Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция экспрессии генов и генетические перестройки при САЙТ-специфической рекомбинации в дрожжах SACCHAROMYCES CEREVISIAE

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Регуляция экспрессии генов и генетические перестройки при САЙТ-специфической рекомбинации в дрожжах SACCHAROMYCES CEREVISIAE"

московский государственный университет имени м.в.ломоносова

Биологический факультет

На правах рукописи УДК 577.218:575.113

с Ч А я с фессинг Михаил Юрьевич

регуляция экспрессии генов и генетические перестройки при саит-специфическои рекомоинации в дрожжах васснапонусез сепеу131ае.

03.00.03 - молекулярная биология

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических-наук

Москва 1995 г.

Р Г Б ОД

.1 V

Работа выполнена в лаборатории молекулярных основ онтогенеза Научно-исследовательского института физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова.

Научный руководитель: доктор биологических наук Г.И.Кирьянов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Я.И.Бурьянов доктор биологических наук А.А.Колесников

Ведущая организация: Институт общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН

Защита состоится 1995 г. в Ф^часоъ на

заседании Специализированного Совета Д.053.05.70. при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, ГСП-3, Москва, Воробьевы горы, Институт физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ, аудитория 536.

• С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан: 1995 г.

/

- ' /

Ученый секретарь

специализированного совета л^' .

кандидат биологических наук В.Н.Каграманов

общая характеристика работы

Актуальность проблемы. В последнее десятилетие были достигнуты значительные успехи в трансформации и трансфекции клеток высших эукариот. Однако для решения многих задач мало ввести в клетку нужную последовательность ДНК: часто ее надо интегрировать в строго определенный локус генома (проблема генного таргетинга). Кроме того, для решения ряда задач может понадобиться осуществление высокоточных и регулируемых рекомбинационных обменов между введенной и геномной ДНК и между различными участками генома. Но использование эндогенной общей рекомбинации высших эукариот для решения таких проблем значительно осложнено тем, что в соматических клетках высших эукариот уровень хромосомальной негомологичной рекомбинации существенно выше уровня гомологичной рекомбинации. Кроме того, системы общей рекомбинации эукариот сложны и мало изучены.

Все это и стимулировало применение альтернативного подхода -использование сайт-специфической рекомбинации для осуществления регулируемых генетических перестроек в клетках высших эукариот. Это стало возможно благодаря высокой эффективности и относительной простоте таких реакций. Недавно ряд групп успешно использовал сайт-специфическую рекомбинацию для регуляции экспрессии генов и генного таргетинга в высших эукариотах (Golic and Linquist, 1989 ; Sauer and Henderson, 1989 ; Dale and Ow, 1990; Onouchi et al. , 1991; Sauer and Henderson, 1991; Fukushige and Sauer, 1992).

Регуляцию экспрессии генов обычно осуществляли посредством рекомбинационных делеций фрагментов ДНК. Генный таргетинг представлял собой интеграцию плазмида, несущей еводимый ген, в предетерминированный локус, содержащий соответствующий рекомби-национный сайт. Сегмент ДНК, фланкированный двумя рекомбинацион-ными сайтами в прямой ориентации, является субстратом или продуктом таких реакций. Альтернативной стратегией хромосомального таргетинга и регуляции экспрессии генов может стать использование инвертируемых сегментов ДНК в качестве субстрата для рекомбинаци-онного процесса. Регуляция экспрессии гена посредством смены ориентации его промотора или кодирующей области, расположенных на инвертируемых сегментах ДНК, встречается у прокариот и известна как регуляция по типу "смены фаз" (Rahman et al., 1985; Iida,

1984).

Недавне была осуществлена индукция генов посредством инверси их кодирующих областей с помощью Сге рекомбиназы фага pi (Dale and Ow, 1990) И рекомбиназы пдазмиды pSRl Z.rouxii (Onouchi et ai., 1991) в культуре клеток табака. Однако возможности регуляци экспрессии генов по типу "смены фаз" в эукариотических клетках остаются практически неизученными, хотя регуляция экспрессии генов посредством рекомбинационных делеций исследуется в последние годы очень интенсивно. Кроме того, использование инвертируемых сегментов ДНК может значительно повысить эффективность генного таргетинга. Для этого с помощью сайт-специфической рекомбинации можно было бы замещать инвертируемые сегменты, расположенные на хромосомах, на сегменты, расположенные на плазмидах, т.е. осуществлять генетические обмены по типу "смены сегментов". Основная проблема генного таргетинга посредством сайт-специфической рекомбннационной интеграции состоит в нестабильности интегранта, т.к. он легко делетирует за счет внутримолекулярного рекомбинаци-онного процесса между фланкирующими его рекомбинационными сайтами (Huang et ai., 1991). Использование для генного таргетинга смены сегментов ДНК позволит добиться стабильной интеграции генов, т.к. интегрировав в хромосому, инвертируемый сегмент не может из нее делетировать, будучи фланкированным рекомбинационныш сайтами в противоположной, а не в прямой относительной ориентации.

Цель работы. Изучение возможностей применения системы сайт-специфической рекомбинации 2 мкм плазмиды s. cerevisiae для регуляции экспрессии генов по типу "смены фаз" и генетических обменов по типу "смены сегментов" в эукариотических клетках и анализ фак-ров, влияющих на эффективность процессов такой регуляции, с использованием в качестве модели эписомальных дрожжевых плазмид.

