антител без инактивации комплемента) ; 2 - обработка сыворотки 0,01 M ЭДТА или прогревание при 5б°С в течение 30 мин (общая блокада комплемента)?3 - обработка сыворотки 0,01 H Mg-ЭГТА (избирательная блокада.классического каскада комплемента). В серии опытов для опсонизации использовали йибронектин ("Sigma" , США) в концентрации 320 мкг/мл. Осадок пептидогликана инкубировали с исследуемым субстратом ( 100 мкг/мл)в течение 30 мин при 37°С, трижды отмывали и ресуспендировали в растворе Хенкса. 13 опытах с рестимуляцией нейтрофилов применяли латекс с диаметром частиц 1,92 мк в концентрации 0,3х10*®/мл.

Для изучения адгезии нейтро^илов использовали эндотелий вены пупочного канатика новорожденных детей. Пуповину разрезали и Фиксировали в специальном блоке с лунками так, чтобы дно лунок было образовано эндотелием. Затем в лунки помечали 0,2 мл нейтроТилов (2,5хЮб/мл) и 0,2 мл пептидогликана (ICO мкг/мл). После IL-wi-нутно». инкубации при 37°С подсчитывали количество клеток в супер-натанте. Процент адгезированных нейтроТилов определяли по борму- ' ле: 100 - х 100, где А - количество клеток в камере после инкубации, В - количество клеток в камере до инкубации.

Антитела к пептидогликану золотистого стафилококка опреде-

ляли в реакции .энзим-меченых антител. Солюбилизированный пептидо-гликан (обработка ультразвуком 22кГц, 20 мА, 30 мин) сорбировали на поли стироловых планшетах , последовательно обрабатывали бычьим сывороточным альбумином, исследуемыми сыворотками, мечеными пероксидазой поливалентной или моноспецифическими антисыворотками против 1е<3 , ХбН и 1бА . .После каждого этапа проводили отмывку лунок твином-20. Затем следовала инкубация с субстратом для пероксидазн ( смесь ортофенилендиамина и перекиси водорода) и фиксация результатов раствором серной кислоты. Учет результатов проводили на мультискане МСС/340 РС1<зЪэ18Ъепш" , Финляндия). Позитивным контролем служили реакции с пулом сывороток здоровых доноров. Показатели негативного контроля (пробы без пептидоглика-на) вычитали. Результат выратсали в условных единицах по формуле:

где А - показатель реакции с исследуемой сывороткой; В -со стандартным пулом сывороток. В тех пв сыворотках определяли опсоническую активность антител. С этой целью сыворотки прогревали 30 мин при 56°С для инактивации комплемента и исследовали их способность усиливать не?,' роТилстимулиругацие свойства лепт- -догликана золотистого стафилококка в реакциях люминолопосредо-ванной хемилюминесиендаи. Учитывали } '¡зультат на пике хемилюми-иесценши, показатели негативного контроля ( нейтро^илы, стимулированные неопсонизированным- пептидогликаном) вычитали. Позитивным контролем слагали реакции с пептидогликаном, опсонизированным пулом сывороток здоропых допоров. Результат выратсали в условных единицах по '"ормуле, приведенной выше ( определение антител).

При статистической обработке результатов использовали рекомендации Ю,И.Иванова и О.Н.Погорелюка "Обработка результатов медико-биологических исследований на микрокалькуляторах" (1990). Вычисляли следующие показатели: средняя арифметическая, средняя ошибка сие.чно'! величины, достоверность различий средних величин

( по критерию Стьвдента и критерию Z).

