Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетическая характеристика мутантов дрожжей-сахаромицетов с нестабильностью природных хромосом

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Генетическая характеристика мутантов дрожжей-сахаромицетов с нестабильностью природных хромосом"

ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи УДК 502.202.23:576.316

11УЛЛДЗЕ Андрей Мамиевнч

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МУТАНТОВ.ДРОЖЖЕЙ-САХАРОКИНЕТОЗ С НЕСТАБИЛЬНОСТЬЮ ПРИРОДНЫХ ХРОМОСОМ

оз.ос.25 - Клеточная биология.

Автореферат диссертации на соискание ученсл степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ - 1992

■ Работа выполнена в Лаборатории генетики митоза Института цитологии Российской Акадаиии Наук.

Научный руководитель -доктор биологических наук В.Л.Ларионов.

,4 д Официальные оппоненты:

' доктор биологических наук 0.К.Глебов

кандидат биологических наук В.Т.Пенехонов

Ведущее учреждение - Институт молекулярной генетики РАН.

Завита диссертации состоится ао/Х'л1992 г. в^часов на заседании Специализированного совета Д.ооз;?з.о1., при Инст1 уте цитологии РАН по адресу» ... 194064 г. С.-Петербург, Тихорецкий проспект, 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.

Автореферат разослан 1?^МСгр^хЦ 1993 р.

Ученый секретарь Специализированного совета

кандидат биологических наук Л.Н.Писарева

©Институт цитологии РАН

I '' \ ' * ... . .. .

(

ссертацин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Дрожжи-сахаромицеты давно стали оаним из наиболее удобных объектов молекулярной и клеточной биологии. На модели дрожжей изучают матричные процессы, т. е. репликацию, транскрипцию и трансляцию, секрецию белков, проблему передачи сигналов клетками и многие другие аспекты жизнедеятельности клетки. Особую роль в клетке играют хромосомы, являясь носителями генетической информации. Процесс воспроизведения хромосом и передачи их в дочерние клетк! - одна из наиболее ответственных функций. Этим обусловлен чрезвычайно сложный и "це. мало изученный генетический контроль трансмиссии хромосом. У дрожжей гассЬагопусев сегеу1а1ав выделены все цйс-активные элемент I, необходимые для жизнедеятельности хромосомы. Это центромеры, репликаторы и т_ломеры. На основе этих элементов созданы искусственные минихромосомы, которые можно вводить в клетки дрожжей с помощью генетической трансформации. Минихромссомы обладает всеми осноьными свойствами хромосом, т.е. ррплицируются только один раз в клеточном, цикле, поддерживаются в клетке однокышйно и упорядоченно расходятся в митозе. Однако потеря минихромосомы, в отличие от природной хромосомы, не приводит к гибели клетк1. Поэтому минихромосомы стали уникальной моделью для изучения трансмиссии эукариотических хромосом.

Дру, лм преимуществом дрожжи является относительная легкость получения мутантоь по генам, контролирующим трансмиссию хромосом. Однако до понимания механизмов генетического контроля трансмиссии хромосом пока очень далеко. Одной из причин этого является отсутствие теоретических обоснований поддержания хромосом в клетке, незнание причин, вызывающих их дестабилизацию. С другой стороны, уже идентифицированные гены, регулирующие трансмиссию хромосом, изучены слабо. Для понимания их работы

нужен глубокий генетически анализ, изучение взаимодействия генов, их клонирование и установление продукта.

Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла б попытке теоретического обоснования поддержания минихромосом в клетках дрожжей, определения основных Факторов, определяющих их стабильность, а также генетический анализ мутантов сЫ и клонирование одного из генов сни

Для достижения сформулированной цели были поставлены следующие задачи.

1. Построение математической модели поддержания минихромосом в клеточной популяции и проверка ее работоспособности.

2. Изучение влияк ш дополнительных центромерсолержаоих структур на жизнеспособность клетки.

3. Генетический анализ мутаций сЫ.

4. Клонирование гена СН13.

Научная новизна полученных результатов.. Работа содержит новые данные как теоретического, так и экспериментального характера. Во-первых, построена математическая модель, описывающая процесс поддержания плазмид в популяции клеток. Как показала экспериментальная проверка, модель соответствует реальному положению вещей, а это значит, что положенные в ее основу допущения верны. Можно утверждать, что митотическая стабильность минихромосом определяется в основном двумя факторами - вероятностью их потери на генерацию и количеством делений, которые может пройти клетка после потери плазмилы. Во-вторых, впервые показано, что клетка способна поддерживать до десяти дополнительных центромеров в митозе, но не в мейозе, что еце раз подтверждает глубокие различия в двух типах деления клетки.