Научная новизна и практическая значимость. Впервые была осуществлена регуляция гена по типу "смены фаз" с помощью рекомбннационной системы 2 мкм плазмиды s.cerevisiae. Использование в качестве модели эписомальных дрожжевых плазмид позволило оценить влияние ряда факторов на эффективность такой регуляции. В частности, установлено, что наличие последовательности рекомбинацион-ного сайта frt между промотором и структурной частью регулируемого гена не влияет на эффективность экспрессии последнего в дрож-

жевых клетках.

Впервые осуществлены регулируемые генетические обмены по типу "смены сегментов" с помощью сайт- специфической рекомбинации в эукариотических клетках. Показана высокая эффективность использования положительной селекции сегментов при данном способе регуляции генетических обменов в дрожжах. Предложено использовать генетические обмены по типу "смены сегментов" для осуществления генного таргетинга в клетках эукариот.

Полученные результаты носят приоритетный характер и имеют важное значение для дальнейшего изучения регуляции экспрессии генов и генетических перестроек при сайт-специфической рекомбинации в эукариотических клетках и контролируемой модуляции активности эукариотических генов.

Аппробация работы. Материалы работы представлялись на семинарах лаборатории молекулярных основ онтогенеза НИИ физико-химической биологии им. Белозерского, кафедры химии природных соединений химического факультета МГУ им. Ломоносова и отделения био-хии Висконсинского университета (г. Мадисон, США).

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на {03 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение результатов, выводы и список цитируемой литературы. Работа проиллюстрирована 7 рисунками и 2 таблицами. Список цитируемой литературы содержит 122 наименования.

СОДЕРЯАНИЕ РАБОТЫ

Регуляция экспрессии гена по типу "едены фаз" с помощью реКОЛбинаЗЫ П.Р б дрожжах Я. сеге^ая1ае.

Схема эксперимента по исследованию генетических перестроек, осуществляемых с помощью рекомбиназы и,р в дрожжах Я. сегеу1з1ае.

Для изучения возможностей регуляции экспрессии генов по типу "смены фаз" и генетических обменов по типу "смены сегментов" в эукариотических клетках мы использовали рекомбинационную систему 2 мкм плазмиды дрожжей я. сеге^я^ае. Она относится к системам тг^-типа и ее функционирование требует наличия единствен-

з

ного бежа - рекомбиназы flp и простых рекомбинационных сайтов frt (McLeod et ai., 1986). Ранее была показана способность реком-бшазы flp катализировать эффективные генетические обмены в клетках ВЫСШИХ эукариот (Golic and Linquist, 1989; O'Gorraan et al., 1991).

В качестве модели в наших экспериментах мы использовали эпи-сомальные плазмиды дрожжей, содержащие инвертируемый сегмент с геном неомйцинфосфотрансферазы . и (nptii), обеспечивающим устойчивость клеток дрожжей и высших эукариот к антибиотику гине-тецину G418 при соединении С активным промотором (Webster and Dickson, 1983). Индукция гена nptii происходила в результате его соединения с промотором после рекомбинационной инверсии, осуществляемой flp рекомбиназоЯ (рисЛА). Если инвертируемый сегмент первоначально находился в прямой, экспрессируемой ориентации, то инверсия приводила к репрессии активности маркерного гена. Источником рекомбиназы flp служила эндогенная 2 мкм плазмида используемого В работе [cir+] штамма дрожжей S.cerevisiae SKY594. Поскольку в данных условиях синтез рекомбиназы протекал постоянно, то инверсия сегмента происходила сразу после трансформации. Поэтому для определения уровня экспрессии репортерного гена в отсутствии инверсии содержащего его сегмента мы использовали делеционные производные наших конструкций, в которых инверсия невозможна (рисЛА).

Клетки, содержащие 2 мкм плазмиду, были использованы наш также для исследования индуцированных flp рекомбиназой генетических замещений (генетических обменов по типу "смены сегментов"). Как трансформирующие плазмида, так и эндогенная 2 мкм плазмида содержат инвертируемые сегменты ДНК, фланкированные frt сайтами в противоположной друг к другу ориентации. Межмолекулярная рекомбинация с участием этих сайтов может приводить к образованию химерных плазмид в результате, смены инвертируемых сегментов посредством двойных реципрокных обменов. Такие обмены приводят к замещению последовательности nptii гена фрагментом 2 мкм плазмиды и фрагмента 2 мкм плазмиды последовательностью nptii гена (рис.IB).

Для анализа регуляции экспрессии nptii гена с помощью рекомбиназы flp в дрожжах мы использовали фенотипическую систему де-

JbN,.-CTCl

A

Рис.1 А,В. Смена ориентации и замещение гена nptii под действием рекомбиназы flp. А. Присутствие или отсутствие второго интактного сайта frt определяет способность (слева) или неспособность (справа) гена nptii инвертировать относительно промотора GALCYC. Стрелками обозначено направление нормальной транскрипции. atrf - частично делетированный сайт frt.

В. Двойной реципрокный обмен между 2 мкм плазмидой и плазмидами pugfneoi(1-2) под действием рекомбиназы flp. Показан Hindin фрагмент 2 мкм плазмиды, использованный в качестве зонда при анализе ДНК методом блотт-гибридизации по Саузерну. Характерные фрагменты, гибридизующиеся с этим зондом, также указаны. Обозначения рекомбинационных сайтов: Р, PvuII; к, Kpnl; Н, Hindill.

