Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение последствий интеграции плазмиды в дрожжевые хромосомы методом пульс-электрофореза

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение последствий интеграции плазмиды в дрожжевые хромосомы методом пульс-электрофореза"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

МЕШВАЯ Екатерина Владимировна

ИЗУЧЕНИЕ ПХЛЕДОТВИЙ ИНТЕГРАЦИИ ПЛАЗМВДЫ В ДРОЖЖЕВЫЕ ХРОЖСОШ МЕТОДОМ ПУЖ-ЭЛЕКТРОФОРЕЗА

03.00.04 - Биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1991

Работа выполнена в лаборатории генетики эукариот Отдела молекулярной и радиационной биофизики Ленинградского институ та ядерной физики им.Б.Л.Константинова АН СССР.

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение;

доктор биологических наук, профессор И.А.Захаров.

доктор биологических наук Т.Р.Сойдла,

кандидат биологических наук Г.И.Чихиржина.

Институт микробиологии АН СССР (Москва).

Зечди^ диссертации состоится " ^ " 199С.Г.

.^рчасов на заседании специализированного совета ' К 063.57.09 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук в Санкт-Петэрбургском государственном университете по адресу 199034, Санкт-Петербург, Университетская набережная, д.7/9.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке имени А.М.Горького СПбГУ.

Автореферат разослан Л^-^^Л у 1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета

А.Г.Марков

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Молекулярная биологик относительно недавно галучила в свой арсенал методов - "гель-кульс-электрофорез" (PFQ) •оригинальную технику.позволяющую разделять молекулы ДНК крупных >азмеров (до 12,5 млн.п.о.). В условиях пульс-электрофореза ¡азделение огромых ДНК происходит в агарозном' матриксе под [ействием напряжения пульсирующего электрического поля с ©меняющимся направлением. .

Метод пульс-электрофореза за короткий срок получил широкое фименение в молекулярно-биологических исследованиях гвномов про-[ эукариот. Особенно успешно его используют при изучении »азличных видов дрожжей, в частности, дрожжей ЗоссЬагщсез ereviaiae.

Дрожжи S.cereutsíoe являются объектом фундаментальных |а<Зораторных исследований, а также широко применяются в икроОиологической промышленности. Хотя к настоящему времени они :орошо изучены генетически и биохимически, использование [ульс-электрофореза открыло новые возможности для изучения сдельных хромосом и манипулирования с ними. С помощью этого [втода стало возможным определение локализации генов в ДНК ромосом, анализ больших (до 400 т.п.о.) клонируемых фрагментов ЦК в составе векторов типа YAC, крупномасштабное физическое :артирование генома, изучение отдельных структур хромосомы, а так te сравнительная характеристика кариотипов различных видов и юдов дрожжей. Последняя возможность особенно перспективна при шапизе промышленных штаммов дрожжей.

Мы применили пульс-электрофорез для изучения последствий итеграции рекомбинантной плазмида pYF91 в дрожжевые хромосомы, "анее в лаборатории были изучены генетические последствия итеграции этой плазмида в Хромосомы дрожжей (Булат, 1984). В результате этих исследований была создана коллекция штаммов, у вторых плазмида интегрирована в большинство хромосом.

В нашей работе предполагалось осуществить с помощью PPG юлекулярный анализ последствий интеграции плазмида pYF9l в геном [рожжей сахаромицетов. Результаты исследования представлялись южными также и для разработки подходов к изучению отдельных рюмосом дрожжей.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы была

идентификация дрожжевых хромовом, в которые произошла интеграция плазмида (химерных хромосом), и хромосом с делениями методом пульс-электрофореза в сочетании с другими биохимическими методами. В связи с этим конкретные задачи были таковы:

1. Апробирование пульс-электрофоретического аппарата конструкции Д.Р.Беригашвшш, отличающегося геометрией электродов от известных аппаратов, описанных в литературе. Разработка оптимальных условий разделения ДНК хромосом дрожжей сахаромицетов с использованием этого аппарата.

2. Идентификация химерных хромосом, в составе которых содержится интегрированная плазмида pTF91, методом пульс-электрофореза.

3. Изучение перестроек I химерной хромосомы, индуцированных 7-облу чешем, методом пульс-электрофореза.

