Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование механизма спонтанной митотической конверсии в правом плече XV хромосомы дрожжей-сахаромицетов

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Исследование механизма спонтанной митотической конверсии в правом плече XV хромосомы дрожжей-сахаромицетов"

121 0 9 9 2

САНКТ- ПЕТ ЕРБУРГСЮТ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УШШЕ^ЙТЕТ

На правах рукописи УДК 575. ГЧ: 576: 85

ПУШНОВА Елена Александровна

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМА СПОНТАННОЙ ЖГОТИЧЕСКОЙ КОНВЕРСИИ В ПРАВОМ ПЛЕЧЕ XV ХРОМОСОМ ДРОЖЖЕЙ- САХАРОМИЦЕТОВ

специальность 03.00.15 - "Генетика"

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1992

1 ' Ну

Работа выполнена в лаборатории генетики эукариот отдела молекулярной и радиационной биофизики Петербургского института ядерной *изики им. Б. П. Константинова Российской . адемии наук.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

' Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор К. А. Захаров (Институт общей генетики РАН); кандидат биологических наук, научный сотрудник М. А. Попова (Научно-исследовательский институт гриппа РАМН).

Ведущая организация: Институт экспериментальной

Д. 063.57.21 при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 139034, г.Санкт-Петербург, Университетская набережная, -т. 7/9, СЮГУ, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной научной библиотеке СПбГУ.

заведующий лабораторией генетики эукариот отдела молекулярной и радиационной биофизики ШЯФ РАН В. Г. Королев.

медицины РАМН (Санкт-Петербург)

Защита состоится часов (/0 мину-! на

Уч?ккй секретар!.

"■■'"1 ■ -3. ; ¡' | ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение молекулярных механизмов ре ко м-. б...,ации представляет coöof. одно из наиболее актуальных направлений совреу~чной генетики. Большой вклад в понимание механизмов этого процесса у г -кариотическмх организмов внесли экспериментальные работы с использованием в качестве объекта исследований дрожжей Saccharomyces cerevisíaf. В рамках проблемы рекомбинации особый интерес представляет вопрос о механизме про-тяже чой конверсии, или коконяерсии сцепленных маркеров. 3 настоящее время в литературе существуют указания на то, что в основе феномена протяженной конверсии могут лежать две принципиально различные г ичины.

Под протяженной конверсией первого типа подразумевается спонтанная ico конверсия слабо сцепленных маркеров, характеризующаяся относительно невысокой частотой (до 4% всех конверсионных событий) и являющаяся, по всей вероятности, результатом образования протяженных участков гетеродуплексной ДНК в митозе дрожжей CEsposito, 1978; Montelone et al., 1981; Golln, Esposito, 1984]. Наблюдаемая зависимость частоты коконверспи сцепленных маркеров от расстояния мевду ними [Solln, Татре, 1988], а также результаты исследования конверсии инсерций [Golln, Falco, 1986; Golln, Falco, 1988], позволяют сделать вывод об ограничении прс яженности участка гетеродуплексной ДНК расстоянием порядка 35 т. п. н.

К протяженной конверсии второго типа следует отнести индуцированные события, т ле как 2мкм ДНК-индуцированная деста-Оилизация хромосом у диплоидов, гетерозиготных по интеграции плазмид, содержащих FRT-сайты 2мкм ДНК tFalco et al., 1982; Макаров и др. , 1987!; Булат и др. , 1983], и протяженная конверсия, щдуцированная интегрированным в хромосому активатором транскрипции Н0Т1 [ Voelkel-Maiman, Roeder, 1990Ы. Отличитель-юй чертой указанных событий является крайне высокая частота, а также характер коконверсии слабо'сцепленных маркеров, а именно, одновременная гомозиготизация маркер з, расположенных дисталь-lee точки интеграции, сопровождающаяся градиентной частотой го-юзиготизации проксимальных маркеров. Предполагается, что в юнове таких индуцированных событий .ежит механизм 'раэ->ыв-и-репликация", т.е. обрыв плеча хромосомы, сопрововдающийся отерей ацентрического фрагмента, акзонуклеолитической деграда-ией центромерсодержащего фрагмента и реплик... ивной репарацией оследнего по матрица интактного гомоюга [Falco et al., 1982;

