Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение генов, контролирующих распределение хромосом и минихромосом в митозе у дрожжей-сахаромицетов

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение генов, контролирующих распределение хромосом и минихромосом в митозе у дрожжей-сахаромицетов"

ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ АКАДЕМИИ НАУК СССР

На правах рукописи

УДК : 575.24 : 576.85

СТРУННИКОВ

Александр Владимирович

ИЗУЧЕНИЕ ГЕНОВ, КОНТРОЛИРУЮЩИХ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ХРОМОСОМ И МИНИХРОМОСОМ В МИТОЗЕ У ДРОЖЖЕЙ-СЛХЯРОМИЦЕТОВ

03.00.25 — Клеточная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ - 1991

Работа выполнена в Лаборатории Института цитологии АН СССР.

генетики митоза

Научный руководитель: доктор биологических наук В.Л,Ларионов .

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Н.В.Тоиилин ( Институт цитологии АН СССР ). кандидат биологических наук Ю.О.Чернов ( Санкт-Петербургский государственный университет ).

Ведущая организация: С.Петербургский Институт ядерной физики им.Б.П.Константинова АН СССР.

Заиита диссертации состоится ">^0' 199^ г.

часов на заседании специализированного Оовета Д.002.73.01. в Институте цитологии АН СССР по адресу: 194064 г. С. Петербург, Тихорецкий проспект. 4. конференц-

зал .

С диссертацией мохно ознакомиться в библиотеке Института цитологии АН СССР.

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного Совета кандидат биологических наук

(сГ) - Институт цитологии

АН СССР. 1991 г.

Л.Н.Писарева

л

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Механизмы, обеспечивавшие воспроизведение генетических структур и их передачу при раз-

I

множении клеток, представляют непреходящий теоретический и практический интерес для биологов, занимающихся изучением клеточного цикла v различных организмов и типов клеток.

Дрожжи-сахаромииеты стали за последние 10 лет универсальной экспериментальной модельной системой для изучения генетического контроля клеточного цикла. Особенности распределения хромосом у дрожжей. по всей видимости, аналогичны закономерностям, выявленным для клеток животных н растений. несмотря на существенные отличия s организации хромосом. Дрожжи. однако. обладают важным преимуществом перед клетками животных: у них можно легко индуцировать мутации. нарушающие работу митотического аппарата клетки.

■ Проблема генетического контроля передачи полного хромосомного набора дочерней клетке при митотическом делении - одна из самых актуальных и бурно развивающихся отраслей клеточной биологии и молекулярной генетики дрожжей . Ко времени начала данной работы. у дрожжей-сахаро-мииетов были выявлены цис-локусы хромосом ( CEN-ДНК ). обеспечивающие процесс сегрегации и служаШие местом образования функционирующих кинетохоров. При этом число выявленных генов дрожжей, контролируюиих иитотическую трансмис-' сию хромосом. ( транс-локусов ) не превышало 8-10. Поэтому задача поиска новых генов такого типа, а также признаков, по которым можно направленно отбирать мутации в таких генах. являлась крайне актуальной. Актуальность Эта сохраняется и в настоящее время. На сегодня известно около 30 генов дрожжей, вовлеченных в процесс расхождения хромосом в митозе. Тем не менее, случаи независимой идентификации одних и тех же генов крайне редки, что свидетельствует о далеко не полном выявлении всего набора генов этого семейства. Одна из групп, давно райотаюииих в этом направлении. - Лаборатория генетики митоза Института цитологии АН

СССР. В этой лаборатории были в свое время начаты пионерские работы по направленному получению мутаций в генах, контролирующих стабильность природных хромосом и искусственных миннхромосом дрожжей I этс!.. сЬ1 ). Тем не менее доля мутаций, приводяиих к увеличению именно частоты нерасхождения миннхромосом и хромосом в митозе, была очень низкой .

