Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль гена CHL12 (CTF18) в хромосомном цикле дрожжей Saccharomyces cerevisiae

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Роль гена CHL12 (CTF18) в хромосомном цикле дрожжей Saccharomyces cerevisiae"

ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

РГ6 од

(Tuf!

~ \ На правах рукописи

КРОЛЬ Евгений Симонович

РОЛЬ ГЕНА CHL12 (CTFI8) В ХРОМОСОМНОМ ЦИКЛЕ ДРОЖЖЕЙ Saccharomvces cerevisiae

03 00.25 - клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1995

Работа выполнена в Институте цитологии РАН и Университете Джоне Хопкинс, США

Научные руководители — д.б.н В Л. Ларионов

профессор Ф. Хитер

Официальные оппоненты - д.б н. В. А. Поспелов

д б.н Ю.И Павлов

Ведущая организация— Биотехнологический факультет

Технологического института, С -Петербург

Защита состоится22.42.1995 г в13час

на заседании Диссертационного совета Д.002.73.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, С Петербург, Тихорецкий пр., 4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН Автореферат р>азослацД9ноября 1995 г

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор биологических наук, Л Н. Писарева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность гцюблемн

Изучение механизма поддержания стабильности генома является одной из важнейших проблем в современной биологии Генетический гомеостаз предопределяет сохранение отобранных форм и успешное наследование полезных признаков организма

Среди процессов, влияющих на стабильность генома в клетках эукариот важное место занимает процесс стабильного хромосомного наследования Дестабилизация хромосом приводит либо к анеуплоидии. то есть изменению числа хромосом в клетке, либо к хромосомным перестройкам и является не только интересным с научной точки зрения феноменом, но и фактором, играющим роль в патологии Например, у человека анеуплоидия является характерным признаком злокачественных новообразований, синдрома Дауна, Кляйнфельтера и других заболеваний с изменением кариотипа (Griffiths, Miller et al. 1993)

Стабильность хромосомного наследования зависит от многих факторов, таких как процессы репликации, рекомбинации, репарации и расхождения хромосом, а также от состояния хроматина, ядерного и цитоплазматического скелета Анализ этих факто[х>в позволяет изучить детали комплексного щюцесса хромосомного наследования и понять причины дестабилизации хромосом в патологии

Генетический анализ факторов, влияющих на стабильность хромосом, явился плодоворным методом изоляции и изучения цис- и транс-факторов, контролирующих хромосомное наследование, а также их взаимодействия между собой в процессе поддержания стабильной хромосомной передачи Однако, для более глубокого изучения процесса, необходимо продолжить исследования, используя молекулярно-биологические, биохимические и цитологические методы В результате такого комплексного анализа мы надеемся получить близкую к реальности модель, отражающую детали механизма поддержания стабильного хромосомного наследования

С точки зрения анализа нерасхождения хромосом, дрожжи сахаромицеты являются удобным экспериментальным организмом Во-первых, дрожжи, в отличие от многих других эукариот, лучше выдерживают анеуплоидию, возникающую в результате ошибок хромосомного наследования Во-вторых, дрожжи совмещают удобства ведения культуры мик[юорганизма с наличием большинства фундаментальных черт, присущих клеткам Eukaryota Поэтому

детали механизма хромосомной стабильности, изученные в дрожжах, могут имет! непосредственное отношение к клеткам высших эукариот В третьих, в отличие о~ высших эукариот, цис-факторы, необходимые для поддержания стабильности х[х)м()Сом (центромер, область начала [>епликации и теломер), не толькс функционально оп{>еделены, но и их нуклеотидная последовательнсхяъ известна i изучена К концу 1996 года дрожжи Saccharomyces cerevisiae будут первш эукариотическим организмом, генетическая последовательность которого буде полностью определена. Вообще, дрюжжи являются генетически и морфологическ: xofxjoio изученным объектом, что позволяет рассматривать физиологически процессы в клетке как совокупность взаимодействующих генных продуктов, v возможно, в дальнейшем позволит рассматривать клетку как единое целое

К числу недостатков этой экспериментальной системы нужно отнести то факт, что митотические хромосомы дрожжей-сахаромицетов не наблюдаемы световой микрюскоп В связи с этим до настоящего времени представлялос невозможным изучение мо{)фологии дрожжевых xjxjmocom Однако, недавно дл дрожжей-сахаромицетов был адаптирован метод флуоресцентной гибридизации i situ (FISH) и применен для наблюдения отдельных районов дрожжевых xpoMocoi .(Guacci. Hogan et al. 1994) В частности, в этой работе метод FISH используется дл наблюдения нерасхождения центромерных участков сестринских хроматид митозе у мутанта ch!12.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы является дальнейшая характеристика механизм поддержания стабильности хромосом в митозе у дрожжей Мы надеялис получить результаты, раскрывающие некоторые детали и особенности этог механизма Методология работы состоит в отборе и изучении мутанто дефектных в стабильном поддержании хромосом, изучении одного из гено который эти мутации оп[>еделяют, и изучение функции белка, кодируемого эти геном, с помощью биохимических, генетических и цитологических методов Бы/ шхггавлены следующие задачи:

1 Характеристика и сравнение фенотипов мутаций, определяющих локус CHI./2 в клетках дрожжей Saccharomyccs cerevisiae. Изучение гена CHLI2, и его последовательности, конструирование штамма, лишенного этого гена, изучение его фенотипа

2 Изучение целостности телочерк» у мутантов сЫ12 в различных условиях, а также возможности влияния дефектных теломерюв в chll2 на стабильность хрюмосом

3 Скрининг неаллельных мутаций, влияющих на стабильность хромосом у дрожжей, на взаимодействие с геном CHL12

4 Изучение поведения клеток штамма, лишенного гена CHL12, в клеточном цикле Определение точки исполнения функции (времени действия) CHL12 в клеточном цикле Сравнение кинетики репликации ДНК у штаммов дикого типа и несущего делецию М12Л с помощью проточного цитометрического анализа синхронизированных культур. Определение наличия репликативных интермедиатов в штамме сМ12Л.

