Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Нейронные механизмы спинного мозга в эмбриогенезе
ВАК РФ 03.00.13, Физиология
Автореферат диссертации по теме "Нейронные механизмы спинного мозга в эмбриогенезе"
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК
ИНСТИТУТ ЭВОЛЮЦИОННОЙ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ им. И. М. СЕЧЕНОВА
На правах рукописи
ВЕЛУМЯН
Александр Агасисвпч
УДК 591.181:591:492:612:832
НЕЙРОННЫЕ МЕХАНИЗМЫ СПИННОГО МОЗГА В ЭМБРИОГЕНЕЗЕ
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
СПЕЦИАЛЬНОСТЬ 03.00.13. — ФИЗИОЛОГИЯ ЧЕЛОВЕКА
И животных
САПКТ-ПЕТЕРГ.УРГ
1993
Работа выполнена в лаборатории развития нервной деятельности животных в онтогенезе (заведующий — доктор биологических наук А. В. Бур-сиан) Института эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова Российской Академии Наук (директор — академик В. Л. Свидер-ский).
Ведущая организация: Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии Российской Академии Наук (Москва).
Защита диссертации состоится « ^ » и*Ср^1993 г. в /0 часов на заседании специализированного совета Д 002.89.01 Института эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова РАН по адресу: Санкт-Петербург, пр. М. Тореза, 44.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова РАН.
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор О. В. БОГДАНОВ доктор медицинских наук, профессор Н. П. ВЕСЕЛКИН доктор биологических наук, профессор Л. Л. ВОРОНИН
Автореферат разослан «
Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук, профессор
М. Н. МАСЛОВА
Г-V-.'.-vCW-
с;' . •;;I::!C1 l
I A .'tV.,^ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
,Актуальность проблемы. Интерес к выяснению закономерностей формирования функций нервной системы в раннем онтогенезе, восходящий к классическим трудам И.М.Сеченова (1878), И.Р.Тарханова (1879), В.Прейера (Ргеуег, 1882), Ра?«)па Кахаля (Cajal, 1908), Дх. Когхилла (Coghill, 1927) и других, не ослабевает до настоящего времени (Анохин, 1968; Богданов, 1972; Богданов, Геворгян, 1983; Бурсиан, 1983; Волохов, 1951, 1966; Войно-Ясенецкий, 1974; Орбели, 1958; Шулейкина, 1969; Фарбер, 1969; Hamburger, 1948, 1981; Hughes, 1968; Jacobson, 1969, и др.). Выяснение особенностей функционирования нервной системы в раннем онтогенезе и возрастных изменений тех или иных нервных функций представляет интерес как в практическом, так и в теоретическом отношении. В практическом аспекте важно иметь точные представления о возникновении и хронологии развития основных функциональных характеристик нервных клеток, таких как возбудимость, хемочувствительность, образование синаптических контактов и особенности их функционирования и др. Важные теоретические обобщения, основанные в значительной степени на онтогенетическом материале (Анохин, 1968; Геккель, 1940; Орбели, 1958; Северцов, 1939; Cajal, 1908; Hamburger, Le vi-Monta le i'ni, 1948, и др.), благодаря бурному накоплению новых данных дают основания полагать, что возможности онтогенетического подхода далеко не исчерпаны и в этом аспекте.
Вопрос о функциональных свойствах незрелых нейронов является одним из наиболее важных для понимания различных особенностей организации нервных процессов в раннем онтогенезе. Многие важные аспекты становления этих свойств нейронов в онтогенезе достаточно широко обсуждались в ряде монографий и обзоров (Богданов, Геворгян, 1984; Буд-ко, 1985; Максимова, 1979; Шулейкина, 1979, 1985; Purpura, 1971; Crain, 1976; Sritzer, 1979, 1982, и др.), К сожалению, ввиду противоречивости и недостаточности имеющихся в литературе прямых данных (см. Максимова, 1979; Шулейкина, 1979, 1985) многие важные вопросы, связанные с функционированием нервных клеток на ранних стадиях развития, остаются до настоящего времени недостаточно ясными. К числу таких вопросов относятся механизмы электровозбудимости, сроки их формирования и их особенности в основных структурных отделах нервных клеток - соме, дендритах и аксоне, механизмы инициации и распространения возбуждения в незрелых нервных клетках, способность их к ритмическим разрядам, особенности процессов синаптического возбуждения и торможения в незрелых нейронах, а также возрастная динамика этих и ряда других фундаментальных свойств нервных клеток.
Основные трудности электрофизиологического исследования нервных клеток в раннем онтогенезе связаны с их значительно меньшими, чем у
зрелых нейронов, размерами, я легкой повреждаемостью, что требует значительно более деликатных манипуляций, чек при работе со зрелыми клетками. Важно отметить, что большинство имеющихся в литературе сведений о функциональных особенностях незрелых нейронов, особенно до 1980-х годов, было получено исследователями, не обладавшими достаточным опытом регистрации потенциалов нервных клеток и не уделявшими, как об этом можно судить по публикациям, должного внимания качеству регистрации, что могло привести к существенным ошибкам в оценках электрофизиологических характеристик нейронов. Важно также отметить, что в противоположность достаточно богатой литературе по электрофизи-одогическим свойствам зрелых нейронов, в отношении соответствующих свойств у незрелых нейронов ввиду крайней недостаточности имеющихся в литературе сведений возможность критически оценить те или иные результаты путем сравнения дабых разных исследований, в большинстве случаев отсутствует, тем более что в разных работах даже на одной и той же структуре одного и того же объекта стадии развития редко совпадали. Эти особенности имеющихся в литературе данных требуют особой осторожности в оценках, что, как показывает конкретный анализ литературы по тем или иным принципиальным вопросам, приведенный в соответствующих главах диссертации, имело место далеко не всегда и привело к ряду недостаточно адекватных представлений о зрелости и незрелости применительно к функциям нервных клеток на ранних стадиях развития.
Цель и задачи исследования. Целью исследования было, на основе критического анализа имеющихся в литературе сведений об электрофизи-■ ологических свойствах незрелых нейронов и закономерностях их структурно-функционального созревания, электрофизиологическое и морфологическое изучение эмбриональных мотонейронов и их синаптических входов. Выбор этих нейронов обусловлен не только существованием специального интереса к нем ввиду того, что они представляют собой "общий конечный путь" (Ч. Шеррингтон, 1911) в моторной реализации конкретных потребностей организма на основе различных интегративных процессов, но также и ввиду того, что физиология зрелых нервных клеток наиболее подробно разработана на этом типе нейронов (Костюк, 1957, 1964; Шаповалов, 1975, 1979; Eccles, 1957, 1964, 1971; Burke, Rudomin, 1977).
Конкретными задачами исследования были:
1. Изучение особенностей инициации и пространственой организации процесса генерации потенциале действия в эмбриональных мотонейронах.
2. Изучение возрастной динамики и особенностей проведения импульсов в аксонах развивающихся нейронов.
3. Выяснение особенностей функциональных взаимодействий между мотонейронами на эмбриональных стадиях развития.
4. Выяснение сроков замыкания рефлекторной дуги в эмбриональном спинном мозге и особенностей сенсо-мотонейронных взаимодействий на ранних стадиях формирования рефлекторной дуги.