Далее, генетический анализ мутантов сЫ позволил установить причины потери минихромосом мутантнык-ч клетками, и разбить мутации на два клр-са. Мутации первого типа (сЬ12.

- э -

chl3-2, chl4, chis) приводят к физической потере минихромосом, тогда как мутации второго типа (chl3-i и chiio) вызывают нерасхождение минихромосом в митозе. Особенно неожиданным «актом оказалось наличие в гене стз двух мутаций с разным первичным эффектом. Это наводит на мысль о том, что и другие гены chl, у которых нерасхождение хромосом не удалось зарегистрировать, все-таки могут быть вовлечены в генетический контроль процесса сегрегации. Генетическое картирование позволило установить точное положение генов сны и chlio на хромосомах хи и vi, соответственно. Один из генов, с L3, клонирован.

Практическая ценность работы.. Полученная формуп, связывающая митотическую стабильность 'минихромосомы с вероятностью tj потери и величиной остаточного роста, позволяет быстро определять вероятность потери плазмиды на генерацию (& именно эта величина представляет теоретический йнтерс.) по митотичес.ой стабильности, не прибегая к трудоемкому анализу. В настоящее время во всем мирд дрожжи широко используются в качестве продуцента чужеродных белков. Полученная формула может оказать незаменимую . услугу для быстрого определения частоты потери вектора. /

Предложен метод создания высокостабильной системы вектор-хозяин с высокой копийностью „лазмиды для использо лния в биотехнологии. Идея метода основана на возможности селекции штаммов дрожжей несущих минихромосому с геном cupi, на высокую устойчивость к ионам меди и высокую копийность вектора. После селекции копийность (не менее 8-ю копий) сохраняется по крайней мере в течение юо генераций. Дополнительным поеимущвством системы является возможность периодического высева клеток на среду с высоким содержанием ионов меди, что существенно снижает вероятность контаминации, т. к. медь является сильным кг точным ядом.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались

на ,международных кон. .зренциях "cell cycle and differentiation (Liblice, 1989),- "Structure of Eukaryotic Genome and Regulation of its Expx-ssion" (Tbilisi, 1989), Ysäst Genetics and Molecular Biology Meeting (Cold Spring Harbor, 1991).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ. .

Объем работы. Диссертация изложена на страницах

маг нописного текста и состоит из зведения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследования, обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего Z46 публикаций отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована и рисунками и 12 таблицами.

- МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использованы штаммы дрожжей sacc' aromycos cerevisiae различного происхождения, как полученные из разных лабораторий <в основном зарубежных), так и сконструированные в ходе настояшей работы.. Их генотипы представлены в табл. 1. Для молекулярного клонирования использованы штаммы Escherichia coli hbioi и dhso.

Среды и условия культивирования дрожжей, использованные в работе, соответствует, в основном, рекомендациям Шермана с соавторами (Sherman et al., 1986). Бактерии выращивали в соотгетствии с рекомендациями, приведенными в известных РУКОВОДСТВа* (ГлОВер 1988; МзНИвТИС И Др., 1984).

Большинство генетических методов, использованных в данной работе, приведено в соответствующих руководствах (Sherman et al., 1986, Гловер, 1988). Некоторые методы были частично модифицированы.

Таблица i

Штаммы дрожжей, использованные в работе.

Обозначение

Генотип

Источник

GRF18 MATa his3 leu2 G.Fink

DC5 llATa his3 leu2 canl G.Fink

L1-DC5 MATa leu2-3,112 his3 lys2 canl В.Ларионов

CL60 MATa ade2 chl4 his4 leu2 met2 thr4 игаЭ H.Куприна

СТА2 MATa ade2 chl3-l his4 leu2 met2 thr< игаЗ Н.Куприна

CL81 MATa ade2 chl3-2 his4 leu2 net2 thr4 игаЗ H.Куприна

cía MATa ade2 chl2 his4 Xc 2 met.2 thr4 игаЗ H .Куприна

K5 MATa/Mata Ieu2-3¿112/ieu2-3,112 ura3-52/ura3-52 ade2-lQl/ade2-101 Iya2/LYS2 HIS3/hiu3 chl3-:'chl3-l CF 5.1 [URA3 SUP11] P.Hieter

1-T2 MATa leu2-3'( 112 ade8-18 cupl-1

57A-T3 MATa trpl leu2

Í6B-T o MATa leu2—3, -12 ade2 his3-ll,15 net2 chl3-l

2ЯС-Т10 MATa ade2 ura3 leu2 chl3-l

34D-T10 MATa ade2 net2 Chl3-i

37A-lxO MATa his3 игаЗ leu2 chl3-l ,

27-T17 MATa argl leu2-3,112 netl ura4 ilv5-l aso5 gal2

21B-T34 MATa leu2 hie2 trpl netl4 игаЗ

1C-AS41 MATa leu2 lys2 chllo А. Струнников

Штрммы дрожжей, происхождение которых не указано, получены в настоящей рас^те.