5 Изучение мо|х{юлогии клеточного блока с помощью иммун<х})луоресцентного анализа митотического веретена у клеток, несущих делецию chll2Л, а также метода флуоресцентной гибридизации т snu

6 Определение мотивов в пептидной последовательности белка Chi 12 Поиск белков, гомологичных белку Chi 12 в GenBank и других базах данных Экспр)ессия части белка Chi 12 в E.coh, выделение и аффинная очистка пептида, получение поликлональных антител Характеристика пептида Chi 12 с помощью антител к нему. Локализация белка Chi 12 в клетке с помощью непр>ямой иммунофлуоресценции

Научная новизна р>аботы

В результате изучения механизма поддержания стабильности хромосом изолирюван и охарактеризован новый ген, контрюлир>ующий хромосомное наследование у дрюжжей S.cerevisiae

Разработан новый тип генетического скрининга, основанный на комбинирювании экспресии интер>есующего гена (пробного гена) на фоне неаллельных мутаций (целевых мутаций), на взаимодействующие с интер>есующим геном мутанты Такой скрининг специфичен и обнаруживает большее количество взаимодействующих мутантов по сравнению со скринингом на дозовую супрессию

Сконструирювана система новых модульных векторюв для экспрессии в дрюжжах, которые маркируют экспр)ессируемый белок пептидной последовательностью ("тагом"), на которую имеется поликлональная сыворотка Экспрессия генов прюверена с помощью Вестерн-анализа и

иммунофлюоресцентного анализа

Впервые показано, что существует мутант у дрожжей, имеющий дефект в анафазе митоза

Представлена неп[ютиворечащая полученным данным модель, прюсто тестируемая и позволяющая расширить наши знания о цикле хромосомного наследования уэукариот

Апробация 1>аботы

Материалы диссертации были представлены на Гордоновской кондеренции по эписомам и хромосомной динамике (Gordon Conference: Episomes and Chromosome Dynamics). Бостон, США, 1993 г, ГХ Международной конференции по биологии дрожжей (International Yeast conference), Сиэттл, США. 1994. Был сделан доклад на коференции "Mid-Atlantic Yeast Conference" в Принстоне, США, 1995 г Работа была представлена на межлабораторном семинаре в Институте цитологии РАН, 1995 г.

Публикации

Материалы диссертации опубликованы в четырех научных статьях. Объем габоты

Диссертация состоит из Введения, Материалов и методов исследования, Результатов, Выводов и Списка литературы. Общий объем диссертации составляет 110 страниц, содержит 20 рисунков и фотографий и 5 таблиц Список цитируемой литературы содержит 130 ссылок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Все основные методы, использованные в этой работе (выращивание бактериальных штаммов, бактериальная трансформация, выделение плазмидной ДНК из бактерий и дрожжей, гибридизационный анализ по Саузерну, методы рекомбинантных ДНК (клонирование), приготовление белковых экстрактов, и т.д.), были основаны на (Maniatis et al., Harlow & Lane, 1988)

Штаммы и с[юды Методы, использованные для ведения дрожжевых штаммов, были взяты из (Rose, Winston et al. 1990) Дрожжевая трансформация производилась по (Keszenman-Pereyra and Hieda 1988), либо no (Rose, Winston et al. 1990)

Плазм иди ые конструкции Вектор для делеции гена CHL12 был сконструирован на основе плазмиды pBR325. 2.5 тпи фрагмент, несущий открытую рамку CH1J2 был вставлен по сайтам /.toRI - Amolli, и 90™ открытой рамки было удалено с 2,1 т п о \Пи\ - Я/лсЖТ фрагментом замененным на 2.2 т п о фрагментом, несущим ген LE!'2. служащий маркером отбора трансформатор, в штаммах, дефектных по этому гену и ауксотрюфных по лейцину Вектор для получения аллели chll2, несущей вставку внутри открытой рамки, был сконструирован на основе того же вектора, но вместо замены большей части рамки для C.HL12, была произведена вставка 1,1 тпо фрагмента, несущего ген URA3. в сайт WmdIII внутри рамки для CHL12.

Плазмиды для экспрессии генов в дрожжах p414GEUl и p414GEU2 содержат сильный индуцибельный дрожжевой промотор CAI.1 и стартовый кодон гена GAL1. пептидный маркер El и промотор гена 1'КЛЗ. служащий терминатором транскрипции Вектор p4I4GEUl служит для N терминального мечения экспрессируемого белка, a p414GEU2 - для С терминального мечения Против маркера El имеются поликлональные антитела Все стыковочные сайты были проверены секвенированием Ген CHL12 был клонирован в плазмиду p414GEUl с получением p414GEUl/12 При контрольной экспр>есии в дрюжжах

(логарифмическая культура, 12ч индукции) белок Chi 12 был экспрессирюван в плазмиде p414GEUI'12 в присутствии галактозы в 50 раз выше, чем в диком типе Обе плазмиды комплементировали фенотипы, вызванные мутацией chI12 На среде с глюкозой белок не был детектирован на Вестерн блоте и плазмида p414GEUl/12 не комплементировала мутацию сЫ12Д.