Научная новизна и практическая ценность. В настоящей диссертационной работе разработаны условия

электрокариотипирования дрожжей на пульс-электрофоретическом аппарате, представляющем собой модификацию известных конструкций. Подобраны условия разделения ДНК дрожжевых хромосом легких, средних и тяжелых весов отдельно для каждой весовой фракции. Определены размеры ДНК легки:, дрожжевых хромосом лабораторного штамма 6-Д3005 Гатчинской коллекции, совпавшие с размерами ДНК хромосом дрожжевого штамма Х2180-1В, на котором проводились первые исследования по идентификации хромосом дрожжей S.cerevlalae.

Наш предложен способ визуальной идентификации химерных хромосом в ^ектрокариотипе дрожжей сахаромицетов на материале kojглекцда штаммов с интегрированной плззмидой.

С использованием метода пульс-электрофореза нами были обнаружены перестройки типа делеций в I химерной хромосоме индуцированные 7-облучением.

Результаты работы подтверждают адекватность метода пульс-электрофореза задаче визуального наблюдения за изменениями ДНИ, происходящими на хромосомном уровне.

В практических целях опыт данного исследования может использоваться при работе о промышленными штаммами дрожжей, претерпевающими в ходе многолетней селекции кариотипические изменения, относящиеся либо к числу хромосом, лчбо к их структуре (делеции, инсерции, транслокации).

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались или представлялись на школе-семинаре "Молеку эрная генетика"дрожжей, Петергоф, 1989 г; VII Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов", Москва, 1990 г.; семинаре кафедры генетики ЛГУ, 1990 г.; семинарах ЛИЯФ АН СССР в Отделе молекулярной и радиационной биофизики, 1989-1990 гг.

Публикации. По тбкй диссертации опубликовано 5 статей.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения; обзора литературы по теме исследования; главы, посвященной описанию использованных материалов и методов; трех глав, содержащих экспериментальные результаты; заключения и выводов. Работа изложена на 128 страницах машинописного текста; содержит 20 рисунков, 2 таблицы. Список используемой литературы включает 134 наименования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе при анализе методом пульс-электрофореза использовались следующие штаммы дрожжей S.cerevtatae Гатчинской коллекции: штамм 6-í3005/pYF91 с генотипом clrf МАТа Ieu2-3,112 ura3 /LEU2/, являющийся исходным трансформантом при получении штаммов интегрантов, содержащих интегрированную в дрожжевые хромосомы плазмиду pYF91; штамм 6-Д3005, не содержащий плазмиду pYF91, использованный для идентификации ДНК хромосом и оценки их' размеров; штаммы-интегранты: T-II-8-9, T-II-8-22C, T-II-8-22B, T-II-8-10, Т-2-8-51 , T-II-8-190, T-II-125, Т-2-269, T-II-3T3, T-II-8-289 с генотипом с1г° МАТа 1еи2-3,112 игаЗ pLEU2, содержащие плазмиду pYF91, интегрированную в хромосомы I, III, IV, V, VII, VIII,IX, XI, XV, соответственно; штамм ЗА-ДЭ061 генотипа с!г° МАТа leu2 adel, применяемый при скрещиваниях с 7-облученными клетками штамма T-II-8-9 (интегранта по I хромосоме); штаммы 51ДА-Д3021 с генотипом cir° МАТа 1еи2-3, 112 adel-14 pLEU2 и st2 с генотипом cir° МАТа leu2,3-112,ade1-H pLEU2, содержащие интегрированную плазмиду pYT91, использованные в качестве контрольных штаммов в опытах по молекулярной гибридизации колоний; штамм Д-3064 с генотипом cir° МАТа /МАТа Ieu2/lcu2 ade1/ADE1 игаЗЛШЗ pLEU2, используемый в опытах при разделении хромосомных ДНК пульс-электрофорезом как контрольный

штамм; штамм г. col i НВ101 с генотипом leuB pro thl nfr~endo~recA, используемый для трансформации рекомбинантными плазмидами (получен из ВНИИ генетика).

В работе также • использовались следующие рекомбинантные плазмида: эписомной плазмидой pYF91 (Storms et.al., 1979) трансформировали клетки дрожжей для получения штаммов интегрантов; плазмида YRpl 4/ARS1/CEN1 (Hleter et.al.,1985), pUC8/ADE1 (получена от Г.К.Гедминене, НПО "Фермент", Вильнюс), оср1 (получена от В.Л.Ларионова, НИН АН СССР, Ленинград) использовали для получения радиоактивно меченных проб в опытах по Саузерн-гибридизации.