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ. Нейтрофилстимулируюцие свойства пептидогликанов изучали в реакциях люминолзависимой хемилюми-несценции. Для определения оптимальных условий били проведены опыты с пептидогликаном Б.aureus ССМ 88ü по подбору дозировки препарата и изучению кинетических характеристик процесса. Пеп-тидогликан добавгяяи к нейтро? гам в конечной концентрации I, 3, 10 и 30 мкг/мл. При дозировках I и 3 мкг/мл хемилюминесценция возрастала в 2,2 и 2,5 раза по сравнению с контролем, более высокие дозы прлпарата (10 и 30 мкг/мл) вызывали Ь - 7-кратное усиление ответа. Во всех дальнейших экспершентах" использовали пепти-догликан в концентрации 10 цгг/мл. Кинетика хешлюминесцснции была следуюцей: после внесения стимулятора начиналось постепенное нарастание показателей, которые достигали максимума к 15 - 45-й мин (чаще к 30 шн), затем они плавно снижались и к 1£0-й мин приближались к уровню контроля. В своих опытах мы ориентировались на максимальные значения хемилюминесценцйи, наблюдая за ее развитием на протяжение не менее 45 мин.

Способность пептидогликана золотистого стафилококка стимулировать хемилюшнесценцию нейтраТилов послужила, основанием для изучения не^трофилстимулирумних свойств аналогичных препаратов

.г I

из других видов стафилокка, а также бактерий отдаленных таксонов. Пептидогликан золотистого стафилококка значительно превосходил

к

по своей активности (5,4+0,3x10 имп/мин) препараты из S.pyoce-nes "Копчанский"(1,4<;0,бх10О, р<0,05) и E.coli M-I7 (1,3+0,4х хЮ^, р<0,05), но уступал пептидогликану B.bifidum Ii? I

С ,

(10,8+0,8x10 , р<0,05). Колебания нейтрофилстимулирующей активности наблвдались и для II эталонных штаммов различных видов стафилококка. Урлвень хемилюминесценгрш, индуцированной пептидо-

гликанами из ¡их сильно варьировал. Для аналитических целей был о выделено три группы пептидогликанов - с высокой, средней и низкой нейтрофилстимулируицей активностью. В первую группу вошли S.nui-eua ССМ 885 и s.oohnii ССМ 2736, вызывавшие максимальную хемилюминесценцию (5,4+и,ЗхЮ^ и 5,3+0,8x10^ имп/мин), во вторую -S.epidcrmidis ССМ 2124 (.3,4+0,4x10^ , S.intermedin ССМ 5739 (3,2j;I,0xl05), O.hominia ССМ 3474 ( 2,2+0,2x105) И G.cspitis ССМ 2734( I,6+0,3xI0b), в третью - В.hyicua я.a. hyicua ССМ 2268 (0,7+0,2x105), B.xylosus ССМ 273В( 0,Ьг0,2хЮ5), £3.hyicua chromoKcnes ССМ 3337 (, 0,5+0,1x10^), О.lentus ССМ 3472 (0,3+0,1хЮ5 ) и 3.rmprophyticuo ССМ 883 (0,2+0,1x10^ При сопоставлении со o.oureua достоверные различия получены для всех видов, креме S.oohnii .

Различия нейтро^илстимулирукщих свойств пептидогликанов не только среди бактерий отдаленных таксонов, но и у представителей одного рода (Staphylococcia) побудили нас проанализировать, с какими свойствами пептидогликанов это связано. Для этого результаты наблюдений о нейтро^илстимулирукцей активности пептидогликанов были спроецироваш на данные литературы об их структучих и антигенных характеристиках. Анализ проведен на модели стафилококков, пептицогликаны которых иэуч:'г-- наиболее детально. Сопоставление нейтро'илстимулирукцей активности пептидогликанов и их химической структуры ( А.К.Акатов, В.С.Зуева, 1983; Seidl, Ghleifer , 1986) показало, что эти признаки не связаны между собой. К примеру, в группу пептидогликанов, межпептидные мостики которых состоят из глицина, вооши препараты с сильной (8.aureus, S.oohnii) И слабой (S.hyicua з.ч. hyicua, S.hyicua chromogenea, a.xylosus) способностью активировать нбйтрофилы. То же самое можно сказать и о пептидогликгшах, содержащих в межпептидных мостиках серии: среди них встречались стимуляторы с различной