Получение антител против Chi 12 Часть открытой римки. содержащая принадлежащие гену CHL12 f>60 пн„ была переклонирована из плазмиды р1А в бактериальный экспрессионный вектор pRSETA (InVitrogen Corp., США) Пептид ЮС массой ЗОкД, содержащий карбоксильный конец СЫ12 и 6 остатков гистидина, был экспрессирован в бактериальном штамме BL2HDE3) pLvsE и афинно очищен на [№2+]-содержашей хроматографической колонке (Qiagen, США), солюбилизирован в 8М мочевине и использован для иммунизации двух Новозеландских кроликов (Hazellone. США) Антисыворотка, реагирующая на белок Chi 12, была очищена с помощью пептида ЮС, лигированного с CNBr активированной сефарозой на хроматографической колонке (Pharmacia), как описано в протоколе компании

Взаимно обратные переносы (reciprocal shifts) Для определения места исполнения функции CHL12 в клеточном цикле мы переносили штамм, дефектный по гену CHL12 и останавливающийся на определенной фазе клеточного цикла, из непермиссивных условий для этого мутанта (11°С) в условия, останавливающие

клетки на различных фазах клеточного цикла Мы наблюдали, переходят ли клетки в следующий цикл при таком переносе, а затем повторяли эксперимент в обратном порядке. По получении непротиворечивых результатов судили о времени исполнения функции гена CHL12

Выживаемость контрюльного штамма — штамма дикого типа YPH500 во всех переносах была выше 90% Контрюль на клеточную гибель во всех переносах не превышал 10%, крюме блока при 1ГС (28%) Контроль на отсутствие блока не превышал 7%. крюме блока при 11СС (25%) Все переносы были повторены не меньше трех раз, и усредненные значения и стандартные отклонения были подсчитаны с использованием стандартных статистических методов

Флуоресцентная проточная цитометрия синхронизирюванных культур Штамм YE106, несущий делецию гена CHL12 и конгенный штамм дикого типа YPH499 .выращивались в полной среде до логарифмической фазы, отмывались от среды стерильной водой и синхронизирювались ЗцМ а факторюм (дрожжевым ферюмоном. останавливающим клетки на стадии GO) в течение 2,5 часов. Далее клетки отмывались от а-фактора, и рюсли в свежей полной среде Каждые 10 минут отбирали ЗООмкл клеточной суспензии и клетки фиксирювали добавлением 700мкл <)(>% этанола не меньше 1 часа Затем клетки были ресуспендированы в 0,2М Трис-буфере, рН=7,5, содержащем 1мг/мл РНказы А на 30 минут при 37°С Далее культура была выдержана 12 часов при 4°С в растворе йодистого прюпидия 6 мкг/мл (PrI) Флуоресцентная проточная цитометрия была произведена на аппарате FACscan (Becton Dickinson) по протоколу этой фир>мы

Иммунолокализация белков Chll2. Rapl и ß-тубулина в клетках дрюжжей. Локализация белка в дрюжжевых клетках была произведена с помощью непрямой иммунофлуоресценции в основном как описано в (Kilmartin & Adams 1984) Полученные в этой работе и афинно очищенные антитела к белку Chi 12 применялись в разведении 1/1000, клетки фиксировались в 3,72 формалине 30 минут и хитиновая оболочка диплоидных клеток расщеплялась зимолиазой 20Т (Promega) в течение 2,5 часов. На всех стадиях клетки промывались 2% раствором бычьего сывороточного альбумина в буфере PBS

Антитела прютив белка Rapl и бактериальный штамм BL21, содержащий вектор, несущий дрх>жжевой ген RAP1 под индуцибельным прюмоторюм из гена LucZ. были любезно предоставлены S.Gasser. Антитела были афинно очищены на нитрюцеллюлозном фильтре, содержащем экспрессирюванный пептид Rapl как описано в (Klein. Laroche et al. 1992) Для иммунолокализации Rapl в дрюжжевых клетках антитела использовались в разведении 1/500

Для наблюдения митотического верхзтена в дрюжжевых клетках использовались антитела 6 345, направленные против ß тубулина

Флуоресцентная m гибридизация Этот метод использовался по (Guacci. Hogan et al. 1994) с небольшими модификациями

Компьютерные методы Поиск гомологии между последовательностями осуществлялся на компьютерах Национального Центр« Биоинформации (NIH, США) с помощью пакета BLAST, в подготовке изображений к печати использовалась программа Adobe Photoshop (Adobe, США), статистические расчеты производились в Microsoft Excel (Microsoft, США)