5. Идентификация конкретных тормозных синаптических путей в эмбриональном спинноммозге^выяснение особенностей тормозных процессов----------
в эмбриональных нейронах и их роли в эмбриональном спинном мозге.
6. Выяснение функциональных особенностей эмбриональных нейронов в зависимости от миелинизации их аксонов в связи с дифференцировкой начального сегмента аксона.
Научная новизна.
1. Разработан препарат изолированного суперфузируемого спинного мозга куриного эмбриона, позволяющий существенно повысить уровень электрофизиологических исследований на этом классическом объекте ней-роэмбриологии. Приоритет автора в этом вопросе признан на международном уровне, и данная работа получила развитие в некоторых других направлениях благодаря использованию разработанной методики в Институте физиологии им. А.А.Богомольца АН Украины К.В.Баевым с сотрудниками, в США в университете штата Коннектикут в лаборатории Л.Ланд-мессер (Ь.ЬапйтпеБзег), а также в Университете штата Айова и в Национальном Институте Здоровья в Бетезде (Мериленд) М.О'Донованом (М.О'Оопоуап).
2. С помощью внутриклеточной регистрации потенциалов исследованы
свойства потенциалов действия и различных постсинаптических потенциалов в эмбриональных мотонейронах начиная с 10-11-го дня развития.
3. Показано, что на всех указанных стадиях развития мотонейроны имеют потенциалы покоя, практически не отличающиеся от потенциалов покоя зрелых мотонейронов, и способны генерировать потенциалы действия, основные электрофизиологическпе характеристики которых также мало отличаются от аналогичных в зрелых мотонейронах.
4. Измерены скорости проведения в моторных аксонах в период с 6.5-го по 18-й день развития эмбриона и в сенсорных нейронах в период с ю-го по 16-й день развития.
5. Обнаружено существование механизма возвратного торможения в спинном мозге куриного эмбриона, аналогичного Реншоу-торможению в спинном мозге млекопитающих, начиная с 10-го дня развития. Установление этого факта является первой демонстрацией данного механизма в спинном мозге немлекопитающих и дает основания для обобщений относительно эволюции данного механизма.
6. Показано существование электрических взаимодействий между эмбриональными мотонейронамн, аналогичное описанному в зрелом спинном мозге и в раннем постнатальном онтогенезе.
7. Показано, что рефлекторная дуга замыкается в спинном мозге куриного эмбриона на 7,5-й день развития. На 10-дневных и более старших эмбрионах показана чисто возбуждающая природа прямых синаптических влияний первичных афферентов яа мотонейроны. Показана чувствительность эмбриональных мотонейронов К глутамату, являющемуся наиболее вероятным медиатором возбуждения в зрелом спинном мозге, начиная с б.5-го дня развития.
8. Показано, что постсинаптическое торможение присутствует в спинном мозге эмбриона па всех стадиях, на которых удавалось качественно регистрировать потенциалы мотонейронов с помощью внутриклеточных микроэлектродов (начиная с 10-го дня развития). Установлено, что основные свойства тормозных постсинаптических потенциалов (ТПСП) в эмбриональных мотонейронах практически не отличаются от свойств ТПСП в зрелых Ш>тоней>ронах, включая и* зависимость от трансмембраниого распре-деяеаия ионов хлора, близость потенциала реверсии к потенциалу покоя я шунтирующее действие на мембрану, проявляющееся в эффективном угнетений потенциалов действия.
9. Установлено существование а спинном мозге эмбриона различных тормозных путей к мотонейронаМ: нисходящего, опосредуемого волокнами вентральных и латеральных столбов белого вещества, и рефлекторного полисинаптического. С помощью Выявления растормаживающих эффектов стрихнина и бесхлорной среды показана возможность существования тормозных процессов в янтернейронном аппарате, активно ограничивающих диффузное распространение возбуждения, ухе на ранних • стадиях развития.
10. Показана чувствительность постсинаптической мембраны эмбриональных мотонейронов к гамна-амийомасляной кислоте (ГАМК) а глицину, являющимся наиболее вероятными медиаторами торможения в зрелом спинном мозге, начиная с б,5-го дня развития. С помощью антагонистов данных аминокислот пикротохсина и стрихнина показана специфичность их действия уже на наиболее ранних из исследованных стадий развития.
11. Выявлены принципиальные различия в топографии аксонной зоны инициации импульса в эмбриональных мотонейронах до и после начала миелинизации, позволившие сформулировать гипотезу о двух типах ин-тегративной деятельности нейронов в зависимости от ааличия или отсутствия в их аксоне структурно дифференцированного начального сегмента.
Теоретическое и практическое значение работы. Представленные в работе экспериментальные данные позволяют существенно конкретизировать, а в отношении ряда вопросов и пересмотреть существующие представления об особенностях функционирования нервных клеток на эмбрво-
нальных стадиях развития. В частности, не нашло подтверждения распространенное представление о функциональной незрелости эмбриональных нейронов, основанное на исследованиях с недостаточно жесткими критериями оценки возможных изменения состояния клеток в результате введения в них микроэлектрода.-Собственный экспериментальный материал демонстрирует достаточно высокую "зрелость" многих электрофизиологии ческих характеристик спинальных мотонейронов куриного эмбриона на всех стадиях, когда удавалось удовлетворительно зарегистрировать их потенциалы с помощью внутриклеточных микроэлектродов - начиная по крайней мере с 10-го дня инкубации.
Проведенные исследования позволяют глубже представить функциональные возможности эмбриональной нервной системы. Показанное в работе ранвее формирование ряда высокоспециализироваввых систем, таких как система возвратного торможения мотонейронов, моносиваптическая рефлекторная дуга, длинные нисходящие проприоспинальвые (а возможно, также и супраспинальные) связи и некоторых других систем межнейронных взаимодействий свидетельствуют о том, что причиной функциональной незрелости эмбриональной нервной системы, а тем более нервной системы новорожденных, является не традиционно предполагавшаяся функциональная незрелость нервных клеток и их взаимодействий, а некоторые другие свойства. Полученные данные позволили выявить, наряду со значительно более низкими скоростями проведения импульсов и более высокими значениями входного сопротивления незрелых нейронов, также и принципиально новый функциональный аспект, связанный с изменением типа инте-гративной деятельности нейронов в ходе диференцировки начального сегмента аксона на ранних стадиях миелинизации.
Сформулированная в работе гипотеза о новом функциональном аспекте миелинизации имеет широкую приложимость как в нормальной физиологии нервной системы, так и в ряде ее специальных разделов и позволяет глубже понять особенности нервных процессов на домиелиновых стадиях развития как в онто- так и в филогенезе, а также в клинике демиелиии-зирующих заболеваний. Эта гипотеза позволяет по-новому оценить патологические процессы, происходящие при демиелинизирующих заболеваниях и может быть использована для разработки методов их ранней диагностики .
Полученные в работе, результаты и обобщения могут быть использованы в лекционых курсах по общей физиологии нервной системы, клинической нейрофизиологии, онтогенетической физиологии и некоторых специальных разделах нормальной физиологии нервной системы.
Основные положения, выносимые ва защиту.
1. Разработан препарат изолированного суперфузируемого спинного
мозга куриного эмбриона, открывший широкие возможности для систематических микроэлектродных и нейроанатомических исследований на этом классическом объекте нейроэмбриологии.