Определение митотической стабильности минихромосом

проводили следующим образом. Отдельные колонии дрожжей,

выращенные на селективной по отношение к плазмидному маркеру

среде, рассевали на полной среде, а через двое суток

переносили методом отпечатков на селективную среду.

Митотическую стабильность определяли как отношение Ъв

процентах!, числа колоний, выросших на селе1 ивной среде, к

числу колоний, выросших на полной среде.

Причины нестабильност минихромосом у дрожжей проводили по методу, предложенному нами. . Он сснован на том, что нестабильность хромосом и минихромосом мс зт быть следствием либо нерасхокдения сестринских хроматид в митозе (сегрегация по типу 2 : о), либо событий потери (сегрегация по типу 1 : о). Зти события по-разному влияют на копийность минихромосомы в клетке. В случае нерасхождения в популяции дояны появляться клетки с двумя и более копиями минихромосомы. В случае событий утраты повышения числа копий минихромосомы в клетках не происходит. Таким образом, выяснение того, какая из двух причин ответственна за дестабилизацию минихромосом у мутантов, сводится к оаределенис числа копи минихромосомы в мутантной клетке. Для этого достаточно установит» характер сегрегации маркера минихромосомы в мейозе. В том случае, если гаплоидная клетка содержала одну копию минихромосомы, две гаплоидные споры будут содержать микихромосому, а две другие - нет. "ели же клетка, вступившая в мейоз, содержит две или более копии минихромосомы, то расщепления по маркеру минихромосомы в мейозе не будет: все четцэе гаплоидные споры будут содержать центромерную плазмиду.

Биохимические методы взяты из .общеизвестных руководств (Маниатис и др, 1984, Гловер, 1988), а также из руководств соответствующих фирм (Nick-Translation Kit, Amershast).

Пульс-электрофорез хромосом дрожжей (модифицированный ofac > проводили на аппарате, изготовленном кооперативе* "Диапульс", Москва, '"арозные блоки с хромосомами дрожжей готовили согласно стандартной методике (carle, Olson, 1984), но без использования литических ферментов. Кроме того, вместо протеиназы к мы применяли проназу Р. Эти модификации, как нам удалось выяснить, не ухудшают качество » стабильность препаратов хромосом, но позволяют сказаться oi дорогих ферментов. Электрофорез проводили в о, з-кратно!

трис-б^атном буфере при напряжении 200 V, что соответствоало напряженности поля 9-ю у/см, и температуре 8-ю°с в течение 12-48 час. Время пульса меняли ступенчато от зо сек лля разделения маленьких хромосом и хромосомных фрагментов до 150 сек для разделения больших хромосом.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Динамика потери минихромосом в клеточной популяции. Минихромосомы являются удобной моделью для изучения трансмиссии хромосом. Оценку стабильности минихромосом обычно проводят, определяя митотическую стабильность минихромосом, т. в. долю клеток в колонии дрожжей, сохранивших мк-'ихромосому после большого числа делений. Однако клетка, потерявшая плазмиду, может проходить еще несколько циклов деления в селективных условиях. Чтобы выясн! ь соотношение • зжду митотической стабильностью и истинной частотой потери минихромосом, мы попытались описать динамику потери минихромосом в клеточной популяции.

Мы исходили из предположения, что на величину

митотической стабильности влияют три параметра:, вероятность

*

потери минихромосомы на генерацию р, количество делений, которое может пройти клетка в селективных ,:ловиях после потерн п-эзмиды т и общее число генерация к. Очевидно, что о<1,:1 и Т£к ( >к не имеет биологического смысла).

Анализ рекуррентных соотношения, описывающих количество клеток с плазмидой и без нее в клеточной популяции, позволяет обобщить их следующим образом:

,т

мк (Т) р

-V- ■2 — "к

(2-р)Т <2-р)к

+ -Ж - 1 (1)

(2-р)

где и - число клеток с плазмидой и без плазмиды

после к генераций при числе "остаточных делений" т.