- 4 -

--улат, 1987а; Voelkel- teiman, Roeder, 1990Ы. Цель и задачи работы. Целью настоящей работы явилось исследование частоты и характера событий спонтанной митотической рекомбинации d правом иль« XV хромосомы дрожжей Saccharomyces cerevisias. Основным подходом к решению поставленной задачи служило определение частоты событий реципрокной и нереципрокной рекомбинации в локусе ADE2, а также событий коконверсии в ло-кусе ADE2 и сцепленных маркерных сайтах. Для реализации данного подхода было необходимо сконструировать тестерный-диплоидный штамм с множественно маркированными XV хромосомами, отобрать рекомбинантов и проь-сти их генетический анализ. Научная новизна. В настоящей работе впервые зарегистрирована крайне высокая частота событий спонтанной митотической коконверсии сцепленных маркеров правого плеча XV хромосомы у дрожжей, происходящих по типу "разрыв-и-репликация", т.е. в результате обрыва плеча хромосомы с последующей репарацией укороченного плеча по матрице интактного гомолога.

Показано, что 2мкм ДНК не является фактором, способный стимулировать гомологичную митотическую рекомбинацию и, в частности, события протяженной конверсии в исследованном наш участке генома дрожжей, что позволяет ' сделать вывод об отсутствии .последовательностей, гомологичных FRT-сайту 2мкм ДНК, в исследованном районе правого плеча XV хромосомы.

Результаты определения размера хромосом XV у коконвертан-тов, а также у сегрегантов, претерпевших 2мкм ДБК-индуцированную деста илизацию :ромосомы XV, позволяют предположить, что репаративныЯ процесс имеет' место в ранних клеточных делениях после обрыва плеча хромосомы.

Практическая ценность работы. Результаты, полученные в настоящей работе, вносят в. .¡ад • в понимание механизмов коконверсии сцепленных маркеров в митозе дрожжей Saccharomyces cerevisiae и представляют -несомненный практический интерес в биотехнологическом аспекте. В соответствии с полу энными нами данными можно утверждать, что митотическая стабильность промышленных штаммов дрожжей при культивировании не зависит от наличия в клетке 2мкм ДНК.

Апробация работы. Результаты исследований были приставлены на vil Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва. 1990). на XV Международном специализированном симпсэиуиг по дрожжам 'Рига. 1991), а также на научных семинарах .'дабсрзго;"генетики ^укариот и отдела молекулярной и

радиационной биофизики Петербургского института ядерной физики РАЕ

Мбликации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и ч?зисы 4 со Зданий.

Структура и объем цис 'Эртации. Работа изложена на 142 страницах машинописного текста, содержит 9 таблиц, 17 рисунков и состоит из обзора литературы, включающего 3 г .здела, описания материалов и методов, экспериментальной части, включающей 4 раздела, обсзздения результатов, выводов и списка литературы (157 liai, з-яований).

МАТЕРИАЛ» й МЕТОДЫ Штаммы. В работе были использованы штаммы 3B-SAB1, 2D-SAB2 и XV-289 Гатчинской генетической коллекции дрожкей Saccharomyces cerevlslae, штамм №898 N435-2A из коллекции д-ра Т. Ниллсон-Тиллгрена (Дания) и штамм GRF18 из коллекции д-ра Дж.Р. йшка (США), а тага» штаммы, полученные в настоящей работе. В работе также использовали штаммы J Ml 09 С Vanish-Рчггоп et al. , 1885J и НВ101 [Маниатис и др. , 1984] Escherichia coll. Среды и ус *овия культивирования. Для культивирования дрожжей использовали полную среду YAPD и минимальную среду МЗ, селективные среды представляли собой среду МЗ с соответствующими добавками в стандартных концентрациях; для культивирования бактерий использовали, среду LB; культивирование проводили в стандартных условиях [Захаров и, др., 1934; Маниатис и др. , 1984]. Генетический анализ, в работе использовали стандартные методы частной генетики дрожжей [Захаров и др., 1984]. Плазмиды. В работе были использованы плазмиды 1-5 и -А2, сконструированные в лаборатории генетики эукариот ОЫРВ ПИЯФ РАН, а также плазмида pJDB219, полученная от д-р Дж. Д. Беггс' (Великобритания), и плазмида YRpl4/ARSl/CENlE, любезно предоставленная л-ром П. Филиппсеном (Швейцария). Трансформация клеток микроорганизмов. -и дрожжей трансфор-

мировали методом KUf? Т Kl mura, 1986,, для трансформации клеток Е.coll использовали метод электропорации [Dower et al.. 1988]. Выделение плазмидно' ДНК. Для выделения плазммдной ДНК ив клеток Е.coll и тотальной ДНК из клеток дрелей использовал« стандартные методчки с небольшими "одификациями [Маниатис и др. , 1984; Johnston, 1988].