текции. Дрожжевые клетки, выращиваемые в присутствии глюкозы, при перенесении в галактозосодержащую среду начинают делиться только после адаптационного периода, длящегося 3-5 часов , необходимого для дерепрессии и индукции промоторов, контролирующих экспрессию генов, обеспечивающих утилизацию галактозы (Adams, 1972). Оказалось, что в присутствии G418 этот период увеличивается до недели и более и его продолжительность определяется эффективностью экспрессии гена nptii (рис.4). Таким образом, изучая кинетику роста дрожжевых трансформантов после их перенесения из глюкозной среды в галактозосодержащую среду с g418, можно судить об эффективности экспрессии в них гена неомишнфосфотрансфэразы п. Этот

метод позволил нам показать способность рекомбиназы flp обеспечивать регуляцию экспрессии генов по типу "смены фаз" в дрожжевых клетках и оценить влияние ряда факторов на эффективность такой регуляции.

Создание плазмид для изучения регуляции экспрессии генов по типу "смены фаз" с помощью рекомбиназы flp

В Дрожжах S. cerevisiae.

Для исследования возможностей регуляции экспрессии генов по типу "смены фаз" и генетических замещений типа "смены сегментов" с помощью рекомбиназы flp мы создали два семейства эписомальных дрожжевых плазмид: puG и рир. Схема их конструирования приведена на рис.2 (последовательность этапов конструирования - начиная с верхнего правого угла данного рисунка против часовой стрелки). Результаты конструирования каждой плазмиды проверялись и подтверждались с помощью рестрикционного картирования ( данные не приведены). В плазмидах семейства puG регулируемый ген nptii контролируется промотором galcyc (рис.4В), а в плазмидах рир -cis-ахтиваторной последовательностью гена фосфоглицеринкиназы (UAspGK) (рис.4В), обладающей очень высокой промоторной активностью даже В отсутствии промоторного кора (Ogden et al., 1986).

Сначала 2 мкм.плазмида была получена нами с помощью препаративного электрофореза суммарной дрожжевой ДНК, выделенной из штамма SBY251. Затем ее клонировали в Psti сайте плазмиды pucis (Norrander et ai., 1983). Полученную плазмиду назвали pCVUlO (рис.2) и использовали далее в качестве источника последовательности frt сайта и для получения фрагментов 2 мкм плазмиды, послуживших нам в качестве зонда при исследовании ДНК дрожжевых трансформантов методом блотт-гибридизаци по Саузерну. Структура плазмиды pcvuio соответствует л-форме 2 мкм плазмиды (рис.2) (Voikert et ai.,1989), причем STB (raf) область последней располагается проксимально Hindin сайту последовательности pucis в составе pcvuio (рис.2).

Последовательность frt сайта была очищена с помощью препаративного агарозного гель-электрофореза в виде Hindin фрагмента плазмиды pcvuio длиной 900 п.о.Затем полученный фрагмент гидроли-зовали рестриктазой aiui и последовательность frt сайта клонировали в виде фрагмента длиной 166 п.о. в линеаризованной рестрик-

Рис. 2. Схема конструирования плазмид, использованных в работе. Стрелками обозначено нормальное направление транскрипции

п

гена nptii. ura3, leu2-d, Amp - селективные маркеры, repi, rep2, flp и raf - ГеНЫ 2 mkm плззмиды. galcyc - промотор galcyc, pgk-uas,,™, 2 и - STB область и ориджин репликации 2 мкм плазмиды,

FCjK

необходимые для автономной репликации и стабилизации плазмиды в [cir+] клетках, orí - бактериальный ориджин репликации, msc -полилинкер для клонирования. На карте плазмиды ррм 6.6 обозначены лишь наиболее важные для настоящей работы сайты узнавания рестриктаз sau за и Drai. Сайты узнавания рестриктаз обозначены следующим образом: a, AIuI; в, BamHI; Bg, BglII; d, Drai; h, Hindlll; K, Kpnl; P, Pstl; Sc, SacI; Sal, Sali; Su, Sau ЗА; S, Smal; X, Xbal; Xh, Xhol.

тазой smai плазмиде pucis. В результате были получены плазмиды pfrt(r) и pfrt(L), отличающиеся ориентацией клонированного фрагмента относительно последовательности вектора (рис.2). В плазмиде pfrt(r) frt сайт расположен таким образом, что два участка связывания frt рекомбиназы, лежащие в прямой относительной ориентации в его составе, направлены от ватш сайта к xbai сайту последовательности вектора pucis, если принимать за их направленность направление к спейсерному участку рекомбинацион-ного сайта (рис.2). BamHi - Bgiii фрагмент плазмиды psv2neo (Southern and Berg, 1982), содержащий ген nptii и сигнал поли-аденилирования из ранней области вируса SV4 0 (на рисунках обозначен как терминатор генов вируса sv40), был введен в BamHi сайт плазмиды pfrt(R). Полученные плазмиды pFRTneo+ и pFRTneo" отличаются ориентацией гена nptii (рис.2). Далее мы использовали их для создания дрожжевых плазмид, содержащих ген nptii как в составе инвертируемых, так и неинвертируёмых сегментов ДНК.