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было создание эффективной и простой системы для регистрации явления нерасхождения миннхромосом в митозе: использование такой системы для идентификации новых генов, контролирующих правильное распределение сестринских хроматид и мини-хроматид: а также молекулярное клонирование одного из таких генов. Из указанной цели вытекает следующие задачи данной работы:

1. С помопыв независимых биологических предпосылок теоретически обосновать возможность регистрации повышенной частоты нерасхождения иинихромосои по их накоплению у части клеток популяции:

2. Сконструировать систему клетка-минихромосома. позволяю«.ую визуализировать процесс нерасхождения и возможного накопления миннхромосом. с использованием в качестве индикатора гена, обладающего дозозависймым проявлением:

3. С. использованием аналогичной экспериментальной системы индуцировать и отобрать мутанты дрожжей с повышенной частотой нерасхождения миннхромосом:

4. Попытаться выделить один ген данного семейства из

I

библиотеки генов дрожжей и провести его первичную ■характеристику.

Научная новизна и значимость работы. В данной работе впервые продемонстрировано новое проявление дестабилизации миннхромосом v дрожжей - значительное накопление мини-хромосом в клеточной популяции, как результат митотического нерасхожления. На основе минихромосомы. несушей ген метал-лотионеина дрожжей и сответствуюиих реиипиентных атаммов разработана високоселектив на я система для отбора мутантов.

накапливающих минихромосомы. С использованием этой системы было получено 4 мутанта ( 1 - в рамках данной работы. 3 -соавторами ). характеризующихся, кроме накопления мннихромосом. существенной их дестабилизацией, а также снижением стабильности природных хромосом. Наконец. в рамках работы осувест в лено молекулярное клонирование БМС1. генд, мутации в котором приводят к накоплению мннихромосом. и показано, что БМС1 является необходимым геном.

Практическая ценность работы. Простая теоретическая чодель поведения мннихромосом в популяции клеток может !ыть применена для описания и результатов нерасхождения 1риродных хромосом. Совокупность результатов теорети-(еского и экспериментального анализа нерасхождения мини-хромосом в клетке, а также накопления мннихромосом в части слеток популяции. существенно расширяют представления о механизмах трансмиссии мннихромосом. Клонирование гена БМС1 I доказательство того, что он является геном, необходимым ;ля вегетативного роста, открывает возможности для выясне-|пя роли продукта этого гена в клеточном цикле, а также для 1Ыделення гомолога этого гена из клеток человека.

Апробация работы. Материал диссертации докладывался на овместном семинаре Лаборатории генетики митоза и Лабора-орни стабильности хромосом и клеточной ннженерии Института итологии АН СССР, на Всесоюзной конференции "Новые направ-ения в биотехнологии" ( Пунино. 1988 ). на XIV Международен конференции по молекулярной биологии и генетике дрожжей Финляндия, 1988 ), на Международном симпозиуме по анэу-лоидни ( США. 1989 I. на Исследовательской конференции АБЕВ: Репликация и сегрегация хромосом дрожжей ( США. 990 ) .

06-ьеи работы. Диссертация изложена на 102 страницах аыннопмсного текста, состоит из введения, обзора лнтера-уры. методической части. четырех глав результатов, бсуждення и выводов, содержит 5 таблиц и 15 рисунков, пнсок литературы включает 103 наименования, из них - 98 на нглийском языке.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе были использованы в основном штаммы американского происхождения, предоставленные различными зарубежными лабораториями, и их производные: а также штаммы, сконструированные в ходе работы.

В работе. для клонирования и размножения плазмид, использовали штамм E.coli DH5. Для размножения плазмид. не несущих детерминант устойчивости к антибиотикам, с генами LEU2. URA3 и TRP1 дрожжей, использовали штамм МН1р66.

В работе использовали, в основном, центромерсодержаиие плазмиды ( минихромосомы ). .несущие гены CDC4. CDC16. CUP1. HTS3. LEU2. SUP11. TRP1. URA3. и центромерные локусы CEN3. CEN4 и CEN6 . в различных сочетаниях. Среды и условия культивирования дрожжей, использованные в работе, соответствует. в основном, стандартным ( Sherman et al.. 1986 ).