Для большого числа re. jраций к имеем:

n"(t) 2т

lim - - ----i (2)

к*» (2-p)A(l-p)

Формула (2) гораздо проще и удобнее, чем (1). Чтобы проверить возможность ее использования на практике, мы провели анализ соотношения n"/n+ для различных значений k, р vi т Результаты анализа приведены в табл. 2. Значения n"/n+ для к-20 (за 20 поколений формируется колония дрожжей) считали по формуле (1), а для к»® - по формуле (2).

Таблица 2

Отношение n"/n+ ^пи различных значениях т, р и к.

1 ' к р" 0,1 0,3 0,5 0,7 0,8 0,9

1 20 0,111 0,429 1,000 2,321 3,696 7,662

1 а 0,111 1,429 1,000 2,321 3,896 9,000

20 0,231 0,977 2,554 6,840 12,472 26,707

а .0,231 0,977 2,556 6,890 12,889 32,058

20 0,364 1,737 5,316 17,477 35,911 06,877

00 0,364 1,737 5,321 17,673 37,580 108,282

20 0,512 2,787 10,218 42,412 99,490 274,645

| - ю 0,512 2,788 10,237 43,198 106,167 360,263

Экспериментальная проверка модели. Такая проверка могла

бы иыявить существование некоторых не учтенных моделью «акторов, влияющих н_ конечное соотношение плазмидсодержащнх и бесплазмидных клеток. Для этого мы определяли экспериментальные значения р и т, рассчитывали по ним значения митотической стабильности и+/(н++н") и сравнивали со значениями, полученными стандартным способом. Формулу (2) преобразовали к более удобному виду:

Г Р I'1

__ - (1-р)[1- - I (3)

N+Н 1 £ 3

Два штамма дрожжей, ^-осб и сипе, трансформировали МИНИХрОМОСОМаМИ НсрСЕИЗ И Ег-СЕЫЗ (Коирг1па, Ьаг10П0У,. 1983), несущими ген ьвиг и центромерный локус сеиз. Репликация плазмид в клетках дрожжей обеспечивается слабым репликатором из генов рибосомкой РНК. дрожжей (Бгс^ак, Ии, 1979). Плазмида исрсЕЮ содержит один репликатор рДНК, в то время :ак плазмида й2-сеыз несет две копии репликатора.

Материнскую и дочернюю клетки трг сформантов, делящихся в селективных условиях (минимальная среда без лейцина), отделяли друг от друга с помощью микроманипулятора. Че{. зз двое суток на пластинке подсчитывали число пар, в которых обе клетки (н) или только одна из двух клеток (в) образовала колонию на селективной среде. Частота потери плазмиды на генерацию определяется соотношением р-в/(л+в). Кроме того, с помощью микроманипулятора учитывали остаточный ■ р ст бесплазмидньи клеток на селективной среде (и?ст) для тех пар, в которьи одна из клеток у1рачивала плазмиду. Число

остаточных делений т определяли по формуле т«1од1150СТ, где

5°ст - среднее число клеток в микроколониях. Вычисг иные по Формуле (3) сравнивали с величиной митотической стабильн сти, определенной методом отпечатков.

Для обе х штаммов ха актернр значительно большая стабильность плазмиды иг-СЕЮ, несущей два репликатора рДНК, чем однорепликаторной плазмиды ксрСЕЮ. Частота потери двурепликаторной плазмиды 2-сею удовлетворительно согласуется с расчетным значением частоты потери двух однорепликаторных плазмид исрСЕЮ, находящихся в одной клетке, при условии их независимой сегрегации. Согласно данным тетрадного анализа, обе эти плазмид' поддерживаются в клетке однокопийными (Коирг1па, Ьагхопоу, 1983). Это

свидетельствует о том, что основная причина потери клетками в митозе плазмид с репликаторами рДНК связана с неэффективной репликацией этих плазмид в трансформированных клетках.