Рестрикция и электрофоне^ Рестрикцию ДНК и злекгрофороэ в агь-розном геле проводили в стандартные условиях [ Маниатис и др.-,

19843, при проведении ортогонеии .ого электрофореза хромосомных препаратов дрожжей использовали описанную методику СМелоэвая и др. 19903.

Радиоактивное мечение ДНК и гибридизация. Для радиоактивного мечения ДНК методом рассеянных затравок, а также последующей дот- и блот-гибридизации ДНК с радиоактивно мечеными ДНК-зондами, использовали стандартные методики СМаниатис и др., 1984]. Статистическая обработка результатов. Для сравнения значений частоты рекомбинации использовали компьютерную программу MYSTAT с применением критер;.л t Стьюдента СРокицкий, 19613.

РЕЗУЛЬТАТЫ IÍ ОБСУЖДЕНИЕ Анализ частоты спонтанной митотической рекомбинации в правом плече хромосомы XV.

С целью анализа частоты спонтанной митотической рекомбинации в правом плече XV хромосомы дрожжей нами был сконструирован диплоид ЕАР12 генотипа

МАТ* 1еи2-3,112 ARS1 ADE2 his3-ll,15 МАТа leu2-3,112 arffl ade2-192 H1S3 гетерозиготный по мутациям в генах ADE2 (правое плечо XV хромосомы), HIS3 (правое плечо XV хромосомы, 50 сМ дисгальнее ADE2) и ARG1 (левее плечо XV хромосомы). Бее продукты рекомбинации или сегрегации в тест-системе ЕАР12 отбирали как бело-красные половинчатые колонии в рассеве белых колоний диплои-да. Б coi .'ветствш' з положением маркерных мутаций в гомологичных XV хромосомах диплоида ЕАР12 различные события рекомбинации или сегрегации в данной тест-системе р, истрируются следующим образом: 1. В случае нерасховдения XV хромосом фенотип клеток красной половины секте, ной колонии должен соответствовать Leu" Arg~Ade~His+. 2. В случае рекомбинации в правом плече XV хромосомы фенотип клеток красной половины секторной колонии должен соответствовать Leu~Arg+Ade~Hts+. Есл1 рекомбинация нереципрок-ная (конверсия в ADE2), фенотип клеток белой половины рекомби-нантной колонии соответствует Leu~Arg+"Ade+}í ís+; в случае рецип-роктой рекомбинации фенотип клеток белой половины рекомбинант-ной колонии соответствует Leu"Arg+Ade+His~.

Нами были отобраны и проанализировав половинчатые бело-красные галонии в рассеве клеток трех независимых клонов диплоида ЕДР12. Результат1; анализа частоты спонтанной митоти-представлены в таблице 1. В скобках указаны ча.-г :г на клетку на г*н«раця»

(х10~®) с ошибкой среднего. Анеуплоидов среди :егрегантов обнаружено не было.

Таблица 1.

Частота спонтанной митотической рекомбинации у диплоидов ЕАР1Е.

Тестерный диплоид Число проанализированных клоноч Число кроссоверов конвертантов

ЕАР12-1 158 ООО 1 2

ЕАР12-5 157 ООО 4 8

ЕАР12-9 151 ООО 0 6

всего ЕАР12 466 ООО (1.07+0. 99) 5 (£'. 43*1. 46) 16

Анализ частоты спонтанной копнверсии сцепленных маркеров пр_а-_ вого плеча хромосомы XV.

