Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика Staphylococcus aureus, выделенных от бактерионосителей, и разработка способа их санации

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Характеристика Staphylococcus aureus, выделенных от бактерионосителей, и разработка способа их санации"

005535437 На пРавах рукописи

Зверев Александр Федорович

ХАРАКТЕРИСТИКА $ТАРНУ№СОССШ АІШЕШ, ВЬЩЕЛЕННЫХ ОТ БАКТЕРИОНОСИТЕЛЕЙ И РАЗРАБОТКА СПОСОБА ИХ САНАЦИИ

03.02.03 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 4 ОКТ 2013

Оренбург-2013

005535437

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном учреждении науки «Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза» Уральского отделения Российской академии наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук ФГБУН «Институт клеточного и внутрикле точного симбиоза УрО РАН» Научный консультант: Заслуженный работник высшей школы РФ, доктор медицинских наук, профессор ГБОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия» Минздрава России

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор ГБОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия» Минздрава России

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет»

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «14 » ноября 2013 г. часов на заседании диссертационного совета Д 208.066.03 при Оренбургской государственной медицинской академии по адресу: Россия, 460000, г. Оренбург, ул.Советская, д.6, конференц-зал (к.205), телефон (3532) 40-35-62, факс (3532) 77-24-59, e-mail: org-ma_dsl@esso.ru, официальный сайт: http://orgma.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ОрГМА.

Автореферат

разослан 2013 г., автореферат и текст

объявления размещены на официальном сайте ВАК Министерства образования и науки РФ в сети интернет.

Карташова Ольга Львовна

Сетко Нина Павловна

Чайникова Ирина Николаевна

Габидуллин Зайнулла Гайнулинович

Ученый секретарь диссертационного совета д.м.н., профессор

Немцева Наталия Вячеславовна

ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы

Проблема стафилококкового бактерионосительства сохраняет свою актуальность, поскольку бактерионосители являются источниками эпидемиологической опасности. В то же время важное клиническое значение стафилококкового бактерионосительства определяется типичностью процесса транслокации стафилококков со слизистых оболочек во внутреннюю среду организма-хозяина с развитием широкого спектра заболеваний (Wertheim H.F. et al., 2005; van Rijen M.M., Kluytmans J.A., 2008). Условия формирования резидентного бактерионосительства связаны с наличием у резидентной стафилококковой микрофлоры особых свойств, обеспечивающих ее адаптацию к условиям, складывающимся на слизистой оболочке передних отделов носовых ходов, и таким образом, ответственных за длительное сохранение микроорганизма в данной экологической нише. Так, среди штаммов S. aureus, выделенных от резидентных бактерионосителей, установлена высокая частота встречаемости антагонистической активности в отношении широкого круга микроорганизмов (кори-небактерий, микрококков и др.), являющихся представителями нормальной микрофлоры верхних дыхательных путей (Дерябин Д.Г., 2000). Показано, что у постоянных носителей резидентного типа происходит накопление наиболее вирулентных и резистентных к антибиотикам стафилококков (Терновская Л.Н., 1983; Эрдынеева B.C., 2011), а также обладающих способностью к инактивации факторов естественной резистентности с высокими значениями признаков (Блиндер Е.А., 2005; Карташова ОЛ. с соавт., 2009).

Многочисленными исследованиями показано, что техногенные факторы внешней среды, модифицируя свойства стафилококков, способствуют формированию состояния бактерионосительства и развитию инфекционно-воспалительных заболеваний (Даутов Ф.Ф. с соавт., 2007; Атаниязова P.A., 2008; Ковальчук И.Ю., 2009; Ефимова Н.В. с соавт., 2011).

В связи с этим, научный интерес представляет изучение биологических, в том числе персистентных свойств у стафилококков, выделенных от резидент-

ных и транзиторных бактерионосителей, а также бактерионосителей, проживающих на территориях с разным уровнем антропогенного загрязнения, что позволит разработать способы борьбы с бактерионосительством.

Целью настоящей работы явилось изучение биологических свойств стафилококков, выделенных со слизистой оболочки переднего отдела носа бактерионосителей разных типов, с разработкой способа их санации.

Для достижения цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Изучить биологические свойства стафилококков (антикарнозиновая, антилактоферриновая, slgA- протеазная активность) и местный иммунитет у бактерионосителей разных типов.

2. Исследовать биологические свойства S. aureus, выделенных от бактерионосителей, проживающих на территориях с разным уровнем антропогенного загрязнения воздушной среды, и провести их сравнительный анализ.

3. Разработать способ санации резидентных бактерионосителей циклофе-роном и оценить его эффективность.

Научная новизна

Проведенные исследования позволили установить, что золотистые стафилококки, выделенные у резидентных бактерионосителей, характеризуются высокой экспрессией свойств, направленных на инактивацию защитных факторов барьерного эпителия слизистых переднего отдела носа (карнозина, лактофер-рина, slgA), которые могут служить критериями эпидемиологической опасности.

Выявлена прямая зависимость между уровнем антилактоферриновой и sl-gA-протеазной активностей стафилококков и содержанием лактоферрина и slgA в назальном секрете резидентных бактерионосителей. Научно обоснованы особенности патогенеза резидентного бактерионосительства на модельных системах «лактоферрин хозяина — антилактоферриновая активность стафилококков» и «slgA хозяина - sIgA-протеазная активность стафилококков».

Установлено, что у бактерионосителей, проживающих на территориях с высоким уровнем антропогенного загрязнения воздушной среды, отмечается

повышение уровня микробной обсемененности слизистой оболочки передних отделов носа золотистыми стафилококками, обладающими выраженной анти-карнозиновой активностью и способностью к образованию биопленок.

Экспериментально установлена оптимальная длительность проведения санации резидентных стафилококковых бактерионосителей циклофероном. Выявлены особенности санации лиц, проживающих на территориях с высоким уровнем загрязнения воздушной среды, характеризующиеся подавлением у золотистых стафилококков способности к инактивации карнозина и появлением симбионтов в составе микрофлоры носовых ходов. С использованием метода атомно-силовой микроскопии впервые визуализированы результаты воздействия циклоферона на поверхностные структуры клеток S. aureus, выявлено значительное увеличение шероховатости их поверхности и изменение морфологии, что позволяет констатировать нарушение барьерных функций клеточной стенки золотистых стафилококков.

Практическая значимость

В результате исследования получены новые данные, расширяющие представление о роли факторов персистенции стафилококков в формировании бактерионосительства.

Свойства стафилококков, направленные на инактивацию факторов естественной резистентности хозяина, и, особенно их комбинация, могут быть использованы как эпидемиологические маркеры стафилококков, выделенных от резидентных бактерионосителей.