Трансформацию клеток E.coll проводили по методу Барнеса (Barnes, 1977). Трансформацию клеток дрожжей для получения штаммов-интегрантов проводили по методу, разработанному в нашей лаборатории (Захаров и др., 1984).

Плазмидную ДНК из клеток В.coli выделяли по методу щелочной экстракции (Blrnbolii, Doly, 1979). Тотальную ДНК из клеток дрожжей выделяли на нитроцеллюлозных фильтрах по методу Илгена и др. (Ilgen et.al., 1979). Препараты дрожжевой хромосомной ДНК для разделения пульс-электрофорезом получали по методу, описанному Шварцем л Кантором (Shwartz, Cantor, 1984). Маркерную "лестницу" ДНК фага К получали по методу, описанному Ван-Оммэном и Веркерком (Van Omen, Verkerk, 1986).

op

Внесение метки Р в ДНК плазмид или их фрагментов осуществляли в реакции ник-трансляции , описанной в сборнике мет зик по генной инженерш Маниатисом и др. (Маниатис и др., 1984).

Гидролиз ДНК плазмид рестринтазами проводили в условиях, рекомендованных поставщиком НПО "Фермент" (г.Вильнюс). Элюцию фрагментов ДНК плазмид из агарозного геля , перенос ДНК хромосом дрожжей из агарозных гелей на нитроцеллюлозный и нейлоновый фильтры и последующую гибридизацию с мечеными пробами по Cayзерну осуществляли по стандартным методикам, описанным Маниатисом и др.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

1.Идентификация штамма, не содержащего свободно

ре иодирующуюся многокопийную 2 мкм плазмиду

Материалом диссортационного исследования послужила коллекция птаммов-интегрантов'! созданная в лаборатории генетики эукариот ПИЯФ АН СССР. Для получения штаммов- интегрантов , т.е. штаммов, :одержащих в хромосомах интегрированную эписомную плазмиду pYF91, клетки дрожжевого гаплоидного штамма 6-Д3005 cirf-reHOTima были трансформированы ДНК плазмида pYT91(Булат, Захаров, 1984). Генотипически колонии трансформантов, несущих плазмиду как в автономном, так и в интегрированном виде не отличались друг от зуга и единственным способом отбора интегрантов являлся анализ их :табильности. Особо нестабильный штамм T-II-8 был отобран Л.А.Захаровым. На основе этого штамма были получены интегранты по [, III, 17 и V хромосомам ^Булат, 1984). Косвенные генетические данные указывали на то, что у нестабильного штамма отсутствует 2 мкм плазмида.

Методом молекулярной гибридизации колоний нами было доказано отсутствие у штамма T-II-8 свободной 2 мкм плазмида. Суммарная IHK из клеток этого и контрольных штаммов была выделена на гатроцеллюлозных фильтрах и фильтр с ДНК использовался в опытах

ор

то гибридизации с радиоактивно меченной Р ДНК плазмида ocpl. Хлазмида ocpl содержит полные последовательности 2 мкм плазмида и глазмида'pBR322. Штамм T-II-8, не содержащий 2 мкм плазмиду, был использован для отбора интегрантов по I, II, III, IV, V, VI, VII, /III, IX, XI, XII, XV хромосомам (Яровой и др.,1987).

2.Доказательство физического сцепления плазмиды pYF91

с хромосомами дрожжей

Штаммы шести интегрантов: T-II-8-9, Т-П-Э-22С, T-II-8-22B, Г-И-8-10, Т—II—8—190 и T-II-8-289 (интегранты по I, III, IV, V, /II и XV хромосомам, соответственно) с генетически адентифицированными химерными хромосомами, были проанализированы методом молекулярной гибридизации колоний. Цель этого эксперимента заключалась в том, чтобы доказать, что плазмида pYF9I содержится в клетках отобранных интегрантов не в свободной !орме, а в составе хромосомы. Для этого предварительно били

подучены споровые сегреганты из двух полных тетрйд гибридов о скрещивания каждого интегранта со штаммом ЗА-ДЗОб1/с1г°. ДНК и культуры каждой споры была выделена на нитро^зллюлозных фильтрах Фильтр с ДНК использовался в опытах по гибридизации радиоактивно меченной 32Р ДНК плазмида рВН322. Результат молекулярной гибридизации показали, что гибридизационный сигна "сегрегировал" моногенно, в полном соответствии с поведение ллазмидного 1Е1)2 маркера. Это послужило доказательством того, чт во всех анализируемых штаммах-интегрантах плазмида пр образовании спор сегрегирует как хромосомный локус. Получении результаты согласуются с данными по генетическому картирован!! сайтов интеграции плазмида рУР91 (Яу-кп <98*)-

Мнтегранты с идентифицированными химерными хромосомами дале были проанализированы методом пульс-электрофореза.

