Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование локализации источника двигательной ритмики в изолированном спинном мозге куриного эмбриона

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование локализации источника двигательной ритмики в изолированном спинном мозге куриного эмбриона"

ОРДЕНОВ ЛЕНИНА И ДОТБИ НАРОДОВ АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНЫ Ордена Трудового Красного Знамени Институт физиологии ии. А.А.Богомольца

На правах рукописи

ЧУБ Николай Леонидович

ИССЛЕДОВАНИЕ ЛОКАЛИЗАЦИИ ИСТОЧНИКА ДВИГАТЕЛЬНОЙ РИТМИКИ В ИЗОЛИРОВАННО! ■ ШИННОМ МОЗГЕ КУРИНОГО ЭМБРИОНА

03.00.13 - Физиология человека и яивотных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Киев - 1992

Работе выполнена в Институте физиологии им. А.А.Богомольца ЛН Украины

Научный руководитель - доктор биологических нчук,

профессор К.В.Баев

Официальные оппоненти - доктор биологических наук,

профессор Ю.П.Лиианский кандидат биологических наук

В.Н.Оксамитный

Ведущее учреждение - Киевский государственный

университет им. Т.Г.Шевченко.

Защита диссертации состоится г.

на заседании специализированного совета Д-016.15.01 при Институте физиологии ии. А.А.Богомольца АН Украины (Киев, ул. Богомольца, 4).

С диссертацией иожно ознакомиться в библиотеке Института физиологии км. А.А.Богоыольца АН Украины.

Автореферат разослан

1992 г

• •••• •»•«••«« у* « « Ч •••С * 9

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических.неук , З.А.Сорокина-йарина.

. ОБЗАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Важнейший достижением последних лет в области изучения двигательных систем является признание существования в спинной иозге позвоночных нейронных генераторов, способных обеспечивать координированные движения конечностей. Известно, что в состав этих генераторов входят ицтернейроны, которые неидеа-тичны по своей локализации и функциональному значению / viaia 1917, Баев и др. 1979а, б. Баев 1991/. В связи с этим предполагается, что в составе генераторов следует выделять определенные подразделения. Одни из них обладают ритмогенными свойствами и могут рассматриваться как источники двигательной активности. Другие же обеспечивают.перераспределение созданной ритмики к соответ* ствугщим выходным системам генератора. Однако, вто представление носит лишь гипотетический характер, так как роль различных областей спинного мозга в генерации двигательной активности окончательно не выяснена. В частности, не известна локализация в спинной иозге источников двигательной ритмики. Очевидно, что для выясне- ' н'ия этого вопроса прежде всего необходимо обеспечить изоляцию различных участков серого вещества спинного мозга. Поатому, в настоящее время определенный прогресс в решении этой задачи связывают с проведением исследований на препаратах изолированного мозга.

• Сравнительно недавно Ландиессером И 0"ДОНОВШОМ /Landmesser, o'DonovnnDG2*/ получен препарат изолированного спинного мозга и задней конечности куриных эмбрионов ранних сроков эмбриогенеза (8-Ю-день развития), сохраняющий способность спонтанно генерировать эфферентную импульсную активность. В этом случав программа ' активации мышц бедра была сходной с локомоторной. После деа-^ерен--тации препарата двигательная активность, генерируемая изолированным спинным мозгом, не изменялась. Таким образом, впервые были получены неопровержимые доказательства наличия в спинном мозге куриных эмбрионов ранних стадий эмбриогенеза спинального генератора, который в отсутствие нисходящих входов и афферентных обратных связей способен генерировать координированную двигательную активность. Однако, в настоящее время исследования на изолированном спинном мозге куриных эмбрионов поздних стадий развития не / проводились, что не позволяет оценить изменения ритиогенных , свойств этого спинального генератора в процессе становления двигательных функций.

-г-

Цель работы. Исследовать алектрическув активность а спин а ль-ных корешках куриных эмбрионов ранних (8-Ю-дневных). и поздних (16-20-дневных) сроков развития и выявить локализацию источника двигательной ритиики в спинном мозге.

Главные задачи.

1. На препарате изолированного спинного иозга сравнить особенности ритмической активности в дорсальных (ДК) и вентральных корешках (ВК) куриных вибрионов ранних (б-Ю-дневных) и поздних (16-20-дневных) сроков развития.

2. Используя методику перерезок, определить локализацию в серой веществе спинного мозга источника спонтанной ритиики в ДК и ВК.

3. Изучить влияние ШДА, Ь-ДОФА и Ь-гдутаиета на изолированные участки серого вещества спинного мозга, которые обладав? рит-могенныыи свойствами.

Научная новизна работы:

Впервые обнаружена спонтанная подпороговая активность - синхронные циклические алекгротонические колебания потенциалов в ДК и ВК, генерируемые препаратом изолированного спинного мозга 16-20-дневных куриных вибрионов.

Установлено, что половинка спинного мозга длиной в один сегмент способна генерировать подпороговую активность в ДК и ВК. Выявлено, что источник этой подпороговой активности локализован в дорсальном роге.

Обнарухено, что ШДА и Ъ-ДОйА усиливает спонтанную подпороговую активность, генерируемую препаратом изолированного спинного мозга'. Появляются импульсные разряды в ДК и ВК, что позволяет судить о надпороговом рекиме работы спинального двигательного генератора. '

Показано, что 2-АФВ подавляет подпороговую и вызванную НМДА или Ь-ДОФА ритмическую активность, что'предполагает участие сходных (ШДА-чурствительнюО нейронных сетей в генерации'обоих типов ритиики.

Продемонстрировано, что'после рассечения препарата спинного мозга, подпороговая активность в ДК, генерируемая- изолированный дЬрсальным рогом, усиливалась ШДА или Ь-ДОФА. В изолированном ве^^альном^рогеЛ'итмика ле_лаблвдаласьни-до,-ни-после-действия—

эгих веществ.

На основании перечисленного сделан вывод о том, что нейронная сеть, являвдаяся источником двигательной ритмики, локализована в дорсальной роге спинного uoaia куриного эмбриона. Более вентраль-но расположенные нейронные сети являйся ведомыми.