На основе полученных экспериментально-лабораторных данных разработан способ санации циклофероном стафилококковых бактерионосителей под контролем антикарнозиновой активности стафилококков (Патент РФ на изобретение № 2441656), позволяющий санировать стафилококковых бактерионосителей, проживающих на территориях с высоким уровнем загрязнения воздушной среды. Материалы работы использованы при составлении информационно-методического письма «Диагностика и санация стафилококковых бакте-

рионосителей», утвержденного Министерством здравоохранения Оренбургской области.

Положения, выносимые на защиту

1. Формирование резидентного бактерионосительства характеризуется изменением состояния систем «лакгоферрин - антилактоферриновая активность», «51{»А - бГцА- протеазная активность»: одновременным увеличением содержания в назальном секрете лактоферрина и секреторного ^ А, а также значений антилактоферриновой и 81|»А- протеазной активности золотистых стафилококков.

2. У резидентных стафилококковых бактерионосителей, проживающих в условиях повышенного уровня загрязнения воздушной среды, отмечается высокая микробная обсемененность слизистой оболочки переднего отдела носа золотистыми стафилококками с выраженной антикарнозиновой активностью и способностью к образованию биопленок.

3. Основу эффективной санации резидентных стафилококковых бактерионосителей, проживающих на территориях с высоким уровнем загрязнения воздушной среды, составляет использование циклоферона, подавляющего пер-систентный потенциал золотистых стафилококков и способствующего нормализации состояния микробного биоценоза.

Апробация работы. Материалы работы были доложены и обсуждены на: пленуме Научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды РАМН и Минздравсоцразвития России по проблеме: «Методологические проблемы изучения, оценки и регламентирования биологических факторов в гигиене окружающей среды» (Москва, 2009); IX Российской конференции иммунологов Урала (Челябинск, 2011); П международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Фундаментальные и прикладные исследования в биологии» (Донецк, 2011); X научной сессии молодых ученых и студентов «Современное решение актуальных научных проблем в медицине» (Нижний Новгород, 2011); VII Всероссийской конференции «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 4 публикации в журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ, получен патент на изобретение РФ № 2441656 от 10 февраля 2012 года.

Объем и структура диссертационной работы

Текст диссертации изложен на 142 страницах машинописи, содержит введение, 6 глав, заключение, выводы, указатель литературы, включающий 127 отечественных и 85 иностранных источников. Текст иллюстрирован 19 рисунками и 11 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Для изучения биологических свойств стафилококков и местного иммунитета при стафилококковом бактерионосительстве было обследовано 67 здоровых лиц (студенты 3 курса Оренбургской государственной медицинской академии). Дифференциация типов носительства проводилась по Чистовичу Г.Н. (1969) и включала сопоставление видовых и типовых характеристик культур, выделенных трехкратно от одного лица с интервалом 10 суток. В результате обследования выявлены: 22 бактерионосителя S. aureus резидентного типа, 24 бактерионосителя S. aureus транзиторного типа и 21 не носитель S. aureus (трехкратно выделялся Staphylococcus epidermidis).

Для изучения биологических свойств стафилококков, выделенных у детей 9-12 лет, проживающих на территориях с разным уровнем антропогенной нагрузки, на стафилококковое бактерионосительство трехкратно было обследовано 109 детей, проживающих в селе Шарлык Шарлыкского района Оренбургской области (учащиеся СОШ № 2) и 101 ребенок, проживающий в городе Но-вотроицке Оренбургской области (учащиеся СОШ № 16).

Анализ загрязнения атмосферного воздуха проведён в соответствии с ГОСТом 17.2.3.01-86 и РД 52.04.186-89 на содержание пыли, диоксида азота, диоксида серы, оксида углерода, формальдегида, а также металлов: никеля, цинка, меди, марганца и др. Оценка риска воздействия на здоровье детского на-

селения - на основе «Руководства по оценке риска для здоровья населения при воздействии химических веществ, загрязняющих окружающую среду» Р 2.1.10.1920-04, а также методического пособия «Окружающая среда. Оценка риска для здоровья. Основные элементы методологии» (М., 1998).

Материалом для исследования послужили штаммы стафилококков, выделенные от описанных выше лиц. Выделение и идентификацию стафилококков до вида проводили в соответствии с «Унифицированными методами лабораторной диагностики инфекционных заболеваний» (Приказ МЗ СССР №535), а также с использованием тест-систем фирмы «Lachema» (Чехия). Выделение клонов осуществляли путем рассева суточной бульонной культуры золотистого стафилококка на плотную питательную среду в соответствии с указаниями Дж. Миллера (1976).

У всех выделенных штаммов определяли факторы вирулентности и пер-систенции: способность коагулировать плазму, проявлять лецитовителлазную и гемолитическую активность по Биргер М.О. (1982), антикарнозиновую, анти-лактоферриновую и sIgA-протеазную активности по Бухарину О.В. с соавт. (1999,2005).

Образование биопленок стафилококками оценивали по степени связывания ими кристаллического фиолетового в стерильных 96-луночных полистироловых планшетах (О'Toole G., 2000).

Чувствительность стафилококков к антибиотикам определяли диско-диффузионным методом согласно Инструкции научно-исследовательского центра фармакотерапии (2004).

Генотипирование 24 штаммов золотистых стафилококков, выделенных от резидентных и транзиторных бактерионосителей, проживающих на территориях с разным уровнем антропогенной нагрузки, проводили методом RAPD-ПЦР со случайным олигонуклотидным праймером размером 10 нуклеотидов (Shot 1). У этих же штаммов определяли гены патогенности: pvl-f, sec 3, clfA, clfB, arg, mec А с помощью метода полимеразной цепной реакции.

Концентрации лактоферрина и slgA в назальном секрете определяли им-муноферментным анализом с использованием реагентов ЗАО «Вектор - Бест» (для лактоферрина) и «Хема-медика» (для slgA) в соответствии с инструкциями по их использованию, результаты регистрировали на фотометре Multiskan MS (Labsystems, Финляндия).

Для изучения влияния циклоферона на персистентные свойства стафилококков был использован его раствор для внутривенного введения (Циклофе-рон®, ООО «Наука» - технологическая фармакологическая фирма «ПОПИСАН», Санкт-Петербург).

Экспериментальное изучение влияния препарата на антикарнозиновую активность стафилококков и их способность к образованию биопленок проводили на 12 клонах S. aureus, выделенного со слизистой оболочки переднего отдела носа резидентного бактерионосителя. Обработанные циклофероном стафилококки исследовали методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) в контактном режиме с использованием сканирующего зондового микроскопа SMM-2000 (ЗАО «ПРОТОН-МИЭТ», Россия).

Для отработки режима санации трехкратно в течение месяца с интервалом в 10 дней на стафилококковое бактерионосительство было обследовано 80 детей в возрасте 8-12 лет, проживающих в селе Нежинка Оренбургского района Оренбургской области (учащиеся УМО «Нежинский лицей»), и сформирована группа резидентных бактерионосителей из 26 человек, которые были санированы циклофероном в течение 10 дней с ежедневным бактериологическим контролем с определением вида микроорганизма и персистентных свойств у выделенных золотистых стафилококков для отработки режима санации.