С целью регистрации событий конверсии в локусе ADE2, сопровождающихся конверсией в локусе HIS3, расположенном на 50 еМ дистальнее ADE2, нами был проведен генетический анализ сегре-гантов диплоида ЕАР12, возникших в результате конверсии в локусе ADE2. В соответствии с положением маркеров в гомоло1 ичных XV хромосомах диплоида ЕАР12 в результате точковой конверсии в локусе ADE2 конвертам: фенотипа Leu" Arg+Ade~H Одолжен быть ге~ терозиготен по мутации his3-ll,15, а в случае коконверсии в ло-кусах ADE2 и HIS3 - гомозиготен по нормальной аллели HIS3. Результаты анализа генотипов конвертантов ЕАР12 в случайной выборке аскоспор приведены в таблице 2. Контролем наличия гаплоидных продуктов мейоза в случайной выборке аскоспор служила идентификация клонов фенотипа Leu"Arg~Ade~Hls+.

Данные, представленные в таблице 2, свидетельс зуют о крайне высокой частоте событий коконверсии в локусах ADE2 и HIS3: 81% (13 из 16) проанализированных конвегтантов гомозиготны по нормальной аллели гена HIS3. Очевидно, что набл ,аемая частота событий коконверсии значительно превышает ожидаемую ,„ля независимых событий конверг -и в локусах ADE2 и HJS3: учитывая, ч»о частота спонтанной митоти"еской конверсии в единичном локусе зарегистрированная как в наших экспериментах (таблица 1), так и в экспериментах других авторов [Kunz, llavnos, 1901], сс,-

ответствует доля гомозигот по нормальной аллели гена

Н133, возникших в результате независимой конверсии в этом ло-кусе, должна составлять 0.1%-0. 01% продуктов конверсии в локусе А0Е2. •

Таблица 2.

Характеристика рекомбинационных событий в сцепленных с А0Е2 маркерных сайтах у конвертантов ЕАР12.

Тестерный Обозначение Конверсия Конверсия в сайте рестрик-

дипдоид кош ртанта в HIS3 ции, прилежащем к ADE2

ЕАР12-1 1г-1 + К+

2г-1 - К+

ЕАР12-5 • 1г-5 + Н-

2г-5 н+

Зг-5 + н+

6г-5 + н+

7г-5 - н+

8г-5 + н-

9 г-5 + н+

•10г-5 + н-

ЕАР12-9 1г-9 +

2г-9 + н+

Зг-9 + к+

- 4г-9 - н-

5г-9 + н+

6г-9 + н-

Н+ и Н- означает, соответственно, ьаличие или отсутстви конверсии в маркерном сайте рестрикции Нра1;

К+ и Ч- означает, соответственно, наличие или отсутстви конверсии в маркерном Сайте рестрикции Крп1.

С целью дополнительного маркирования правого плеча хрс мосомы XV нами был проведен поиск полиморфизма длины рестрикдо онных фрагментов гиб[ дизующихся с последовательностью ге^ АГЕ2, у родителей диплокда ЕАР12 т.е. гапло<-ов 5-ЕАР1 ЗКР18. Тотальную ДНК гаплоидов рестрицировали 23 ра".тач:{Ы>. {ч-сгриктазчик, после чего фрагменты рестрикции разделяли '•.--к: Г'Г4срегск б агарсрнлч геле подвергали "лет-гиОги;:/; лип

[32р]-мечеН0й последовательностью плазмиды рА2 включающей полную нуклеотидную последователь..ость гена ADE2. В результату рестрикционного анализа было обнаружено 2 случая полиморфизма длины фрагментов рестрикции, прилежащих к локусу ADE2 (рис.1): размер Фрагментов Hpal-рестрикции, гибридизующихск» с последовательностью ADE2, составил 9 т. п. н. и 3 т. п. н. у штамма 5-ЕАР1 (дорожа б) и 6 т. п. н. и 3 т.п. н. у штамма BRF18 (дорожка 7); после рестрикции Kpnl и "ибридиаации с плазмидой рА2 у штамма 5-ЕАР1 был идентифицирован фрагмент размером около 18 т. п. н. (дорожка 2), а у штамма GRF18 - фрагмент размером около 23 т. п. н. (дорожка 3).

23 т.п.н. -9.4 т.п.н.-б.б Т.П.Н.'

4.4 т.п.н.

2.2 т.п.н. 2.0 т.п.н.

III

•л

' ч:

№

0.6 т.п.н.

1 2 34 5 б 7

'fei 8 9 10 U

Рис. 1. Определение длины фрагментов рестрикции последовательностей, прилежащих к ADE2, у родителей диплоида ЕАР12.