2. С помощью внутриклеточной регистрации потенциалов в сочетании с жесткими критериями оценки качества регистрации и исключения селекции более продвинутых в своем развитии клеток микроэлектродом показано, что в плаае основных характеристик потенциалов покоя и потенциалов действия мотонейроны являются вполне "зрелыми" ухе к 10-му днв эмбриоаального развития. В то же время скорость проведения импульсов в их аксонах на этих стадиях развития как и в течение всего эмбрионального периода крайне низка, причем сравнение ее^коростью проведения импульсов в зрелых аксонах сходного диаметра свидетельствует о незрелости мембранных процессов, ответственных за проведение импульсов в аксонах.
3. Ухе на ранних стадиях развития электровозбудимость присутствует как в аксоне, так и в сомадендритной мембране нервной клетки, о чем свидетельствует наличие соответствующих компонентов у потенциала действия эмбриональных нейронов, причем амшштудно- временные характеристика соответствующих компонентов практически не отличаются от соответствующих характеристик в зрелых мотонейронах. В то хе время впервые разработанный и экспериментально проведенный анализ топографических особеностей агсонных компонентов потенциала действия свидетельствует о существенных перестройках аксовной зоны инициации импульса я ходе дифференцировки начального сегмента аксона на ранних, стадиях миелинизации.
4. Сформулирована гипотеза о новом функциональном аспекте миелинизации, согласно которой выделяются два основных типа интегративной деятельности нейронов в зависимости от наличия или отсутствия у них пространственно ограниченного начального сегмента аксона, что, в свою очередь, определяется наличием или отсутствием у аксона миелиновой оболочки.
5. Ухе на довольно ранних стадиях эмбрионального развития в спинном мозге формируются различные возбуждающие и тормозные входы на мотонейроны, о чем свидетельствует наличие как возбуждающих, так и тормозных постсинаптических потенциалов (ВПСП и ТПСП, в их спонтанной и вызванной электрической активности. Уже на 6-8-й день развития мотонейроны обнаруживают чувствительность к апплицируемым глутамату, являющемуся наиболее вероятным медиатором возбуждения в зрелом спинном мозге, и гамма-аминомасляпой кислоте и глицину, являющимся в зрелом спинном мозге медиаторами торможения.
6. Показано, что уже на ранних стадиях эмбрионального развития в
спинном мозге формируется ряд высокоспециализированных систем мех-нейронных взаимодействий. В частности, ухе к 10-му дню развития у куриного эмбриона в достаточно высокой степени сформированы система возвратного Реншоу-торможения мотонейронов, электрические взаимо-действиямежду-мотонейронами,__ моносинаптическая рефлекторная дуга,
длинные нисходящие проприоспинальяые пути. В интернейронном аппарате---------
присутствуют тормозные системы, ограничивающие, хотя и не столь эффективно, как в зрелом спинном мозге, возникновение и диффузное распространение спонтанных вспышек возбуждения я длительных последействий в ответ на различные внешние воздействия.
7. Представленные данные о Реншоу-торможении являются первой демонстрацией этого механизма в спинном мозге немлекопитающих и дают основания для предположения, что в ходе эволюции этот механизм возник у общего предка птиц и млекопитающих в классе рептилий. Апробация работы. Результаты докладывались па различных научных заседаниях в Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова АН СССР (ныне РАН) в период с 1981 по 1991 г., на заседаниях секции нейроонтогенеэа Лениградского (ныне Санкт-Петербургского) общества физиологов (1983, 1988, 1989), на межлабораторном семинаре в Институте проблем передачи информации АН СССР (1984), на УШ всесоюзной конференции по электрофизиологии центральной нервной системы (Ереван, 1980), УШ, XI и X всесоюзных совещаниях по эволюционной физиологии (Ленинград 1982, 1986 и 1990), XIV съезде всесоюзного физиологического общества (Баку, 1983), международном симпозиуме "Роль афферентного притока в созревании функций мозга" (Суздаль, 1984), всесоюзной конференции "Развивающийся мозг" (Тбилиси, 1984), 4-м международном симпозиуме по нейроонтогенезу (Прага, 1985) , на межлабораторных семинарах в Институте ВНД и нейрофизиологии (Москва, 1985, 1988), 4-й и 5-й всесоюзных конференциях "Физиология и биохимия медиаторных процессов" (Москва, 1985, 1990), всесоюзной конференции "Исследования глутаматергических синапсов (Ленинград, 1987), 4-м съезде армянского физиологического общества (Ереван, 1987), з-й всесоюзной конференции по нейронаукам (Киев, 1990), 3-м всемирном конгрессе ИБРО по нейропаукам(Монреаль, 1991) и 11-м международном симпозиуме "Поза и походка: механизмы управления" (Портленд, США, 1992) и международном симпозиуме памяти академика С.В.Аничкова "Нейрофармакология на рубеже двух тысячелетий" (Санкт-Петербург, 1992).
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения,
описания объекта и основных, методических приемов исследования и 6 экспериментальных глав с обзорами литературы, предшествующими нзло-
хеншо экспериментальных данных и заключениями по каждой из рассматриваемых проблем, выводов я списка литературы, охватывающего 490 работ, из них 136 на русском языке. Работа изложена на страницах маши-
нописного текста, включая 86 рисунков и 13 таблиц на отдельных страницах .
ОБЪЕКТ И ОСНОВНЫЕ МЕТОДИЧЕСКИЕ ПРИЕМЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Опыты проводили на спинном мозге куриного эмбриона. Выбор этого объекта был обусловлен прежде всего тем, что он является классическим объектом нейроэмбриологических исследований (Богданов, 1972; Бэр, 1828; Волохоа, 1951; Войио-Ясенецкий, 1974; Hamburger, 1973; Preyer, 1888; Romanoff, I960, и др.) и в отношении различных аспектов его развития в литературе имеются довольно подробные сведения. Принадлежность к классу птиц позволяет выяснять на этом объекте вопросы в плаве не только функционального нейроонтогенеза, но также и в сравнительно-физиологическом и в эволюционном аспектах-. Наконец, этот объект удобен благодаря возможности длительного хранения оплодотворенных яиц при пониженной температуре с сохранением способности к дальнейшему развитию эмбриона при помещении в инкубатор, что позволяет иметь к опыту эмбрионов запланированного возраста.
Препарат изолированного суперфузирусмого спинного мозга куриного эмбриона. Ввиду значительных сложностей проведения микроэлектродного эксперимента на целом эмбрионе, связанных с трудностями достижения необходимой для этого механической стабильности объекта (см. Provine, 1973), автором был разработан препарат изолированного суперфузируемо-го in vitro спинного мозга куриного эмбриона (Velumian, 1981, 1984). Наряду с высокой механической стабильностью, позволяющей регистрировать потенциалы крайне легко повреждаемых микроэлектродом эмбриональных нейронов, этот препарат имеет также и ряд других преимуществ. В частности, он позволяет в широких пределах варьировать ионный и фармакологический состав внеклеточной среды путем соответствующих изменений состава перфузирующего раствора.