3.Изучение штаммов-интегрантов методом пульс-электрофореза (РГС

Эксперименты по анализу штаммов-интегрантов дрокже 5.сегеи(а(ае выполнялись на пульс-элэктрофоретическом аппарате который отличается от известных, описанных в литератур констру. дай. Схема геометрии электродов предложен Д.Р.Еериташвили (ИМБ АН СССР, Москва) (рис. 1). Отличительно чертой данной геометрии электродов является ромбическо расположение 32 электродов с углом 120°. Такой электродный конту создает оптг -.альные условия разделения вмДНК в агарозном геле пргчем полосы разделенной ДНК дьижутся строго по прямой, вдол оси геля. Модифицированный РРС-аппарат был изготовлен в наше лаборатории Б.Ф.Яровым.

При разделении в пульсирующем поле ДНК хромосом дрожже (использовали различные штаммы-интегранты и контрольный итак 6-Д3005) было обнаружено, что для максимального разрешения ДI различных размеров требуется применение разных режимов разгоню1 Исходя из группирования полос ДНК в геле в условиг пульс-электрофореза, электрокариотип дрожжей был условно разделе на три фракции. К фракции легких хромосом отнесли ДНК, кменщ размеры 250-450 т.п.о.; к фракции средних весов - ДНК ( , размераг.ш" 450-800 т.п.о.; к фракции тяжелых хромосом - ДНК размерами сзОО т.п.о.-З млн.п.о. Предварительные значения размере

. - 00

А о о В о О О О

120

/ ° Г Оо

V, оо

о о

11 ]

Оо

°о О о

о о о о В* о О д+

расположит»! аппарате по ,В~ и А+,В+ -

Рис Л. Схема электродов в РРС -Д.Р. Бериташвили. к ряда электродов на анодах и катодах альтернативно-переключающихся полей.

хромосомы I

XI V-VIII

IX III

VI I

£7

- I

690 65с/^ |§й 600 580- ' , г

.'ги«1

450 440--

360 360280 280— 245 250-

Й

-А.' I

*'

Рис.2. Сравнение размеров ДНК хромосом (легких весов) гаплоидного штамма 6-Д 3005 и стандартного штамма Х2180-1В дрожжей Б. сетШае.

1 - размеры хромосомных ДНК штамма Х2180-1В по данным Карла и Олсона;

2 - результаты определения размеров хромосомных ДНК штамма

6-Д3005;

3 - электрокариотил штамма 6-Д3005;

4 - ДНК олигомеров фага Л.

ДНК были взята из литературных данных Карда и Одеона (Carle, Olson, 1987) по PFG-разделению ДНК дрожжевого штамма Х2180-1В.

Для каждой из трех принятых условно фракций ДНЗ экспериментально были подобраны оптимальные условия разделения, Оптимальный режим разделения ДНК легких хромосом дрожгэй, обозначенный как режим А состоит из трех этапов перенлючени) напряжения и длительности импульса: 1. напряжение - 170 в длительность импульса - 30 с , , продолжительность этапа 2 часа 2. напряжение - 170 В , длительность импульса - 50 с , продолжительность этапа 17 часов; 3. напряжение -110 В длительность импульса - 100 с , продолжительность этапа г часов; общая продолжительность PFG - 26 часов.

Для разделения ДНК фракции тяжелых хромосом использовало! режим В, также состоящий из трех этапов переключения напряжешн и длительности импульсов: 1. напряжение - 170 В, длительност] импульса'- 30 с. , продолжительность этапа 1 час; 2. напр'яжени!

- 170В, длительность импульса - 50 с , продолжительность этап; 2 часа; 3. напряжение - 110В, длительность импульса - 100 с , продолжительность этапа 41 час; общая продолжительность PIG - 4< часа.