Для конструирования эписомальных дрожжевых плазмид, используемых в наших экспериментах, мы взяли в качестве вектора плазми-ду YEpsecl (рис.4В) (Baldari et al., 1987). С одной стороны полилинкера в ней находится промотор galcyc, индуцируемый галактозой и полностью репрессируемый в присутствии глюкозы (Johnson and Davis, 1984), а с другой - последовательности терминатора гена flp и frt сайта (рис.2,- 4В). В результате гидролиза YEpsecl рестриктазой xbai происходит делеция части плазмиды с частичным разрушением сайта frt в ней. Лигирование xbai фрагмента pfrtneo" длиной 2,1 т.п.о. с оставшейся частью плазмиды YEpsecl приводит к соединению nptii гена с galcyc промотором и восстановлению разрушенного сайта frt. Полученная при этом конструкция названа нами pUgNEO (рис.2; 4В). Плазмиду pUgFneOl получили путем лигирования большого фрагмента, образующегося при совместном гидролизе YEpsecl рестриктазами SacI и BamHI, с Sacl - BamHI фрагментом pFRTneo"1" длиной 2,2 т.п.о. (рис.2). В этой плазмиде nptii ген клонирован между двумя инвертированными frt сайтами (рис.4В). Частичный гидролиз плазмиды puGFneoi рестриктазой xbai приводит к выреза фрагмента, содержащего ген nptii. Религирование продуктов гидролиза обеспечивает инверсию этого фрагмента с образованием плазмиды pügFneol-2 (рис.2;4В). полный гидролиз pUQFneol рестрик-тазой xbai приводит к частичной делеции одного из frt сайтов. При

религированш образующейся при этом рестрикционной смеси мы получили плазмиды pUgFneoiA и puGFneoiA-2, содержащие по одному ин-тактному и одному разрушенному сайту frt (рис.2; 4В).

Для клонирования pupFneoi-2 плазмиду ррмб,б(рис.2), любезно предоставленную М.Нистатом, подвергли совместному гидролизу рест-риктазами sau3A и Drai для получения uaspgk содержащего фрагмента длиной 340 п.о. Этот фрагмент лигировали с плазмидой рэьзоо (Brosius, 1989), предварительно совместно гидролизованной рест-риктазами smai и Bgin. В результате мы получили плазмиду pupi (рис.2). Плазмиду puQFneoi-2 обработали, рестриктазой xhoi. Полученную в результате линеаризованную плазмиду частично гидроли-зовали рестриктазой Kpni для удаления промотора cyc. Полученную таким образом плазмиду лигировали с saci - Kpni фрагментом pupi длиной 420 и.о., содержащим uaspgk. В образовавшейся при этом плазмиде pUpFneoi-2 cyc промотор оказался замещенным uaspgk (РИС.2;4В). Для получения плазмиды pUpNEO плазмида pUpFneol-2 была гидролизована рестриктазой xbai. В результате такого гидролиза весь участок от uaspgk (xbai сайт, находящийся в 3'-положении по отношению к uaspgk, был внесен с последовательностью полилинкера рбьзоо) до frt сайта, расположенного в 2 мкм части плазмиды, был удален. Причем этот frt сайт был частично разрушен в результате такой делении. Лигирование с xbai фрагментом pfrtneo- длиной 2,1 т.п.о. обеспечило соединение гена nptii с uaspgk и восстановление разрушенного frt сайта в образующейся в результате плазмиде pupNEO (рис.2,- 4В).

Неспецифическая промоторная активность Aiui фрагмента

2 мкм плазмиды, несущего frt сайт.

Мы ожидали, что плазмида puGFneoia-2 (рис. 4В ), несущая nptii ген в антисмысловой ориентации относительно промотора galcyc, не будет обеспечивать устойчивость дрожжевых трансформантов к антибиотику g418, так как в ней не может происходить инверсия nptii содержащего сегмента под действием flp рекомбиназы. Однако мы обнаружили низкий, но заметный уровень устойчивости к антибиотику у трансформантов sky594 (pugfneol^) (рис.4 ). В принципе, неомяцинтрансферазная активность в этих трансформантах может возникать в результате редкой инверсии сегмента, содержащего последовательность гена nptii, засчет гомологичной рекомбинации

между интактным гит сайтом и участком гит сайта, оставшимся после

делеции (обозначен как дтир на рис.1А ). С другой стороны,

устойчивость трансформантов 3^594(ри„Рпео1й-2) К С418 может быть

с?

5 4 -1

6

Рис. з. Анализ активности гена ырти в условиях репрессии промотора саьсус. Клетки высевали штрихом на уерб агар, содержащий 600 мкг/мл С418, и инкубировали 3 дня при 30°С.

SKY(pupNEO) (сектор 6) использовали в качестве примера сильной экспрессии гена nptxi на глюкозсодержащей среде.

связана с последовательностью, расположенной рядом с геном nptii. Оказалось, что эти трансформанты сохраняют небольшую устойчивость к G418 при выращивании на глюкозосодержащей среде (рис.3 ). При этих условиях экспрессия гена nptii не может индуцироваться промотором galcyc, так как он полностью репрессирован глюкозой (Johnson and Davis, 1984). Действительно, ТраНСфорМЭНТЫ sky59 4(puqneo) не способны расти на глюкозосодержащей среде в присутствии g418 (рис.3 ). Мы предполагаем, что aiui фрагмент 2 мкм плазмиды, содержащий frt сайт, обладает неспецифической промоторной активностью, поскольку клонирование.его между galcyc промотором и nptii геном в плазмиде pUgFneoiü обуславливает устойчивость трансформантов sky594(pU„Fneolü) к g418 в глюкозсо-

Сектора:

1.sky594(pU„NEO)

4. (pUgFneolA)

5. (pUgFneolü-2)

2.