Непосредственно перед препаровкой эмбрион полностью удалялся из яйца и взвешивался, после чего отсекались голова и дистальные части конечностей для последующего определения стадии развития. Препаровка проводилась в перфузируемой ванночке при комнатной температуре. В исследованный период эмбрионы не обнаруживают болевой чувствительности, что позволяло, так же как и во всех известных в литературе исследованиях, проводить препаровку без наркоза. С туловища и конечностей полностью снималась кожа, удалялись внутренности и препароваяись, в зависимости от программы эксперимента, различные нервы ноги и/пли
крыла, после чего вырезался позвоночник вместе с нервами. Для полного выделения спинного мозга производилась вначале дорсальная, а затем вентральная ламинэктомия.
Отпрепарованный спинной мозг помещался в ванночку из оргстекла, объем которой варьировал, в зависимости от-возраста эмбриона и задач конкретного эксперимента, от 0.2 до 2.0 мл. Для обеспечения механической стабильности спинного мозга он фиксировался на дне ванночки каплями 0,5% агара, приготовленного на физиологическом растворе, или крючками из стекла или нержавеющей стали. Для исключения нарушений стабильности регистрации гидравлическим ударом при переключении пер-фузирующих растворов использовался гидростатический стабилизатор собственной конструкции, поддерживавший скорость перфузии на заданном уровне, обычно 4 мл/мин. Спинной мозг сохранял хорошую жизнеспособность в условиях перфузии, судя по некоторым электрофизиологическим показателям и способности к аксонному транспорту пероксидазы хрепа, в течение 12 и более часов.
Состав перфузирующего раствора, использовавшегося в основных сериях экспериментов, был (в мМ): NaCl - 120, KCl - 3, МаНС03 - 20, СаС12 - 2.6, МдС12 - 1.3, D-глюкоза - 11. В специальной серии опытов нами было показано (Velumian, 1981), что в отсутствие ионов магния в перфузирующем растворе в спинном мозге присутствует выраженная эндогенная активность, осложнявшая в силу своей нестабильности анализ различных вызванных, процессов в исследуемых нейронах. Изучение этой эндогенной активности, представляющей специальный интерес в плане ее отношения к спонтанной нейрогенной моторной активности эмбрионов (см. Бурсиан, 1983; Войно-ЯсенецкиЙ, 1974; Provine, 1973) не входило в задачу нашей работы. В присутствии 1.3 мМ ионов магния вспышки эндогенной синаптической активности в мотонейронах не наблюдались, хотя их можно было спровоцировать различными растормаживающими воздействиями. До поступления в ванночку раствор уравновешивался с газовой смесью 95% 02 + 5% С02, благодаря чему его pH устанавливался в пределах 7.5+ 0.1. В опытах на эмбрионах старше 14-дневного возраста в перфузиру-ющий раствор добавлялась перекись водорода в разведении 0.001% для улучшения кислородообеспечения спинного мозга (Pulton, Walton, 1986; Llinas, Sugimori, 1980). Температура раствора регистрировалась в течение всего опыта с помощью термосопротивления, помещенного в ванночку в непосредственной близости от исследуемых сегментов спинного мозга и поддерживалась, за отдельными исключениями, когда проводились специальные тесты для определения температурной зависимости эффектов, в пределах 25+1°С.
Эяектрофизиологические эксперименты. Потенциалы мотонейронов ре-
гнстрировались, кроме специально оговоренных случаев, с помощью внутриклеточных микроэдектродов. Использовались стеклянные микроэлектроды, заполненные в основных сериях экспериментов 0.6 М раствором K2S04 или 4 >1 раствором СН3С00К, что позволяло минимизировать изменения тор^мозных постсинаптических потенциалов при введении ыихроэлектрода в клетку. Наиболее стабильные результаты достигались при использовании микроэдектродов, электрическое сопротивление которых было не ниже 70 - 90 Мегом. Микроэлектрод соединялся со входом усхдитеяя с помощью агарового мостика и хлорсеребряного электрода. Референтный электрод помещался в ванночку с мозгом и также представлял собой агаровый моогик и хлорсеребржиый электрод. Дня одновременной регистрация потенциалов н пропускания электрических токов через мембрану исследуемой клетки микроэлектрод был включен в традиционную мостовую схему.
Для вызова антидромных ответов в мотонейронах, л также выявления возвратных эффектов раздражали седалищный нерв или, реже, вентральные корешкк соответствующих сегментов спинного мозга с помощью проволочных или всасывающих электродов. Раздражение сегментарных афферентных волокон производилось также либо в седалищном нерве, либо в дорсальном корешке. Для разделения центральных эффектов раздражения афферентных и эфферентных волокон в опытах с раздражением седалищного нерва производилась перерезка дорсальных или вентральных, в зависимости от конкретных задач эксперимента, корешков пояснично-крестцо-вого утолщения. Для раздражения нисходящих путей вентрального в латерального канатиков белого вещества, а также в отдельных опытах для рвздрахенкя вентральных и дорсальных корешков спинного мозга в области их выхода из спинного мозга использовались биполярные вольфрамовые электроды торцевого типа диаметром 80 мкм.
В опытах по изучению эффектов аминокислот-медиаторов на постсинап-тическую мембрану эмбриональных мотонейронов агонисты н антагонисты апплицировались либо через систему перфузии, либо ионофоретичесхи. В последнем случае использовались склеенные внутриклеточный и ионофо-ретический микроэдектроды ( Велумян, 1979; Велумян, Шаповалов, Ширяев, 1976; Curtis, 1968; Krnjeyic, Schwartz, 1966). Для мвкроионофоре-ткчесхой аппликации веществ использовались четырехка&альные микропипетки с диаметром кончика 2-3 мкм, отдельные каналы которых заполнялись ЗМ растворами монояатриевой соли 1-глут аминов ой кислоты, гамма-аминомасляной кислоты (ГАЖ), глицина и хлористого натрия. Последний использовался как общий для всех каналов референтный электрод при ионофореэе (Weigth, Salmoiraghi, 1967), либо как внеклеточный регистрирующий. Вещества апплицировались прямоугольными толчками тока силой 50 -гГОнА, дллтельносты-о S~o-Zoo ^.с-
Хотя в каждом опыте удавалось зарегистрировать активность довольно большого (от 5 до 50} количества мотонебронов, в излагаемый материал
вошли данные лишь в отношении около 600 из них в силу хестких критериев отбора, подробно рассмотренных в диссертации, а в отношении ряда ваяТшТхарактеристиг потенциалов действия число.клеток, отобранных для детального анализа, было значительно нихе. Результаты обрабатывались статистически общепринятыми способами (Вознесенский, 1969).
Нейроанатомические эксперименты. Особенности морфологии мотонейронов и центральных проекций первичных афферентов изучались с помощью их избирательного маркирования методом аксонного транспорта перохси-даэы хрена (Мезц1аш, 1981) .
Перохсидазу апшшцировали на перерезанные центральные торцы спн-нальных нервов, адресующихся в крыло и ногу (сегменты 13-15 н 28-30 соответственно) с помощью точно подобранных по диаметрам (от 40 до 120 мхм) всасывающих пипеток. Хотя расстояния от места аппднкацпи до терминальных ветвлений афферентов и дендритов мотонейронов не превышали в большинстве опытов 1-2 мм, для транспорта пероксидазы требовалось не менее 10-15 часов, что было, по-видимому, обусловлено низкой скоростью транспорта в эмбриональных аксонах и низкой температурой перфузирующего раствора (20-24°С).