Оптимальным режимом разделения ДНК всех весов является реки? С со следующими параметрами:1. напряжение - 170 Б, длительност] импульса - 50 с, продолжительность этапа 2 часа; 2.напряжени(

- НОВ, длительность импульса - 50 с, продолжительность этап! 17,5 часов; 3. напряжение - 110 В, длительность импульса—100 <

продолжительность этапа 27 часов; общая продолжительное^ РГ -47 часов.

Очевидно, при решении конкретных .задач следует выбирать тако! режим разделения хромосомных ДНК, при котором можно достич] максимального их разрешения.

4. Идентификация и определение размеров хромосомных ДМ

в электрокариотипе гаплоидного штамма 6-Д3005 методом PFC

Методом PFG были идентифицированы и определены размер хромосомных ДНК гаплоидного штамма 6-Д3005, который являла исходным при получении интегрантов. Определение размера ДН проводилось относительно конкатамерев ДНК фага X , размер! которых легкат в области от 50 т.п.о. до 1 млн.п.о. Полученны<

значения размеров ДНК оказались следующие: 245 т.п.о., 280 т.п.о., 360 т.п.о., 450 т.п.о., 600 т.п.о., 690 т.п.о. Сравнетк-полученных данных с данными размеров ДНК стандартного штамма Х2180-1В показало, что длины ДНК в этих штаммах близки, что дает возможность идентифицировать выявленные полосы, как конкретные хромосомы (рис. 2). Правильность идентификации отдельных хромосом была подтверждена Саузерн-гибридизацией ДНК штаммов-интегрантов по I, IV, ы V хромосомам с меченной 32Р рВИ322-пробой. Благодаря интеграции в хромосомы рекомбинантной плазмиды pYF91, химерные хромосомы оказались маркированными бактериальной

последовательностью pBR322. Методом блот-гибридизации по Оаузерну с меченной 32Р рВИ322-пробой была проведена идентификация ДНК трех химерных хромосом-I, IV и V. Выоор эъих хромосом бил обусловлен тем, что ДНК I и IV хромосом являются крайними полосами в электрокар:ытипе (нижняя и верхняя,соответственно), а ДНК V хромосомы лежит в области средних весов хромосом. На радиоавтографах, полученных в результате Са; зерн-гибридизации, радиоактивные сигналы указали положение ДНК химерных хромосом I, IV и V. Эти данные согласуются с результатами идентификации хромосомных ДНК в штамме 6-Д3005.

5.Визуализация интеграции

Интегранты по восьми хромосомам с идентифицированными генетическими методами химерными хромосомами (некоторые интегранты с картированными сайтами интеграции) были проанализированы пульс-электрофорезом. ДНК из штаммов T-II-8-9, T-II-8-22C, T-II-8-22B, Т-И-8-10, T-II-51, Т-И-125, Т-И-373, T-II-269 (интегранты по I, III, IV, V, VI, VIII, IX', XI хромосомам, соответственно) разделяли методом PFG в условиях режима С. В результате ■ электрокариотипирования штаммов-

интегрантов было обнаружено, что у пяти штаммов-интегрантов (по I, III, VI, IX и XI хромосомам) каждый из этих

электрокариотипов отличается от других местоположением единственной полосы ДНК. При сравнении с электрокариотипом

контрольного штамма 6-Д3005, не содержащего химерных хромосом, Сило установлено, что ДНК, изменившие (уменьшившие) свою подвижность в геле соответствовали именно той хромосоме, в которую по генетическим данным была интегрирована плазмида. Так, например, по отношению к маркерной À-олигомерной "лестнице" подвижность ДНК I химерной хромосомы меняется на интервал, равный 1/5 шага "лестницы". Таким образом, очевидно, что увеличение размера ДНК хромосом на 13,2 т.и.о. влияет на ее подвижность и это четко фиксируется пульс-электрофорезом (рис- 2>).

Благодаря пульс-электрофорезу, мы обнаружили химерность XI хромосомы в штамме T-II-8-3T3, генетический анализ которого давал неоднозначные результаты.

Из проанализированных интегрантов не удалось показать видимого различия электрокариотипов интегрантов по IV, V и vin хромосомам. ДНК IV хромосомы находится в зоне, где изменение размера ДНК на небольшую величину в данной. PFG-системе не фиксируется, а ДНК V и VIII хромосом по неизвестным причинам идут в составе одного дуплета.