активностью(з.epidermidis и g.3aprophytioua j. Ранее в нашей лаборатории были получены данные, характеризующие степень антигенного родства пептидогликанов различных видов стафилококка (Д.Г.Астафьев и соаьт., 1986). Согласно этим исследованиям, степень антигенной гомологии s.aureus с другими представителями рода Staphylococcus неодинакова. Сравнение н е 1 т рофи л ст к мули рую-щей активности пептидогликанов и их антигенных характеристик не выявило связи между этими признаками, В частности, пептидоглика-НЫ S.xylosus, S.hyicus s.s. hyicua, S.hyicus chrouocenes, ан-тигенно близкие золотистому стафилококку, обладали, в отличие от него, слабой нейтрофмлстпмулирукцей активностью. Напротив, пеп-тидогликан s.epidermidig , имеющий минимальное антигенное родство с пептидогликаном золотистого стафилококка, был олизок к нему ' по способности стимулировать нейтрофилы.

Отсутствие корреляции методу структурными параметрами и ней-трск^илстимулирукщей активностью пептидогликанов стафилококка привело к предположению, что своеобразие их взаимоотношений с ' клеткой могло бить связано.с особенностями воздействия на различные медиаторнне узлы респираторного взрыва лейтропилов. Такая возможность реально обоснована для ряда стимулов и объясняется относительной дискретностью рецепторных и Э'Некторннх механизмов кислородзависимого метаболизма йагоиитов. Для решения этой задачи мы воспользовались приемом рестимуЛяции клеток. В основу втих опытов положены наблюдения о том, что стимулы, использукщие одинаковые пусковые и медиаторше механизмы в системе респираторного взрыва, вызывают перекрестную деактивацию нейтрофила, в то же время способность к рестимуляции гетерешогачными раздражителями сохраняется чА.Л.Невмятуллин, 1989; Tomita et al., 1984; Mo Phail, Snyderman, 1934). Опыты ставили по следующей схеме:

первичную стимулянта клеток проводили пептидогликаном О.aureus, рестимуляцию-пептидогликанами s.aureus, s.oohnii, s.epidermi-dio и латексом. Последний взаимодействует с фагоцитами через гидрофобные контакты, т.е. является "нерецепторным" стимулом. Пептидогликаны, использованные для рестимуляши, обладали неодинаковой нейтро^илстимулирукщей способностью и характеризовались разной степс!пью антигенного родства с пептидогликаном золотистого стафилококка. Псе препараты использовали в дозах, которые вызывали равноценную хемилюминесценцию нестимулированных нейтро-Филов (рис.1). При анализе вычисляли индекс относительно уровня хемилюминесценции нейтроФилов, не подвергавшихся рестимуляции. После реакции на пептидогликан Sntiron клетки не отвечали на рести-муляцию гомологичным (о.aureus) и гетерсяогичними (S.oohnii и . s.opidermidis) пептидогликанами, но в то же время сохраняли способность повторно реагировать на латекс (рис.1). Индекс ре-стимуляции составил ДЛЯ 9.aureus - 1,0520,14 , S.oohnii 0,99+0,19 , B.epldermidi3 - U,87+0,07 ( p>0,0&), для латекса -3,21+0,40 ( p<0,05). Эти исследования дают основание думать, что пептидогликаны стафилококков активируют респираторный взрыв, используя однотипные механизмы, которые отличаются от реакций, запускаемых раздражителям! типа латекса Иными словами, принципиальные различия нейтро<7илстимулирующих свойств пептидогликанов не связаны с особенностям механизмов их взаимодействия с клеткой.

■• Нейгрсфмьный Фагоцитоз служит главным эжектором иммунитета против стафилококковой инфекции, liro полноценность определяется взаимодействием различи« Факторов, среди которых немаловажную роль играют опсонины, опосредующие реакции Фагоц1тов,( А.Н.Ма-янский, Д.Н.Маянский, 1939; Л.М.Вавилова, Т.В.Голосова, 1990).