Получены свидетельства о наличии пряного (т.-е. не зависимою от катехоламинов) возбувдащего эффекта L-ДОФА на нейронную сеть дорсального poia спинного мозга куриного вибриона.

Теоретическое и практическое значение работы.

Полученные результаты позволяет глубже понять механизмы функционирования эмбрионального спинного мозга и роль спинальных нейронных сетей, локализованных в различных областях серого вещества мозга, в генерации двигательной активности. Результаты работи могут быть использованы для дальнейшего целенаправленного изучения нейронной организации спинальных генераторов ритмических движений; выяснения медиаторных механизмов, лежащих в основе ритмоге-неза; при тестировании и изучении действия нейрефармакологических препаратов; при исследовании определенных патологических состояний, связанных с нарушением двигательных функций спинного мозга.

Апробация работа. Основные положения диссертации доложены на Всесоюзном симпозиуме "Регуляция сенсомоторных функций" (Винница, 1989), XIII съезде украинского физиологического общества им. и.П. Павлова (Харьков 1990), семинаре секции Нейрофизиологии Института физиологии им. A.A. Богомольца АН УССР (Киев, 1991).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методики исследований, результатов экспериментов, обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 117 страницах машинописного текста, иллсстрирована 21 рисунком, в работе цитирован 161 литературный источник.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ

Основная часть опытов была выполнена на изолированном спинном мозге куриных эмбрионов поздних стадий развития (16-20-дневных). Эмбрион извлекали из яйца и помещали в операционную ванночку с охлажденным (10-12° С) проточным раствором следующего состава (в миллимолях на I л): Naci-120, kci -2,5, caci2 -2,6, Mgci2-I,3,

2- <J-tO

кнрог0,5, маНсс^-20, глюкоза-П,1. Через 2-3 мин производили дорсальную ламинэктомию, вскрывали твердую мозговую оболочку и пересекали корешки, добиваясь максимально возможной их длины. Для обеспечения лучшей супер^узии, в большинстве случаев, производилась продольная гемисекция мозга. Из лшбосакрального отдела извлекали кусочки мозга необходимой длины. Выделенный участок мозга помещали в экспериментальную ванночку с проточным охлажденным раствором той же температуры (скорость протока 5-7 мл/чин) и фиксировали к залитому воском дну с помощью "Г"-образных металлических булавок. Затем медленно (в течение 1-1,5 ч) повышали температуру суперфузирупцего раствора до 26-27° С и фиксировали на этом уровне на .протяжении всего опыта. При этой температуре препарат спинного мозга в течение длительного времени (8 ч и более) мог находиться в хорошем функциональном состоянии. Электрическую активность начинали регистрировать не ранее чем через 1,5-2 ч после окончания операционной подготовки препарата.

В ходе эксперимента нормальный суперфузируиций раствор заменяли раствором, содержащий исследуемые вещества. Время аппликации составляло 5-10, иногда 15 мин. Затем препарат отмывали в течение 40-60 мин до восстановления исходной активности.

В условиях изменения концентрации ионов Са и 11д (конкретные величины указываются по ходу изложения результатов) исходную ос-мотичность нормального раствора сохраняли путем соответствующего изменения концентрации хлорида натрия. Все растворы постоянно аэрировали карбсгеном (95 « 02и 5 ^ С02), рН находился в пределах 7,4*0,1.

Если в ходе опыта осуществлялись дополнительные перерезки препаратов мозга, то начинали регистрировать активность не ранее чем через 30 мин после каждой перерезки.

Методика приготовления препарата изолированного спинного мозга куриных эмбрионов ранних сроков развития (б-1С-дневных) была аналогична. Отличие состояло в том, что выделялся весь спинной мозг (с шейного по лшбосакральный отдел включительно) и в некоторых случаях сохранялась одна из задних конечностей. Кола и верхние оболочки с мышц удалялись. Конечность фиксировали на дне ванночки с помощью "[¡"-образных металлических булавок. Для электрической ^ииу.ляш111_ЕОверх[;ости-иозга-прииеняли-б1тояярнь:е-т:етазк:?ческие

электроды с межэдектродным расстоянием 0,5-1,0 ми. Стимуляция осуществлялась одиночными прямоуюльными толчками тока длительностью 0,5-1,0 мс, напряжением 10-20 В.

В работе от препаратов изолированного спинною мозга регистрировали активность двигательных нервов, потенциалы дорсальных (ДКП) и вентральных корешков (ВЫО монополярно посредством стек-ляных всасывапцих электродов, заполненных нормальным раствором и соединенных с усилителем через Agci электроды. В тех случаях, когда сохранялась одна из конечностей с помощью стекляных всасывающих электродов отводилась эдектромиограмма некоторых мышц. Референтный Agci электрод находился в суперфуэируШеы растворе. Электрическая активность от корешков усиливалась по переменному (постоянная времени усилителя - 2,2 с) или по постоянному току (собственный дрейф усилителя - 50 мкВ/ч) и записывалась на мв1нитог~ раф. Обработка экспериментальных данных осуществлялась на базе электронно-вычислительного комплекса ßf-4, с использованием пакета программ, разработанных в отделе физиологии спинного мозга Института физиологии им. A.A. Богомольца.

В работе использовали: ШДА ф|-метил-0-аспартат, "Диагностика", Англия), 2-АФВ (2-аиино~5-фосфоновалериановая кислота, "Диагностика", Англия), L-ДОФА (Э.^-диокси-Ь-^б-фенилаланин, "Реа-нал", Венгрия), дофамин (з-гидрокси-тирамин-HCI, "Ферак", Германия), норадренадин (норадреналин гидрогартрат, Харьковский завод эндокринных препаратов), L-глутамат (Реахим). Концентрации применяемых веществ: НМДА - 2-40 мкмоль/л, 2-АФВ - 20 мкыоль/л, L-ДОФА - 30-1000 мкмоль/л, дофамин - 50-100 мкмоль/л, норадреналин 50-100 мкмоль/л, Ь-г.цутамат - Ю-ЮОО мкмоль/л.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

I. Ритмическая активность в спинальных корешках во время работы двигательного генератора у куриных эмбрионов ранних сроков развития (в~10-дневных).