(pUgFneol) (pUGFneolir)5,y

3.

держащей среде (рис.3 ). Наконец, равный уровень устойчивости к g418 На среде с ГЛЮКОЗОЙ ТраНСфОрмаНТОВ sky594(pUgFneol-2), (pUgFneolA), (pUgFneol-2) И (pUGFneolA-2) (рИС.З ) ТЭКЖе ОбуСЛОВлен промоторной активностью последовательности, содержащей frt сайт. Действительно, все четыре использованные для получения этих трансформантов конструкции несут интактный frt сайт левее 5'-конца гена nptii, независимо от ориентации последнего относительно промотора galcyc (делеционный сайт frt расположен правее 3'-конца гена nptii как в pu^fneoia так и в pugfneoia-2 плазмидах) (рис.4В).

Промоторная активность последовательности, содержащей frt сайт, была значительно ниже активности сильных промоторов galcyc и uaspgk, используемых в работе, и не помешала оценке эффективности регуляции экспрессии гена nptii (рис.4).

Регуляция экспрессии гена неомщинфосфотрансферазыи по типу "смены фаз" с помощью рекомбиназы flp в дрожжах s. cerevisiae.

Экспрессия гена nptii, контролируемая промотором galcyc в трансформантах SKY594(pugneo>, обеспечивает им довольно высокий уровень устойчивости к g418 в галактозсодержащей среде (рис.4 ). Плазмида puqneo содержит ген nptii, имеющий нормальную структуру (рис.4В ). Все остальные конструкции семейства ри„ содержат после-

о

довательность, несущую frt сайт, между промотором и кодирующей областью этого гена. Такая модификация структуры гена может влиять на эффективность его экспрессии и усложнить ее оценку. Сайт frt содержит инвертированные повторы (Senecoff et al., 1985), которые могут приводить к образованию шпилевидных вторичных структур в 5' нетранслируемой области м-РНК, образующихся в результате транскрипции такой модифицированной структуры гена. А наличие стабильных шпилек может вызывать снижение эффективности трансляции м-РНК в эукариотических клетках (Kozak, 1991). Кроме того, последовательность, несущая frt сайт, содержит в наших конструкциях atg триплет в 5' области по отношению к аутентичному atg триплету гена nptii, что также может приводить к снижению эффективности его экспрессии. Для того, чтобы выяснить насколько выражено влияние наличия последовательности, содержащей

Time (days)

—в-pUGNEO

IGAI -CYCl Гмти-► ! I... IT

у pUGFneo1

.....д.....pUGFneo1A

In«, cycl ^ISt.--I ДПОТ

. pUGFneoU-2

|CAL-;vc|i__

ZiTh^ I Tar. NPTIt I

|G«L-CYCI "~T|-Тт. I Ta-;l ТЯ*

FHT

.....Q.....püGFneo1-2

l"'l _,_EPT

TPFU.-al T..1 I--NPTll I ^

В_pUpNEO

IGÄLI fPGKl ШРТ11-»I Tfl >TPF

15лПГ5Нй1.

—Ф—pUpFneol -2

THF I '»ДI Terl

1ATSF on AMP _I^^EW-

ктьа^Г

■ -♦-YEpsecl В

«ftbHLbaJ^rRT a.

Рис. 4 A.B. Кинетика роста трансформированных клеток дрожжей в yepgai среде с g418. А. Трансформанты штамма sky594 были перенесены со среды sd-ura в среду yepgai, содержащую 70 мкг/мл 6418, и выращивали при 30°С и 160 об/мин. Титр культур определяли визуальным подсчетом клеток в камере Горяева. Каждая приведенная величина является средней после трех независимых экспериментов. Различия в значениях титров культур, полученные в этих экспериментах, не превышали 0,2 log(клеток)/мл.

В. Конструкции, используемые в эксперименте, teri и ter2 -терминаторы генов sv40 и flp соответственно. Все остальные обозначения такие-же, как на рис. I.

тт сайт между промотором и геном даты, на эффективность экспресс! последнего в нашей системе, мы создали плазмиду риспео1л (рис.4В). Подобно рисыЕо (рис.4В), в этой плазмиде ген даты находится в виде сегмента ДНК, неспособного к инверсии под действием рекомби-назы рър. Но плазмида ри0Рпео1й содержит последовательность, несущую гит сайт, между промотором саьсус и геном даты, в то время как р^дао такой последовательности не содержит. Исследования показали, что трансформанты 5КУ594(рисРпео1Л) и ЗКУ594(ри^ИЕО) ИМвЮТ одинаковый уровень устойчивости К С418 (рис.4 ). Таким образом, клонирование гит сайта между промотором и кодирующей областью гена в нашей системе не оказывает заметного влияния на уровень экспрессии этого гена.