Пульс-электрофоретическое изучение штаммов - интегрантов позволило нам убедиться в высокой чувствительности этого метода: инсерция последовательности размером 13,2 т.п.о. составляет всего 2-5% от размера хромосомной ДНК, в которую она интегрирует, и тем не менее,обнаруживается при электрофорезе.

Изученная коллекция интегрантов с идентифицированными химерными хромосомами может служить в качестве источника весовых маркеров в работе по отбору новых интегрантов и идентификации химерных хромосом или хромосомных перестроек у дрожжей методом PFG. В этом случае химерные хромосомы можно будет отбирать визуально, без дополнительных гибридизационных экспериментов с мечеными пробами клонированных генов для подтверждения интеграции!

6.Изучение хромосомных перестроек, индуцированных

Т-облучениам. в клетках штамма-интегранта по I хромосоме

В лаборатории генетики зукариот ЛШФ АН ССС1 проводились работы по созданию селективных систем для отбора перестроек в хромосомах дрожжей, индуцированных 7-облучением. Созданная коллекция интегрантов позволила использовать в такой системе

1Г

сг

аг

Рис.3. Визуализация интеграции плазмиды рУТ91 в хромосомах дрожжей 5. сегец1з1 ае (схема электрокариотипов штатов -

интегрантов по I, VI, III, IX и XI хромосомам).

А, В, С, Э, Е полосы,

соответствующие химерным

хромосомам I, VI, III, IX >, XI.

В

Рис.4. Схема отбора нестабильных клонов, получениях в результате 7-облучения:

1. Рекомбинация плазмиды и I хромосомы.

2. I хромосома с интегрированной плазмидой.

3. у-оОлучение.

4,5. Предполагаемые перестройки хромосом (4 - кольцевая, 5 -хромосома без центромери).

6. Скрещивание со штаммом генотипа АРЕ1.

7. Предполагаемые хромосомные наборы нестабильных гибридов.

8. Секторные бело-красные колонии нестабильных гибридов.

гаплоидный штамм T-II-8-9, имеющий за счет интегрированной плазмиды pYF91 дополнительные маркеры в I хромосоме. Система позволяет отбирать аберрации, произошедшие в I хромосоме (Степанова и др., 198Т).

Эксперимент по отбору перестроек проводился следующим образом (рис.4). Суспензию клеток гаплоидного штамма T-II-8-9 подвергали ^-облучению с дозой 4000 грэй, а затем скрещивали на селективной среде с клетками необлученного гаплоида ЗА-ДЭ061, несущего рецессивный маркер adel (красная окраска колоний). Селекцию проводили по ADE1 маркеру. На селективной среде вырастали белые колонии гибридов, прототрофные по ADE1 маркеру, и малочисленные розовые.• При рассеве на не селективной среде розовые колонии давали начало клонам трех типов: белым, красным и секторным. Доля красных колоний составляла 15-90%. При повторном клонировании секторных клеток такая нестабильность сохранялась. Следовательно, были получены гибриды, отличающиеся высокой нестабильностью.

В процессе эксперимента было отобрано 10 нестабильных гибридных клонов, в клетках которых, как оказалось, был нарушен и процесс мейоза (низкая выживаемость спор или отсутствие споруляции вообще).

Для анализа методом PFG из отобранных нестабильных клонов было взято 4 диллоида Н-1, Н-2.Н-4 и Н-5. В качестве контроля при PFG -анализе использовали необлученный диплоидный штамм Д-3064, содержащий в гетерозиготе I химерную хромосому. Полученные электрокариотипы нестабильных гибридов отличались от электрокариотипа контрольного штамма - в них отсутствовала ДНК I химерной хромосомы и появился новый фрагмент ДНК (K-фрагмент), расположенный в геле чуть ниже ДНК I нормальной хромосокы (рис.5 Этот фрагмент во всех анализируемых образцах имел одинаковый размер. Было также обнаружено, что в олектрокариотипе нестабильного диплоида Н-1 появилась новая полоса ДНК в области расположения' ДНК IX хромосомы и произошло небольшое изменение весов ДНК в области расположения ДНК тяжелых хромосом.

Сравнение размеров ДНК нестабильных гибридов с ДНК весового маркера А.-олигомерной "лестницы" показало, что ДНК Х-фрагмента имеет длину, равную приблизительно 160 т.п.о.