Достоверность различий сравниваемых показателей оценивали по t-критерию Стьюдента (Лакин Г.Ф., 1990).

Результаты исследования и их обсуждение

Для выяснения природы бактерионосительства необходимо понимание патогенетических условий формирования именно его резидентного (персисти-рующего) варианта. При этом принципиальный подход к решению данного во-

проса базировался на предположении о наличии у резидентной стафилококковой микрофлоры особых свойств, обеспечивающих ее адаптацию к условиям, складывающимся на слизистой оболочке передних отделов носовых ходов, и таким образом, ответственных за длительное сохранение микроорганизма в данной экологической нише.

Среди факторов, определяющих колонизационную резистентность слизистой верхних дыхательных путей, важное значение имеют железосвязывающий белок - лактоферрин, секреторный иммуноглобулин А (51{*А) и карнозин. Проведенные нами исследования позволили выявить широкую распространенность и высокие значения у стафилококков, выделенных со слизистой оболочки носа от резидентных бактерионосителей, способности к инактивации карнозина, лактоферрина и, несколько в меньшей степени, секреторного иммуноглобулина А (табл.1).

Таблица 1

Показатели персистентиых характеристик у золотистых

стафилококков, выделенных от бактерионосителей _разного типа _

Показатели Резидентные бактерионосители Транзиторные бактерионосители

Наличие признака, % Антилактоферриновая активность

81,8±8,4 33,3±9,8

Среднее значение, нг/мл 703,0±63,0 443,0±26,0

Наличие признака, % $/#/4 - протеазная активность

40,9±10,7 12,5±6,9

Среднее значение, мкг/мл 0,26±0,05 0,12±0,02

Наличие признака, % Антикарнозиновая активность

100 80,4±8,4

Среднее значение, мг/мл 2,8±0,2 1,8±0,12

Анализ частоты встречаемости комбинации исследуемых признаков у но-сительских штаммов золотистого стафилококка показал, что изоляты от резидентных бактерионосителей, обладающие комбинацией АКрА, АЛфА и slgA-протеазной активности, регистрировались в 36,4% случаев, тогда как среди 24 штаммов S. aureus, выделенных от транзиторных бактерионосителей, ни один не обладал комбинацией данных свойств. Напротив, у транзиторных бактерионосителей 54,2% выделенных штаммов не имели изученных признаков, а у резидентных бактерионосителей - лишь 13,6% изолятов. Наличие комплекса факторов персистенции у штаммов, выделенных от резидентных бактерионосителей, в отличие от штаммов, выделенных от транзиторных бактерионосителей, может служить критерием их эпидемиологической опасности.

Исследование частоты встречаемости штаммов стафилококков с различным уровнем выраженности АЛфА и sIgA-протеазной активности показало, что 27,8% штаммов, выделенных от резидентных бактерионосителей, имели значения АЛфА более 900 нг/мл, среди штаммов от транзиторных бактерионосителей подобные изоляты отсутствовали. Аналогичная закономерность была выявлена и для sIgA-протеазной активности: 55,6% штаммов от резидентных бактерионосителей были способны инактивировать 0,2- 0,4 мкг/мл секреторного иммуноглобулина А, в то время как все штаммы от транзиторных бактерионосителей характеризовались sIgA-протеазной активностью, не превышающей 0,2 мкг/мл. Присутствие штаммов S. aureus с комплексом факторов персистенции с высокими значениями признаков у резидентных бактерионосителей существенно снижает колонизационную резистентность их слизистой оболочки носа и приводит к длительной персистенции S. aureus.

Полученные результаты, отражающие доминирование у резидентных бактерионосителей штаммов S. aureus с высоким уровнем АЛфА, slgA - проте-азной и антикарнозиновой активностей, свидетельствуют об их участии в механизмах выживания на слизистых верхних дыхательных путей, что проявляется в длительном бактериовыделении, и согласуются с аналогичными результата-

ми, полученными ранее для антилизоцимной и антиинтерфероновой активностей микроорганизмов (У свяцов Б Л. с соавт., 1994).

Однако формирование бактерионосительства определяется не только свойствами патогена, но и уровнем защищенности от него организма хозяина (Бухарин О.В., 1999). Среди факторов, определяющих колонизационную резистентность слизистой верхних дыхательных путей, несомненное значение имеют железосвязывающий белок - лактоферрин и секреторный иммуноглобулин A (slgA) (Farnaud S., Evans R.W., 2003; Rey J. et al., 2004). Лактоферрин (ЛФ) -железосвязывающий гликопротеин из семейства трансферринов, оказывающий бактерицидное и бактериостатическое действие на микроорганизмы, содержится в назальном секрете (Канышкова Т.Г. с соавт., 2001; Legrand D. et al., 2005). slgA - основной компонент секрета слизистой носа, предотвращающий адгезию патогенов к поверхности слизистой.

Сравнительный анализ концентраций указанных белков у резидентных и транзиторных бактерионосителей S. aureus показал наличие существенных различий: концентрация лактоферрина в назальном секрете резидентных бактерионосителей достоверно превышала его количественные значения у транзиторных бактерионосителей (2850±297; 2162±94 нг/мл, соответственно р<0,05). Аналогичная закономерность отмечена и для отличий в содержании slgA (58,9±4,16; 41,4±3,66 мкг/мл, соответственно р<0,001). Таким образом, формирование резидентного носительства золотистого стафилококка сопровождается повышенным содержанием в назальном секрете лактоферрина и секреторного

IgA.

При изучении взаимосвязи выраженности биологических свойств стафилококков с содержанием лактоферрина и секреторного IgA в назальном секрете при разных типах бактерионосительства, было установлено преобладание стафилококков, способных инактивировать факторы естественной резистентности при резидентном бактерионосительстве, и выявлена прямая зависимость между уровнем антилактоферриновой активности стафилококков с содержани-

ем лактоферрина в назальном секрете хозяина и sIgA-протеазной активности стафилококков и slgA хозяина.

Полученные данные раскрывают одну из особенностей патогенеза резидентного бактерионосительства на модельных системах «лакггоферрин хозяина - антилактоферриновая активность стафилококков» и «slgA хозяина - slgA-протеазная активность стафилококков».

Известно, что уровень антропогенной нагрузки, в первую очередь, отражается на заболеваемости органов дыхания у детей. Установлена корреляционная зависимость уровня аллергической и инфекционно-воспалительной заболеваемости органов дыхания от степени загрязнения воздушной среды (Даутов Ф.Ф. с соавт., 2007).