По окончании транспорта пероксидазы спинной мозг фиксировали в течение 5 часов в 2 % глутаральдегиде, приготовленном на 0.1 М фосфатном буфере (рН 7.4), при температуре 12°С. Для выявлевия пероксидазы в качестве хромогена использовался бензидин. Реакцию проводили на серийных срезах толщиной 50 мкм, полученных на замораживающем микротоме. Срезы изучались микроскопически с использованием увеличений до 2000 (масляная иммерсия) , фотографировались с помощью фотоприставки на микроскопе "АтрНуа1" и зарисовывались с помощью рисовального аппарата.
Материал этой части диссертации основав на серийных срезах спинного мозга более 80 эмбрионов в возрасте от 6.5 до 13 дней инкубации.
ПРОБЛЕМА ВОЗБУДИМОСТИ НЕЙРОНОВ В РАННЕМ ОНТОГЕНЕЗЕ Противоречивость имеющихся в литературе сведений по данной проблеме , основанных на недостаточно строгих по сравнению с используемыми в отношении зрелых нейронов критериях оценки качества экспериментальных данных, нередко дает почву для недостаточно обоснованных представлений о возможных функциональных особенностях развивающихся нейронов. В связи с этим в диссертации уделено особое внимание анализу качества электрофизиологических данных в онтогенетических иссле-
дованиях.
Потенциал покоя. Потенциалы покоя варьируют в широких пределах, от -30 до -85 мВ, в разных типах дахе зрелых нервных клеток (см. Костюк, 1977; Ходоров, 1975; Eccles, 1957, 1966, и др.). Измерение потенциалов нервных клеток с помощью внутриклеточных электродов неизбежно несет в себе возможвоть некоторого нарушения трансмембранного распределения ионов и шунтирования истинной разности потенциалов между наружной г внутренней средой при нарушении целостности клеточной мембраны. Хотя эти факторы остаются до настоящего времени в значительной мерс неконтролируемыми, очевидно, что величина регистрируемого микроэлектродом потенциала покоя может существенно зависеть от степени повреждения клетки микроэлектродом, что во многом определяется квалификацией экспериментатора и используемыми им критериями оценки качества регистрации. Для иллюстрации зависимости измеряемой величины потенциала покоя от жесткости критериев отбора результатов можно привести пример с мотонейронами взрослой лягушки, потенциал покоя которых "вырос" за два десятилетия после их ранних исследований с помощью внутриклеточных микроэлектродов с примерно -45 мВ (Araki, Otani, 1955; Machne, Fadiga, Brookhart, 1959) до -65 мВ (Велумян, 1979; Barrett, Barrett, 1976; shapovalov, Shiriaev, Velumian, 1978, и др.), что, конечно, не является результатом бурной эволюции этих клеток.
Относительно низкие потенциалы покоя были зарегистрированы на ранних стадиях развития в основном в работах, выполненных до середины 70-х годов, но встречаются и в некоторых более поздних работах, что привело к распространенному до настоящего времени представлению о том,' что потенциал покоя во многих типах нейронов вначале низок и окончательно "созревает" лишь в постнатальном периоде развития. Про-веденый в диссертации анализ данных литературы показывает, что практически во всех случаях, когда удавалось исследовать нейроны в более стабильных условиях регистрации, и главным образом на изолированных перфузируемых препаратах, потенциалы покоя, так же как и потенциалы действия, оказывались значительно более "зрелыми" по сравнению с данными более ранних исследований на препаратах in vivo. Очевидно, что вероятность повреждающего действия микроэлектрода и, следовательно, занижение величины потенциалов покоя тем более вероятно, чем меньше размеры клеток, что особенно важно иметь в виду при оценке исследований в раннем онтогенезе, когда размеры клеток значительно меньше, чем у взрослых животных. Это обстоятельство, как показано в разных разделах диссертации, важно иметь в виду при оценке не только потенциалов покоя, во и других электрофизиологических характеристик нервных клеток на ранних стадиях развития.
В связи с отмечавшимися трудностями качественной регистрации потенциалов незрелых нейронов представляется необходимым дать более детальное, чем это обычно делается, описание этих трудностей на примере нсследованых нами спинальных мотонейронов куриного эмбриона. Особенности" морфологии этих нейронов были нами изучены С-помощью метода ах-сонного транспорта пероксидазы хрена и подробно описаны в диссертации. Здесь достаточно лишь отметить, что на всех исследованных стадиях они имеют довольно развитые дендриты, достигающие длины 100 мкм и более , а размеры сомы у них варьируют от 8 х 12 мкм до 18 х 22 мкм на 6.5-й день, от 12 х 15 мкм до 24 х 38 мкм на 10-й день и от 14 х 17 мкм до 25 х 39 мкм на 13-й день развития.
Даже несмотря на использование в наших опытах очень тонких микроэлектродов, нам редко удавалось зарегистрировать в момент прокола клетки потенциал покоя отрицательнее -30 мВ. На повторных треках микроэлектрода эти величины оказывались еще более низкими, а встречаемость клеток резко уменьшалась, причиной чего часто оказывалось подламывание кончика михроэлехтрода в ткани мозга или образование в нем плотных тканевых прббок и тянущихся за кончиком нитей. Большинство мотонейронов, потенциалы которых нам удавалось удовлетворительно'зарегистрировать, относится к первым трекам микроэлектродов, после чего микроэлектроды приходилось менять.
Потенциалы покоя порядка -30 мВ и нихе, зарегистрированные в момент прокола, ни в одной из исследованных клеток не были стабильными и в большинстве случаев быстро сходили на пет. Антидромные потенциалы действия в таких клетках выявлялись лишь в редких случах, а их амплитуда не превышала нескольких милливольт и падала до нуля ухе в первые секунды после прокола мембраны. Ввиду таких очевидных признаков повреждения такие клетки не принимались нами в расчет для оценки величин потенциалов покоя и потенциалов действия, хотя латентности антидромных потенциалов действия в них, которые не менялись в зависимости от состояния клетки в процессе регистрации, использовались нами для расчетов скоростей проведения в аксонах. Лишь в небольшом числе клеток, которые "выстаивали" в первые 10-30 секунд после введения микроэлектрода, потенциалы покоя, вначале также низкие, начинали медленно увеличиваться и через несколько минут стабилизировались па уровне от -45 до -70 и даже более мВ, однако антидромные потенциалы действия в них, также начавшие постепенно увеличиваться по амплитуде, все еще оставались угнетенными. Эти клетки также не принимались л» расчет для определения в них величины потенциалов покоя. И лишь в тех мотонейронах, у которых достигали стабильного уровня не только потенциалы покоя, но и стабилизировалось амплитудно-временное течение потенциала действия,
потенциалы покоя считались зарегистрированными удовлетворительно.