Для регистрации событий коконверсии в локусе ADE2 и прилежащих маркерных сайтах рестрикции Hpal и Крп) нами был проведен рестрикционный анализ W клеток красной половины секторных колоний, образовавшихся в результате конверсии в локусе ADE2. В случае, когда конверсия в ADE2 не сопровождается конверсией в сцепленном сайте рестрикции, у красного конвертанта обнаруживается суммарный набор фрагментов рестрикции, характерных для родителей 5-ЕАР1 и 6RF18, а в случае события коконверсии в ADE2 и сцепленном сайге рестрикции набор рестрикцишннх фрагме! зв ДНК красного конвертанта идентичен набору, характерному для родителя 5-ЕАР1.

Результаты, представленные н таблице 2, укааыва. ; на крайне высокую часюту событий коконверсии-в локусе ADE2 и np.i-лежащих маркерный сайтах pet рикции llpal и Kpnl, а также позволь jT сделать следующие выводи.

\. Маркерный сайт рестрикции Kpnl рас моложе" между ло-кусами ADE2 и HIS;», тогда как маркорнш! сайт рестрикции llpal

находится проксимальнее ADÉ2, поскольку коконверсия в ADE2 и HIS3 всегда сопровождается конверсией в сайте Kpnl и не всегда сопровождается конверсией сайте Hpal.

2. Характер одновременной гомозиготизации маркеров правого плеча хромосомы XV у диплоида ЕАИ2 сходен с наблюдаемым при коконверсии сцепленных маркеров, индуцированной последовательностью НОГ1 CVoölkel-Meirrao, Roeder, 1990b] , а также при 2мкм ДНл-индуцированной дестабилизации хромосом [Falco et al. , 1982; Захаров и др., 1982; Булат и др., 1983], т.е. в наших экспериментах отмечаег- ч одновременная гомозиготизация маркеров Kpnl и HIS3, расположенных дистальнее селективного маркера ade2-192, не всегда сопровождающаяся гомозиготизацией маркера Hpal проксимальнее ADE2. Явления коконверсии, характеризующейся крайне высокой частотой одновременной гомозиготизации слабо сцепленных маркеров, принято рассматривать как результат обрыва плеча хромосомы с последующей репарацией укороченного плеча по матрице ингактного гомолога [Falco et al., 1982; Булат, 1987; Voelkel-Meiman, Roeder, 1990b], следовательно, можно предположить, что в основе наблюдаемой нами спонтанной митотической коконверсии сцепленных маркеров правого плеча хромосомы XV также лежит механизм "разрыв-и-репликация".

Сравнительный анализ частоты спонтанной гомологичной митотической рекомбинации £ штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae генотипа Lcir"*] и [cir°],

Нам представлялось крайне интересным установить причину обнаруженного нами явления протяженной конвер-ии в правом плече XV хромосомы дрожжей-сахаромицетов. По нашему мнению,фактором, стимулирующим образование двунитевых разрывов, приводящих к обрыву плеча XV хромосомы в процессе спонтанной митотической ре-комбинагчи, могла являться 2мкм плазь < да, присутствующая в клетках лабораторных штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Как известно, 2мкм плазмида содержит ген, кодирующий FLP-реком-биназу, которая осуществляет сайтспецифическую рекомбинацию в "лазмидных последовательностях, называемых FRT-сайтами. Первой стадией сайтспецлфической рекомбинации является генерация разрывов в FRT-сайте, при э^ом 17% разрывов оказываются двунитевы-ми [Аг 'гете et al. , 1985]. При нр^ичии в правом плече XV хромосомы последовательностей, гомологичных последовательности FRT-caíTa, FLP-peKOMíi'.Hasa молот индуцироват! разрывы в данном участке геномл. В пользу карего предположен;« евпде-^-льет валк

- и -

результаты, порченные ,в лаборатории генетики зукариот ОМРБ ПИЯФ РАН С Булат, 19876], в соответствии с которыми частота реципрокной митотической рекомбинации на участке ген ADE2-центромер у штаммов дрожжей генотипа Ccir+] как минимум на порядок выше соответствующей частоты у штаммов генотипа Coir0], что можно объяснить способностью 2мкм плазмиды генерировать двунитевые разрывы в последовательностях правого плеча XV хромосомы, поскольку именно двунитевые разрывы инициируют гомологичную рекомбинацию в митозе дрожжей. Дополнительным аргументом в пользу возможности FLP-зависимой генерации разрывов в хромосомных последовательностях является описанный случай седукции гена ADE1 С Булат и др., 1984; Bui at et al., 1985], заключающийся в 2м i ДНК-индуцированной эксцизии, интегрированной в хромосому I гибридной плазмиды pYF91 вместе с прилежащей ADE1 последовательностью, что можно объяснить FLP-зависимой рекомбинацией медцу одним из FRT-сайтов, присутствующих в pYF91, и хромосомной последовательностью, фланкирующей сайт интеграции.