РЕЗУЛЬТАЧЫ

Глава 1. Начальная.хар^ктеристикахе™ХЩ^^

Характеристика мутантов chl] 2 Мутанты с h!12 обладали р>ядом вторничных фенотипов Выживаемость исходного мутанта sl60 была снижена до 80Х по сравнению с %" у дикого типа Мутанты л/60. si14, CLIO, CL12 характеризовались пониженной скорххггью образования колоний по сравнению с диким типом Эти же аллели не рх>ели при 11°С по сравнению с диким типом Было замечено, что пр>и 11°С 75 80% клеток останавливались в клеточном цикле с характерной морфологией клеток, имеющих большую почку и ядрх> в шейке между материнской и дочерней клетками В большинстве клеток, имеющих такой терминальный фенотип, ядрх> "пережато" шейкой между материнской и дочерней клетками Такой фенотип обычно свидетельствует о дефектах в поддержании или расхождении хромосомной ДНК (Wood and Hartvvell 1982)

Мутации chll2A были проверены и оказались дефектными в поддержании нормальной длины телом ерх>в (F.Spencer) Препарат хрюмосомной ДНК дрюжжей был прюанализирюван по Саузерну с пробой, содержащей дрюжжевую теломерную последовательнсхггь С 1.3 А Сигнал с подвижностью примерно 1,2 тпо представляет около 60Х теломерной ДНК и в мутанте chl 12 укорачивается на 50 1(Х) по

Эти признаки мутанта сЫ12 заставили нас предпринять попытку установить причину дестабилизации хромосом в этом мутанте

Деления гена CHI. 12. Для дальнейшего изучения функции гена CHI.12 мы сконструировали штаммы со вставкой в ген CHI.12 (которая прерывает откр>ытую рамку считывания и нарушает функцию гена), а также вырюзали 85% кодирующей

9

части гена СНЫ 2 Вставка в ген СНЫ2 была произведена при помощи конструкции р\2::111ЫЗ в диплонде УРН501 (Рис 1) Ген СНЫ 2 был вырезан с помощью конструкции р12Д\\LEV2 (Рис. 1) После этого на гетерозиготных по делении или вставке дрожжевых штаммах был произведен тетрадный анализ и обнаружено, что споры, несущие аллели сЫ12::ШАЗ и chll2A-.-J.EU2, образовывали колонии (расщепление 4:0), и, следовательно, ген СН112 не является жизненно важным для клетки при вегетативном росте. Фенотипы делеции (дестабилизация хромосом, блок и клеточная морфология при инкубации при 11°С, замедленный рост) по силе проявления не превосходили фенотипы одной из начальных мутаций $160.

СНЫ2

Рис 1 Открытая рамка гена СНЫ2 Вставка в ген и делеция гена СНЫ2. Показаны сайты рестрикции: М-Ми1, Х-ХЪа\, Ъ-ВатШ, К-ЕсоК\\ Н-НтйШ, С-СТа1, А-АуаП.

Изучение тапомерюв в штамме с делецией CHL.12 В штамме chll2&V.I.EU2 длина теломерюв была уменьшена на столько же. на сколько и в мутации s 160 Так как отсутствие гена CHU2 вызывает стационарное укорючение теломерюв, а также выживаемость мутанта chl¡2\ после 240 генераций не падает, как это прюисходит у мутантов по гену EST!, возможно, вовлеченного в контрюль теломеразной активности у дрожжей, мы заключаем, что, возможно, ген CHL12 контролирует альтернативный путь поддержания целостности теломеров у дрожжей

В дрожжевых клетках возможно локализовать некоторые теломер связывающие белки (например, Rapl) Rapl локализован на периферии ядра, и в диплоидных ядрах обычно видно 8-10 пятен (Klein, Laroche et al. 1992) Известно, что в некоторых мутантах, в которых теломерные последовательности укорочены, локализация Rapl изменяется Мы предприняли попытку выявить локализацию Rapl в ядрах, дефектных по CHL12 Как оказалось, картины локализации Rapl в ядрах chll2 и СНЕ* заметно не отличались друг от друга Таким образом, функция гена CHLl2 не необходима для локализации Rapl на теломерах

Поведение кольцевых хромосом и хромосомных фрагментов в мутанте СНЫ2 Известно, что некоторые мутации в гене !!A!'l, а также мутации в генах S1R3 и S1R-1 ведут к нестабильному поддержанию хрюмосом (Palladino, Laroche et al. 1993) Было бы логично предположить, что хромосомы в мутанте сЫ12 дестабилизированы из за дефектных теломерх)в Сели это предположение верно, тогда кольцевая ДНК, не нуждающаяся в теломер>ах для поддержания своей стабильности, должна быть стабилизирована в мутанте chl¡2 Мы использовали кольцевой хрюмосомный фрагмент размерюм около 120 т п о, а также кольцевую хромосому III длиной 340 т п о Мы сконструировали штаммы, несущие делецию CHL12 и либо кольцевой хрюмосомный фрагмент, либо линейный фрагмент; либо те же фрагменты на фоне дикого типа Кольцевой фрагмент был дестабилизирован в 27 раз (урювень потери на генерацию дикий тип 0 4*, мутант chl¡2A - 11%) Линейный фрагмент был дестабилизирюван в 155 раз (дикий тип - 0 0С5Г, мутант -9 3Ж) Как видно, кольцевой хрюмосомный фрагмент в мутанте chll 2 дестабилизирюван Кольцевая хромосома III на фоне мутации chll2 также была дестабилизирх)вана по сравнению с диким типом Из этого можно заключить, что СНЫ2 вовлечен не только в поддержание теломерюв, а также в др>угие прюцессы. влияющие на стабильность ДНК

Анализ____пептидной последователе юти_белка_____ÇbU 2 Вставка.