Установлено, что одним из этиологических факторов, влияющих на развитие аллергических заболеваний респираторного тракта, являются стафилококки (Таточенко В.К., 1987). Выявлена связь между экологическим неблагополучием территории проживания и изменением биологических свойств микрофлоры организма человека, что приводит к формированию стафилококкового бактерионосительства и других форм инфекционного процесса, в частности, к возникновению болезней органов дыхания (Бухарин О.В., 1997), профилактика развития которых является актуальной проблемой.

Проведенный анализ распространенности заболеваемости детского населения болезнями органов дыхания за 2008-2011 годы по официальным статистическим данным в административных зонах Оренбургской области на урбанизированных и сельских территориях позволил выявить высокую общую заболеваемость среди детей, проживающих на урбанизированных территориях по сравнению с сельскими территориями (Западная, Центральная, Восточная зоны).

Так, общая заболеваемость болезнями органов дыхания детей, проживающих в городах, оказалась в 1,5 раза выше, чем детей, проживающих в сельской местности (1373,5±123,52 и 878,4±46,4, соответственно), самый высокий уровень зарегистрирован в г. Новотроицке (1778,9±159,6), самый низкий в -

Центральной зоне (788,2±23,2) (р<0,01). На основании данного анализа дальнейшие исследования были проведены в двух населенных пунктах: г. Новотро-ицке и с. Шарлык (Центральная зона) и показано, что в атмосферном воздухе г. Новотроицка установлено превышение ПДК диоксида азота в 1,74 раза, взвешенных веществ в 1,45 раза, фенола в 1,76 раза, бенз(а)пирена в 1,6 раза, аммиака в 1,89 раза, в атмосферном воздухе с. Шарлык среди всех выявленных загрязнителей превышение в 1,6 раза ПДК было лишь по оксиду углерода.

С целью раннего определения негативного действия выбросов промышленных предприятий и объектов сельского хозяйства проведена оценка риска влияния загрязнения атмосферного воздуха г. Новотроицка на здоровье детского населения. Анализ полученных данных свидетельствует о том, что на его территории наибольший вклад в развитие неонкологических заболеваний, исходя из расчетных суммарных индексов опасности, вносят следующие специфические химические вещества: диоксид азота, фенол, медь. Из неспецифических загрязнителей атмосферного воздуха превышение референтных (безопасных) уровней воздействия выявлено для ТБР (сумма взвешенных веществ). Учитывая, что отдельные ксенобиотики имеют общие системы и органы-мишени, были рассчитаны индексы неканцерогенной опасности в г. Новотроиц-ке. Показано, что наибольшему риску подвержены органы дыхания с превышением приемлемого уровня в 22,6 раза. Установлено, что рост случаев заболеваний нижних дыхательных путей и появления симптомов со стороны верхних дыхательных путей за счет повышенной концентрации диоксида азота в атмосферном воздухе составляет 8 случаев на 100 детей.

Далее были изучены микробная обсемененность слизистой оболочки бактерионосителей, видовой состав и биологические свойства стафилококков, выделенных у детей, проживающих в населенных пунктах с разной антропогенной нагрузкой.

Микробная обсемененность золотистыми стафилококками слизистой оболочки переднего отдела носа обследованных лиц в Новотроицке была выше,

и у 41,2% бактерионосителей составляла 5*107 КОЕ/мл; тогда как у детей, проживающих в Шарлыке, не превышала 5*10 КОЕ/мл.

При изучении видового состава стафилококков, вегетирующих на слизистой оболочке переднего отдела носа у лиц, проживающих на данных территориях, было установлено, что штаммы золотистых стафилококков резидентного типа в Новотроицке изолировали в 21,8% случаев, в Шарлыке в 12,6%, напротив, у лиц, проживающих в Шарлыке, чаще выделяли коагулазоотрицательные стафилококки (в 58,3% и 34,7% случаев). У детей, проживающих в Новотроицке, на слизистой оболочке переднего отдела носа в 22,8% случаев, наряду с КОС вегетировали S. aureus, в Шарлыке таких лиц было в 2,6 раз меньше (8,8%). Число транзиторных бактерионосителей достоверно не различалось (10,9% и 13,6%).

Сравнительная характеристика биологических свойств изученных штаммов стафилококков, представлена на рисунке 1.

Штаммы золотистых стафилококков, выделенные как у резидентных, так и у транзиторных бактерионосителей в Новотроицке, чаще обладали антикар-нозиновой активностью и способностью образовывать биопленки, чем штаммы, выделенные в Шарлыке, за исключением антикарнозиновой активности стафилококков, выделенных от резидентных бактерионосителей. При изучении выраженности биологических свойств S. aureus, выделенных со слизистой оболочки носа детей, проживающих на территориях с разным уровнем антропогенной нагрузки, отмечались более высокие значения признаков у резидентных бактерионосителей в Новотроицке.

Проведенная сравнительная характеристика антибиотикочувствительно-сти штаммов стафилококков, выделенных от бактерионосителей, проживающих в двух населенных пунктах, отличающихся уровнем антропогенной нагрузки, позволила отметить наличие большего числа резистентных к антибиотикам ш А нов, выделенных от бактерионосителей резидентного типа, проживающих в Новотроицке.

I Шарлык □ Новотроицк

Б У-е.

мг/мл

■ Шарлык □ Новотроицк

Примечание: * - р<0,05 (в Шарлыке по сравнению с Новотроицком) Рис.1. Распространенность (А) и выраженность (Б) биологических свойств S. aureus, выделенных со слизистой оболочки носа детей, проживающих на территориях с разным уровнем антропогенной нагрузки

Генотипирование выделенных золотистых стафилококков показало наличие практически у всех штаммов гена-регулятора agr, гена clfA, кодирующего связывание фибриногена, гена clfB, кодирующего адгезию к слизистой оболочке, у ряда штаммов - генов, кодирующие факторы патогенности и отсутствие у всех изученных стафилококков генов метициллинрезистентности.

Ранее установлена связь между экологическим неблагополучием территории проживания и изменением биологических свойств микрофлоры организма человека, что приводит к формированию стафилококкового бактерионосительства и других форм инфекционного процесса, в частности, возникновению болезней органов дыхания (Бухарин О.В., 1997).

Своевременная санация этих лиц может способствовать профилактике развития экологически обусловленных заболеваний.

В качестве предполагаемого препарата для санации резидентных стафилококковых бактерионосителей нами был выбран препарат циклоферон, который, как известно, стимулирует иммунитет и естественную колонизационную резистентность слизистых оболочек макроорганизма и снижает способность микроорганизмов к инактивации комплемента (Высочина И.Л., 2005; Кириллов Д.А., 2005; Потехина Л.П., 2010).

Популяционная структура исходной культуры S. aureus по АКрА была представлена клонами с разной выраженностью признака: 67% обладали высокой АКрА (2,0-3,0 мг/мл), по 16,5% - средней активностью (1,0-1,9 мг/мл) и нулевой. Среднепопуляционный уровень АКрА составлял 2,03±0,26 мг/мл.