ДНК укороченного фрагмента далее анализировали методами PFC и Саузерн-гибридизации. в результате ' экспериментов по

13 х>

Саузерн-гибридазации ДНК Х-фрагмента с меченными СР фрагментами

ДНК плазмиты pBR322 было доказано, что Х-фрагмент является частью

I химерной хромосомы (ДНК Х-фрагмента гибридизосаласс г

рВИ322-пробой (рис.56). Далее в гибридизационных экспериментах

были использованы меченые пробы клонированных

последовательностей CENI и гена ADE1, локализованных в первой

хромосоме. Последовательность 0EN1, размером 1,7 т.п.о. была

получена в результате рестрикции HindIII рестриктазой ДНК

плазмиды YBp14/ARS1/CENI. Последовательность гена ADE1 была

представлена тремя фрагментами, образующимися в результате

рестрикции рестриктазами HindIII и Sali плазмиды

pUC-8(HindIII-PatI). Фрагменты . имели размеры : 300

п.о.(HlndIII-SalI-фрагмент), 600 п.о.(SalI-SalI-фрагмент), 2,2

т.п.о.(Sall-Sall фрагмент) я перекрывали вой последовательность

гена ADE1 (1.5 т.п.о.). Фрагмент Sall-Sall размером 600 п.о.

представлен последоватгльность», целиком гомологичной ADE1 гену,

а другие два фрагмента, кроме неполной последовательности АБЕ1

гена, содержат последовательности дрожжевой хромосомной ДНК. В

опытах по Саузерн-гибридизации ДНК Х-фрагмента с меченой пробой

CENI и тремя мечеными пробами ADE1 гена было показано, что CENI

проба не гибридизуется с ДНК Х-фрагмента (рис. 5в), a ADE1 пробы

гибридизуются с ДНК Х-фрагмента (рис. 5г).

На основании результатов гибридизации стало возможным охарактеризовать укороченный фрагмент ДНК, образующийся под воздействием 7-облучения в клетках нестабильных клонов. Х-фрагмент является последовательностью, гомологичной последовательности ДНК химерной хромосомы, что следует из наличия в его составе бактериальной последовательности pBR322 и ADE1 гена, принадлежащих I химерной хромосоме. Однако в составе Х-фрагмента отсутствует последовательность CEN1, это може т свидетельствовать либо о делеции лрицентромерной области хромосомы, либо о потере целого плеча хромосомы.

Денситометрический анализ автографов, полученных в результате Саузерн-гибридизации с ADE1 пробами, показал, что отношения интенсивностей ДНК хромосомы и ДНК. Х-фрагмента для образцов Н-1,Н-2,Н-4 и Н-5 были 1:2, 1:11, 20:1, 1:22,соответственно. Это означает, что в клетках штамма Н-1 на одну хромосому приходится в среднем '2 копии Х-фрагмента; в клетках штамма Н-2 на одну

Рис.5. Гибридизация ДНК укороченного фрагмента I химерной хромосомы с меченными ^Р пробами. £.Гель (1% агароза), полученный в результате пульс-электрофоретического разделения ДНК необлученного диплоидного шта»ша ЗА-ДЭ061 с.1 химерной хромосомой (I) и нестабильных дигоюидов Н-1, Н-2, Н-4 и Н-5, соответственно (2-5)]б,в,г. Радиоавтографы, полученные в результате гибридизации по Саузерну ДНК из аналогичных гелей с пробами р1Ж322, СЕЛ/1, АБЕ1, соответственно. А - полоса, соответствующая ДНК укороченного фрагмента I химерной хромосомы. В - полоса, соответствующая ДНК I нормальной хромосомы.

<¿3 4 5" * г ' з ч ¡г 4 ц ъ ь

ромосому приходится в среднем 11 копий Х-фрагмента; в штамме Н-4 а 20 хромосом приходится в среднем 1 копия Х-фрагмента; в летках штамма Н-5 на одну хромосому приходится, в среднем 22 опии Х-фрагмента. Очевидно, нестабильные клоны отличаются друг т друга по копийности Х-фрагмента и по стабильности его охранения в клетках.