комплементирующая мутации в гене СНЫ2, была секвенирювана по методу

DAPI txChll2At

СНЫ 2

' г * * ♦ «

ДВД t i* > » * ¡¿p-

V

^ »

chll2

Рис 2 Локализации белка СЫ12 с помощью иммунофлуо[>еецентного анал ОАР1-краситель, связывающийся с ядерной ДНК, аСЫ12АЬ- афинно очише( поликлональная антисыворотка на белок СЫ12. Эксперимент был проводе! диплоидных клетках дикого типа, контрюль клетки, несущие делецию гена Сл

Сэнгера в лаборатории В Захарьева (ИМБ РАН, Москва) Открытая рамка считывания длиной 2223 по кодирует пептид с массой 84кД П<еледовательн<«ть Chi 12 включает в себя А последовательность NTP связывающего мотива Также последовательн<еть Chi 12 включает в себя мотив ядерной локализации Т антигена SV40

Интересным фактом является наличие участков гомологии в белке Chi 12 и белков, принадлежащих межвидовой группе репликативного фактора С (RFC) RFC называется сложный белковый комплекс, существующий, по крайней мере в 7 изученных видах Eukariota, в том числе в S.cerevisiae , D.metanogaster, М musculus и человеке В дрюжжах (как и в других организмах) все субединицы этого комплекса гомологичны между собой. Надо отметить, что степень гомологии белков семейства RFC между собой выше и некластеризована, как в случае Chi 12

Доказательство отсутствия белка Chll2 в RFC дрожжей Мы прювели Вестерн блоттинг хрхзматографически очищенной ферментативной активности RFC, любезно предоставленной Б Стилманом (B.Stillman), используя аффинно очищенные антитела на Chi 12 Белок Chi 12 с подвижностью 86кД присутствует в экстракте из штамма дикого типа и отсутствует в экстракте из штамма сЫ12Д 1акже, сигнал отсутствует на дорюжке с 60 мкг дрюжжевого RFC Наиболее вероятно, что Chi 12 не принадлежит RFC

Гелок ChlP находите^ в ядре клетки Пептидная последовательность Chi 12 содержит потенциальный сайт для ядерной локализации Компартментализация белка может быть исследована методом непрямой иммунофлуоресценции В данном случае использовались антитела на белок Chi 12 и диплоидные клетки штамма дикого типа и гомозиготные по делеции гена СНЫ 2 (контрюль) В клетках дикого типа Chi 12 был обнаружен в ядре (Рис 2) Интересно отметить, что при экспрессии Chi12 в клетках на плазмиде p4I4GEUl, весь белок ChII2 также локализовался в ядре

Карутирювание точки исполнения функции гена CHL12. Наличие большого количества мутантов по клеточному циклу в дрожжах, которые можно "включать" и "выключать" путем помещения в пермиссивные и непермиссивные условия (мутанты cJc и подобные им), позволило определить "точку исполнения функции гена" Точка в клеточном цикле, после которой выключение функции гена (помещение клеток условного мутанта в непермиссивные условия) не остановит клетки от перехода в новый клеточный цикл, называется точкой исполнения

13

Рис 3 Взамно-об[итные пе[>еносы (оп[>еделение времени действия гена CHL12) На гистограмме отложено количество клеток, не перешедших в следующий клеточный цикл Также показаны верхние п[>еделы стандартных отклонений дл каждого эксперимента Каждый индивидуальный пе[>енос был повторен, по крайней ме[>е, три риза А1 и А2 -клеточные блоки 1 и 2 HU - гидрокси-мочевин ben - беномил

функции гена Также, существуют химические вещества, останавливающие клетки на определенной фазе клеточного цикла, так называемые "яды" клеточного цикла (ЯКЦ) На практике удобнее картировать точку исполнения функции изучаемого гена по отношению к ЯКЦ. так как ими легко манипулировать Гидроксимочевина (ГМ) останавливает клетки в ранней S-фазе. когда ДНК находится в процессе удвоения (Wood and Hartwell 1982) Беномил и родственные соединения (нокодазол, МВС) деполимеризуют микротрубочки и останавливают клетки в поздней G2/M фазах (Wood and Hartwell 1982)

Ген CHL12 не является жизненно важным для клеток Однако, 75% клеток штамма с делегированным геном C.HL12 останавливаются в росте при 1ГС в первом же цикле после переноса, по крайней мере, на время клеточного цикла (24 часа при 11°С). тогда как при 30°С только 20% клеток не переходят в следующий цикл деления за время, равное времени клеточного цикла Это значит, что мы можем определить точку исполнения функции как последнюю точку в клеточном цикле, после которюй инкубация клеток при 11°С не приводит клетки к остановке в пер>вом клеточном цикле Мы картирювали точку исполнения функции CHL12 относительно точки действия гидркжсимочевины (ГМ), беномила, и точки исполнения функции CDC15 — поздняя анафаза митоза Результаты после поправки на выживаемость показаны на Рис 3 Таким образом, мы определили, что точка исполнения гена CHI.12 лежит после ГМ и беномила, но перед точкой исполнения функции CDC15. Следовательно, точка исполнения функции СНЫ2 находится между поздней G2 и анафазой митоза

Глава II. Поиск других генов, взаимодействующих с CHIJ2.