Для исследования зависимости частоты и характера рекомби-нашонных событий от наличия 2мкм плазмиды в клетке нами были использованы Ccir0]-производные диплоида ЕАР12, полученные методом конкурентного "изгнания" 2мкм ДНК плазмидой pJDB219 CDobson et al., 1980]. Наличие Z*. -м ДНК в гестерных штаммах определяли путем дот-гибридизации тотальной ДНК с радиоактивно меченой плазмидой 1-5, содержащей большой EcoRI-фрагмент 2мкм ЛИ, а также путем визуальной идентификации молекул ДНК размером около 6. 3 т. п. н. в препаратах тотальной ДНК после электрофореза в 0. 8%-ном агарозном геле.

Результаты анализа частоты спонтанной митотической рекомбинации у ди-.лоидов ЕАР12 генотипа Ccir0] представлены в таблице 3. В скобках указаны средние значения чаете, рекомбинации на клетку на генерацию (х10 ) с ошибкой среднего. Анеуплоидов среди сегрегантов обнаружено не было. Статистический анализ данных, приведенных в таблицах 1 и 3, показал отсутствие достоверных различий между значениями частот как реципрокной,. так и нереципрокной спонтанной митотической реке '«наций у диплоидов ЕА: 2 генотипа Ccir+] и Ccir0].

Результаты анализа событий конверсии в сцепленных с мар. „рах правого пль-ia XV хромосомы у конвергантов ЕАР12 генотипа Ccir0] суммированы в таблиц. 4. Статистический анализ данных, приведенных в таблицах 2 и ' показал отсутствие дсстсвер-

ных различий мезду значениями частоты коконверсии в локусе ADE2 и сцепленных маркерных сайтах у диплоидов E'D12 генотипа Ccir+] и Cell*5].

Таблица 3.

Частота спонтанной митотической рекомбинации у дылоидов ЕАР12 генотипа Ccir0].

Тестерный диплоид Число проанализированных клонов Число кроссоверов конвертантов

ЕАР12-2 154 ООО 7 2 ,

ЕАР12-7 159 ООО г 7

ЕАР12-11 : 157 ООО 8 4

всего ЕАР12 470 ООО C3.62tl.59) 17 (2.77+1.11) 13

Влияние 2мкы плазмиды на частоту спонтанной митотической рекомбинации в правом плече XV хромосомы дрожжей было проанализировано также у полученных наш диплоидов ЕАР5 генотипа tcir+] и Coir0], гетероаллельных по комплементирующим мутациям в гене ADE2, т. е. аналогичных диплоидаы, у которых ранее Сило зарегистрировано повышение частоты спонтанного митотического кроссинговера на участке ген ADE2-центромер [Булат, 10876]. Статис ический анализ полученных данных показал отсутствие достоверных различий между значениями частот как реципрокной, так и нереципрокной спонтанной митотической рекомбинации у диплоидов ЕАР5 генотипа Ccir+] и Coir0].

Таким образом, проведенный нами сравнительный ананиз частоты и характера событий спонтанной митотической рекомбинации в правом п. че XV хромосомы у двух диплоидных тесторных штаммов генотипа [cir+] и [cir0] показал, что 2мкм ДНК не является фактором, способным с эмулировать гомологичную митоти-ческую рекомбинацию и, в частности, события протяженной конверсии в исследованном нами участке генпа конкретных штаммов дрожжей, что позволяет сделать вывод об отсутствии последовательностей, гомологичных FRT-сайту 2мкм ДНК, в исследованном районе правого плеча XV хромосомы.

Таблица 4.

Характеристика рекомбинационных событий в сцепленных с ADE2 маркерных сайтах у конвертантов ЕАИ2 генотипа [cir0].