Под действием циююферона после первого соинкубирования доля клонов S. aureus с высокой АКрА составила 100%, после второго - 50% с высокой и 50% со средней АКрА. Среднепопуляционный уровень признака был равен 2,62±0,16 мг/мл и 2,05±0,94 мг/мл, соответственно. На третий день эксперимента отмечено также 50% клонов с высокой АКрА и появление клонов с низкой (0,1-0,9 мг/мл) и нулевой активностью (8% и 42% соответственно), а средний уровень продукции ингибиторов карнозина снизился до 1,44±0,26 мг/мл. Далее (четвертый день эксперимента) возросло число клонов с высокой (67%) и низ-

кой (17%) АКрА, а также до 8% уменьшилось количество клонов с нулевой активностью и появилось 8% клонов со средней АКрА, что сопровождалось повышением значения среднепопуляционной антикарнозивой активности стафилококков до 2,2±0,26 мг/мл. После пятого соинкубирования, наряду с клонами, обладающими высокой АКрА (59%), появилась доля клонов со средней способностью к инактивации карнозина (8%), а уровень клонов, не обладающих признаком, увеличился до 33%; далее (шестой день эксперимента) было зарегистрировано такое же количество клонов с высокой АКрА (58%) и 42% клонов без признака. Средний уровень АКрА в популяции составил 1,75±0,26 мг/мл и 1,7±0,26 мг/мл соответственно. На седьмой день эксперимента отмечено нарастание доли клонов без АКрА (76%), 8% составляли клоны со средним и 16% с низким уровнем активности, а среднее значение антикарнозиновой активности в популяции снизилось до 0,195±0,12 мг/мл. Соинкубирование клонов стафилококков с циклофероном на 8, 9, и 10 дни эксперимента не изменяло полученные на 7 день эксперимента результаты. Аналогичная тенденция прослеживались при влиянии циклоферона на способность стафилококков формировать биопленки.

Для подтверждения полученных данных о возможности использования циклоферона в качестве препарата для санации бактерионосителей, нами была проведена апробация в течение 7 дней под контролем антикарнозиновой активности выделенных штаммов. Установлено, что в процессе санации, наряду с восстановлением микробиоценоза, заключающегося в появлении на слизистой носовых ходов представителей нормальной микрофлоры (коагулазонегативные стафилококки), снижается обсемененность слизистых оболочек S. aureus. После седьмого дня санации отмечено наименьшее число бактерионосителей золотистых стафилококков (19,0%) и максимальное - коагулазонегативных стафилококков (57,1%), одновременно S. aureus и CNS высевали у 23,8% санированных детей.

Установлено снижение антикарнозиновой активности у 90,9% выделенных штаммов S. aureus по сравнению с исходным уровнем признака (до санации) с 1,8 мг/мл до 0,9 мг/мл.

Таким образом, проведенные экспериментально-клинические исследования по снижению персистентных характеристик стафилококковой микрофлоры, вероятно, можно рассматривать в качестве возможного механизма положительного эффекта воздействия циклоферона на организм хозяина.

Далее мы изучили особенности морфо-функциональной реакции S. aureus на воздействие циклоферона, с помощью атомно-силовой микроскопии (рис. 2).

Ш

ШШШ ■ шш ляг *, ••••

Рис. 2. АСМ-изображения интактных стафилококков (а, в); после инкубации с циклофероном (б, г)

Оценивали количественно основные морфологические параметры бактерий: длину, ширину, высоту клеток, а также рассчитанный на этой основе объем бактерий. Проведенная визуализация контрольных образцов S. aureus показала, что интактные бактериальные клетки имеют овоидную форму со средними значениями, представленными в таблице 2.

Таблица 2

Морфологические параметры S. aureus до и после воздействия цик-лоферона в терапевтических концентрациях

Группы Морфологические параметры S. aureus

Длина (мкм) Ширина (мкм) Высота (мкм) Rq (нм)

Интактные S. aureus 0,64±0,09 0,88±0,10 0,64±0,05 2,46±0,72

S. aureus после воздействия циклоферона 0,79±0,10 0,81±0,10 0,72±0,02* 3,8±0,27*

Примечание: ^.среднеквадратичная шероховатость поверхности клетки; * - р <0,05 (критерий Вилкоксона) Культивирование S. aureus в присутствии терапевтических концентраций циклоферона (50 мг/мл) выявило значительное увеличение шероховатости поверхности бактериальных клеток и изменение их морфологии, что позволяет констатировать нарушение барьерных функций клеточной стенки S. aureus под воздействием циклоферона.

С целью проверки возможности проведения санации циклофероном резидентных бактерионосителей, проживающих в условиях антропогенной нагрузки, нами были санированы резидентные бактерионосители, проживающие в Новотроицке и Шарлыке.

Проведенная санация характеризовалась преимущественной элиминацией золотистых стафилококков, снижением микробной обсемененности слизистой оболочки этим микроорганизмом и антикарнозиновой активности стафилококков у лиц, проживающих на экологически благополучной территории. Выявлены особенности санации циклофероном резидентных бактерионосителей, проживающих на территории с высоким уровнем загрязнения воздушной среды, заключающиеся в появлении коагулазоотрицательных стафилококков в составе

микрофлоры носовых ходов и снижении у S. aureus способности к инактивации карнозина (рис. 3).

%

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

Элиминация Снижение обсемененности Совместное Снижение АКрА

S. aureus слизистой оболочки носа выделение S. aureus

S aureus S aureus и CNX

■ Шарлык И Новотроицк

Примечание: * - р<0,05 (в Шарлыке по сравнению с Новотроицком) Рис. 3. Результат санации детей, проживающих на территориях с разной антропогенной нагрузкой

Подводя итог проведенным исследованиям следует заключить, что наличие золотистых стафилококков с высокими факторами персистенции в биотопе носовых ходов, сопровождающееся реакций со стороны факторов естественной резистентности, определяет формирование резидентного бактерионосительства; у резидентных стафилококковых бактерионосителей, проживающих в районе с высоким уровнем загрязнения воздушной среды, изменения в биотопе характеризуются высокой микробной обсемененностью слизистой оболочки переднего отдела носа золотистыми стафилококками с высокими значениями антикарно-зиновой активности; основу эффективной санации резидентных стафилококковых бактерионосителей, в том числе проживающих в экологически неблагополучных районах, составляет использование циклоферона, подавляющего пер-систентный потенциал золотистых стафилококков и способствующего нормализации состояния микробиоценоза.

* Ни

1 1 1 !

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что у резидентных бактерионосителей происходит селекция штаммов золотистого стафилококка с высокой экспрессией свойств, направленных на инактивацию защитных механизмов барьерного эпителия слизистых (карнозина, лактоферрина, slgA) переднего отдела носа. Данные свойства, и, особенно их комбинация, могут быть использованы как эпидемиологические маркеры штаммов стафилококков, выделенных от резидентных бактерионосителей.