Инверсия даты содержащего сегмента посредством рьр реком-биназы в трансформантах зку594(рисРпео1-2) обеспечивает им значительно больший по сравнению со зку594(рийРпео1д-2) уровень устойчивости к 0418 (рис.4 ). А инверсия этого сегмента в трансформантах бку594(рисРпео1) приводит к снижению уровня их устойчивости к 18 ПО сравнению СО эку594(рисРпео1Д) (рис.4). Причем уровень устойчивости к антибиотику у трансформантов зку594 (рисРпео1) и эку59 4(рисРпео1-2) оказался одинаковым и имел промежуточное значение по сравнению с трансформантами, содержащими неинвертируемый даты несущий сегмент в прямой и обратной ориентации относительно промотора (рис.4).

Мы также изучили индукцию гена даты при его инверсии относительно идзрск, использованного нами в качестве независимого промотора (Одс1еп оъ ах., 1986). Оказалось, что трансформанты эку594(рирРпео1-2) имеют более низкий по сравнению со бку594 (рирыЕО) уровень устойчивости к С418 (рис.4 ). Интересно, что скорость логарифмического роста трансформантов эку594(рирРпео1-2) в уерсэ1 среде с С418 после перенесения из зо-илА среды оказалась выше скорости роста ЗКУ594(рисРпео1) И ЭКУ594(ри^Рпео1-2) При одинаковой длительности адаптационного периода (рис.4 ), что может быть обусловленным более высокой промоторной активностью илзрск по сравнению с промотором саьсус.

Для анализа рекомбинационных перестроек, происходящих с используемыми плазмидами в дрожжевых трансформантах, мы изучили с помощью рестрикционного анализа структуру плазмид, выделенных из клеток е.соИ после их трансформации дрожжевой ДНК. Мы предпола-

гали, что рекомбиназа рьр, кодируемая эндогенной 2 мкм плазмидой, обеспечивает инверсию этти гена, заключенного между двумя гит сайтами в противоположной относительной ориентации. В результате такой инверсии в трансформантах эку594(рисРпео1-2) должны образовываться плазмиды рисРпео1 и, наоборот, в трансформантах бку594 (рисРпео1) - плазмиды рисРпео1-2. Анализ плазмид из клонов Е.соИ, полученных после трансформации бактериальных клеток дрожжевой ДНК, подтвердил присутствие рисРпео1 в БКУ594(рисРпео1-2) и рисРпео1-2 в эку594(рисРпео1) (табл.1). В обоих трансформантах плазмиды рисРпео1 и рисРпео1-2 содержатся в эквимолярных количествах. Это обусловлено особенностью используемой системы. Производные плазмиды Уерзес1, применяемые в работе, имеют высокую копийность во всех трансформированных клетках (ВаЫаг1 et а1., 1987). Т.к. эндогенная 2 мкм плазмида обеспечивает постоянный синтез рекомбиназы рьр, то устанавливается динамическое равновесие между плазмидами, несущими инвертируемые сегменты в обеих ориентациях.

Таблица I. Анализ клонов е.соИ, полученных при трансформации бактериальных клеток дрожжевой ДНК.а

Дрожжевые Тип плазмид, выделенных из е.соИ.

трансформанты Всего P"GFneo1 puGFi/22K(r)

pUgFneol-2 pUgFneol/2 2f_f (f)

SKY594

(pUgFneol-2) 114 50 45 8 11

SKY5 94

(pUgFneol) 102 45 41 9 7

аСуммарную ДНК из дрожжевых трансформантов, выращиваемых 5 дней в среде YEPGal с 70 мкг/мл G418, использовали для трансформации клеток е.coli. Плазмидную ДНК из бактериальных трансформантов выделяли и подвергали рестрикционному анализу. Числа представляют собой количество случайно выбранных колоний е.соИ, содержащих указанную плазмиду.

Мы также проанализировали популяцию плазмид в трансформантах БКУ594 (ри„?пео1Д-2) . Все 70 КЛОНОВ Е.соИ, полученных после трансформации бактериальных клеток дрожжевой ДНК, содержали только плазмиду рисрпео1д-2. Таким образом, инверсия ырти содержащего сегмента в нашей системе осуществляется специфически рекомбиназой и<р. Мы не обнаружили инверсии засчет гомологичной рекомбинации между последовательностями, содержащими интактный и делеционный гит сайты, в наших конструкциях.

Таким образом, рекомбиназа рьр способна эффективно регулировать гены по типу "смены фаз" в эукариотических клетках.

Осуществление генетических обменов по типу "едены сегментов" с помощью реколбиназы гьр в дрожжах г. сеге^1з!ае.

Генетические обмены по типу "смены сегментов", осуществляемые с ПОМОЩЬЮ, рекомбиназы рьр в дрожжах Я. сегеу1э1ае. В трансформантах зку594 (ри^пеоз.) и бку594 (рисгпео1-2) эндогенная 2 мкм плазмида служит не только источником рекомбиназы рьр, но и содержит второй инвертируемый сегмент, который несет гены рьр и яер2. Двойной реципроКный обмен между гит сайтами, фланкирующими инвертируемые сегменты ДНК, расположенные на разных плазмидах, должен приводить к обмену этих сегментов с образованием химерных плазмид (рис. 1В). Так, должны образовываться, конструкции ри^Бпео1/2(г) и риеРпео1/2), содержащие инвертируемый сегмент из 2 мкм плазмиды, несущий гены рьр и иер2. Эти плазмида отличаются ориентацией сегмента относительно промотора саьсус. Кроме того, должны образовываться производные 2 мкм плазмида, содержащие ирти несущий сегмент (рисЛВ).