Тестерный Обозначение Конверсия Конверсия в сайте рестрик-

диплоид конвертанга в HIS3 ции, прилежащем к ADE2

ЕАР12-2 2г-2 - К-

Зг-2 - К-

ЕАР12-? 1г-7 + к+

2г-7 - к-

Зг-7 + н-

5г-7 + н-

7; 7 - н-

8г-, Н- ■

9г-7 + н+

ЕАР12-11 lr-11 + к+

5г-11 - к-

1 Or-11 + н+

llr-11 + н+

Н+ и Н- означает, соответственно, наличие или отсутствие конверсии в маркерном сайте рестрикции Нра!;

К+ и К- означает, соответственно, наличие или отсутствие конверсии в маркерном сайте рестрикции Крп1.

Определение размера хромосом XV у конвертантов ЕАР12, гомозиготных по сцепленным маркерам правого плеча.

Высказанное рядом авторов предположение о том, что в основе одновременной гомозиготизации слабо сцепленных маркеров мохет лежать механизм "разрыв-и-репликации", до сих пор не имеет экспериментального подтверждения. По налкку мнению, прямом доказательством существования процесса "разрыв-и-регш.кацил" могла явиться идентификация промежуточных продуктог этого процесса, т.е. укороченных хромосом, в глиоме уничготЕеныи конвертантов, поэтому в дальне Ясем мы предприняли раьмера Х-»' хрсмоссч у конвертантов ЕАР12, у^ракт^г-иг-ухихсл одновременной гомоэиготизацией ма. ?рчк пр-.псто г.&чъ.

А нал и' размера хромосом X" ооу^стгляли

тонального электрофореза хромосомных препаратов дрожжей в ага-розном геле и последующей блот-гибридизаци" с С^Р]-мечеными последовательностями плазмиды рА2, включающей полную нуклеотид-ную ..эследовательность гена ADE2, и линейного фрагмента CEN15. Ни у одного из конвертантов, гомозиготных как минимум по аллелям ade2-192 и HIS3, не было обнаружено укороченных по сравнению с нормой последе, .лте .лностей хромосомы XV, гибридизующихся с радиоактивно меченым ДНК-зондом CEN15 (рис.2), что может объясняться двумя причинами: 1. Механизм, лежащий в основе наблю-да юй Hf 'д спонтанной митотической коконверсии сцепленных маркеров правого плеча, не имеет отношения к процессу "раз-' рыв-и-репликация". 2. Б основе наблюдаемой наш коконверсии действительно лежит процесс "разрыв-и-репликация", однако, мы не смогли обнаружить промежуточные продукты этого процесса, поскольку репарация укороченных хромосом происходит в ранних клеточных делениях после обрыва плеча.

Рис. 2. Ортогональный электрофорез хромосомных препаратов конвертантов ЕАР12 (А) и радиоавтограф фильтра после блот-гибридизации перенесенных из геля хромосомных последовательностей с ДНК-зондом CEN15 (Б).

Нами была предпринята попытка доказать, что процесс "разрыв-и-репликация" у дрожжей действительно существует, путем идентификации промежуточных продуктов этого процесса, т. е. укороченных хромосом, в геноме , .плоидов, претерпевших 2мкм ДНК-индуцированную дестабилизацию хромосог при этом анализировали размер хромосом у сегрегантов, образовавшихся в результате ограниченного числа делений после дестабилизации.

Нами были получены две пары д,.ллоидов генотипа Ccir+ ] и ícir0], гетерозиготных по инсерции плазмиды pYF91, интегрированной в хромосому XV на 3.2 сМ проксимальнее локуса HIS3 t Ly-

лат и др. , 1987]. а также по мутациям ade2-192 и his3-ll, .5. В отличие от штаммов генотипа tclr0] гетерозиготы по инсерции генотипа Ccir+] проявляли крайне высокую нестабильность хромосомы с интеграцией (частота вьщэпления красных клонов 0. 025 и 0.043 на клетку на генерацию).

Для определения размера хромосом нами были отобраны красные клоны сегреганто' ; -амегром 2-3 мм (10® -10^ клеток в колонии, т. е. образовавшиеся в результате около 20 митотич- '•ких делений после дестабилизации). Анализ размера хромосом XV осуществляли посредством орте, опального электрофореза хромосомных препаратов клеток колоний в агарозном геле и последующей блот-гибридизации с -мечен-! последовательностью линейного фрагмента CEN15.