Таблица з

Митотическая стабильность минихромосом ксрСЕИЗ и кг-свыз

Штвмм/мини-хромосома

Ll-DC5/RcpCEN3 T.1-DC5/R2-CEN2 GRE18/RcpCEN3 GRF18/R2-CEN3

а в р т Митотическая стабильность минихромосом, )

вычисл. по метод формуле (3) отпечатков

130 49 0,27 6,13 29,5 26,5

547 32 0,055 5,93 79,9 . . 77,9

187 L0 0,21 6,39 38,7 37,5

364 24 0,062 6,29 76,9 76,1

Расхождение расчетных данных с экспериментальными не превышаем 2~3). Авторам аналогичной модели (Murrey, Szostak, 1983) не удалось вывести окончательную Формулу и показать независимость митотической стабильности от общего числа генераций к. Суммируя вышесказанное, можно заключить, что:

(1) предложенная модель достаточно точно описывает динамику поддержания плазмид в клеточной популяции в селективных условиях роста; (ii) число остаточных делений клеток, утративших плазчиду, не зависит от митотической стабильности плазмиды; (ill) Формула (3) модель дает возможность определять частоты потери гибридных плазмид на генерацию.

Копийность центромерных плазмид в клетках дрожжей. Как правило, центромерные плазмиды поддерживаются в клетках дрожжей однокопийно. Однако неясно, какое предельное количество дополнительных центромеров может переносить клетка и в течение какого времени. Для ответа на эти вопросы был сконструирован штамм дрожжей 1-т2, чувствительный к о,з шм Cuso4. Устойчивость клеток дрожжей к ионам меди определяется числом копии гена cupi. Штамм 1-т2

трансформировали плазмидой УСр24, несущей три копии гена cupi. Большинство трансформантов могли расти на среде, содержащей до 1,6-1,в им cuso4, однако с частотой около ю% появлялись трансформанты, способные расти на среде с з,о п>м cuso4. Это соответствует частоте котрансформации у дрожжей. Митотическая стабильность плазмиды YCp24 у этих трансформантов также различалась (табл. 4). Из клеток трансформантов Í-1-t2, 19-1-тг и 23-1-т2 выделили общую ДНК. По 2,5 мкг ДНК использовали для трансформации бактерия. Частота трансформации бактерий может служить мерой числа копий плазмиды в дрожжах. Результаты трансформации (табл. 4) подтверждают данные по устойчивости клеток к ионам меди и стабильности плазмид.

Таблица 4

Поддержание плазмиды УСр24 у трансформантов дрожжей.

трансформант устойчивость стабильность число трансфор-к cuso тм YCp24, ) мантов е. coli

1-1-Т2 1,8 93,1 (442/4-75) 250

19-1-Т2 2,5 96,3 (180/187) 340

. 23-1-Т2 3,0 99,8 (223/224) 1136

1*-1-Т2 2,5 95,2 (398/418) .

1*-1-Т2 3,0 96,8 (511/528)

1*-1-Т2 У, 5 99,2 (483/487)

1*-1-Т2 4,0 99,96 (2244/2245J

* - после селекции на повышенную устойчивость к ионам меди.

Для определения предельного копий минихромосомы в клетке была проведена ступенчатая селекция клеток трансформанта 1-1-Т2 на серии сред с постепенно повышающейся концентрации Си804> Полученные денные (табл. 4) указьвают на постепенное повышение числа копий плазмиды в клетках по мере селекции.

Клетки, потерявшие плазмидный маркер leu2, оказывались чувствительными к о,з вн cuso4, как и исходный ш.амм 1-т2, что подтверждает отсутствие интеграции в хромосому. Клетки, устойчивые к 4,0 юМ cuso4, выращивали в течение юо генераций на полной среде, без селекции, и затем снова проверяли у них устойчивость к ионам меди и стабильность плазмиды. Как устойчивость, так и стабильность не изменились.

Для определения числа копий минихромосомы ycp24 клетки исходного трансформанта i-i-тг и клона, устойчивого к 4,о юм cuso4, скрестили со штаммом 57А-ТЗ и провели тетрадный анализ. В 72 из юо проанализирована. тетрад первого гибрида расщепление было 2 Leu* : 2 Leu-, что подтверждает предположение об однокопийности плазмиды УСр24 у исходного трансформанта. У второго гибрида выживаемость спор в мейозе упала почти до нуля: из 700 тетрад только две оказались полными, четырех споровыми. При этом в обеих расщепление по лейцину было 2* : 2". Таким образом, нам не удалось показать генетически, что селекция на повышенную устойчивость к меди сопровождается повышением копийности плазмиды. ' Однако блот-гибридизация тотальной ДНК с 32Р-меченной ДНК pBR322 показала, что исходный трансформант 1-1-Т2 несет одну копию плазмиды, а у клона, устойчивого к 4,0 тм cuso4 число копий равно 8-ю.