У препарата изолированный спинной мозг-задняя конечность электрической стимуляцией поверхности мозга в торакальном, цервика-льном или лшбосакральном отделах можно было вызвать длительную

Z*

(до 60 с) ритмическую реакцию. Эта ритмика начиналась с синхронного во всех мышцах начального разряда за которым в мьшцах-анта-юнистах следовала альтернирувдая импульсная активность. В случае отведения от нервов мышц-синергистов, соответственно возникали синфазные импульсные разряды. Наличие указанной активности свидетельствует о работе спинального генератора, который, как отмечалось ранее /Landmesser, O'Donovan 1984/, уже у 8-Ю-ДНеВНЫХ SMÖ-рионов способен генерировать координированные двигательнкые программы, сходные с таковыми у взрослых животных. '

В острых опытах, проведенных на кошках, / Baev, Kostyuk 1981, 1982/ установлено, что во время работы спинального двигательного генератора возникаю ритмические изменения ДКП. Однако, подобные сведения об изменениях потенциалов в ДК во время работы эмбрионального двигательного генератора отсутствуют. в пеших экспериментах эфферентная ритмика, вызванная электрической стимуляцией поверхности мозга, всегда сопровождалась соответствующими колебаниями ДКП. У различных препаратов длительность циклов (ДЦ) этой ритмики варьировала от 2 до 4 с. Амплитуда колебаний потенциалов в корешках достигала до 300 мкВ, а их продолжительность обычно составляла порядка I с. Аналогичная активность в ДК (синхронная с колебаниями потенциалов в ВК) наблюдалась и после активации спинального генератора путем добавления в суперфузирувций раствор L-ДОФАв концентрации 100 мкмоль/л. Кроме этого, в случае отведения активности по постоянному току, наблюдался и отчетливый тонический компонент ДКП и ВКП, на'фоне которых происходили их фазные изменения. В этих экспериментах спинной мозг был полностью изолирован. Следовательно, наблюдавшиеся тонические и на их фоне фазные колебания ДКП имели центральное происхождение.

Ноебходимо отметить, что изолированный спинной мозг куриных эмбрионов ыа этих ранних стадиях развития мог и спонтанно генерировать двигательную ритмику, которая была сходна с вызванной активностью. Обычно, спонтанная активность возникала после длительного интервала покоя (до 10-15 мин) и продолжалась 40-60 с.

-Y-

2. Спонтенная подпороговая активность в ДК и ВК, генерируемая изолированными препаратами спинного мозга 1б-20-днев~ них эмбрионов.

В нормальном суперфузирупцем растворе изолированные препараты спинного мозга (половинки мозга размером 3-4 сегмента) в течение длительного времени (до 8 ч и более) спонтанно генерировали электрическую активность. При отведении от спинальных корешков наблюдались повторяющиеся практически синхронные колебания потенциалов в ДК и ВК. Амплитуда колебаний ДШ1 достигала 200 мкВ, а их продолжительность обычно составляла порядка 150 мс. Для колебаний ВКП эти величины составляли около 150 мкВ и 100 не соответственно. Спонтанные изменения ДЫ1 и ВКП не сопровождались импульсной активностью, т. е. они представляли собой злектротокичвекие потенциалы и свидетельствовали о том, что колебания потенциала в иотоней-ронах и афферентных волокнах были подпоротовыми для возникновения потенциалов действия. В дальнейшем этот тип активности, хенериро- " в евшийся препаратом спинного мозха 16-20-дневных куриных вибрионов, для краткости будем называть подпороговой активностью. Y различных препаратов ДЦ этой ритмики варьировала от 2,2^1,5 до 8,2+7,6 с (среднее значение ± стандартное отклонение). Кроме того, наблюдались отличия в следовании циклов. В 80 Й из 24.опытов наблюдалась активность с относительно постоянной ДЦ, а в 20 г опытов имела место тенденция к группированию циклов. В первом случае распределение ДЦ имело разброс длительностей от I до 6 с, а во втором наблюдалось более широкое бимодальное распределение ДЦ. Первый пик отражал наличие малых внутригрупповых интервалов (от 0,6 до 3 с), второй - длительных ыежгрупповых интервалов, варвиру шшх от 4 до 20 с. Во всех случаях подпороговая активность в ВК сопровождалась соответствующими колебаниями ДКП, что позволяло судить о работе генератора по наличию соответствующей активности в ДК спинного мозга.

3. Локализация в спинном мозге 16-20-дневных эмбрионов источника спонтанной подпороговой активности в ДК и ВК.

Перед определением локализации в спинном мозге 16-20-дневных

эмбрионов источнике, ответственного за генерацию подпороговой активности в ДК и ВК, была проведена серия опытов (на четырех препаратах) с целью определения минимальных размеров мозга, необходимых для генерации этой активности. Контролем служила активность ДК и ВК, генерируемая половинкой люмбосакрального отдела мозга (б сешецтов). Затем размер препарата уменьшали (путем отсечения) до четырех и далее, до одною сегмента. Результаты этих экспериментов показали, что уменьшение размеров мозга приводило к увеличению ДЦ спонтанной активности (1,9+1,2, 3,5+2,3 и 5,6+3,8 с для восьми, четырех и одного. полусегмента соответственно). Кроме тою, активность становилась менее стабильной. Необходимо отметить, что параметры активности, генерируемой изолированным полусегментом U03ia, не зависели от тою из какой части люмбосакрального отдела (ростральной или каудальной) ею выделяли.

Для определения локализации источника генерации подпороговой активности использовали перерезки, позволяйте изолировать различные зоны серого вещества спинного мозга. При интактных связях между дорсальным и вентральным рогом колебания ДКП и ВКП практически синхронные. В случае, когда отделялась только часть дорсального рога, активность сохранялась в ДК и ВК. Однако, колебания ДКП и ВКП в данном случае били несинхронными. Амплитуда и частота изменений ДКП и ВКП уменьшались. При перерезке, отделяпцей дорсальный рог от промежуточной зоны и вентрального рога, активность сохранялась только в ДК. При атом амплитуда и частота колебаний Д КП практически не изменялись. Аналогичные результаты были получены и на половинках мозга длиной в один сегмент, т.'е. на меньших по объему нейронных сетях.