Различная копийг.ость и сам факт накопления укороченного рагмента ДНК в клетке привели нас к предположению о его ольцевой форме. Пространственная структура Х-фрагмента была ыяснена с помощью асимметричного РГС„ В асимметричном поле раектории движения кольцевой и линейной ДНК различаются Chaudhury, Chang, 1988). Мы модифицировали собственный'

г» ТТТГТТГ»ГРТ^ПТГТПТ»»

лектродом, что привело к образованию асимметричного поля, симметричным РРО были проанализированы ДНК нестабильных клонов -1, Н-2, Н-4 и Н-5. ¡-'эзультаты эксперимента показали, что ДНК -фрагмента движется в геле подобно линейным ДНК.

Таким образом, возникший в результате 7-об.гучения Х-фрагмент являющийся частью I хромосомы, потерявшей центромеру, но охранившей ген АБЕ1 и ДНК рВН322, интегрированную в. эту ромосому, имеет, скорее всего, линейную структуру. Необычное войство этой крупноразмерной структуры - способность акапливаться в клетках в большом числе копий, зероятно, является ледствием двух факторов: отсутствия центромеры, которая, как звестно, регулирует копийность реплицирующихся структур и аличия ориджина репликации 2 мкм плазмиды.

ВЫВОДЫ

1. Методом молекулярной гибридизации колоний дока'зано тсутствие автономно реплицирующейся 2 мкм плазмиды в дрожжевом тамме Т-11-8, что позволило на его основе создать коллекцию таммов с интегрированной в хромосомы плазмидой рУР91.

2. Плазмида рУГ91, интегрированная в хромосомы дрожжей, :аследуется в составе одной из пары гомологичных хромосом :одобно дрожжевому гену.

3. Подобраны оптимальные условия разделения пульс-электро-юрезом ДНК дрожжей сахаромицетов на пульс-электрофоретическом риборе модифицированной конструкции. Метод пульс-электрофореза

эффективен для анализа изменений в хромосомах, происходящих при интеграции плазмида и перестройках, индуцированных ч-облучением.

4. Методом пульс-электрофореза возможна визуализация интеграции плазмида pYF91, размером 13,2 т.п.о., в хромосомы дрожжей сахаромицетов. Выявлена интеграция плазмида в I, III, VI, IX, XI хромосомы. Генетический и биохимический методы дают однозначную непротиворечивую оценку последствий интеграции плазмида pYF91 в хромосомы дроккей S. cerevlalae.

5. Проанализирована структура укороченного фрагмента химерной хромосомы I, содержащегося в клетках нестабильных диплоидов. Фрагмент является частью химерной хромосомы I, потерявшей центромеру, но сохранившей ADEI ген и бактериальную последовательность pBR322. Х-фрагмент является линейной структурой, размером около 160 т.п.о. Величина этого фрагмента у всех нестабильных диплоидов примерно одинакова.

6. Укороченный фрагмент химерной хромосомы I, образующейся в результате индукции 7-облучением, амплифицирован в клетках нестабильных диплоидов. Нестабильные клоны содержат различное число копий Х-фрагмента.

Основной материал диссертации опубликован в работах:

1. Булат С. А., Межевая Е. В. Генетическое изучение интеграции плазмид в дрожжевые хромосомы. Сообщение III. Отбор по фенотипу клонов дрожжей Sacchar(m/ce3 cerev laiae (Heyen ex Bansen), потерявших 2 мкм ДНК и их генетическое тестирование //Генетика. -1987. -Т.23. -С.421 -430.

2. Булат С. А., Межевая Е. В., Степанова В. П., Яровой Б. Ф., Захаров И. А. Генетическое изучение интеграции плазмид в дрожжевые хромосомы. Сообщение V. Картирование сайтов интеграции плазмида pYF91 //Генетика. -1987. -Т.23. -С.1407 -1413.

3. Межевая Е. В., Бериташвили Д. Р., Степанова В. П., Яровой Б.<5

Захаров И. А. Изучение интеграции плазмида pYF91 в дрожжевые хромосомы методом пульс-электрофореза //Биополимеры и клетка. -1990. -Т.6. -0^90-94.

4. Яровой Б. Ф., Степанова В. П., .Булат С. А., Межевая Е. В., Захаров И. А. Генетическое изучение интеграции плазмид в дрожжиьыа хромосомы. Сообщение IV. Интеграции плазмидн рУК91 в различные хромосомы дрожжей //Генетика. -1987. -Т.23.-С.431-438.

РТП ЛИЙФ,зак.962,тирЛ00,уч,-изд.л. 0,9; 29/Х-1991г. Бесплатно