2. У резидентных бактерионосителей состояние систем «лактоферрин — антилактоферриновая активность», «slgA - sIgA-протеазная активность» характеризуется одновременным повышением как содержания лактоферрина и секреторного IgA в назальном секрете, так распространенности и выраженности антилактоферриновой активности и sIgA-протеазной активности золотистых стафилококков.

3. Выявлено, что у лиц, проживающих в экологически неблагополучном районе, отмечаются изменения в биотопе переднего отдела носа, характеризующиеся высокой микробной обсемененностью слизистой золотистыми стафилококками с высокими значениями факторов персистенции (антикарнозино-вая активность и способность образовывать биопленки) по сравнению с лицами, проживающими в экологически благополучном исследуемом районе.

4. Экспериментально установлено, что под действием цииклоферона происходит снижение уровней антикарнозиновой активности и биопленкообразо-вания S. aureus в результате внутрипопуляционной перестройки микробного сообщества, проявляющейся в значительном увеличении доли клонов с низкой выраженностью указанных свойств или их отсутствием. Максимальный эффект действия циклоферона проявлялся на седьмые сутки эксперимента.

5. Выявлены особенности санации циклофероном резидентных бактерионосителей, проживающих на территории с высоким уровнем загрязнения воздушной среды, заключающиеся в снижении уровня микробной колонизации

слизистой носа S. aureus, уменьшении у них способности к инактивации карно-зина, появлении симбионтов в составе микрофлоры носовых ходов.

Список публикаций

1. Прогнозирование развития болезней органов дыхания у детей, проживающих на техногенно-загрязненных территориях / О.В. Бухарин, А.Ф. Зверев, ОЛ. Карташова, С.Б. Киргизова // Гигиена и санитария. -2010. - №6. - С. 76-78.

2. Потехина, Л.ГТ. Санация стафилококковых бактерионосителей, проживающих на техногенно-загрязненных территориях / Л.П. Потехина, А.Ф. Зверев // Медицинский альманах. - 2011: Материалы X научной сессии молодых ученых и студентов «Современное решение актуальных научных проблем в медицине». - №3. - С.170-171.

3. Зверев, А.Ф. Влияние уровня антропогенной нагрузки на детскую заболеваемость / А.Ф. Зверев, Л.П. Потехина // Тезисы докладов II международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Фундаментальные и прикладные исследования в биологии». - Донецк: Изд-во «Но-улидж», 2011. - С. 139-140.

4. Потехина, Л.П. Санация стафилококковых бактерионосителей иммуномодулятором Циклоферон / Л.П. Потехина, Т. М. Уткина, А. Ф. Зверев // Вестник Уральской академической науки. - 2011. - Т.2. - №2. - С. 55-56.

5. Зверев, А.Ф. Местный иммунитет при стафилококковом бактерионосительстве / А. Ф. Зверев, О Л. Карташова // Вестник Уральской академической науки. - 2011. - Т.1. - №1. - С.138-139.

6. Потехина, Л.П. Способ санации бактерионосителей S. aureus / Л.П. Потехина, Т.М. Уткина, ОЛ. Карташова, А.Ф. Зверев // Современные проблемы науки и образования [Электронный журнал]. - 2012. - № 5. URL: www.science-education.ru/105-7303.

7. Способ санации стафилококковых бактерионосителей [Текст]: пат. 2441656 Российская Федерация, МПК А61КЗ1/435, А61Р11/02. /Бухарин О.В., Карташова О.Л., Киргизова С.Б., Потехина Л.П., Зверев А.Ф.; заявитель и патентообладатель Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН. - №2010136255/15; заявл. 27.08.2010; опубл. 20.12.2010, Бюл. № 4 - 5 с.

ЗВЕРЕВ АЛЕКСАНДР ФЕДОРОВИЧ

ХАРАКТЕРИСТИКА STAPHYLOCOCCUS A UREUS, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ БАКТЕРИОНОСИТЕЛЕЙ И РАЗРАБОТКА СПОСОБА ИХ САНАЦИИ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Оригинал макет подготовлен в программе Word for Windows 2003 Подписано в печать 01.10.2013 Формат 60*84/16. Усл.-печ. л. 1,0. Печать оперативная. Бумага офсетная. Гарнитура Times. Тираж 100 экз.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Зверев, Александр Федорович, Оренбург

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ОРЕНБУРГСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ» МИНЗДРАВА РОССИИ

04201365516 На правах рукописи

Зверев Александр Федорович

ХАРАКТЕРИСТИКА STAPHYLOCOCCUS AUREUS, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ БАКТЕРИОНОСИТЕЛЕЙ И РАЗРАБОТКА

СПОСОБА ИХ САНАЦИИ

03.02.03 - Микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель д.б.н. Карташова О.Л. Научный консультант д.м.н., профессор Сетко Н.П.

Оренбург-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение......................................................................................4

ГЛАВА 1. Обзор литературы............................................................9

1.1 .Особенности биологических свойств стафилококков, выделенных от бактерионосителей.....................................................................9

1.2. Влияние антропогенных факторов на состояние

бактерионосительства....................................................................18

1.3. Способы санации бактерионосителей...........................................23

ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования......................................32

2.1. Выделение и идентификация стафилококков..................................32

2.2. Методы изучения биологических свойств стафилококков...................33

2.3. Методика определения способности S. aureus образовывать биопленки....................................................................................37

2.4. Методика определения чувствительности S. aureus

к антибиотикам.............................................................................38

2.5. Методики определения лактоферрина и slgA в носовом секрете..........38

2.6. Методики определения влияния циклоферона на стафилококки..........39

2.7. Методика санации резидентных бактерионосителей.........................41

2.8. Молекулярно-генетическое исследование штаммов стафилококков......42

2.9. Методики определения загрязнения атмосферного воздуха исследуемых территорий и оценки риска его

воздействия для здоровья населения..................................................44

2.10. Методы статистической обработки материала...............................45

ГЛАВА 3. ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СТАФИЛОКОККОВ И МЕСТНЫЙ ИММУНИТЕТ У

БАКТЕРИОНОСИТЕЛЕЙ. :.............................................................47

3.1. Факторы персистенции стафилококков, выделенных

у детей со слизистой оболочки переднего отдела носа...........................47

3.2. Характеристика местного иммунитета при стафилококковом

бактерионосительстве.....................................................................55

ГЛАВА 4. ОЦЕНКА РИСКА ДЛЯ ЗДОРОВЬЯ ДЕТСКОГО НАСЕЛЕНИЯ АТМОСФЕРНОГО ВОЗДУХА ПРОМЫШЛЕННОГО ГОРОДА И СЕЛЬСКОГО

НАСЕЛЕННОГО ПУНКТА..............................................................60

4.1. Гигиеническая характеристика загрязнения атмосферного воздуха исследуемых территорий Оренбургской области..................................60