При анализе клонов е.соИ, полученных после трансформации бактериальных клеток ДНК, выделенной из трансформантов зку594

(рисРпео1) И ЭКУ594(риеРпео1-2) ПОМИМО ПЛЭЗМИД рисРпео1 И

рисРпео1-2 МЫ Обнаружили плазмиды ри^пес^/г 2ц(Г) И риаРпео1/2 2ц.(£) (табл.1). Их строение мы подтвердили с помощью рестрикцион-ного анализа. Набор фрагментов, образующихся при гидролизе этих плазмид рестриктазами хъа1 и ЕсоЕ1 соответствует ожидаемому на основе теоретических расчетов (рис.5).

Таким образом, рекомбиназа рьр осуществляет в дрожжевых клетках не только внутримолекулярную реакцию инверсии сегментов

ДНК, фланкированных сайтами гит в противоположной относительной ориентации, но и осуществляет межмолекулярные обмены инвертируемыми сегментами ДНК. Мы предлагаем использовать такие обмены в эукариотических клетках для регулируемых генетических замещений по типу "смены сегментов" и для осуществления генного таргетинга.

Рис. 5 А,В. Замещение гена nptii фрагментом г плазмиды под действием рекомбиназы flp. а. Ожидаемые рестрикционные карты ре-комбинантных плазмид. xbai и е - рестрикционные сайты xbai и Eco ri соответственно.

В. Рестрикционный анализ плазмид pugf 1/2 гщг) (дор. 2,4) и ptiçF 1/2 2 д(f) (дор. 3,5). Плазмидаую ДНК гидролизовали рестрик-тазами ecori (дор. 2,3) и xbai (дор. 4,5). В дор. I находятся продукты гидролиза ДНК фага а рестриктазой BstEii.

Селекция инвертируемых сегментов ДНК при регуляции генетических обменов по типу "смены сегментов", осуществляемой с помощью рекомбиназы flp в дрожжах Для исследования возможностей селекции инвертируемых сегмен-

т.п.о.

о- _ s,e

Hpl —

Рис. 6. Исследование соотношения копийностей инвертируемых сегментов ДНК с помощью блотт-гибридизации по Саузерну. Суммарную ДНК трансформантов SKY594(puGFneoi-2), выращиваемых 5 дней в среде YEPGal с 70 мкг/мл G418 (дор. I) или 3 дня в среде sd-ura (дор. 2) после первичной селекции на sd-ura среде, подвергали совместному гидролизу рестриктазами Kpni и pvuii, продукты гидролиза разделяли с помощью электрофореза в 0,7% агарозном геле, переносили на нейлоновый фильтр и гибридизовали с радиоактивно-меченным Hindin фрагментом 2 мкм плазмиды длиной 1,3 т.п.о., как описано в Материалах и методах.

тов ДНК при их обменах под действием сайт-специфической рекомбинации МЫ использовали трансформанты SKY594(pU„Fneol-2). Эти клетки содержат два инвертируемых сегмента, фланкированных сайтами frt: nptii содержащий из плазмиды pugfneoi-2 и rep2,flp содержащий из эндогенной 2 мкм плазмиды (рис.1В). Мы изучили соотношение копийностей этих сегментов при выращивании трансформантов в различных средах, как показатель наличия селекции сегментов. Для этого ми использовали два метода: рестрикционный анализ плазмид из клонов е. coli, полученных при трансформации бактериальных клеток суммарной ДНК дрожжевых трансформантов, и исследование такой ДНК с помощью блотт- гибридизации по Саузерну. При трансформации

клеток е. сои суммарной ДНК дрожжей селектируются puG плазмиды и разрешаются их коинтеграты друг с другом и с 2 мкм плазмидами (мы использовали гесл+ штамм е.coli NM522). Таким образом, этот метод позволяет нам оценить соотношение копийностей сегментов в плазмидах pugf.

При исследовании дрожжевой ДНК с помощью блотт-гибридизации по Саузерну мы использовали в качестве зонда радиоактивномечен-ный Hindin фрагмент 2 мкм плазмиды длиной 1,3 т.п.о., не гибри-дизующийся с плазмидами puGF (рис.1В). Это позволило нам определить соотношение копийностей сегментов в производных 2 мкм плазмид и их коинтегратов. Т.к. 2 мкм плазмида и ее прооизводные в дрожжевых клетках присутствуют в основном в мономерной форме

Таблица 2. Анализ клонов е.соИ, полученных при трансформации бактериальных клеток дрожжевой ДНКа.

Среды,.в Тип плазмид, выделенных из е.соИ

которых -----------------------------------------------------

выращивали ри^пеог-г рисп/2 211(1)

дрожжевые Всего

клетки ри^пео! рисР1/2 2ц(г)

SD-URA 77 7 5 35 32

YEPGal+G418 114 50 45 8 11

SD-URA

ПОСЛе 70 25 33 7 5

YEPGal+G418

Суммарную ДНК из дрожжевых трансформантов Б^594 (рисгпео1-2), выращиваемых 3 дня в среде бо-цка, 5 дней в среде YEPGal с 70 мкг/мл С418, или 3 дня в среде зо-1ша после инкубации в течение 5 дней в среде YEPGal с 70 мкг/мл С418, была использована для трансформации клеток е.соИ. Числа представляют собой количество случайно выбранных бактериальных колоний, содержащих указанные плазмиды.