в.аигеиа 8,'оо1ш11 В.вр1(1егт1(Ив

Латвко

СТИМУЛЯЦИЯ

12 3 4 5 6

х1(г имп/мин

РЕСТИМУЛЯЦИЯ

Ян

12 3

Индекс рестимуляции

Рис. I. Стимуляция и рестимуляции нейтродинов пептидоглнка-иами стафилококков и латексом

<

Штриховкой отмечена рестимулячия неРт роллов гомологичным ( □ ) , гетерологичными ( й ) пептидоглика-нами и латексом ( Щ ) после стимуляции пептидоглика-ном З.чигеив.

Хемшшшнесценция на 60-й мин после стимуляции пептидогли-КаНОМ З.пигеин

ШЩЕКС РЕСТИМУЛЯЦИИ

Максимальная хемилюминесценция после рестимуляции

По мнению рада авторов опсонический резерв сыворотки в фагоцитарных реакциях против стафилококка зависит от а. ипептидоглика-новых антител и способности пептидогликана активировать комплемент ( Л.В.Бояринова и соавт., 1983; РеЬегаоп, Поае^Ьа1 , 1982; УегЪгиеЬ оЪ а1., 1980). Однако вклад антител и комплемента в оп-сонизацию стафилококка и в усиление различных реакций фагоцитов расценивается неоднозначно. Мы исследовали взаимодействие нейтро-'Тилов с пептидогликаном золотистого стафилококка после его обработки ильной сывороткой и сывороткой, из которой избирательно удаляли антитела и/или блокировали активность комплемента. Результат оценивали по люминолзависимой хемилкшнесценции.

Опсонический рТфект цельной сыворотки проявлялся в усилении

с

(опсониэированннй пептидогликан - 11,2+1,4x10 , неопсонизирован-ный пептидогликан - 5,4+0,3x10^ имп/мин) и ускорении реакции (пик - иа Ю-15-й мин). Удаление антипептидогликановых антител снимало опсоническую активность сыворотки на 42,6?6 (7,5+1,6x10^ имл/мин) , а дополнительная инактивания комплемента (обработка ЭДГА ) - еде на 24,1% (5,2+1,1x10^ имп-мин)( рис.2). Это подтверк-дает данные о главенствугацей роли антител и комплемента в опсони-зации пептидогликанов, полученные ранее на других моделях (Л.В.Бо-яринова и соаат., 1903; Peteгaon еЬ п1.,1978; УвгЬгиеЬ ot а1., 1900). Снижение опсонической активности сыворотки, лишенной антител, после инактивации ко?/1племента показало, что подключение пептидогликана к комплемент-зависимому фагощтозу могло происходить без участия антител. Наиболее важным механизмом прямой ( антителонезависимой) активации комплемента принято считать его альтернативный каскад (Л.М.Вавилова, Т.В.Голосова, 1990). Вместе с тем, известны субстраты, которые вступают в прямое взаимодействие с С1-*акторой, имитируя классический путь активации

Рис.2. Опсоническая активность сыворотки, обработанной

в различных режимах, в реакциях нейтрон и лов с пепти-догликаном 3.aureus . I - цельная сыворотка; 2 - сыворотка после избирательного удаления антител (истощение пептидогликаном S.aureus: ЮОмкг/мл, О—4°С, 30 пин); 3 - истсценная сыворотка, обработанная 0,01 М ЭДГА или 0,01 М Мб -ЭГГА; 4 - истощенная сыворотка, прогретая при 5б°С 30 мин. Косая штриховка -опсоническая активность антител; вертикальная - опсоническая активность комплемента; сплошная - опсоническая активность тердолабильных комплементнезависи-мых опсонинов; горизонтальная - опсоническая активность тер.гостабильных комплементнезависимых опсонинов.

комплемента (Loos et al., I978J. Для разграничена реакций с пептидогликаном в .системах классического и альтернативного каскадов комплемента к сыворотке, лишенной антител, мы добавляли З.ДТА или Mg-ЗГТА. Близкие результаты, полученные в этих опытах,

с g

(5,2+0,6x10 и 5,îh0,5xX0 имп/мин, р>0,05), свидетельствуют о том, что активация комплемента происходила по классическому пути. Такая возможность отмечалась и друтоми авторами, работавшими с пепти^гликанами (Л.Б.Бояринова и ссавт., 1983; Kawasaki et al., 198?, Janusz et al., 1987).