В результате описанной выше жесткой селекции из общего количества 588 зарегистрированных мотонейронов эмбрионов 9-18-дневного возраста было отобрано лила 114, из которых в 22 мотонейронах 9- и 10-дневных эмбрионов потенциалы покоя можно было считать зарегистрироваными удовлетворительно лишь условно, поскольку в них травмирующее действие микроэлектродов было, по-видимому, более сильным, и достичь полного восстановления потенциалов действия не удавалось даже если потенциал покоя стабилизировался. Измеренные после восстановления от повреждения клеток потенциалы покоя мотонейронов куриного эмбриона были в среднем -65.9+6.5 мВ (п=25) на 11-й день инкубации и -61.2±7.7 мВ (п=13) на 18-й день. Приведенный в диссертации материал, прослеживающий день заднем эту и ряд других электрофизиологических характеристик мотонейронов после 10-го дня инкубации, не дает оснований предполагать "незрелость" величин потенцалов покоя мотонейронов во второй половине инкубации куриного эмбриона. Как средние, так а граничные значения потенциалов покоя исследованных нами спинальных мотонейронов куриного эмбриона находились в период с 9-го по 18-й день развития в тех же пределах, что н потенциалы покоя зрелых мотонейронов различных животных (см. Burke, Rudomin, 1977; Eccles, 1957, 1964), включая птиц (Rubin, 1974), и варьировали независимо от возраста, т.е. определялись скорее удачностью регистрации чем возрастными особенностями. Важно отметить, что на всех исследованных стадиях нам удавалось зарегистрировать мотонейроны с потенциалами покоя -70 мВ и выше, что удается далеко не во всех исследованиях на зрелых мотонейронах.
Ввиду того, что в нейроонтогенетических микроэлектродных исследованиях обычно отсутствуют критерии оценки степени зрелости регистрируемых нейронов, высказывалось предположение (Бурсиан, 1983), что микроэлектрод отбирает более крупные и, следовательно, более зрелые клетки. Поэтому в нашей работе был впервые применен критерий оценки соответствия удовлетворительно зарегистрированных клеток характерным для своего возраста скоростям проведения импульсов в аксонах. Такие данные были вами получены на 588 мотонейронах, среди которых были как удовлетворительно зарегистрированные, так и те, которые обнаруживали явные признаки повреждения и гибли ухе в первые секу.-ды после введения микроэлектрода. Как показало сопоставление потенциалов покоя н скор»6тей проведения импульсов в аксонах индивидуальных мотонейронов, ни на одном из исследованных возрастов скорости проведения в аксонах удовлетворительно зарегистрированных клеткок не превышали характерных для своего возраста значений. Эти данные дают достаточно веские основания считать, что если в наших опытах и имел место отбор клеток мик-
роэлектродом, то он происходил не по признаку зрелости клеток.
В отношении мотонейронов эмбрионов до 9-го дня развития предпринимавшиеся нами до настоящего времени попытки достичь удовлетворительной регистрации были безуспешны, причиной чего являются, по-видимому, не- только" малые-раз меры клеток^-но и, воз можно, малая мощность мембранных систем активного транспорта ионов, не успевающих восстановить нарушенное в результате введения микроэлектрода нормальное распределение ионов по обе стороны мембраны.
Приведенные в этом разделе диссертации собственные и литературные данные показывают, что величины потенциалов покоя в различных нервных клетках разных животных на ранних стадиях развития находятся, за редкими исключениями, в тех же пределах, что и потенциалы покоя зрелых нейронов. Хотя нельзя полностью исключить некоторые изменения потенциала покоя на стадиям дробления (см. Божкова, Сорокин, 1375}, а также, возможно, на ранних стадиях развития в условиях культуры (Чутга-на, 1981; Miyake, 1978; см., однако, Willard, 1980), в настоящее время нет достаточных оснований полагать, что в развивающихся in vivo незрелых нервных клетках они имеют более низкие по сравнению со зрелыми нейронами значения.
Потенциал действия. Хотя свойствам потенциалов действия незрелых нейронов уделялось много внимания, достаточно детального анализа их электрофизиологических свойств, сопоставимого по уровню с аналогичными исследованиями на зрелых нейронах, до сих пор не проводилось. Значительно более точные по сравнению с данными, полученными в опытах на целых плодах и новорожденных животных, сведения о потенциалах действия развивающихся нейронов были получены в работах, выполненных после середины 70-х годов благодаря использованию различных перфузи-руемых in vitro препаратов ЦНС (Велумян, 1982, 1985; Arasaki, Kudo, Nakanishi, 1984; Fulton, Walton, 1981, 1986; Harada, Takahashi, 1981, 1983; Schwartzkroin, 1982; schwartzkroin, Kunkel, 1982; Sutor, Ziegl-gansberger, 1985; Velumian, 1981, 1984). Наиболее детальный анализ свойств потенциалов действия нейронов и отдельных их компонентов возможен, как показали классические исследования Экклса с сотрудниками на зрелых мотонейронах (Eccles, 1957, 1964), в отношении антидромно вызываемых ответов. Нами такой анализ был проведен на мотонейронах пояснично-крестцового отдела спинного мозга куриного эмбриона в период с 9-го по 18-й день развития.
Ввиду важности вопроса о качестве регистрации и, следовательно, объективности оценок параметров потепциалов действия в незрелых нейронах необходимо подробнее описать процедуру их регистрации в наших опытах (см. Велумян, 1985), имея в виду, что многие из рассматривав-
мых деталей, при их неучете, могли бьггь причиной выявления некоторых «особенностей " незрелых нейронов в некоторых публикациях. Непосредственно после введения микроэлектрода при "потенциале покоя" не выше -30 мВ в большинстве исследованных вами мотонейронов потенциал действия был, резко угнетен и имел амплитуду не более 3-4 мВ. Эти потенциалы действия брались нами в расчет только для измерения скоростей проведения в аксонах.
В значительно меньшем количестве клеток, у которых потенциал покоя, также редко превышавший -30 мВ, восстанавливался до уровней отрицательнее -50 мВ стабилизировался на периоды времени от нескольких минут до в отдельных случаях двух часов (последнее наблюдалось даже в отдельных мотонейронах 11-дневных эмбрионов), потенциалы действия также увеличивались по мере роста потенциала покоя, и в них возникали сначала НС, а затем и СД компоненты. Такой ход восстановления потенциалов действия характерен и для значительно поврежденных микроэлектродом мотонейронов взрослых животных, однако в эмбриональных мотонейронах это восстановление происходит медленнее отстает во времени от восстановления потенциала покоя. Наиболее трудно восстанавливался СД компонент потенциала действия, и нередко даже в клетках, потенциал покоя которых после восстановления от начального повреждения стабилизировался на уровне более отрицательном чем -50 мВ (негласно установленный нижний предел потенциалов покоя в большинстве исследований на зрелых нейронах), амплитуда потенциала действия ве превышала половины абсолютной величины потенциала покоя, и лишь через несколько минут НС компонент достигал максимальной величины, после чего появлялся СД компонент, амплитуда которого постепенно возрастала, а длительность уменьшалась. Хотя причины этого явления не анализировались, можно полагать, что в основе их лежит неэквивалентное восстановление после начального нарушения, вызванного введением микроэлектрода, асимметрии распределения по обе стороны мембраны клетки ионов калия, вносящих основной вклад в потенциал покоя, и натрия и/или кальция, участвующих в генерации потенциала действия.
В наших опытах из 114 мотонейронов 9-18-дневных эмбрионов, потенциалы покоя которых восстановились после начального повреждения до стабильных уровней -50 мВ и более, лишь в 70 удалось достичь также и относительной стабилизации амплитудно-временного течения потенциалов действия, причем в 6 из них, принадлежавших 9- и 10-дневным эмбрионам, было очевидно, что ход восстановления потенциалов действия был еще более медленным по сравнению с мотонейронами более старших эмбрионов, вследствие чего полного их восстановления пи в одном из исследованных нами мотонейронов 9- и 10-дневных эмбрионов достичь не уда-
лось.