Супрюссорный__анализ мутаций в гене CHL12. Одним из наиболее

распространенных скринингов на генетическое взаимодействие является поиск неаллельных супрессорюв Существуют несколько видов такого скрининга В одном из них ищут клон, сверх-экспрессируюший некий прюдукт, который супрессирует мутацию в интересующем гене В этом случае говорится о "дозовой" супрессии Предполагается, что белок, кодируемый вторичным супрессором. может функционально или физически взаимодействовать с продуктом изучаемого гена

Мы изолировали дозовые супрессоры точечного мутанта chl!2 по фенотипу холодочувствительности, изолировали плазмиды, несущие эти супрессоры и проверяли супрессию холодочувствительности штамма si 60 после повторжой трансформации в дрх>жжи Из 120(ХК) начальных трансформантов только один клон

стабильно супрессировал фенотип холодочувствительности при повторно! трансформации штамма si60. Этот клон (pCR20) был картирован в локусе н; х[х)мосоме IV, несущем ген CTF12, мутации в котором приводят к нарушениям i митозе. Супрессия pCR20 имела место в двух других аллелях сЫ12. а также i делеции chll2& Наконец, фенотипы повышенной нестабильности хромосом i дефектных теломерюв, присущие мутантам chl¡2 также были проверены н; супрессию pCR20 Оказалсюь, что pCR20 не супрессируегт эти фенотипы chll2 Следовательно, нам удалось генетически разделить присущие ch!12 фенотипь нестабильности хромосом и холодочувствительности

Определение специфичности скрининга на синтетическую дозовук легальность Для определения специфичности фенотипа синтетической дозово! летальности (СДЛ) мы произвели скрининг "целевых" мутантов, контролирующи: два разных процесса в клетке — репликации ДНК и расхождению хромосом Да различных гена для экспресии ("пробных гена") также вовлечены либо i репликацию (0RC6). либо в расхождение íCTFI3) Мы экспрессировали гены ОКСб i CTF13 в 30 целевых мутантах и наблюдали случаи СДЛ. учитывая, принадлежат л! к одному пути генетически взаимодействующие пары экспрессированного гена i целевой мутации

После трансформации плазмидами, несущими либо CTF13, либо ORC.6, \ соответствующими векто{ами (контрюлы в неиндуцированных условиях, от тр>е: до шести независимых трансформантов переносились в условия, где экспресси) «ответствующих генов была индуцирована (на среду с галактозой) Поел! учитывал<х:ь отсутсвие [ххгга либо замедленный [юст штаммов, несущих лиГх плазмиду с геном, либо только вектор, при нескольких температурах

Экспрессия CTFI3 привела к взаимодействию с мутантами (ctfl4, chU.ctf'19 контролирующими [»асхождение хромосом Экспрессия гена ORC6 вызвал; летальный эффект в мутантах cdcó-l, cdc46-l, cdc2-l. Все эти три мутант, участвуют, как и ORC6, в репликации хромосомной ДНК Оверэкспрессия ORO вызвала также летальность мутантов cdc!4 и cdclt5. Было показано, чт< нестабильность плазмид, несущих область начала репликации и центромер, в это» мутанте может быть частично супрессирована добавкой нескольки: последовательжхттей области начала репликации Это, вполе возможнс свидетельствует о том, что cdcl4 дефектен в поддержании функции обласп начала {епликации, и, следовательно, вовлечен в путь репликации у дрожже) (Hogan and Koshland 1992) Пока нет никаких доказательств, что cclclfi принимав' какое либо участие в репликации ДНК Таким образом, из 8 отобранных с помощьк:

тура. и и.' Ал I «I "Рч а и. Ал сЫЧЛ /А

1\ к л:_ ^ л к Д.

20 /V, А 20 /V, л.

30 УЧ 1/4. го Лч

¿0 А /А У X.. 40 л /А Ц/ V..

50 А Л / 50 л Л

60 ,л Л 60 ,л А

70 Л ■ Л 70 Л ,Л

80 ,А ,л ВО .А Л

90 Л 90 А ,-Л

•оо Л- ■оа Л.. XV

Рис 4 Проточно флюориметржческий анализ синхронизированных культур СН1.12^ - клетки дикого типа. сЫ12Л - мутант, несущий делецию гена СИ/.12.

скрининга на синтетическую дозовую летальность генетически взаимодействующих мутантов 7 пар генов вовлечены в один и тот же процесс в клетке

Локусы. взаимодействующие с геном CHL12. Мы произвели скрининг на синтетическую дозовую летальность, экспрессируя ген CHL12 на фоне мутаций, контролирующих метаболизм или расхождение хромосомной ДНК Ген CHL12 взаимодействовал с четырьмя мутантами, контролирующими репликацию хромосом (cdc2-l, cdc46-l, cdc'-i, cdcl~-l> Следовательно, обоснованно предположить, что ген CHL12 вовлечен в метаболизм хромосомной ДНК

Глава III. Изучение последствий мутации сМ12 в клеточном цикле

Отсутствие репликативных интермедиатов у хромосом мутанта сЫ12. Мы проверили мутант chll2 на наличие некоторых дефектов по репликации Существует предположение, что хромосомы, не закончившие репликацию, в гель при пульс-форезе не входят Действительно, хромосомы клеток дрожжей, подвергнутых воздействию ГМ, которая останавливает клетки в S-фазе, не входили в гель

Клетки мутанта chU2&. инкубированные при пермиссивной или непермиссивной температуре (30°С или 11°С, соответственно), были помещены в агарозу, мягко лизированы, и белки удалены с помощью протеиназ Такой препарат, содержавший интактные хромосомы, был подвергнут пульс-форезу OFAGE или CHEF, и степень вхождения хромосом в гель была оценена по сравнению с контролем Хрюмосомы мутанта ch!I2 входили в гель на уровне хромосом дикого типа Таким образом, мы не наблюдали накопления репликативных интермедиатов, характерных для хромосом клеток, репликация которых блокирована гидроксимочевиной или мутацией cdc46-l.