После удаления антител и инактивации комплемента сыворотка сохраняла способность усиливать взаимодействие стафилококкового пептидогликана с нейтрогТилами (остаточная опсоническая активность -33,3;£). Это свидетельствовало о присутствии в ней дополнительных опсошнов, не связанных с антителами и комплементом. Их активность не зависела от присутствия двухвалентных катионов (сохранялась после обработки ЭДТА), только чась из них (13,796) отличалась термостабилыюстью, выдеркивая температурный режим инактивации комплемента (прогревание при 56°С). Природа этих факторов требует дальнейшего изучения, но, по крайней мере, часть из них нам удгшось связать с ¡Тибронектином: обработка ^ибронектином усиливала нейтроп7илстимулирукщие свойства пептидогликана золотистого стафилококка в 1,5 раза.

Способность антибактериальных антител ассистировать Фагоцитам во многом определяет устойчивость к гтиогенной инфекции и исход воспаления. Между тем опсонической характер!стике антител уделяется мало внимания, в основном учитываются их количествен-, ные параметры, которые не всегда отражают реальный вклад антител в эволюцию инфекционного процесса. Нами изучено содержание антипептидогликановых (5.aureus) антител, относящихся к разным классам иммуноглобулинов,в сравнении с их функциональной

(опсоничсской ) активностью у здоровых и больных с хирургмческой гнойной патологией. ибследовано 26 больных с посттравматическии остеошелитом (9 человек), абсцессом легкого( I),подпечепочным абсцессом ( I), эмпиемой плевры (2), внутрибршинным абсцессом (I), гнойным лимфаденитом (I), трофической язвой (I), послеоперационными (6) и посттравматическими (4) гнойными осложнениями. Продолжительность заболевания от 3 недель до 12 месяцев.

Результаты представлены на рис.3. Общее содержание антипеп-тидогликаноьых антител по данным иммун&Т.ерментпого анализа у больных (5,3+0,6) было достоверно выше, чем у здоровых (3,4+0,3 , р 0,Ой). Количество 1е<> -антиген в сыворотках больных (2,5+0,3) превышало соответствующий показатель у здоровых (1,7+0,3), различие средних величин достоверно по критерию

Р=0,95 и не достоверно по критерию Стыодента р>0,05 ). Содержание антител других классов (1еМ, 1еА) было практически одинаковым в сыворотках здоровых и больных (1еМ: 1,3+0,2 и 1,1+0,2 ; 1вА! 1,0+0,2 и 0,8+0,1 ; р>0,05). Опсоническая активность антител у больных колебалась от 0,1 до 3,8 , у здоровых - от 0 до 38,2. Среднее значение у больных было достоверно ниже, чем у здоровых, соответственно - 1,3+0,2 и 5,8+2,7 (р<0,С5). Таким образом, сниженная антителозавискная опсоническая активность сывороток больных сочетелась с более высоким содержанием в них 1б<5 -антител - основного источника комплемент-независимих антибактериальных опеонинов. Этот парадоксальный факт можно объяснить наличием сывороточных факторов, блокирующих опсонический эффект антител. Возможно, это были антитела, не обладавшие (или обладавшие слабой) опсонической активностью. Экранируя эпитопы пеп-тидогликана, они могли препятствовать Фиксации полноценных ( "сильных") опсошнов. Учитывая, что у большинства больных низ-

Рис.3. Опсоническая активность (А) и уровень антипептидо-гликановых (З.аигоиа) антител (Б ) р сыворотках здоровых С □ ) и больных с хирургической гнойной патологией ( ЕЯ ). В - уровень антител, относящихся к различим классам иммуноглобулинов.

Рисунок демонстрирует, что средний показатель опсонической активности был значительно выше в группе здоровых; напротив, общее содержание антител и их опсонически активной фракции было выше у больных шогенными инТекц^ями. Содержание 1еМ- и 1бА-антител в обеих группах было практически одинаковым.