4.2. Оценка риска неканцерогенных эффектов

при действии загрязнителей атмосферного воздуха...............................65

ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ КАЧЕСТВЕННЫХ ХАРАКТЕРИСТИК И БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ СТАФИЛОКОККОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ У ДЕТЕЙ, ПРОЖИВАЮЩИХ НА ТЕРРИТОРИЯХ С РАЗНЫМ УРОВНЕМ АНТРОПОГЕННОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ

ВОЗДУШНОЙ СРЕДЫ..................................................................70

ГЛАВА 6. РАЗРАБОТКА СПОСОБА САНАЦИИ РЕЗИДЕНТНЫХ СТАФИЛОКОККОВЫХ БАКТЕРИОНОСИТЕЛЕЙ...............................86

6.1.Изучение влияния циклоферона на биологические свойства

S. aureus в эксперименте.................................................................86

6.2. Санация резидентных стафилококковых бактерионосителей циклофероном..............................................................................92

6.3. Изучение особенностей действия циклоферона на S. aureus с использованием атомно-силовой микроскопии.....................................99

6.4. Особенности санации циклофероном стафилококковых бактерионосителей, проживающих на территориях с разным

уровнем антропогенного загрязнения воздушной среды........................102

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...........................................................................106

ВЫВОДЫ..................................................................................118

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...............................................................120

ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы

Проблема стафилококкового бактерионосительства сохраняет свою актуальность, поскольку бактерионосители являются источниками эпидемиологической опасности. В то же время важное клиническое значение стафилококкового бактерионосительства определяется типичностью процесса транслокации стафилококков со слизистых оболочек во внутреннюю среду организма-хозяина с развитием широкого спектра заболеваний (Wertheim H.F. et al., 2005; van Rijen M.M., Kluytmans J.A., 2008). Условия формирования резидентного бактерионосительства связаны с наличием у резидентной стафилококковой микрофлоры особых свойств, обеспечивающих ее адаптацию к условиям, складывающимся на слизистой оболочке передних отделов носовых ходов, и таким образом, ответственных за длительное сохранение микроорганизма в данной экологической нише. Так, среди штаммов S. aureus, выделенных от резидентных бактерионосителей, установлена высокая частота встречаемости антагонистической активности в отношении широкого круга микроорганизмов (коринебактерий, микрококков и др.), являющихся представителями нормальной микрофлоры верхних дыхательных путей (Дерябин Д.Г., 2000). Показано, что у постоянных носителей резидентного типа происходит накопление наиболее вирулентных и резистентных к антибиотикам стафилококков (Терновская Л.Н., 1983; Эрдынеева Б.С., 2011), а также обладающих способностью к инактивации факторов естественной резистентности с высокими значениями признаков (Блиндер Е.А., 2005; Карташова О.Л. с со-авт., 2009).

Многочисленными исследованиями показано, что техногенные факторы внешней среды, модифицируя свойства стафилококков, способствуют формированию состояния бактерионосительства и развитию инфекционно-воспалительных заболеваний (Даутов Ф.Ф. с соавт., 2007; Атаниязова P.A., 2008; Ковальчук И.Ю., 2009; Ефимова Н.В. с соавт., 2011).

В связи с этим научный интерес представляет изучение биологических, в том числе персистентных свойств, у стафилококков, выделенных от резидентных и транзиторных бактерионосителей, а также бактерионосителей, проживающих на территориях с разным уровнем антропогенного загрязнения воздушной среды, что позволит разработать способы борьбы с бактерионосительством.

Целью настоящей работы явилось изучение биологических свойств стафилококков, выделенных со слизистой оболочки переднего отдела носа бактерионосителей разных типов, с разработкой способа их санации.

Для достижения цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Изучить биологические свойства стафилококков (антикарнозиновая, антилактоферриновая, slgA- протеазная активность) и местный иммунитет у бактерионосителей разных типов.

2. Исследовать биологические свойства S. aureus, выделенных от бактерионосителей, проживающих на территориях с разным уровнем антропогенного загрязнения воздушной среды, и провести их сравнительный анализ.

3. Разработать способ санации резидентных бактерионосителей цикло-фероном и оценить его эффективность.

Научная новизна

Проведенные исследования позволили установить, что золотистые стафилококки, выделенные у резидентных бактерионосителей, характеризуются высокой экспрессией свойств, направленных на инактивацию защитных факторов барьерного эпителия слизистых переднего отдела носа (карнозина, лактоферрина, slgA), которые могут служить критериями эпидемиологической опасности.

Выявлена прямая зависимость между уровнем антилактоферриновой и sIgA-протеазной активности стафилококков и содержанием лактоферрина и slgA в назальном секрете резидентных бактерионосителей. Научно обоснованы особенности патогенеза резидентного бактерионосительства на модельных системах «лактоферрин хозяина - антилактоферриновая активность

5

стафилококков» и «slgA хозяина - sIgA-протеазная активность стафилококков».

Установлено, что у бактерионосителей, проживающих на территориях с высоким уровнем антропогенного загрязнения воздушной среды, отмечается повышение уровня микробной обсемененности слизистой оболочки передних отделов носа золотистыми стафилококками, обладающими выраженной антикарнозиновой активностью и способностью к образованию биопленок.

Экспериментально установлена оптимальная длительность проведения санации резидентных стафилококковых бактерионосителей циклофероном. Выявлены особенности санации лиц, проживающих на территориях с высоким уровнем загрязнения воздушной среды, характеризующиеся снижением у золотистых стафилококков способности к инактивации карнозина и появлением симбионтов в составе микрофлоры носовых ходов. С использованием метода атомно-силовой микроскопии впервые визуализированы результаты воздействия циклоферона на поверхностные структуры клеток S. aureus, установлено значительное увеличение шероховатости их поверхности и изменение морфологии, что позволяет констатировать нарушение барьерных функций клеточной стенки ¡золотистых стафилококков.

Практическая значимость

В результате исследования получены новые данные, расширяющие представление о роли факторов персистенции стафилококков в формировании бактерионосительства.

Свойства стафилококков, направленные на инактивацию факторов естественной резистентности хозяина, и, особенно их комбинация, могут быть использованы как эпидемиологические маркеры стафилококков, выделенных от резидентных бактерионосителей.

На основе полученных экспериментально-лабораторных данных разработан способ санации циклофероном стафилококковых бактерионосителей

под контролем антикарнозиновой активности S. aureus (Патент РФ на изо-

6

бретение № 2441656), позволяющий санировать лиц, проживающих на территориях с высоким уровнем загрязнения воздушной среды. Материалы работы использованы при составлении информационно-методического письма «Диагностика и санация стафилококковых бактерионосителей», утвержденного Министерством здравоохранения Оренбургской области.