(Petes and Williamson, 1975), ГО МЫ МОЖвМ ОЦвНИТЬ СООТНОШвНИе

копийностей сегментов с помощью этого метода в 2 мкм плазмидах и их производных, которые не селектируются при трансформации в е. сои. На радиоавтографе при этом хорошо различимы три характерных сигнала (рис.6): один - от фрагмента длиной 6,1 т.п.о., соответствующего интактной 2 мкм плазмиде и ее коинтегрантов с плазмидами pugfi/2 2ц, два других -от фрагментов длиной 2,9 и 1,7 т.п.о., выщепляемых из производных 2 мкм плазмиды, содержащих NPTii несущий сегмент в различных ориентациях (рис.IB).

Сначала мы определили соотношение копийностей инвертируемых сегментов в трансформантах skys94(pugfneoi-2) после их селекции и последующего культивирования в среде sd-ura. При этом оказалось, что rep2,flp несущий сегмент в таких клетках значительно преобладает, о чем свидетельствуют как результаты анализа клонов е.соИ (табл.2), так и данные исследования дрожжевой ДНК с помощью блотт-гибридизации по Саузерну (рис.6, дор.2). Этого и следовало отдать, sd-ura среда не является селективной ни для одного из изучаемых инвертируемых сегментов. [cir+j клетки s.cerevisiae содержат ДО 60 копий 2 МКМ плазмиды (Futcher and Сох, 1983 ), а при трансформации попадает лишь одна или 2, 3 копии плазмиды pu„Fneoi-2. Таким образом, после трансформации в них значительно

U

преобладают rep2,flp содержащие сегменты из 2 мкм плазмиды. Это преобладание сохраняется при последующей селекции и выращивании трансформантов в sd-ura среде.

Затем мы определили соотношение копийностей инвертируемых сегментов после перенесения трансформантов из sd-ura среды в среду YEPGal, содержащую G418. Здесь селектируется nptii содержащий сегмент, обеспечивающий клеткам устойчивость к G4is. Он и преобладает в геномах растущих трансформантов (табл.2, рис.6, дор.1).

Для подтверждения сохранения соотношения копийностей инвертируемых сегментов в отсутствии их селекции мы определили соотношение их копийностей в трансформантах при их выращивании в среде sd-ura после переноса из yepgal среды с G418. При этом соотношение копийностей сегментов, установившееся в YEPGai/G4i8 среде сохраняется (табл.2, данные блотт-гибридизации по Саузерну не приведены).

Таким образом, использование подходящей селективной среды

1 п

позволяет эффективно селектировать целевые сегменты при регуляции генетических замещений по типу "смены сегментов" с помощью сайт-специфической рекомбинации в клетках эукариот.

ВЫВОДЫ

1. Для изучения возможностей регуляции экспрессии генов по типу "смены фаз" и генетических замещений типа "смены сегментов" с помощью рекомбиназы п,р в эукариотических клетках сконструировано два семейства эписомальных дрожжевых плазмид: рис и рир. В плазмидах рис регулируемый ген ырти находится под контролем промотора саьсус, а в плазмидах рир - под контролем с1з-активаторной последовательности гена фосфоглицерокиназы (идзрск).

2. Показана возможность регуляции экспрессии гена ырти в составе дрожжевых эписомальных плазмид посредством рекомбинацион-ной инверсии его кодирующей области относительно промотора. Таким образом, система сайт-специфической рекомбинации 2 мкм плаз-миды дрожжей Б.сегег181ае может использоваться для регуляции экспрессии генов по типу "смены фаз" в клетках эукариот.

3. А1и1 фрагмент 2 мкм плазмида, содержащий рекомбинационный сайт рлт, обладает в дрожжевых клетках неспецифической промоторной активностью. Уровень этой промоторной активности существенно ниже уровня активности таких сильных промоторов дрожжей, как саьсус в индуцирующих условиях и иабрск.

4. Клонирование А1ш фрагмента 2 мкм плазмиды, содержащего сайт ррт, между промотором и контролируемым им геном не оказывает заметного влияния на эффективность экспрессии последнего в дрожжах сеге^^ае.

5. Система сайт-специфической рекомбинации 2 мкм плазмиды дрожжей сегеУ131ае может использоваться для осуществления генетических замещений по типу "смены сегментов", т.е. путем ре-комбинационного обмена последовательностями ДНК, заключенными между двумя сайтами п^т в противоположной относительной ориентации, в клетках эукариот. Данный способ регуляции генетических перестроек предложено использовать в качестве нового метода осуществления направленной сегрегации экзогенных последовательностей ДНК в строго определений локус генома (генного тарге-тинга).

6. Показана высокая эффективность использования положитель-

ной селекции сегментов при осуществлении генетических обменов типа "смены сегментов" в дрожжах. Причем при отсутствии селекции для обоих обменивающихся сегментов соотношение их копийностей в геномах растущих клеток сохраняется.

1. S.V.Saveliev, M.Yu.Fessing, A.M.Kopylov, G.I.Kirjanov (1993) 'Phase variation' - type regulation of gene expression and

gene replacement mediated by FLP recombinase in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Curr Genet, V.24, p.p. ¿?6-31. -

2. M.Yu.Fessing, S.V.Saveliev, A.M.Kopylov, G.I.Kirjanov* Positive segment selection during 'Phase variation' - type regulation of gene replacement mediated by FLP recombinase in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Biochem and Mol Biol Int, in press.

работы, опубликованные по материалам диссертации