кал опсоническая активность сочеталась с избирательным накоплением -антител без нарастания антител других классов, лоточно предположить, что роль блокирукщих факторов играла фракция Тдй- антител со слабой опсонической активностью. Такие антитела легко получить искусственным путем, разрушив Рс-грагмент пепсином. Такая обработка лишает антитела опсонических свойств (вследствие взаимодействия с го-рецепторами Фагоцитов) при сохранении их антигенсвязываюцей активности и основанных на ней серологических реакций ( А.Н.Маянский, Д.Н.Маянский, 1989). Нельзя исключить и другую возможность: у больных могли накапливаться факторы, блокирующие активность иммуноглобулинов на уровне взаимодействия с пептидогликаном (экранирование ?аЪ-Фрап.и,нта) или с фагоцитами ( блокада ?о-1рагмента . Появление агентов с подобной активностью при инфекционной патологми описано ъ литературе (А.Л.Кульберг, 1973). Б целом, следует признать, что персистент-ше очаш инфекции не обеспечивают- полноценной мобилизации эффек-торных ресурсов иммунитета, которые могли бы быть использованы для создания перевеса над микробнич патогеном в зоне гнойного воспаления. Это может быть связано с образованием "анткопсоничес-ких"факторов, оказывающих конкурентное действие в опсоно-Фагоии-тарных реакциях, либо с иммунологической инертностью процесса, который не возбуждает достаточного антителообразовадшп. В любом случав следует поставить вопрос о целесообразности воздействий, способных повысить опсонический резерв системы фагоцитоза. Сюда прежде всего следует отнести стимуляцию образования опсонически активных антител против патогенетически значимых бактерий.

Ключевым механизмом воспаления является взаимодействие .. :й-коцитоь с эндотелием. Известно, что продукты бактерий прямо или косвенно усиливают адгезию не"'тро'илов на эндотелиоцита , побут,-

дая их к миграции в очаг воспаления. Наиболее изучен в этом отношении липополисахаридннй эздагоксин грамотрицательнчх бактерий: он активирует эндотелиоциты, а с нейтропилаыи вступает в опосредованные реакции (Д.Н.Маянский, 1288). Учитывая важность проблемы, мы изучили влияние пептидогликанов стафилококка на адгезивный процесс в системе "нейтрофил - эндотелий". Пептидогликан золотистого стафилококка в концентрации 50 мкг/мл стимулировал адгезию. Значительное увеличение процента закрепившихся на эндотелии нейтросмлоь наблюдалось уже на Ь-й мин после добавления пеп-тидогликаьа ( опыт - 50,0+4,5 , контроль - 10,5+3,1 , р<0,0б) и нарастало в дальнейшем, составляя на 15-й мин 68,5+5,1 , а на 30-й мин - 79,0+11,036. В последующих опытах пользовались 15-минутной инкубацией.

Ряд экспериментов был посвящен определению клетки-мишени для пептидогликака в изучаемой системе. Обработка нейтратилов различными концентрациями пептидогликана приводила к усилению их адгезивных свойств, если количество препарата составляло 2 мгк/мл и более. Прединкубация эндотелия с пептидогликаном также усиливала прилипание к нему интактных нейтросфилов; эффект набладали, начиная с концентрации 10 мкг/мл. Основные результаты отражены на рис.4.

В серии опытов была сделана попытка оценить влияние секреторных продуктов эндотелиоцитов, подвергнутых контакту с пептидогликаном, на их адгезивные реакции с неГ<трО(|илами. Для этого эндотелий обрабатывали пептидогликаном (50 мкг/мл ) в течение Ь мин при 37°С, затем после трехкратного отмывания добавляли среду 199 и инкубировали 15 мин при 37°С. Супернатант тестировали в системе "интактные не«тро<Тилы - интактный эндотелий". Результаты опытов в 1,5 раза превышали значения контроля, которым служил супернатант из лунки с эндотелием, не подвергавшимся об-

Рис.4. Влияние пептидогликана золотистого стафилококка на адгезию гейтрофилов к эвдотелиальным клеткам.