Биохимические н генноинженерные методики. если не указано иного, взяты из пособия Маниатис и др.. 1984. В работе использовали рестриктазы и другие энзимы следующих фирм: Amersham. BRL. N.E. Biolabs. Boehrinser. Pharmacia. Fermentas. Каждый «ермент использовали при условиях, рекомендованных производителем. Пульс-электрофорез ( Carle. Olson. 1984 ) проводили на аппарате ортогонального типа ( Диапульс. Москва ) при напряжении .200 В. силе тока 200 мА. в ТББ I О.Зх ). Для разделения хромосом длиной 200-600 тпн использовали время пульса - 50 с, разделения - 24 ч. Для разрешения полос. соответствующих более длинным хромосомам ( 700-1500 тпн ) электрофорез проводили дополнительно в течение 24 ч с временем пульса 200 с.

Трансформацию клеток дрожжей проводили двумя методами ( I to et al.. 1983: Keszenman-Perevrа. Rieda. 1988 ).

В работе использовали метод получения направленных 5'-" 3' делений плазмидной ДНК < Henikoff et al.. 1984 > с модификациями. предложенными фирмой Promesa. для точного картирования гена на фрагменте ДНК.

Основные генетические методики дрожжей, использованные в работе, описаны в специальных пособиях ( ЗЬегшап а1.. 1986: Захаров и др.. 1984 ).

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ОБСУЖДЕНИЕ Поскольку в задачу данного исследования входило изучение генов, влияюмих на сегрегацию хромосом, была, сделана попытка смоделировать процесс расхождения, основываясь на известных данных о сегрегации хромосомоподобных элементов в митозе у дрожжей. Результаты расчетов выводились в виде значений. соответствующих численности той или иной фракции клеток после определенного числа поколений. В алгоритм было заложено несколько параметров. перечисленных ниже, позво-ляюиих. с одной стороны, приблизить теоретическую популяцию к реальной, с другой стороны - дающих возможность модифицировать условия неточного деления ("фактор влияния среды"): вероятность нормальной сегрегации минихромосомн в каждом клеточном делении ( ): предельное число делений материнской клетки ( Кщ=10 ): число остаточных делений клетки, потерявшей плазмилу ( Ко ' . предельно возможное числ.о копий минихромосом на клетку ( пп1ах=10 ). число генераций ( N ). По данным расчетов, для каждого набора параметров, были построены графики, отражаюмие зависимость доли клеток в популяции. имеюмлх более одной копии минихромосомы I п>1 ). а также доли бесплаэмидных клеток ( п=0 ). от частоты правильного расхождения мннихромосомы в каждом клеточном делении ( Р2 ). На рис.1, представлен такой график, для условий. максимально приближенных к реальным при мягкой селекции на минихромосому. Доля клеток с п>1 служила основной характеристикой результатов нерасхождения мини-хромосомы. и. фактически, представляла собой дол» клеток, "накопивших" плазмиду. Приступая к разработке модели, мы предполагали. что такое накопление должно, происходить в популяции, однако оценить его масштабы. без привлечения моделирования, было бы, непросто. В результате проведенных

0.70 0.75 О.ВО О.й 0.90 0.95 1.0

Рис.1. Доля бесплазмидных и накопивших минихромосому клеток в популяции, в зависимости от частоты нормальной сегрегации в митозе (Р2). По вертикальной оси отложены доли клеток с п>1 {черные кружки) и п=0 (белые кружки") в процентах от общего числа клеток в популяции после прохождения 20 генераций. Число остаточных делений бесплазмидной клетки Ко=6 (селективные условия).

расчетов были выявлены интересные особенности модельной системы. Во-первых, модель оказалась устойчивой к небольшим отклонениям всех параметров. кроме-Р2. Во-вторых, как видно на рис.1.. й» теоретической популяции, при Р2<1. происходит значительное накопленне плазмиды, причем существует оптимальная частота правильного расхождения. при которой доля клеток. накопивших плазмиду. максимальна. В-третьих, эффективность накопления мннихро-мосомы справа и слева от максимума может, быть одинакова, но если слева доля бесплазмидных клеток в популяции велика, то справа практически такая же. как для дикого типа < Р2=0.99 ). Этот неожиданный результат. в случае. если модель достаточно адекватна, предсказывает возможность возникновения анэуплоидии ( накопления ) по минихромосоме без заметного сопутствуюиего

снижения стабильности. оцениваемой по суммарной популя-ционной частоте потерн t доля клеток с ri=0 ) .