Проточная флуориметрия синхронизированных культур Для оценки кинетики репликации мы отслеживали накопление ядерной ДНК в клетках мутанта chI12 и штамма дикого типа в клеточном цикле Мы синхронизировали клетки в стадии GO с помощью а-фактора, а затем позволяли им совершить цикл деления, отбирая пробы каждые 10 минут для проточной флуориметрии Клетки chlI2 не отличались от клеток дикого типа по скорости накопления ДНК, однако у клеток chl!2 наблюдалась явная задержка в стадии G2/M (Рис 4)

Иммун(х|)луоресцентный анализ митотического веретена Мы исследовали

18

длину веретена у клеток chU2A при выращивании при пермиссивной температуре У дрожжей сахаромицетов длина митотического веретена является характерным признаком перехода от метафазы к анафазе в митозе В метафазных клетках веретено короткое и не пересекает границу между материнской и дочерней клетками. В поздней анафазе веретено проходит через шейку между материнской и дочерней клетками, доходя до противоположных полюсов обеих клеток У мутанта chll2\ 20% клеток имели веретено промежуточной длины, и оно пересекало шейку между материнской и дочерэней клетками Таких клеток в штамме дикого типа меньше одного процента

Рис 5 Схема флуоресцентной т situ гибридизации диплоидных дрожжевых клеток с пробой на хромосомный центромер Изображены клетки в стадиях: G2, анафазы и телофазы Светлые пятна - сигналы гибридизации с центромерами Также показаны митотическое веретено и две пар>ы гомологичных хрх>м<еом Цифрами обозначены доли клеток, находящихся в ахгтветствуюшей фазе хрх>мосомного цикла

Флуогюсцентная in stiu гибридизация центрюмерюв отдельной хромосомы в

мутанте сМ12Л. Недавняя разработка метода флуоресцентной т хии гибридизации на дрожжах позволила проследить судьбу центромеров при дефектном расхождении хромосом у мутанта сЫ12А. Мы наблюдали расхождение двух пар сестринских центрюмерюв хромосом XVI (диплоидные ядра) в ядрах дикого типа и в мутанте. В ядрах дикого типа центромеры расходятся в анафазе первыми, появляясь у противоположных полюсов делящегося ядра тогда, когда большая часть хромосомной ДНК еще не разошлась. Соответветственно, у 85X ядер дикого типа центромеры не разошлись, у 14% ядер центромер>ы наблюдались на противоположных полюсах ядра В мутанте сЫ12Л, в 702 ядер сестринские центрх>меры находились вместе, в 10% ядер наблюдали центрюмеры, разошедшиеся к полюсам делящегося ядра, а в 20Х ядер мы наблюдали разделение, но не расхождение сестринских центрюмерюв (см. схему на Рис. 5) Несмотря на отчетливое разделение двух сигналов, они оставались в середине делящегося ядра Так как, формально, анафаза начинается с разделения сестринских центромеров, мы заключаем, что мутация сЫ12 приводит к дефекту в анафазе митоза

ВЫВОДЫ

1 Изучен новый ген CHL12 ICTF18), контролирующий стабильность хромосом у дрюжжей S.cerevisiae. Этот ген не является жизненно важным для клеток в лабораторных условиях, однако его отсутствие в клетках ведет к повышению нестабильности 120 т.п.о хромосомного фрагмента в 150 раз, а также к повышению нестабильности естественных хрюмосом и центрюмерсодержащих плазмид

2 Отсутствие функции гена CHL12 ведет к укорочению теломерных последовательностей дрюжжей на 50-100 п о. Длина теломеров не изменяется при продолжительном выращивании культуры и выживаемость мутантной культуры не падает. Кольцевые хромосомы, не содержащие теломерные последовательности, также дестабилизированы в мутанте chtl2 Наконец,

пространственное расположение теломеров в ядрах клеток сЫ12 не отличается от такового в клетках дикого типа

3 Показана высокая специфичность нового скр>ининга на взаимодействие генов, использующего фенотип синтетической лозовой летальности (СДЛ) (повышенная эспрессия гена убивает клетки неаллельного мутанта) Путем скрининга мутантов на взаимодействие с геном CHL12 с использованием фенотипа СДЛ были изолированы мутанты по генам CDC2, CDC~, CDC1~ и CDC46 вовлеченные в метаболизм хромосомной ДНК (репликация и репарация ДНК)

4 Мутанты, дефектные по гену CHL12, а также мутант, несущий делецию гена, при помещении в 11°С останавливаются в фазе с удвоенной хрюмосомной ДНК, с большой дочерней почкой и ядром, находящемся около или внутри шейки между материнской и дочерней клетками Определено время исполнения функции CHL12 в клеточном цикле в фазе G2 или ранней фазе митоза, и ограничено точкой чувстствительности и к беномилу (G2) и точкой исполнения функции гена CDC15. С помощью проточной цитометрии синхронизированных культур показано, что мутант chll2A прюходит фазу синтеза ДНК примерно с той же скоростью, что и штамм дикого типа Однако, клетки с удвоенным, или с почти удвоенным количеством ДНК дополнительные 20 минут не переходят в следующий клеточный цикл С помощью пульс фореза типа OFAGE и CHEF показано отсутствие репликативных интер>медиатов у хромосом штамма сЫ12&