По оси ординат - процент адгезированных нейтройилов. По оси абсцисс: I - контроль (адгезия без пептидогликана); 2 - адгезия нейтрофилов к эндотелию в присутствии пептидогликана: 3 - адгезия не!1,трофилов к эндотелию, предварительно обработанному пептидогли-каном: 4 - адгезия неЯтрофилов, предварительно обработанных пептидогликаном, к эндотелию. Концентрация пептидогликана - 50 мнг/мл.

работке пептидогликаном (7Г,Х+5,9 и 48,4+4,9%, р 0,05). Это означает, что под влиянием пептидогликана золотистого стафилококка эндотелиощты выделяли в среду вещества, повышающие адгезивность нойрофилов.

Полученные результаты показывают, что пептидогликан золотистого стафилококка усиливает адгезивные реакции в системе "нейт-рофи'л - эндотелий". Эффект зависит от дозы препарата и времени инкубв'"ти. Стимулиругацему воздействию подвержены как нейтроДилы, так и эндотелий, причем эндотелиоциты выделяю* факторы, способные усиливать прилипание к ним интактных нейтрофилов.

Активность пептидогликанов разных видов стафилококка (з.си-reus COM 885, ü.intermediua CCH 573.9, ¡3 hyicus s.s. hyicua CCM 2560, 3.hyicus chromogenes COM 5387; бшш выражена неодинаково. Наиболее сильным стимулятором адгезии нечтро<?илов на эндотелии был пептидогликан золотистого стафилококка ( Ы ,0+4,6?») , меньшей активностью обладал пептидогликан s.intermedius (29,1+3,(50. Пептидогликаны ■ S.hyicua а.а. hyicus, 3.hyicua cnro-mogenes вызывали слабое усиление реакции (24,1+2,2 и 22,!>+2,8%), близкое к показателям контроля (I9,0+3,2sS, р>0,05). Заметим, что в опытах по стимуляции хемилюминесценции нейтрофилов соотношение ме;кду активностью этих пептидогликанов было таким же: s.su-геиз обладал сильной активностью, s.intermedius - средней, а S.hyicus s.a. hyicus, S.hyicus chromogenes - слабой. Неодинаковая способность стимулировать адгезивные и кослородзависимые реакции нейтрофилов является аде одной иллюстрацией биологической неоднородности пептидогликанов. Стимуляция адгезивного процесса-дополняет спектр известных биологических эффектов пептидогликанов и макет рассматриваться как один из механизмов их флогоген-ности.

выводы

л. Пептидогликаны. ста'илбкокков стимулируют лгоминолзависимую хемилюминесценцш нейтрофилов человека. Этот признак неодинаково выракен у разных видов стафилококка и ие связан с антигенными и структурными особенностями их пептидогликанов. Из II изученных видов стафилококка наиболее активным стимулятором неРтро'илов был S.aureus.

2. По способности стимулировать нейтрофилы пептидогликан золотистого стафилококка значительно превосходит аналогичные препараты ¿.pyogenes и E.coli , но уступает пептидогликану B.bi-fidum.

3. Пептидогликаны стафилококков запускают хемилюминесценцию неТтрофилов, используя однотипные механизмы, которые отличаются от реакции, индуцируемой латексом через неспецифические (гидрофобные) контакты.

4. Обработка пептидогликйна золотистого стагилококка нормальной сывороткой человека'усиливает его способность стимулировать люминол зависимую хемилюминесценцию нейтрофилов; эффект проявляется в повышении интенсивности реакции и ее ускорении.

Б. Кроме антител и комплемента в спектре антипептидоглика-новых опсонинов обнаружены факторы, активность которых не зависит от двухвалентных катионов; некоторые из них выдерживают температурный режим инактивации комплемента. Часть антитело- и комплементнезависимых опсонинов представлена фибронектином.

6. Повышенное содержание антипептидогликановых lGG-антител у больных с хирургической гнойной патологией сочетается с относительно низким уровнем антителозависимой опсонической активности сывороток, что мояет быть связано с накоплением функционально неполноценных igG-антител, блокирующих опсонические реакции.