4. Действие ШЦА на спонтанную активность, генерируемую изолированными препаратами спинного мозга 16-20-дневных эмбрионов.

После замены нормальною раствора раствором, содержал::м ШДА (2-25 икмоль/л), у 18 из 20 препаратов (половинки мозга длиной в 3-4 сегмента) наблюдалось четко выраженное усиление работы спшальною генератора (в двух случаях наблюдалось только увеличение ^с^шты^дектромниыеских-Д№-и-В1Ш).-После-воздействия-ШДАти.11т-г

литуда ДИ1 и ВКП значительно возрастала, в В 1С появлялись ПД. Импульсные разряды начинали регистрироваться и в ДК. Они били соизмеримы по амплитуде с эфферентными разрядами в ВК или даже превосходили их. Кроне того, уменьшался разброс ДЦ, и ритмика становилась более стабильной (5,0+2,9 и 4,2+0,6 с до и во время аппликации 8 мкмоль/л НУДА соответственно). Таким образом, значительное увеличение интенсивности электротонических ВКП свидетельствует о возросшей амплитуде циклических изменений мембранной потенциала мотонейронов. Эти изменения становятся достаточными для генерации мотонейронаии ПД, что позволяет рассматривать данный уровень активности двшательного спинального генератора как надпороювый.

Двигательная эфферентная активность возникала через 3-4 мин после начала суперфузии НУДА и продолжалась до 5-10 мин, а затеи исчезала. После отмквшшя мозга в нормальной растворе в течение 40 мин повторная аппликация НУДА вновь была эффективной.

Отведение активности по постоянному току показало, что НУДА даже в пороховых концентрациях (2-4 мкмоль/л) способен вызывать появление тонического компонента ДКП» Тонический сдвиг проявлялся и в ВКП.

Действие 2-АФВ (блокатора НМДА-рецепторов) обнаруживалось через 5-6 мин после начала суперфузии. При использовании 2-AiiB в концентрации 20 икмоль/л в пяти из секи случаев подпороговая активность полностью и обратило блокировалась. В остальных случаях иногда наблюдались отдельные всплески электротонических ДКП и ВКП с ДЦ более 40 с. Га ае концентрация 2-АМЗ была достаточной для блокады надпорогового уровня активности спинальнохо генератора в случае применения КУДА в концентрации 8 мкмоль/л.

Для определения локализации ШДА-чувствительной нейронной сети - источника генерации, двигательной активности, препарат спинною мозга (половинка мозга длиной в 3 сегмента) дополнительно рассекали и исследовали влияние ШДА на две изолированные части мозга - дорсальную и вентральную (последняя отпрепарирована вместе с промежуточной зоной). Очевидно, что при пороговой концентрации ПИДА достаточно аффективно усиливалась активность, генерируемая нейронной сетью изолированного дорсального рога (судя по наличию тонического компонента ДКП), В условиях более высоких концект-/ раций ШДА появлялась импульсная ритмика в дорсальной роге, в вент-

моральной части мозга она не возникала. .В двух из шести случаев действие ¡ШДА в концентрациях 4-20 мкмоль/л на 1енератор дорсального рога проявлялось лиаь в увеличении частоты электротонических ДКП.

5. Влияние Ь-ДОФА на спонтанную активность, генерируемую изолированными' препаратами спинного мозга 16-20-дневных эмбрионов.

В нормальном суперфуэирупцеы растворе работа спинального генератора характеризовалась наличием спонтанных ритмических колебаний электротонических потенциалов в ДК и ВК. Через 3-4 мин после начала суперфузии раствором, содержащим Ь-ДОФА в малых концентрациях (30-150 мкмоль/л), наблюдалось отчетливое усиление работы спинального генератора. Колебания ДНИ и ВКП значительно усиливались, в волокнах корешков появлялась распространявдаяся импульсная активность. Появление разрядов мотонейронов свидетельствует о надпороговом режиме работы спинального генератора. Во время суперфузии раствором, содержащим Ь-ДОФА в малой концентрации, надпо-роювая активность возникала в 6 из 12 препаратов и продолжалась 5-7 мин, в остальных случаях наблюдалось только увеличение частоты колебаний влектрстонических ДИ1 и ВКП.

Влияние на спинальный генератор Ь-ДОФА в больших концентрациях (200-1000 мкмоль/л) отличалось от воздействия этого вещества в малых концентрациях и характеризовалось следупцкми особенностями. Так, через 8-10 мин после начала суперфузии препарата раствором, содержащим 500 мкмоль/л Ь-ДОФА, средняя частота'колебаний ДКП и ВКП снижалась на 45 %, уменьшалась и амплитуда колебаний, что свидетельствует об угнетении работы спинального генератора. Однако, во время последующего отмывания были зарегистрированы случаи возникновения надпороювой активности. С повышением концентрации Ь-ДОФА от 200 до 1000 мкмоль/л и увеличением продолжительности аппликации степень угнетения работы спинального генератора возрастала.

Суперфузия в течение 10 мин раствором, содержании дофамин или норадреналпн в концентрации 50 мкмоль/л, не влияла на спонтанную подпороговую активность в корешках препарата,мозга. Однако, аппликация этих катеходаишов^-концентрации^Бдвоетзст;ьХГёй_(10С

ыкмоль/л), приводила к угнетению работы спинальною генератора. Через 7 мин после начала суперфузии раствором, содержащим дофамин, средняя частота колебаний ДКП и ВКП уменьшалась на 36—¡t5 % относительно контро льного уровня. Для норадреналина эта величина составляла 65-73 В течение 30-40 мин последу щего отмывания препаратов нормальным раствором частота спонтанной активности постепенно восстанавливалась до исходного уровня. Случаи возникновения надпороговой активности не наблюдались.