5 При 30°С клетки мутанта сМ12Л медленнее, чем клетки дикого типа проходят митоз С помощью непрямой иммунофлуоресценции показано, что в 20% клеток мутанта митотическсе веретено находится в промежуточном положении между фазой короткого (С2/метафаза) и фазой длинного веретена (поздняя анафаза/телофаза) В клетках штамма дикого типа эта цифра составляет менее 1% Как показала флуоресцентная гибридизация m situ, в 20% ядер клеток мутанта центромеры хромосомы XVI разделены, но не расходятся к полюсам делящегося ядра. Такая морфология встречается только у IX ядер клеток дикого типа

6 Пептидная последовательность генного прюдукта Chi 12 имеет гомологию с пептидными последовательностями семейства репликативного фактора С (RFC) По данным, полученным с помощью Вестерн блоттинга с использованием поликлональных антител против ChI12, белок Chi12 не является мажоржой субъединицей очищенного комплекса дрюжжевого RFC. Белок ChM2 нерастворжм в растворах неионных детергентов и не переходит в раствор после ферментативного гид ¡юлила ДНК Белок Chi 12 локализуется в ядре клеток в всех фазах клеточного цикла

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ген CHL12 необходим для стабильного поддержания х[юмосом в вегетативном цикле у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Отсутствие этого гена в клетке вызывает 150 кратное повышение нестабильности хромосомного фрагмента длиной 120 т.п о., а также невозможность роста при пониженной температуре Чакже, теломерные последовательности укорочены в мутантах по гену СН1.12 Однако, дефект в поддержании теломеров не является по крайней мере единственной причиной нестабильности хромосом в этом мутанте: конструкции, не нуждающиеся в теломерах (кольцевые хромосомы), также нестабильны в мутанте по гену CHL12

Продукт гена CHL12 имеет значительную гомологию с репликативным фактором С (RFC), белковым комплексом, играющим важнейшую роль в процессе репликации ДНК в клетках эукариот. Все основные субъединицы этого комплекса гомологичны между собой Более того, ген CHL12 взаимодействует с мутантами контролирующими репликацию хромосомной ДНК, в том числе с двумя жизненно важными ДНК полимеразами, одна из которых, ДНК полимера за 6, непосредственно взаимодействует с RFC. Однако, продукт гена CHL12 не является мажорной субьединицей комплекса RFC Невозможно исключить, однако, что этот белок может модифицировать лишь часть комплексов RFC, или в процессе очистки RFC белок Chll2 теряется. Репликация большей части хромосомной ДНК проходит у мутанта по гену CHL12 с такой же скоростью, как в клетках дикого типа (в пределах разрешения данного эксперимента) Более того, функция гена CHL12 исполняется поздно в клеточном цикле, либо в поздней части фазы G2, либо в метафазе/анафазе митоза

Клетки, мутантные rio гену CHL12, проходят митотическое делени медленнее, чем клетки дикого типа Дефект анафазы у этого мутанта ответственен за это замедление, и, вероятно, пониженную скорость роста и пониженную выживаемость клеток

Мы предполагаем, что ген CHLI2 контролирует заключительный этап метаболизма хромосомной ДНК в ее подготовке к расхождению в митозе В отсутствие функции гена CHL12 клетки входят в митоз с пока неизвестными дефектами в ДНК и испытывают трудности в сегрегации хромосом

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТГМЕ ДИСССР1АЦИИ

Куприна Н К) Кроль С С . Корябин М Ю.. Шестопалов Б В . Блисковский В В , Банников В М , Гизатуллин Р 3 . Кириллов А Б., Кравцов В.Ю.. Захарьев В М , Хитер Ф . Ларионов В Л (1992) Новый ген. CHI.15, регулирующий репликацию хромосом у Saccharomvces cerevisiae. Молекулярная биология, Т 27, стр> 569 588

Kouprina, N.. Е. Kroll, V. Bannikov, V. Bliskovsky, R. Gizatullin, V. Zacharyev, V. Larionov. (1992) CTF4 (CHL15) mutants exhibit defective DNA metabolism in the yeast Saccharomvces cerevisiae. Moll.Cell Biol. 12: 5736-5747.

Kouprina, N.. E. Kroll. A. Kirillov, V. Bannikov, V. Zacharyev, V. Larionov. (1994) CHI. 12, a gene, essential for the fidelity of chromosome transmission in the yeast Saccharomvces cerevisiae. Genetics 138: 1067-1079.

Kroll, E.S.. K. Hyland, P. Hieter, J.J. Li. (1995) Establishing genetic interactions b\ a synthetic dosage lethality phenotvpie. Genetics mpress.

Kroll. E.S.. F. Spencer. V. Larionov, P. Hieter. (1995) The role of the CHL12 (CTVlHi gene in yeast cell cycle - defects in replication lead to defects in segregation. The abstract of the platform presentation on The Mid-AtlanticYeast Conference. Princeton. NJ. U.S.A.

Подписано к печати 'З.И.9Ь. Заказ 409 Тираж 100 Объем 1,25 п.л. Ц0Л СПГУ. 19°С34, Санкт-Петербург, наб. Макарова,б.