Доказательства того, что такое, накопление действительно происходит, были получены после разработки соответствующей экспериментальной системы. Для маркирования мини-хромосомы был выбран ген CUP1. кодирующий металлотионеин дрожжей ( Foirel. Welch. 1982 ). Для выявления нерасхождения использовали плазмиду ( миннхромосому I YCp24. с тремя повторами гена CUP1 ( ' рис.2. ). обладающего дозозависимым проявлением. " ,

Поскольку в наыем распоряжении не было мутантного центромера. и. следовательно. мнннхромосона УСр24 имела характерный для минихромосомы дикого типа уровень нерасхож-дення. реципиентный ытамм должен был обладать тремя особенностями. Во-первых, ытамм должен обеспечивать частичную дестабилизацию центромера дикого типа, находящегося в составе,} минихромосомы.: во-вторых. должен быть чувствительным к нонам меди, чтобы не маскировать устойчивость, определяемую

плазмидой: в-третьнх. он должен обеспечивать возможность

1

трансформации по маркеру ЬЕ1)2 . Поскольку подавляющее большинство лабораторных штаммов дрожжей устойчивы к ионам чеди ( содержат • более 1 повтора С11Р1 на хромосоме VIII ). на первом этапе были получены соответствующим образом

LEUS

CUP1

CEN3

Рис.2. Карта плазмиды УСр24. Размер плазмнды - 14 т.п.н.

маркированные штаммы cupls. Два ытамма противоположных ти-4 пов спаривания: 16C-AS13 и 44C-AS13. были взяты в качестве

г

базовых для дальнейшей работы.У этих штаммов было проверено аллельное состояние локуса CUP1 на хромосоме VIII. методом б лот-гибри лизации. и было показано, что они несут 1 копию гена CUP1.

Для дестабилизаии минихромосомы YCp24 в митозе, было решено объединить в одном штамме фенотип чувствительности к Си + + и мутацию smci ( Larionov et al.. 1Э85 ). Штамм R2-GRF18 был скрещен с 16C-AS13. и были. получены м'ейотические еегреганты гибрида AS41 . Все сегреганты из первых четырех тетрад, полученных при тетрадном анализе гибрида AS41 . были трансформированы мннихромоеомой YCp24. По ее митотической стабильности на среде без лейцина определили расщепление по л о к у сv втс1 в тетрадах ( не отклонялось от 2:2 ) . Затем v всех сегрегантов. Cucs. трансформированных мннихромоеомой УСр24 . определяли уровень устойчивости к Си++ и стабильность минихромосомы на среде с 1 .5 мМ CUSO4. Результаты, анализа ( таблица 1. ) позволяют сделать вывод о косегрега-ции мутации smel и повышенной устойчивости трансформантов к нонам меди.. То есть, в данном эксперименте зарегестрирован новый Фенотип мутации smel - накопление минихромосом при мнтотических делениях клеток. Причем. такое накопление является подвижным в отношении числа копий минихромосом на клетку. Так. при определении митотической стабильности YOp24 v клонов штаммов smel. взятых со среды, содержащей 1.5 мМ CuSC>4. оказалось, что стабильность повышается практически до 100%. тогда как у штаммов Smc+ никакого увеличения стабильности не лроисходнт ( табл.1 ). Более того, как видно из таблицы, для штаммов Smc~ такое "транзитное" накопление является обратимым: при снятии жесткого селективного давления среды, стабильность возвращается к исходному уровню. Чтобы убедиться в том. что явление накоплення свячано именно с дестабилизацией функции центромера у мутантов smcL. все перечисленные сегреганты были трансформированы плазмидон YRp3. Данная плазмида полностью гомоло-

Таб лица 1.

Косегрегаиия мутации smcl и накопления минихромосомы YCp24 в мейотическом потомстве гибрида AS41.