В ходе экспериментов было такхе обнаружено, что 2-АФВ блокирует вызываемое L-ДОй'А (в малых концентрации) усиление работы спинального генератора. Аппликация ICO мкмоль/л L-ДОФА в присутствии 20 ыкмоль/л 2-А4В не приводила к усилению активности, генерируемой мозгом.

После перерезки, отделяющей дорсальный рог от промежуточной зоны и вентрального рога, аппликация L-Д02/А в концентрации 30-150 нкмоль/л усиливала активность, генерируемую нейронной сетью изолированного дорсального рога. В трех из четырех экспериментов в дорсальном корешке возникала надпороговая активность, а в одной наблюдалось только увеличение частоты электротонических колебаний ДКП. В вентральной части мозга ритмика не появлялась.

б. Модификация активности, генерируемой изолированными препаратами-спинного uoaia 16~2С-дневных эмбрионов при изменениях концентрации ионов Са и tíg.

Как указывалось вкие, препарат изолированного спинного мозга (половинка мозга длиной в 3-4 сегаента) в нормальном растворе в течение длительного времени (до а ч и более) ¡.(ог спонтанно генерировать подпороговую активность в ДК и ВК. После замены нормального суперфузкруиего раствора раствором с повкаенной концентрацией конов Щ (от 1,3 в нормальном растворе до 5,0 амоль/л) спонтанная активность постепенно исчезала. Прежде всего, как правило, исчезали колебания ВКЕ, затеи ДКП, а через 10—15 мкн работа спинального генератора полностью прекращалась. Аналогичные изменения вызывала суперфузия препарата раствором с пониженной от 2,6 до 1,0 ми оль/л концентрацией ионов Са. Однако, в этих случаях могли возникать фоновые импульсные разряды в ВК. Все изменения носили

обратимый характер, после отмывания препарата в течение 15-20 мин нормальным раствором исходная активность полностью восстанавливалась.

Кроме того, в шести из восьми опытов во время угнетения работы спинального генератора (после увеличения концентрации ионов 11g или снижения концентрации ионов Ca в суперфузирущеи растворе) ' било зарегистрировано возникновение ранее не выявленного типа ритмики. Эта активность представляла собой электротонические колебания BKII, возникавшие к отдельных (один или два-три соседних) ВК независимо от колебаний ДКП. При отведении от различных препаратов длительность данных колебаний BKII находилась в пределах 200-400 мс, а амплитуда составляла от 50 до 200 мкВ. У одною и того же препарата амплитуда была относительно стабильной по сравнение с амплитудами колебаний ДКП и ВКП во время спонтанной активности в нормальном растворе. В дальнейшем, самостоятельные электротонические колебания в ВК препарата спинного мозга, появляпци-еся после изменения полною состава суиерфузирувдего раствора, 'будем называть ритмикой в ВК.

Наблюдалась следувдая зависимость изменения относительных частот спонтанной активности и ритмики в ВК от времени суперфузии раствором с повышенной до 5,0 ммоль/л концентрацией ионов Ug. Через 10-12 мин после начала суперфузии частота спонтанной активности уменьшалась на 40 %, что сопровождалось возникновением ритмики в ВК. Через 20 мин суперфузии спонтанная активность полностью подавлялась, а частота ритмики в ВК достигала максимального значения (0,4/с). На протяжении последуыдего отмывания (в течение 20-25 мин) частота спонтанной активности плавно увеличивалась, в то время как ритмика в ВК постепенно исчезала. Иногда, через 5-8 мин после начала отмывания препаратов нормальным раствором, частота и амплитуда спонтанной активности резко увеличивались, что сопровождалось немедленным исчезновением ритмики в ВК. Повторные суперфузии препаратов мозга раствором с пониженной концентрацией ионов Ca или повышенной концентрацией ионов Hg, вызывали появление ритмики в ВК, которая при длительной экспозиции продолжалась до 10-15 мин.

Было также обнаружено, что в отличие от спонтанной активности, для которой характерны-синхронные изменения BMjojBcexJiECH--

латерадышх корешках люмбосакрального отдела спинного мозга, ритмика в ВК не была в соседних корешках синхронизирована, задержка между возникавшими колебаниями потенциалов варьировала в пределах от 500 до 600 мс.

Оуперфузия Препаратов раствором без ионов Са и с повни-енной до 5,0 ммоль/л концентрацией ионов Ug, в течение 4-5 мин приводила к полному подавления спонтанной активности. Ритмика в ВК в этих случаях никогда не возникала.

7. Модификация активности, генерируемой изолированными препаратами спинного мозга 16-20-дневных эмбрионов под действием L-глутамата.

В неких опытах, через 3-4 мин после замени нормального раствора раствором, содержащим Ь~1лутамат в малых концентрациях (0,01-0,04 ммоль/л), наблюдалось усиление работы спинального генератора. У шести из восьми препаратов возникала надпороговая ритмика, которая обычно продолжалась 5-7 мин. В остальных случаях наблюдалось только увеличение частоты колебаний электротонических ДКП и ВКП. Аналогичная (вызванная аппликацией КУДА или L-ДОФА) надпороговая активность генератора спинного мозга 16-20-дневных куриных эмбрионов была рассмотрена в предыдущих главах работы.

Влияние L-глутамата в больших концентрациях (0,05-1 ммоль/л) на спинальный генератор отличалось от воздействия этого вещества в малой концентрации и характеризовалось следующими особенностями. Гак, через 3-5 мин после начала суперс(узии препарата раствором, содержащим 0,5 ммоль/л L-глутамата, средняя частота спонтанных колебаний ДКП и ВКП снижалась на 60-70 ь, что свидетельствует об угнетении работы спинального генератора дорсального рога. К реме того, в этих условиях в отдельных (один иди два-три соседних) ВК, возникали не синхронные с ДКП колебания ВКП. Эта активность была аналогична ритмике в ВК, которая вызывалась изменением конного состава суперфузирущего раствора, С повышением концентрации L.-глутамата от 0,05 до I ммоль/л частота ритмики в ВК возрастала от 0,15 до 0,4/с.