7. Пептидогликаны стафилококков усиливают адгезивш'ч реакции в системе "нейтро.сил - эндотелий", стимулируя нейтроТилы и эндо-телиоциты. Активность пептидогликанов разных видов-стафилококка выражена неодинаково.

СПИСОК РАБОГ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТШЁ деСЕРГАЦИИ.

1. Иммунологаческая и функциональная характеристика антител человека к бактериальным пептидогликанам/ А.Н.Маянский, Д.Г.Астафьев, Ю.Б.Лебедева, И.В.Маянская, Л.А.Малкина, Л.В.Гуревич// Актуальные вопросы теоретической и прикладной иммунологии. Механизмы противоин^екционного иммунитета: Тез. докл. I Всесоюзной кон<тер.-М. ,1987.-С.76-77.

2. Ендозые и штамиовые особенности стафилококков в системе опсоно - Фагоцитарных реакций/ А.И.Маянский, Т.и.Кошатина, Ю.В.Лебедева, А.Л.Невмятуллин// Актуальные вопросы клинической микробиологии в неинфеквдонной клинике: Тез. докл. II Всесоюзной конференции.1988.-С.200-210.

3. Реактивная хемилюминесценция как способ функционального зондирования не!;тро^илов в клинике и эксперименте/ А.Н.Маявский, ЮЛ).Лебедева, И.ЬЛаянская, А.Л.Невмятуллин и др.//£акторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях: Тез. докл. IX мездшстигутской кон-сТер., Челябинск, 1983.-С.;10ч?2.

4. Лебедева К.Е. Неоднородность пептидогликанов различных видов ста илококка в реакжях индуцироьанной хемилюминесценции неГ'троТилов// Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различшх Физиологический и патологических состояниях: Тез. докл. IX ме.шнститутской контер.,Челябинск, I988.-C.75.

5. Лебедева Ю.В. Опсошн-заЕисимая хешлюминесценцня нейтро-

Филов в системах с пептидогликаном золотистого стафилококка// Тез. докл.УШ науч. конф. молодых ученых Волго-Вятского региона, Горький, 1989.-С.1Ев-159.

6. Лебедева C.B. Нейтрофилстимулируыцие свойства пептидо-гликанов различных видов стафилококка// Экспериментальная клиническая иммунология и аллергология: межвузов, сб. науч. тр.-Чебоксары,1989.-С.69-74.

7. Сравнительная характеристика пептидогликанов бифидобак-терий и ста-^илококков/ Н.И.Сибирякова, Ю.В.Фокина, Г.И.Гончарова, Е.А.Якимычева// Моделирование и клиническая характеристика фагоцитарных реакций: Респ. сб. науч. тр.-Горький, 1989.-С.69-74. '

8. Лебедева Ю.В. Реактивность нейтралов к пептидогликану золотистого стайилококка в системе опсонической кооперации// Моделирование и клиническая характеристика фагоцитарных реакций: Респ. сб. науч. тр.-Горький, 1989.-С.64-69.

9. Лебедева Ю.В., Астафьев Д.Г., Маянский А.Н. Реактивность нейтрофилов в системах с пептидогликанавд различных видов ставило-кокка// Журн. микробиол. эпидешол, и инмунобиол.-1989,- № 6,-

С.57-60.

10. Предупреждение осложнений у новорожденных детей с остры-1 ми респираторными вГгнойно-воспалительными заболеваниями/ А.Н.На-янский, И.Г.Шиленок, В.А.Воробьева, Е.А.Азова, Д.Г.Астафьев, А.П.Разживин, Н.И.Сибирякова, Ю.В.Фокина и дрЛ Методические рекомендации .-М-во здравоохранения РСФСР.-Горький,1989.-14с.

11. A.c. 1666372 СССР. МНИ G Ol H 33/543. Способ определения рецепторов нейтрофилов человека/ А.Н.Маянский, И.В.Чеботарь, Ю.В.Лебедева, А.Л.Невмятуллин, Н.И.Сибирякова, Т.М.Конышкина// Публ. 23.10.91. Еюл. № 39.