Приведенные/диссертации данные показывают, что в период с 11-го по
18-й день развития куриного эмбриона величины потенциалов покоя и потенциалов действия мотонейронов практически не меняются и уже близки к значениям, описанным в зрелых мотонейронах. Так, средние значения величин потенциалов покоя и потенциалов действия в эмбриональных мотонейронах ухе на 11-й день развития были соответственно -65,9+6,5 мВ (п=25) и 64,2+7,1 мВ (п=18), а в зрелых мотонейронах голубя (Rabin, 1975) они равны соответственно -59±11 мВ (п=31) и 57±13 мВ (п=41). Так же как и потенциалы покоя, амплитудные характеристики потенциалов действия варьировали в разных клетках в период с 11-го по 18-й день развития независимо от возраста что, по-видимому, определялось лишь качеством регистрации в индивидуальных клетках. Превышение пика потенциалов действия над нулевым уровнем ("овершут") имело место в некоторых клетках даже 11-дневных эмбрионов. Важно также отметить, что отсутствовала прямая зависимость между величиной потенциала покоя и наличием овершута: овершут мог иметь место не только в клетках с наибольшим но также и с наименьшим в исследованной группе клеток данного возраста потенциалом покоя. Точно так же не все потенциалы действия, имевшие максимальную амплитуду в группе исследованных клеток данного возраста, имели амплитуду, превышавшую абсолютную величину потенциала покоя.
Так же как и в зрелых мотонейронах (Eccles, 1957), на восходящей фазе исследованных нами потенциалов действия эмбриональных мотонейронов можно было выявить перегиб, соответствующий переходу возбуждения с начального сегмента аксона (вопрос о том, что этот термин не всегда правомерно применять, разбирается в диссертации особо) на со-мадепдритную мембрану. Важно отметить, что в противоположность некоторым данным о том, что в незрелых нейронах переход возбуждения с начального сегмента аксона на сомадендритную мембрану затруднен и поэтому НС-СД переход выражен в потенциале действия более резко чем в зрелых клетках, в нашей работе это наблюдалось лишь в клетках, находящихся в процессе восстановления от начального повреждения после введения в них микроэлектрода, после чего выявить перегиб на восходящей фазе потенциала действия во многих клетках не удавалось даже с помощью электронного дифференцирования. В таких клетках НС-СД переход удавалось выявить лишь с помощью гиперполяризующих токов, пропускаемых через внутриклеточный микроэлектрод или парных антидромных раздражений. Амплитуда НС компонента, измеренная непосредственно по перегибу на восходящей фазе полноразмерных потенциалов действия, в выявлявшемся в чистом виде ПС компоненте в клетках, в которых по тем
или иным причинам СД компонент был заблокирован, или экстраполированная из зависимостей его амплитуды от силы гиперполяризующего тока составляла в разных клетках 0.4-0.6 амплитуды полноразмерного потенциала действия.
Тесты с парными антидромными раздражениями позволили установить, что моторные аксоны эмбриональных мотонейронов способны воспроизводить частоты порядка 100-400 импульсов в секунду, тогда как в сома-дендритной мембране верхняя граничная частота при таком способе тестирования не превышает 50 имп/с. Сходные величины в отношении СД компонентов можно было получить и при тестировании с помощью деполяриза-ционных смещений потенциала мембраны током, пропускаемым через внутриклеточный микроэлектрод. Эти результаты свидетельствуют о том, что хотя в ряде исследований с помощью внеклеточной регистрации фоновой активности незрелых нейронов частота импульсации в них была крайне низкой, причиной этого могла быть не неспособность этих клеток к высокочастотным разрядам, а скорее низкий уровень фоновых воздействий на них в конкретных условиях экспериментов. В пользу способности со-мадендритной мембраны незрелых нейронов к генерации ритмических разрядов может свидетельствовать также и то, что длительность следовых процессов в них по сравнению со зрелыми нейронами, возможно, несколько меньше.
Так же как и в зрелых нейронах, амплитуда потенциалов действия в эмбриональных мотонейронах линейно зависела от силы тока, увеличиваясь при пропускании через мембрану гиперполяризувяцих токов и уменьшаясь при деполяризующих токах, что позволяло оценить величину входного сопротивления мембраны мотонейронов. Определенные таким способом величины входного сопротивления мембраны мотонейронов варьировали в разных клетках в пределах от 1.4 до 14.0 мегом независимо от возраста, что, так же как и регистрируемые потенциалы, могло в определенной мере зависеть от качества регистрации, однако приведенные в диссертации данные не обнаруживают прямой связи этих величин с потенциалами покоя. В среднем входное сопротивление мембраны мотонейронов в исследований нами период развития составляло 7.27+3.59 мегом (п=21) при тестировании деполяризующими и 7.89+3.71 мегом (п=16) - гиперпо-ляризующими токами при потенциале покоя в среднем -63,1±8,62 мВ (п=22).
Рассмотренные в этом разделе диссертации данные позволяют заключить, что как потенциалы покоя, так и потенциалы действия нервных .клеток имеют если не "зрелые", то достаточно близкие к "зрелым" величины. Практически во всех случаях, когда удавалось анализировать компонентный состав потенциалов действия, в них выявлялись аксонный
и с ома дендритный компоненты,что свидетельствует о раннем формировании электровозбудимости не только сомадендритной, но и аксонной мембраны.
В то же время необходимо отметить, что на наиболее ранних стадиях развития, как это показано на некоторых нейронах амфибий и насеко------ мых7 не удается выявить наличие^потенциалов действия в нервных клетках даже при пропускании через их мембрану значительных деполяризующих токов, что в некоторых работах рассматривается как свидетельство отсутствия электровозбудимости (Baccaglirii, Spitzer, 1977; Goodraan, 1982; Goodman, Spitzer, 1981), хотя не во всех случаях мозга о было исключить возможное шунтирование эффектов тока из-за большой электротонической связи между эмбриональными нейронами.
РОСТ АКСОНОВ, МИЕЛИНИЗАЦИЯ И СКОРОСТЬ ПРОВЕДЕНИЯ ИМПУЛЬСОВ
Скорость проведепия импульсов по аксонам в значительной мере определяется условиями распространения локальных токов, генерируемых потенциалами действия в отдельных участках аксона. Эти условия претерпевают значительные изменения в раннем онтогенезе благодаря изменени- . ям геометрических параметров аксонов и их микроокружения, а также в ряде типов аксонов их миелинизацией.
Представления о резком увеличении скорости проведения импульсов в развивающихся аксонах при начале миелинизации основываются на отдельных исследованиях, выполненных на сравнительно поздних стадиях развития (Eccles, Shealy, Willis, 1963; Gallego, Huizar, Kudo, Kuno, 1978; Huizar, Kuno, Miyata, 1975; Hursh, 1939; Skoglund, 1960), но в большей степени на аналогиях со зрелыми аксонами, чем на конкретном экспериментальном материале. В данной главе подробно рассмотрены изменения скоростей проведения в моторных аксонах куриного эмбриона в период с 6.5-го по 18-й день развития.