Клетки дрожжей могут поддерживать в митозе не менее ю дополнительных центромерных плазмид, причем даже в отсутствии селекции. Данные тетрадного анализа позволяют предположить, что мейоз более чувствителен к дополнительным центромерам. По-видимому, в мейозе количество микротрУючек лимитировано более строго, чем в митозе, и наличие большого числа "лишних" центромеров в клетке приводит к обшей дестабилизации генома и к анэуплоидии, что и объясняет падение выживаемости аскоспор. Этот факт еще раз показывает.

насколько глубоки различия двух типов деления клетки -митоза и мейоза.

Причины нестабильности хромосом у мутантов chl. В лаборатории генетики митоза был получен ряд мутантов дрожжей chl (CHronosome Loss), у которых была повышена частота потери природных хромосом и искусственных минихромосом. Нестабильность хромосом и минихромосом у мутантов chl может быть следствием либо нерасхождения сестринских хроматид в митозе (сегрегация по типу 2 : 0), либо событий потери (сегрегация по типу 1 : о). Мутанты chl трансформировали плазмидой pYe(CEN3)4i, маркированной геном LEU2, а затем скрестили с партнерами дикого типа, не несущими плазмиды. Так как все мутации chl рецессивны, дальнейшие изменения копийности прекращаются, и. диплоидные клетки поддерживают столько копий плазмиды, сколько они получили от трансформированного родителя. У полученных гибридов (не клонируя их! ) индуцировали мейоз и проводили тетрадный анализ (табл. 5).

Таблица 5

Мейотическая сегрегация плазмиды pYe(cEK3)4i у мутантов chl-

Гибрид

Число тетрад с сегрегацией плазмидного маркера (LEU2) (4+:о") и

(2+:2~) и (1+:3 )

(3+:Г)

chl 2 chl3-l

X GRF18

* X GRF18 *

chl3-l х GRF18 Chl3-2* X GRF18 chl4* x GRF18 chl5-l* X GRF18 Chl5~2* x GRF18 chl10* X DC5

23 (85%) 4 (15%)

13 (24%) 42 (76%)

6 (22%). 22 (78%)

16 (70%) 7 (30%)

9 (69%) 4- (31%)

12 (80%) 3 (20%)

16 (94%) 1 (6%)

б (21%) 23 (79%)

родитель, трансформированный плазмидой pVo(CEH3)4i.

* -

Группа мутантов распадается на два четко обособленных класса. В первом из них основной тип расиеплени по гену LEU2 2+ : 2~ (мутанты Chl2, Chl3-2, chl4, И Chl5). Ко второму классу, с преимущественным расцеплением. 4"*' : о", относятся мутанты chl3-i и chlio. Обращает на себя внимание два факта. Во-первых, характер расщепления плазмидного маркера у гибрида chi зависит от того, какой родитель был трансформирован, что подтверждает правильность рассуждений. Во-вторых, поражает то, что мутации в одном и том же гене, chl3-i и chl3-2 затрагивает, по-видимому, разные системы поддержания стабильности плазмид. Таким образом, гены сньз и chlio контролируют сегрегацию хромосом митозе. Однако наличие двух мутантных аллелей гена снх,э с разным фенотипом позволяет думать, что и у других мутантов chl сегрегация хромосом может быть нарувена, мо в меньшей степени.

Картирование генов chl В предварительных экспериментах нам удалось установить хромосомную локализацию генов chl. Было установлено, что гены chl2 и сньз расположены на хромосоме xxi, ген сны - на хромосоме iv, _ ген chls - на хромосоме ix, а ген chlio - на хромосоме vi.

Результаты точного картирования генов chl3 и chlio с помощью тетрадного.анализа приведены в табл. 6. Мутация сыз сцеплена с мутациями ura4 (21,8 см) и ilv5 (33,3 см). В результате ген chls картирован на правом плече хромосомы хи, где до того не было картировано ни одного гена, что указывает на то, что это новый ген. Мутация chlio слабо сцеплена с мутацией his2 <43,1 см), картированной на правом плече хромосомы vi на расстоянии зо,7 см от центромера (Mortiner et al., 1989). Учитывая сцепление с центромером (12,5 см) можно утверждать, что ген chlio находится на левом плече хромосомы. Очень близко к гену chlio картирован ген cdc4, не аллельный chlio (А. В. Струнников), т.е. ген chlio также является новым.

Таблица б

Картирование генов сньз и сныо с помощью тетрадного анализа.