В ходе экспериментов было такие обнаружено, что после блокады работы генератора дорсального рога (путем добавления з суперфузи-

рущий раствор антагониста ШЦА-рецепторов - 2-АФВ) L-глутамат сохранял способность вызывать ритмику ВК. Аппликация 0,1 ммоль/л ■ L-глутамага в присутствии 0,02 ммоль/л 2-АФВ приводила к угнетении спонтанной активности в ДК, однако это не препятствовало возникновению ритмики в ВК.

После перерезки, отделяющей вентральный рог от промежуточной зоны и дорсального рога, спонтанная ритмика сохранялась только в ДК, а в ВК она не наблюдалась. Аппликация !Ь-г.цутамата в концентрации 0,05-1 ммоль/л вызывала появление ритмики в ВК, которую в этих случаях продуцировала нейронная сеть полностью изолированного участка вентрального роха спинною мозга.

ОБСУЖДЕНИЕ

В 1..'.тоящей работе, выполненной на препарате in vitro , получен ряд фактов, которые позволяют обсудить локализацию источника двигательной ритмики в спинном мозге куриного эмбриона. Прежде чем перейти к рассмотрению этого вопроса, остановимся на результатах, полученных на эмбрионах 8-Ю-Дневногс возраста. Ранее было известно, что на этом сроке развития спинной мозг способен спонтанно или в ответ на стимуляцию его поверхности генерировать координированную эфферентную ритмику / Landmesser, O'Donovan 198^/. Однако, сведения о функционировании периферической обратной связи во время работы эмбрионального генератора отсутствовали. Результаты нашей работы позволяют сделать заключение о функционировании (по крайней мере частичном) периферической обратной связи уже на восьмой день развития эмбрионов. Так как эфферентная двигательная ритмика сопровождалась тоническими и на их фоне фазными колебаниями ДКП, что свидетельствовало о модуляции пресинаптического торможения со стороны спинального генератора. Учитывая этот факт, в дальнейшем о работе спинального генератора судили не только по наличию электрической активности на его афферентном выходе (так как в сдучаях перерезок, отделяющих мотонейроны, такая возможность исчезает), а и по наличию электрической активности в ДК.

Результаты исследований на эмбрионах 16-20-дневного возраста показали, что изолированные препараты спинного мозга способны спонтанно генерировать ритмическую активность. Эта_ритмика-пред-—

ставляла собой синхронные колебания электротонических потенциалов ДК и ВК, т. е. в отличие от эфферентной активности, генерируемой препаратами спинного мозга эмбрионов 6-10-дневного возраста, импульсные разряды-в ВК отсутствовали.

Результаты экспериментов с изоляцией различных участков серого вещества спинного мозга показали, что источником спонтанных колебаний ДКП и ВКП является нейронная сеть, которая локализована в дорсальном роге. Так как после рассечения препарата нейронная сеть изолированного дорсального рога сохраняла способность спонтанно генерировать ритмическую активность в ДК, а в изолированной вентральном роге (вместе с промежуточной зоной) ритмика не наблюдалась.

Следует отметить, что в ряде работ /Bagust et au 1985а, в, Czeh, -Somjen I989B, Ryan et aK 1984/, ВЫПОЛНвННЫХ на ВЗРОСЛЫХ позвоночных животных, описана аналогичные спонтанные колебания ДКП в изолированных препаратах спинного моз1а. Однако, на основании данных упомянутых выше работ трудно судить о том, чем обусловлено происхождение активности этого та па. Хотя, как верно отметили Сзеф и Сомьен / Czeh, sonjen 1989в/, наличие синхронной активности в ДК и ВК ассоциируется с работой двигательного генератора. Разумеется, что это представление само по себе может казаться не вполне обоснованным, так как отсутствуют импульсные разряды в ВК и происходит лишь подпороговая (для генерации потенциалов действия) активация мотснейронов. Поэтому, в настоящей работе было изучено действие веществ, специфически влиягиих на работу двигательного генератора.

Результаты этих экспериментов показали, что аппликация ШДА приводила к значительному усилению спонтанных колебаний ДКП и ВКП, в спкнальных корешках появлялась импульсная активность. Вызванная ШДА эфферентная ритмика становилась сходной с таковой во время работы спкнального двигательного генератора у эмбрионов 6-10-дневного возраста, В связи с этик можно выделить два состояния функционирования спинального генератора у эмбрионов поздних стадий развития - подпорогсвое и надпороговое. Для первого характерны низкие значения интенсивности ДКП и ВКП, отсутствие потенциалов действия в ВК, низкая регулярность процесса. Для второго -высокая амплитуда колебаний ДКП и ВКП, наличие тонического коипо-

нента и импульсной активности в ВК и ДК. Необходимо отметить и более высокую регулярность процесса. Однако следует полагать, что оба типа ритмики являются отражением работы генератора двигательных программ. В пользу данного заключения свидетельствуют следующие факты. Эффективные концентрации ШДА в наших опытах равнялись 2-25 мкмоль/л, что соизмеримо с величинами эффективных концентраций у ВЫСШИХ позвоночных (10-30 мкмоль/л ДЛЯ крысы / Kudo, Yema-da 1987/). 2-АЬВ в концентрации 20 мкмоль/л эффективно подавляла как вызванную ШДА, так и подпороговую активность. В этой концентрации 2-ASíB подавляла и локомоторную активность, генерируемую изолированным СПИННЫМ МОЗГСМ крысенка / Kudo, Yamada 1987/« СуМмируя вышесказанное, мокно сделать вывод о том, что под- и надпо-роговая активность имеет одну и ту ке фармакологическую чувствительность, или, другими словами, в генерации обоих типов ритмики принимают участие сходные нейронные сети, в активации которых участвуют рецепторы ВДДА-типа.

Результаты исследования действия ШДА на рассеченные препараты мозга показали, что спонтанная активность, которую генерировала изолированная нейронная сеть дорсального рога, усиливалась под действием ШДА. В изолированном вентральном роге (вместе с промежуточной зоной) ритмика не наблюдалась ни до, ни после аппликации этого вещества. Следовательно, с учетом избирательности действия ШДА не локомоторную активность позвоночных молно заключить, что источник двигательной ритмики локализован в дорсальном роге спинного мозга куриного эмбриона. Более вентрально расположенные нейронные сети являются ведомыми и о их помощью, по-видимому, осуществляется координация активности мотонейронов различных групп мышц, необходимая для реализации ритмических движений конечностью.