Ст аб иль - Максималь ная Стабильность YCP24

ность концентрация на среде при пов-

Штамм YCp24 1 Гено CuSO/j. с 1.5 мМ торном

на среде -тип на которой CUSO4 переносе

без растет транс- на среду

лейцина формант ( мМ) Лейцин"

1C-AS41 15 smcl 2.2 100 21

1A-AS41 95 SMC1 1. 5 97 97

2A-AS41 31 smcl 2.2 100 28

2B-AS41 96 SMC1 1.5 95 95

3A-AS41 41 smcl 2.2 97 45

3D-AS41 37 smc 1 2.2 100 34

4B-AS4i 96 SMC1 1.5 97

4C-AS41 94 SMC1 1 . 5 95 -

Примечание: Штаммы без плазмиды чувствительны к 0.2 мМ CL1SO4 .

гична YCp24. но не имеет центромерного локуса. Устойчивость всех штаммов. трансформированных YRp3 не превышала 0.5 мМ. а стабильность плазмиды находилась в пределах 5-7%. Различия между сегрегантами Smc+ и Sine- зафиксировано не было. Таким образом, транзитное накопление минихромосом у мутанта smcl является прямым следствием процесса нерасхождения минихромосом в митозе в результате дисфункции центромера.

В результате приведенных экспериментов стала очевидной возможность использования разработанной системы детекции перасхожпения для обратной задачи - отбора мутантов с повышенной частотой нерасхождения минихромосом в митозе.

Первоначально были испробованы различные варианты мутагенеза. позволившие убедиться. что мутагенное воэдои-

ствне действительно приводит к индукции повышенной устойчивости клонов штамма'16C-AS13 IYCp24J. В окончательном варианте индукцию мутантов проводили УФ-о6лучейием на чашках с полной средой YPD. так. чтобы на чайку после мутагенеза приходилось не более 200 колоний. Затем клони перепечатывали на среду, содержащую 2 мМ CuS04. Расположение выросших на этой среде клонов находили на исходной чашке. и отсевали клоны.' В шести повторностях опыта по мутагенезу было отобрано более 1000 клонов, сохранивших плазмиду и способных расти в присутствии 2.0 мМ CuS04. У всех отобранных клонов была проверена мнтотическая стабильность минихромосомы YCp24. V клона 10-16C-AS13 было обнаружено понижение митотнческой стабильности до 50-60%. Н.Куприной и А.Власовым среди первичных мутантов были выделены еще 3 клона, также характеризующихся снижением стабильности мнни-хромосом. При ретрансформаиии клонов штамма 10-16C-AS13. плазмидой YCp24 было показано. что фенотип повышенной устойчивости к меди и снижения митотнческой стабильности минихромосои сохраняется. Таким образом было установлено, что мутант 10-16C-AS13 несет транс-действуюиую мутацию, приводяиую к нерасхождению минихромосом в митозе, и обозначенную amc2 ("accumulation of rninichromosomes"). При скрещивании штамма 10-16C-AS13 со штаммом 44C-AS13 (Ашс+) было показано, что гибрид не проявляет ни накопления, ни дестабилизации минихромосомы YCp24. а следовательно мутация ашс2 является рецессивной. У мутанта атс2. как было показано, накопление носит транзитный характер, как и у мутанта smcl. Генетический анализ мутанта атс2 показал, что nmc2 является мутацией в одном ядерном гене.

Поскольку было известно. что у мутанта smcl не наблюдается заметной дестабилизации природных хромосом, было интересно проверить стабильность хромосом у мутантов ame. Для этого были сконструированы диплоидные штаммы, гомозиготные по мутации атс2. Средняя частота потерн одного из гомологов хромосомы III у гибридов amc2/amc2 составляла 3.81+-0.5)х10"3 (проверено 9030 клонов). Частота потери

хромосомы III у нзогенных гибридов АИС2/ашс2 не превышала 10~4. Таким образом, было показано, что у мутанта аглс2- в 30 раз повышена частота потери хромосомы III. что указывает на важность данного гена для мнтотической стабильности не только минихромосом. но и природных хромосом.