гибрид гены число сегрегация рассто-

тетрад яние,

Рй ЫРО т СМ

27-Т17 X 11у5-сь13 24 1 30 33.3

X 340-Т10 11у5-ига4 20 4 31 61.2

с1113-ига4 31 . 0 24 21.8

"21В-Т34 X сЫ10-Ь1в2 23 3 32 43.1

X 1С-А341 сЫЮ-сепб 88 28 12.5

Клонирование гена сньз. Для клонирования гена сньз был использован подход, предлояенный Ф. Хитером (Н1е1ег еъ а1., 1985). Диплоидный штамм дрожжей К5, содержащий хромосомный фрагмент ср 5.1 [Ш?аз эири], был трансформирован банком дрожжевой ДНК со средним размером вставок ю-12 кь. Банк сконструирован Ф. Спенсер на основе плазмиды рэвзг и любезно предоставлен Ф. Хитером. Нонсенс-мутация а<1е2-101 приводит к образованию красного пигмента в колонии дрожжевых клеток. Однако ген °ирц, кодирующий супрессорную тРНК; не дает проявляться мутации ааег-Ю!» Повышенная, частота потери хромосомного фрагмента под действием мутации сЫЗ-1 приводит к тому, что часть клеток в формирующейся колоний" имеют ген Бири (у них мутация аае2-Ю1 не проявляется), : а часть не имеют, что выражается в появлении больного количества радиальных секторов красного и белого" цвета. Если . вставка ДНК на плазмиде содержит ген сньз, то потеря хромосомного фрагмента должна прекращаться, и такая колония будет иметь белый или слабо розовый цвет.

Всего было проанализировано 22 тысячи колоний трансформантов. Только 79 из них имели белый или розовый * цвет. Стабильность плазмиды рввзг со вставкой, маркированной

геном LEU2, в клетках 70 клонов составляла 40-50); еще в 5 клонах - юо%, что, по-видимому, обусловлено ..нтеграцией гена LE02 в хромосому или генной конверсией; наконец, третий класс (4 клона с рабочими номерами з, 16, 18 и 44) имел стабильность плазмиды 85-90%. Именно последний класс клонов должен содержать плазмиды со вставкой гена CHL3. Выделенные из этих клонов плазмиды со вставхами были обозначены 3-PSB32, 16-pSB32, 18-PSB32 И 44-pSB32.

Генетический анализ рекомбинантных клонов. Плазмиды 3-pSB32, i6-pSB32, ie-pSB32 и 44-pSB32 были использованы для трансформации штаммов дрожжей 28с-тю и lsi. у полученных трансформантов стабильность плазмид ютавляла 80-85% Стабильность плазмиды pSB32 в штаммах дикого типа также равна 85%, что несколько ниже, чем стабильность других центромерных плазмид. Согласно этому критерию, все четыре вставки комплементируют мутации сЫз-i и chl3-2, что лишний раз подтверждает их аллельность. Трансформанты ' штамма 28с-тю скрестили to штаммом 37а-тм и у полученных гибридов проверили способность к биполярному скрещиванию. Гибриды с плазмидами з-рзвзг, ie-pSB32 и 44-psB32 не скрещивались с тестерными штаммами, а гибрид с плазмидой i6-pSB32 образовывал незаконные триплоидные гибриды с той же частотой, что и гибрид без плазмиды. Таким образом, получены три рекомбинантные плазмиды, способные комллементировать оба фенотипа 'мутации chl3 - дестабилизацию мииихромосрм и способность к биполярному скрещиванию.

Субклонирование гена CHL3 и рестрикционный анализ. Для субклонирования гена CHI3 использовали плазмиду 44-pSB32. EcoRi-фрагменты этой плазмиды лигировали с обработанной этим же ферментом ДНК плазмиды pRS3i5 и трансформировали е. coli DH5<>. Из 36 трансформантов выделяли ДНК и трансформировали и трансформировали штамм дрожжей 2вс-тю, проверяя затем стабильность плазмид. Только два клона содержали вставки.

комплементирующие мутацию chl3, Далее анализировали одну из полученных плазмид, p44R-22. Серия одиночных и ДВОЙНЫХ рестрикций позволила нам построить рестрикционную карту плазмиды EcoRi-фрагмента плазмиды P44R-22, приведенную на рис. 1. Фрагмент не имеет сайтов узнавания рестриктазами

ВагоНГ, HlndlII, Smal, Ehel, Eco52.I, Xhol, Dral, Fael, EcoCl.I Eco32.I и Kpnl.