Результаты исследования действия L-ДОвА свидетельствуют о том, что эта аминокислота в зависимости от концентрации способна усиливать или тормозить активность, генерируемую препаратом спинного мозга. Действие L -ДОЗЗА в малой концентрации (30-150 мкмоль/л) приводило к возникновению надпороговой ритмики (т. е. ритмической импульсной активности в корешках спинного мозга). А нелогично действовал и ШДА. Результаты экспериментов с рассечением препарата показали, что Ъ -Д0ФА. активирует нейронные сети, локализованные в дорсальном роге, т. е. действует на источник^___

-17-

двигательной ритмики непосредственно.

Кроме того, результаты этих экспериментов позволяет заключить, что механизм возбуждающего воздействия L-ДОЙА не связан с активацией катехоламинчувствительных спинальных нейронных сетей мозга куриных эмбрионов. Б пользу такою заключения свидетельствуют следующие факты. Норедреналин и дофамин в концентрации 50 мкмоль/л не влияли на электротонические колебания ДКП и BMI, а увеличение концентрации этих катехолаыинов в суперфузирупцем растворе до 100 ыкмоль/л вызывало снижение частоты данных колебаний, что указывает на угнетение работы спинальною генератора.

Учитывая данные, полученные на диализированных спинальных нейронах миноги /Русин и др., I9BB, 1969/ и куриного эмбриона /Русин, Баев, 1990/, относительно потенциации под действием L-ДОФА в малых концентрациях вызываемых ШДА ионных токов, и активации тормозных глициновых рецепторов этой аминокислотой в больших концентрациях, можно предположить следущий механизм ее действия на спинальный генератор. Так, в случае применения L-ДОФА в низких концентрациях происходит потенциация ШДА-зависимой нейронной активности, и это приводит к усилению работы генератора - возникновению надпороговой ритмики. Во время суперфузии препарата L-ДОшА в высоких концентрациях за счет его действия на глицин-чувствительные нейроны, которое в этом случае превалирует над потенцирующим действием на НУДА-рецепторы, наблюдается торможение работы генератора. В ходе последупцего отмывания препарата нормальный раствором концентрация L-ДОФА снижается, что приводило к обрат-нону эффекту - потенциации {ЩА-завнскмой активности и далее к усилению работы сгпшального генератора.

Таким образом следует полагать, что при внутривенном применении L-ДОФА, очевидно, способен также непосредственно воздействовать на нейронные структуры центральной нервной системы, а не только усиливать синтез к освобождение катехолаыинов в пресинапти-ческих окончаниях.

Прежде чем рассмотреть результаты, полученные нами при понижении концентрации ионов Са или повышении концентрации ионов Мд в суперфузирупцем растворе, целесообразно остановиться на особенностях действия этих изменений кснною состава внеклеточного раствора на спинной мозг. Данные литературы / c?. eh, son,jen I9S9a, Din-

gledin, Somjen 1964, Hutter, Kostian 1954/ СВИДеТеЛЬСТВуЮТ 0 том, что снижение в суперфузируицем растворе концентрации ионов Са от 2,6 до 1,0 ммоль/л вызывает угнетение эффективности синап-тической передачи, прежде всего за счет уменьшения выброса медиаторов из окончаний пресинаптических термикалей, хотя нельзя полностью исключить и возможность наличия изменений возбудимости мембран нервных клеток. В случае повымення концентрации ионов Цд от 1,3 до 5,0 ммоль/л возможно еще и специфическое подавление вызываемой ШДА деполяризации нейронов / Ault et-aJ. 1980, Mayer et аЦ 19£&/. Именно втим можно объяснить единственное различие в действии обоих растворов. Только после снижения концентрации ионов Са без изменения концентрации ионов Цд, в ВК спинного мозга куриного эмбриона появлялись фоновые импульсные разряды.

Достаточно неожиданным оказался тот факт, что в процессе постепенного исчезновения спонтанной подпороговой активности могло возникать такое состояние, когда спинальный генератор ритма как бы "расщеплялся" и появлялся еще один тип циклической активности

ритмика в ВК. Возникновение данной ритмики и ее существование после прекращения работы источника двигательной ритмики, нейронные сети которого локализованы в дорсальном роге, свидетельствует о наличии ритмогенных свойств и у нейронных популяции вентрального рога.

Результаты, полученные нами при исследовании действия L-Глу-тамата, подтвердили данное предположение. Так, изолированный вентральный рог (после рассечения препарата мозга) при действии этой аминокислоты сохранял способность генерировать ритмику в ВК. Для осуществления этой ритмики необходимо взаимодействие между нейронами вентрального рога, что, в частности, может обеспечиваться синоптическими контактами возвратных коллатералей мотонейронов на других мотонейронах, которые, как показано Даповалов, Ширяев . 1984, Cliuheim et а). 1964, Карамян, Судеревскя 1986, Карамян и др. 1988/, существуют у многих позвоночных. В данном случае, определенную роль может играть не ШДА-чувствительная активность нейронов вентрального рога, так как при действии L-глутамата ритмика в ВК возникала на фоне блокады МИДА рецепторов 2-АФВ.