В рамках данной раб оты была проверена аллель ность мутаций ашс2 и ашс4 ряду известных ранее, мутаций, вызывающих снижение мнтотической стабильности хромосом. Было показано. что гены cdc6. cdcl4. top2, chl4. chl3. smol. CDC16 не аллельны генам amc2 и amc4. Таким образом, гены ашс2 и ашс4 являются новыми генами. контролирующими расхождение минихромосом у дрожжей.

Как было предсказано при моделировании процесса не-•расхождения, можно ожидать заметного накопления минихромосом в клетке без существенного сннжения их стабильности. Действительно. при индукции мутантов ашс были получены сотни мутантных клонов, проявляющих отчетливый фенотип Ашс. у которых. тем не менее, не наблюдалось значимого снижения стабильности YCp24. по сравнению с исходным штаммом 16С-AS13. 20 мутантов этой группы. были подвергнуты более тщательному анализу. Клоны, потерявшие миннхромосому УСр24. не отличались по уровню чувствительности к ионам меди ( 0.2 мМ ) от штамма J.6C-AS13. После ретрансформации плаэмидой YCp24dl ( аналогом YCp24. но с одннм повтором CUP1 ) у'19 из 20 проверенных клонов показано наличие в популяции клеток. имеющих. 1.2. 3 н 4 копни минихромосомы. Воспроизведение фенотипа Ame у мутантов этой группы, свидетсль-ствует о том., что неожнданно низкая. на первый взгляд, селективность предложенной системы для отбора мутантов ( 4 мутанта из 1000 первичных ). объясняется не методическими просчетами. а неотъемлемым свойством предложенной схемы позволять отбор ликн-мутаций типа ame.

Для молекулярного клонирования аллелей дикого типа были выбраны гены smel и ашс4. Это было связано с тем. что эти две мутации, проявляли наибольшую дестабилизацию мини-

/

минихромосом в митозе. по сравнению с другими мутантами, имев-иимися в нашем распоряжении.

Первым подходом. Использованным в работе для клонирования этих генов был метод, основанный на зарегестри-рованной в ходе работы токсичности минихромосом с геном SUP11 для клеток мутантов ашс4 н smcl. На специально сконструированном векторе PAS25. несумем ген SUP11. был построен банк генов дрожжей ( размер вставок: .5-7 тпн I . Тем не менее оказалось, что для мутанта smcl. схема селекции неэффективна, а у мутанта ашс4. несмотря на высокую селективность отбора даже на уровне трансформируемое™ штамма, были отобраны исключительно ревертанты по гену ашс4 или случаи интеграции.

Параллельно с вышеизложенным подходом был начат скрининг колоний трансформантов штамма smcl библиотекой, полученной от Ф.Хитера ( Spencer et al.. 1990 ). Из 10000 трансформантов, было выбрано 500 крупных колоний, в которых определяли стабильность минихромосом. Из трех трансфер-, мантов ( 63. 38 и 194 ). проявлявших высокую стабильность минихромосом. плазмиды были спасены в первом же опыте. Плазмиды рбЗ и р!94 оказались полностью идентичными по данным рестрикционного анализа. При введении в клетки штаммов smcl эти плазмиды воспроизводили высокую стабильность.

Кроме этого, они комллементировали и дополнят.-льный "сек-\

торный" фенотип, обнаруженный при введении в клетки smcl хромосомного Фрагмента

Первым ' тестом на идентичность клонированной последовательности гену SMC1 было определение хромосомной локализации клонированного фрагмента. Результаты блох-гибридизации с разделенными методом пульс-электрофореза хромосомами свидетельствуют о том. что клонированный фрагмент содержит п-оследовательности. уникальные для хромосомы VI. в которой ранее и была локализована мутация smcl.

Второй тест заключался в демонстрации генетического сцепления последовательности вставки рбЗ при ее нормальной локализации I- в составе хромосомы ) с мутацией smcl.