Sail EcoRI

Sail PstI Bglll EcoRI

4,3 kb

2,3 Xb

-^- -4,4 Ы, __ .

|_3,6 kb

Рис. l. Рестрикционная карта гена сньз и фрагменты, использованные для субклонирования (внизу).

Мы предприняли еще одну попытку субклонирования гена сньз. Для этого использовали 5 фрагментов разного размера (рис. 1). Все пять плазмид были выделе ни после трансформации е. coli и отбора клонов со вставками на среде с ампициллином, iptg и X-Gal. Далее-полученными плазмидами был трансформирован штамм дрожжей гвс-тю, и у трансформантоз проверена стабильность плазмид. Она оказалась во всех пяти случаях низкой. Это значит, к сожалению, что ни одна из клонированных вставок .не несет полную копию гена сньз. Однако полученные данные позволяют говорить о том, что сайт рестрикции Bglll находится внутри гона, т. к. ни один из двух фрагментов EcoRi-Bgin не комплементирует мутацию. Этот факт можно использовать для замены гена сньз в хромосоме, чтобы более подробно изучить его функции.

- IB -

выводы

1. Основными «акторами, влияющими на митотическую стабильность минихромосом в популяции дрожжей, являются вероятность ее потери на генерацию и остаточный рост клеток после потери ллазмиды. Действие других факторов пренебрежимо мало.

2. №тотическая стабильность минихромосом связана с вероятностью потери р и остаточным ростом т следующим

н+ . р .о?

образом: _ - (1-р) 1- ^ .

к +и '

3. Клетки дрожжей способны поддерживать по меньшей мере до десяти дополнительных функциональных центромеров при митотичвском способе размножения, однако в мейозе это приводит к резкому падению выживаемости клеток.

4. Идентифицированы два гена, сньз и сныо, мутации в которых приводят к нерасхождению минихромосом в митозе. Только одна из мутаций в .гене сньз, chl3-i, приводит к иерасхождению минихромосом. tí случае мутации chi3-2 основной причиной дестабилизации является, по-видимому, . дефект репликации иёили абортивная рекомбинация.

5. Ген сны клонирован в составе фрагмента ДНК размером в,б kb.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Pirozhkciv V., Tsouladre A., Kouprina N., Larionov V. Determination of probability of plasnid loss per generation // Gene. - 1984. - V.28. - P.237-239.

2. Цуладзв A.K, Ларионов В. Л. Анализ наследования центромерсодержаких плазмид у дрожжей-сахаромицетов // Докл. Акад. Наук СССР. - 1985. - Т.282. - С.450-452.

3. Куприна Н.Ю., Папина 0. Б., Иуладзе A.M., Ларионов В. Л: Наследование искусственных минихромосом у мутантов

дрожжей-сахаромицетов с нестабильностью природных хромосом // Докл. Акад. Наук СССР. - 1987. - Т. 292. - С.

734-737.

4. Kouprina M., Pashina О., Nikolaishvili N., Tsouladze A., Larionov V. Genetic control of chromosome stability in the yeast Saccharomyces cerevisiae // Yeast. - 1988. V.4. - P.257-269.

s. Куприна Н.Ю., Николайввили H. T., Пекина О. Б., Цуладзе А. Я, Ларионов В. Л. Изучение причин нестабильности искусственных мини-хромосом у мутантов дрожжей по генам CHL // Молекулярная биология. - 1988. - V. 22. -Р.1072-1079.

6. ..арионов В.Л., Пуладзе A.M. Способ получения центромер-содержашего вектора. // Авт. св. № 1480356. - 1989.

7. Tsouladze A., Kouprina H., Pashina О», Hikolaiahvili N., Larionov V. Genes controlling chromosome transmission in yeast. // Abetr. Cell Cycle and Differentiation. Liblice. 1989. - P.54.

8. Kouprina H., Tsouladt* A., Koryabîn M., Hieter P., Larionov V. Identification and genetic napping CHL genee

• controlling mitotic chromosome transmission in, yeast // . Yeast. - 1991. - (In Press)

9. Larionov V., Kouprina H., Tsouladze 'A. The genes controlling chromosome transmission in the yeast mitosis // Abstr. Structure of eukaryotic genome and regulation of its expression. Second bilateral symposium USSR -USA. - Tbilisi, 1989. - P. 58.

10. Kouprina N., Kroll E., Tsouladze A., Strunnikov A., Koryabin M., Larionov V. The study of CHL genes controlling mitotic chromosome transmission // Abstr. Yeast genetics and molecular biology meeting. - Cold Spring Harbor. 1991. - P.110.