В связи с этим можно попытаться оценить возможное функциональное значение обнаруженной нами ритмики в ВК. По-видимому, в

. . -19-

"нормальных" условиях активность нейронных сетей дорсального рога доминирует и подавляет способность нейронов вентрального рога генерировать периодический процесс. Это особенно отчетливо проявлялось в случаях значительного усиления спонтанной активности и возникновения надпороговой активности, что сопровождалось быстрым исчезновением ритмики в ВК. Кроне того, как показали'результаты внутриклеточного отведения, мотонейроны сгибателей и разгибателей 12-15-даевных куриных эмбрионов во время работы спинального двигательного генератора получаст одинаковый деполяризующий приток от общих интернейронов /O'Donovan 1989/. Поскольку деполяризация во всех ВК лшбосакрального отдела спинного мозга синхронна только во время работы нейронных сетей дорсального рога, следует полагать, что это единственный источник двигательной ритмики. Ритмика в ВК возникала лишь в одном или в двух-трех спинальных корешках, т. е. в данную активность вовлекались только отдельные популяции мотонейронов. Этого явно недостаточно для осуществления конечностью-сложного движения (типа локомоторного). Таким образом, обнаруженная неыи ритмика в ВК-может рассматриваться как некий аналог пароксизмальной активности, возникающей при изменении эффективности синаптической передачи в высших отделах центральной ■ нервной системы / Jefierys, Haas 1982, Yaary, Konnerth 1983/. На уровне спинного мозга она, возможно,'является проявлением патологических состояний (тремор отдельных мышц или клонические судороги конечности).

В заключение следует отметить, что сделанный в настоящей работе вывод о ведущей роли нейронов дорсального рога в генерации двигательной ритмики не противоречит данным микроэлектродных исследований, проведенных на кошках / JanKoivska, et al. 1967, Edgerton et ai, .1976, Баев и др. 1979а, б/, а так,же работам на кроликах с использованием меченной 2-деоксиглскозы и последующего аутора-диографического анализа/ viaia et а), 1988/. В цитируемых работах было показано, что при работе спинального двигательного генератора большинство ритмически активных нейронов локализовано в промежуточной зоне серого вещества спинного мозга. Однако, эти более многочисленные нервные клетки могут являться ведомыми по отноше- • нию к менее многочисленным, задахдиы ритм, нейронам дорсального рога.

-20-

ВЫВОДЫ

1. Изолированный спинной мозг 8-10-дневных 1<уриных .эмбрионов способен генерировать координированную двигательную активность» которая сопровождалась тоническими и ка их фоне фазными колебаниями ДКП. Последние свидетельствуют о наличии уже на ранних стадиях эмбриогенеза механизма модуляции уровня поляризации терминалей первичных афферентов со стороны двигательного генератора.

2. Изолированные препараты, выделенные из люмбосакрального отдела спинного мозга эмбрионов поздних стадий развития (16-20-дневных), способны спонтанно генерировать ритмическую активность -синхронные электротонические колебания потенциалов в ДК и ВК. В отличие от эфферентной активности, генерируемой препаратом спинного мозга ранних стадий эмбриогенеза, импульсные разряды в шинельных корешках не возникали, что свидетельствует о подпороговой работе спинального генератора.

3. Аппликации ШДА или L-ДОЛА вызывали увеличение амплитуды

' спонтанных 'электротонических колебаний, появление тонического компонента ДКП и ВКП и возникновение импульсной активности в ДК и ВК, т. е. переводили спинальный двигательный генератор в надпоро-говый режим работы.

• П. Специфический б локатор ЩЦА-рецепторов - 2-АФВ подавляла как спонтанную, так и вызванную Н11ДА или Ь-ДОФА активность, что свидетельствует об участии сходных (ШДА-чувствительных) нейронных сетей в генерации обоих типов ритмики.

5. Возбуждающее действие L-ДОФА не опосредовано катехоламина-ми, т. к. ни дофамин, ни норадреналин не вызывали усиления спон-

. танной активности в ДК и ВК.

6. Нейронная сеть изолированного дорсального рога сохраняла способность спонтанно генерировать ритмическую активность в ДК, которая усиливалась под действием ВДА или L-ДОФА. В изолированном вентральном роге (вместе о промежуточной зоной) ритмика не наблюдалась ни до, ни после аппликации эти* веществ. Это позволяет заключить, что источник двигательной ритмики спинного мозга куриного эмбрионе локализован в дорсальном роге. Более вентрально расположенные нейронные сети являются ведомыми.

7. Снижение эффективности синаптичеекой передачи (после снижения концентрации ионов Ca или увеличения конценграции ионов Ug в

Суперфузирущем растворе) приводило к угнетению работы нейронных сетей дорсального рога и к появлению несинхронной с колебаниями Д НП ритмической активности в отдельных (I или 2-3 соседних) ВК. Подобная ритмика в ВК наблюдалась и после изоляции вентрального рога под действием Ь-глутамата. Предполагается, что отмеченная ритмика мояет являться проявлением патологических двигательных состояний (тремор отдельных мышц или клонические судороги конечностей).

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Баев К. В., Чуб Н. Л. Ритмическая электрическая- активность изолированного спинного мозга куриного эмбриона // Нейрофи-зиология.-1987.-19, Я 4.-С. 554-557.

2. Баев К. В., Чуб Н. I. Роль различных областей спинного мозга в генерации спонтанной двигательной активности куриного эмбриона // Нейрофизиология.-1989.-21, £ 1.-С. 123-126.

3. Чуб Н. Л. Роль различных участков серого вещества спинного мозга в генерации спонтанной двигательной активности. Всесоюзный симпозиум "Регуляция сенсомоторннх функций", Винница, 1909, Сб. докл., стр. 166.

Чуб Н. Л. Особливост! дП Ъ-глутамату на нервов! кл1тини вентрального рогу спинного мозку курячого ембр1ону. Цатериалы XIII съезда украинскою физиологического общества им. И.П.Павлова, Харьков 1990.

5. Чуб Н. Л., Баев К. В. Влияние Ы-ыетил-О-аспартата на спонтанную активность, генерируемую изолированным спинным мозгом- 16-20-дневных куриных эмбрионов // Нейрофизиология,-1991.-23, 5 2.-С. 205-213.

6. Чуб Н. Л. Модификация ритмики, генерируемой изолировштм спинным мозгом 16-20-дневных куриных эмбрионов, вызванная изменением концентрации ионов Са и Кд в суиерфуэиругщем растворе // Нейрофизиолсгия.-1991.~23, Я З.-С. 333-338.

7. Чуб н. Л. Действие Ъ-ДОФА на спонтанную активность, генерируемую изолированным спинным мозгом 1б-20~дневных куриных эмбрионов // Нейрофизиология.-1991.-23, $ З.-С. 338-343.