Положения, выносимые на защиту

1. Формирование резидентного бактерионосительства характеризуется изменением состояния систем «лактоферрин - антилактоферриновая активность», «б^А - б^А- протеазная активность»: одновременным увеличением содержания в назальном секрете лактоферрина и секреторного ^А, а также значений антилактоферриновой и э^А- протеазной активности золотистых стафилококков.

2. У резидентных стафилококковых бактерионосителей, проживающих в условиях повышенного уровня загрязнения воздушной среды, отмечается высокая микробная обсемененность слизистой оболочки переднего отдела носа золотистыми стафилококками с выраженной антикарнозиновой активностью и способностью к образованию биопленок.

3. Основу эффективной санации резидентных стафилококковых, бактерионосителей, проживающих на территориях с высоким уровнем загрязнения воздушной среды, составляет использование циклоферона, подавляющего персистентный потенциал золотистых стафилококков и способствующего нормализации состояния микробного биоценоза.

Апробация работы. Материалы работы были доложены и обсуждены на: пленуме Научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды РАМН и Минздравсоцразвития России по проблеме: «Методологические проблемы изучения, оценки и регламентирования биологических факторов в гигиене окружающей среды» (Москва, 2009); IX Российской конференции иммунологов Урала (Челябинск, 2011); II международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Фундаментальные и

прикладные исследования в биологии» (Донецк, 2011); X научной сессии

7

молодых ученых и студентов «Современное решение актуальных научных проблем в медицине» (Нижний Новгород, 2011); VII Всероссийской конференции «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 4 публикации в.журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ, получен патент на изобретение РФ № 2441656 от 10 февраля 2012 года.

Объем и структура диссертационной работы

Текст диссертации изложен на 143 страницах машинописи, содержит введение, 6 глав, заключение, выводы, указатель литературы, включающий 125 отечественных и 83 иностранных источника. Текст иллюстрирован 19 рисунками и 11 таблицами.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Особенности биологических свойств стафилококков, выделенных от

бактерионосителей

Важное клиническое значение бактерионосительства определяется достаточной типичностью процесса транслокации (переноса) стафилококков с наружных кожных покровов и слизистых оболочек во внутреннюю среду организма хозяина с развитием широкого спектра гнойно-воспалительных заболеваний (Дьяченко Ю.В., 1994; Wertheim H.F. et al., 2005, van Rijen M.M., Kluytmans J.A., 2008). Следовательно, стафилококки также представляют опасность для самого бактерионосителя (Шульга И.А., 1996; Шульга И.А. с совт., 1999; Kluytmans J. et al., 1997; Allon M., 2004). С другой стороны, носи-тельство стафилококков в носовых ходах может представлять опасность для окружающих за счет аэрогенного распространения, что особенно актуально в организованных детских коллективах (Choi С.S. et al., 2006; Andersen P.S. et al., 2012).

В формировании стафилококкового бактерионосительства выделяют два этапа - колонизация патогеном экологической ниши и персистенция патогена (Бухарин О.В. с соавт., 1993).

Первый этап - колонизация - определяет начало любой формы инфекционного процесса. Ключевым механизмом колонизации является адгезия бактерий к слизистым оболочкам, где осуществляется «опознание» своих территорий за счет специфического лиганд-рецепторного взаимодействия. На клетках назального эпителия обнаружены протеиновые рецепторы, обеспечивающие эффективную адгезию стафилококков к дифференцированным эпителиоцитам (Miyake Y. et al., 1990). Еще один механизм адгезии S. aureus на слизистой оболочке носовых ходов определяется существованием специфического Са2+ - опосредованного взаимодействия его поверхностных трип-синчувствительных белковых структур с карбогитратным компонентом назального и бронхиального муцина (Thomas V.L. et al., 1993; Olsen К. et al.,

2013). Факторами адгезии стафилококков являются тейхоевые кислоты кле-

9

точной стенки. С помощью мутанта S. aureus, не способного синтезировать тейхоевую кислоту, показано, что она также придает стафилококкам устойчивость к жирным кислотам, выделяемым сальными железами кожи, путем предотвращения связывания жирных кислот с клетками бактерий (Kohler Т. et al., 2009), центральная роль в прилипании стафилококков к эпителиальным клеткам слизистой носа принадлежит липотейхоевым кислотам (Вершигора А.Е., Позур В.К., 1982; Weidenmaier С. et al., 2004; Rongpharpi S.R. et al., 2013).

Aly R., Maibach H.I. (1977) изучили способность S. aureus и других микроорганизмов прилипать к эпителиальным клеткам носа и показали более значительную степень сродства S. aureus к клеткам эпителия носа у носителей стафилококков, чем у лиц, носителями не являющимися. Эти факты свидетельствуют об экологическом значении эффекта прилипания. Данные, полученные H.F. Wertheim et al. (2008) в условиях in vivo и in vitro, позволили установить, что поверхностный белок (клампинг-фактор, ClfB) является определяющим в формировании резидентного бактерионосительства, поскольку обладает повышенным сродством к лорикрину (белку, расположенному на поверхности клеток слизистой оболочки носовых ходов) (Schaffer А.С. et al., 2006; Dagnew М. et al., 2012). При этом оказалось, что стафилококк прикрепляется не ко всей поверхности слизистой, а именно к тем участкам, где у эпителиальных клеток на поверхности много кератина (O'Brien L.M. et al., 2002).

В результате адгезии на эпителиальном пласте стафилококк оказывается в микроокружении, со стороны которого испытывает конкуренцию за сайты прикрепления и трофические субстраты, а также антагонистическое воздействие ферментных и бактериоциноподобных факторов (Frank D.N. et al., 2010; Shibabaw A. et al., 2013). При адгезии стафилококк преодолевает это противодействие со стороны представителей индигенной микрофлоры с помощью антибиотиков, бактериоцинов, лизоцима. Бактериолизины стафилококка включают целую группу литических ферментов из класса гидролаз,

основной мишенью действия которых являются разные структуры пептидог-

10

ликана клеточных стенок стафилококка и других, прежде всего, грамположи-тельных бактерий. Среди веществ этой группы - лизостафин, лизоцим (мура-мидаза), эндопептидаза, Ы-ацетилмурамил-Ь-аланинамидаза (Wastrom а. Vesterberg, 1971). Лизоцимная активность бактерий, как и бактериоциногения, создает селективные преимущества для патогенов в экологической нише (Бухарин О.В. с соавт., 1985).

Отражением важности биоценотических взаимоотношений в определении типа носительства явилась подтвержденная Д.Г. Дерябиным (2000) в группе резидентных штаммов S. aureus высокая частота встречаемости их антагонистической активности в отношении широкого круга микроорганизмов (коринебактерий, микрококков и др.), являющихся представителями нормальной микрофлоры верхних дыхательных путей.

Установлено, что в эконише резидентных стафилококковых бактерионосителей наиболее ин