Была построена рестрикиионная карта вставки в плазмиде р$3( рис.3. ). и проверена способность различных рестрик-ционных фрагментов коиплементировать мутацию эшс1. Наименьший комплементирующий фрагмент имел длину 5 тпн. Для проверки. является ли клонированный ген необходимым, была сконструирована плазмида рА.3113. несущая вставку гена Н153 в сайт ВашН1. находящийся внутри гена БМС1. Фрагмент этой плазмндц был нспользован для трансформации клеток дрожжей штаммов УРН102 и УРН274 к прототрофности по гистиДину. Для гаплоидного штамма УРН102 не было получено ни одного трансформанта. Штамм же УРН274 ( диплоид ) трансформировался с нормальной частотой ( стабильность маркера Н133 - 100%. ). Полученные данные свидетельствуют о том. что использованная мутация ( вставка ) приводит к рецессивной летальности, что. вероятно, означает необходимость гена БМС1 для вегетативного роста клеток дрожжей.

Их 3

Т. П.Н.;

Рис.3.Рестрнкционная карта вставки геномной ДНК в плазмиде рбЗ. Обозначены сайты, уникалвные для вставки.

выводы

1. С привлечением математического моделирования роста популяции клеток, несущих минихромосому. показано, что при отклонении частоты правильной сегрегации сестринских мини-хроматид в митозе от нормального значения. в популяции возникает субпопуляция клеток, накопивших минихромосому.

2. Реальное сумеетеование явления накопления минихро-мосомы заоегестрировано при объединении в одном штамме.■ минихромосомы с геном металлотионеина дрожжей: мутации smcI . ограниченно дестаби л изируюией минихромосому: аллеля хромосомного локуса CUP1. определяющего чувствительность бесплазмидного штамма к сотям меди.

3. С использованием штамма, чувствительного к ионам меди и минихромосомы . несущей детерминанту устойчивости к наличию меди в среде, разработана система отбора мутантов с повышенной частотой нерасхохдения минихромосом.

4. По разработанной схеме выделен и охарактеризован м\-тант дрожжей. характеризующийся не только накоплением минихромосом. но и дестабилизацией хромосомы III. Показано, что дестабилизация минихромосом у данного мутанта определяется моногенной ядерной мутацией.

5. Клонирован ген дрожжей SMC1. принадлежащий семейству генов. мутации в которых, приводят к накоплению минихромосом в митозе. Показано. что ген является необходимым для вегетативного роста гаплоидных штаммов дрожжей.

СПИГ.ОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Струнников А.В.. Пирожков В.Н.. Ларионов В.Л. Математическая модель. описывающая динамику накопления иентромерсопержаиих плазмид в митозе // Тезисы докл. Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии" Пушимо..-1988.-П.27-28 .

2. Ларионов В.Л.. Струнников А.В. Накопление искусственных минихромосом v мутанта дрожжей-сахаромицетов с нарушением процесса сегрегации // Докл. АН СССР.-1987.-Т.294.-N 6.-С.1493-1497.

.3. Ларионов В.Л.. Куприна Н.Ю.. Струнников А.В.. Власов А.В. Селекция мутантов с нерасхождением минихромосом у дрожжей Snocharomvces cerevisiae // Докл. АН СССР.-1988,-T-300.-N 6.-С.1485-1488.

4. l.ar.ionov V. . Kouprirm N. . Strunnikov К. . Vlasov А..

A direct selection procedure for isolating yeast mutants with an impaired seeregat ion of artificial mifiichromosomes // Current Genetics.-1989.-V.15-P.17-25.

5. I.arionov V.. Kouprina N.. Strunnikov A.. Vlasov A. Direct selection procedure for isolation of veast mutants with impaired segregation of chromosomes // Mechanisms of Chromosome Distribution and Aneuploidy -Reno.: Alan R. Li ss.Tno. . 1 9R9.-10P.

6- Kouprina N.. Krol1 E.. Tzouladse A.. Strunnikov A.. Koryabin M. . Larionov V. The study of CHL genes controlling mitotic ^hromo4ome transmission // 1991 Yeast genetics and molecular hioloey meeting -San-Francisco. C-A .-1991 .-P . 110 .