Ни у одного из проанализированных 67 красных сегрегантов не было обнаружено укороченных по сравнению с нормой последовательностей хромосомы XV, гибридизующихся с радиоактивно меченым ДНК-зондом CEN15. 1аким образом,отсутствие укороченных хромосом X" в геноме дрожжей, претерпевши 2мкм ДНК-индуцированную дестабилизацию хромосом, указывает на го, что, если в основе дестабилизации действительно лежит механизм "разрыв-и-реплика-ция", репарация укороченных хромосом происходит в первых клеточных делениях после дестабилизации, и к моменту достижения колонией размера, достаточного для биохимичес. го анализа, укороченные хромосомы в геноме сегрегантов уже н обнаруживаются.

ВЫВОДЫ

1. Осуществлено рестрикционное маркирование областей правого плеча хромосомы XV, фланКирукяда локус ADE2, у гаплоидных штаммов дрожжей, происходящих из Гатчинской и Американской генетических коллекций; обнаружено два сайта рестрикции, а именно, Hpal и Kpnl. которые могут быть использованы в качестве маркерных.

2. Впервые зарегистрирована крайне высокая часто' событий спонтанной' митотическ-й коконверсии сцепленных маркеров у дрожжей, а именно, коконверсии в локусе DE2 и сцепленных с ним локусе HIS3 и двух маркерных сайтах рестрикции; характер коконверсии позволяет предположить, что в основе этого процесса лежит механизм "разрыв-и-реплик&ция", т.е. обрыв плеча хромосомы с последующей репарацией укороченного плеча по патрице интакт ного гомолога

3. Исследсзано влияние ?.мкм плагмиды на частоту спсита:-.-

ной коконверсии сцепленных маркеров в митозе. Показано, что присутствие 2мкм ДНК не стимулирует спонтанную митотическую рекомбинацию в нуклеотидных последовательностях правого плеча XV хромосомы исследованных штаммов дрожжей.

4. Продемонстрировано отсутствие промежуточных продуктов процесса "разрыв-и-репликация", а именно,укороченных XV хромосом, в геноме . .ложественкых конвертантов, а также в геноме диплоидов, претерпевших 2мкм ДНК-индуцированную дестабилизацию хромосомы XV; полученные результаты позволяют предположить, что репарация укороченных хромосом происходит в первык клеточных делениях после дестабилизации.

Основные публикации по теме диссертации

1. Пушнова Е. А. . Макарова 0. Е , Булат С. А. АЗЕ2-полимор-физм в изучении молекулярных механизмов спонтанной митоти ..¡ской рекомбинации у дрожжей-сахаромицетов // Тез. докл. VII Всесоюзного симпозиума "Молекулярные механизмы генетически) процессов". - М , 1990. - С. 260-261.

• 2. Булат С. А., Улкапова 0. В,, Пушнова "Е. А. ДНК-полиморфизмы трех видов дрожеи-сахаромицетов // Тез. докл. VII Всесоюзного симпозиума "Молекулярные механизмы i енетических процессов". - М , 1990. ■ - С. 200-201.

3. Pushnova r А., Bulat S. А., Korolev V. G. Comparison of spontaneous mitotic recombination in Cclr0] and [cir+] strains of yeast Saccharomyces cerevisiae // Abstr. of XV International Specializea Symposium on Yeast. - Riga, 1991. - P. 110.

4. Pushnova E. A.. Bulat S. A., Korolev V. G. Investigation of the mechanism of unusually high coconversion in the right arm of yeast chromosome XV // Abstr. of XV International Specialized Symposium on Yeast. Riga, 1991. - P. 111.

5.. Пушнова E. А. Сайтспецкфическая рекомбинация 2-мкм плаэмиды дрожжей Saccharomyces cerevisiae // Генетика. - 1992. - Т. 28. - С. 25-34.

6,- Pushnova Е. А., Bulat S. A., Korolev V. G. Comparative analysis of spontaneous mi' >tic recombination in [cir° 3 and tcir+ ] strains v the. yeast Saccharomyces r^revlsiae //. Curr. Genet. - 1992. - V. 21. - N.6.

PTII ПИЙФ, зак.ЧЬо, тир.ЮО, уч.-изд.л.0,8; 6ДШ-1992Г.

Бесплатно