Приведенный в диаертации материал свидетельствует о том, что хотя на домиелиновых стадиях развития и имеет место некоторое увеличение скоростей проведения в моторных аксонах от средних значений 0.3 м/с на 6.5-й день развития до 0.6-0.7 м/с к началу миелинизации, первые признаки которой выявляются на 12-13-й день, это увеличение значительно отстает от ожидаемого на основании данных об изменениях диаметров аксонов и данных о скоростях проведения в зрелых немиелини-зированных аксонах сходного диаметра. На 6.5-й день развития куриного эмбриона моторные аксоны проводят импульсы со скоростями в 2.9 раза меньшими, чем зрелые немиелинизироваяные аксоны такого же диаметра, а к 13-му дню, через день после выявления первых признаков миелинизации моторных аксонов, это соотношение уменьшается до 2.1, т.е. даже к началу миелинизации активные свойства мембраны эмбриональных аксо-
нов еще далеки от дефинитивных. Эти данные свидетельствуют о том, что формирование активных свойств мембраны аксонов не заканчивается к началу миелинизации. Сходным образом, изменения скоростей проведения импульсов в моторных аксонах после начала миелинизации, благодаря которой они достигают к 18-му дню в среднем 2.3 м/с, также значительно отстают от ожидаемых на основании изменений диаметров, если исходить из аналогий со зрелыми аксонами. В зтом случае, однако, хотя на основании данных по домиелиновым стадиям очевидны отличия активных свойств мембраны аксонов к началу миелинизации, важную роль могут играть также проксимо-дистальная гетерохрония миелинизации аксонов и возрастные изменения длины мехперехватных участков.
В некоторых опытах фокальные ответы мотонейронов имели два четко разделенных пика даже у 10-дневных эмбрионов, однако это не является отражением возможной ранней дифференциации альфа и гамма аксонов, поскольку эти ответы не удавалось разделить варьированием силы раздражения верва. Такие двухкомпонентные фокальные антидромные ответы мотонейронов выявлялись не во всех участках, где регистрировались антидромные ответы, а лишь на границе между двумя сегментами и лишь в опытах, в которых антидромный залп поступая в спинной по не менее чем двум разным спинальным нервам из седалищного нерва. Распределение скоростей проведения в аксонах мотонейронов было на исследованных нами стадиях мономодальными, что также исключает возможность наличия двух дифференцированных групп мотонейронов в этот период развития. Поэтому можно полагать, что причиной выявления двух пиков фокального антидромного ответа мотонейронов на границе между двумя сегментами является неодинаковость дистанции прохождения антидромных импульсов к локализующимся в этой области мотонейронам обоих сегментов (у куриного эмбриона сакральное сплетение, формирующее седалищный нерв, четко ориентировано в каудальном направлении).
Закономерные возрастные изменения скоростей проведения в моторных аксонах эмбрионов и представленные в диссертации конкретные данные о них по каждому дню развития позволили, как отмечалось выше, использовать этот параметр для оценки соответствия отдельных внутриклеточно зарегистрированных мотонейронов, отобранных по критериям стабильности потенциалов покоя и потенциалов действия, наиболее характерным для данного возраста скоростям проведения в их аксонах. Ранее таких критериев, ввиду отсутствия подробных данных, в нейроонтогенетических исследованиях не применялось.
В диссертации представлены также данные по возрастным изменениям скоростей проведения в афферентных волокнах, основанные на фокальной и внутриклеточной регистрации ответов нейронов спиналЬных ганглиев на
раздражение седалищного нерва. Ухе на 1<кй день развития в этих нейронах нами была выявлена четкая дифференциация по скоростям проведения в их аксонах на быстрые и медленные, причем более быстрые имеют скорость-проведения,_ сходную со скоростью проведения в моторных аксонах. " .
СООТНОШЕНИЕ МЕЖДУ СТРУКТУРНЫМИ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫМИ .
ОСОБЕННОСТЯМИ НЕЙРОНОВ В ходе развития нервные клетки претерпевают значительные изменения формы и размеров, в связи с чем представляет бодьшой интерес возможная роль этих факторов в детерминации их функциональных особенностей (см. Шулейкина, 1979, 1985; Шулейкина, Раевский, Гладкович, 1382). В связи с этим в диссертации проанализированы сведения о соотношении между структурными и функциональными свойствами, известные в отношении зрелых нейронов, и оценена возможная значимость их для понимания функциональных особенностей развивающихся цейронов.
Роль размеров тел нейронов.
Размеры сомы и возбудимость нейронов. Очевидно, что чем меньше размеры сомы клетки, тем больше, при прочих равных условиях, ее входное электрическое сопротивление и, следовательно, также больше величина смещений потенциала, создаваемых проходящими через мембрану токами. В отношении зрелых нейронов такая зависимость, выражающаяся также и в большей легкости возбуздения потенциалов действия в нейронах, имеющих большее входное сопротивление действительно показана (Henneman, 1957, 1979; Henneman, Somjen, Carpenter, 1965; Luscher, Ruenzel, Henneman, 1979; Henneoan, Mendell, 1981). В спинальных мотонейронах незрелых крыс (Fulton, Walton, 1986) и исследованных нами мотонейронах куриного эмбриона для генерации потенциалов Действия требовались деполяризующие токи порядка 0\5-1 нА, что почти на порядок меньше, чем в зрелых нейронах (ср.: Eccles, 1957).
Данные литературы свидетельствуют о том, что в незрелых нейропах наиболее выраженные возрастные изменения входного сопротивления происходят на самых ранних стадиях становления электровозбудимости. Необходимо иметь в виду, что изменения входного сопротивления сомаден-дритной мембраны нейронов в ходе развития могут быть обусловлены не только геометрическими факторами, включая увеличение размеров сомы и разрастание дендритов, но и возможным изменением удельного сопротивления мембраны благодаря увеличению в ней плотности ионых каналов. К сожалению, детальных сведений по этим вопросам до настоящего времени в литературе нет, однако можно отметить, что плотность суммарных ионпых токов, протекающих через мембрану при ее возбуждении, с воз-
растом увеличивается (Баев, Русин, Софровов, 1986).
Размеры сомы и выраженность компонентов потенциала действия нейрона. В отношении малых размеров тел незрелых нейронов определенный интерес может представлять тот факт, что во многих интернейронах зрелого спинного мозга и некоторых других типах нейронов, также имеющих малые размеры сомы, отсутствует характерный для более крупных клеток, какими являются альфа-мотонейроны, перегиб на восходящей фазе потенциалов действия, разделяющий НС и СД компоненты. В связи с этим необходимо иметь в виду, что НС-СД переход в любых типах нейронов замедляется при гиперполяризациовных смещениях потенциала соматической мембраны и облегчается при деполяризующих смещениях. Учитывая возможное большее входное сопротивление этих нейронов, можно полагать, что при ортодромном возбуждении, при котором обычно исследовались потенциалы действия в этих нейронах, генерируемые в них постсинаптические токи вызывают значительные деполяризациоиные смещения потенциала соматической мембраны, которые облегчают НС-СД переход, что, по-видимому, и является причиной невыявления НС-СД перехода в этих условиях. Сходные с отмеченными выше трудности выявления НС-СД перехода наблюдались и нами в эмбриональных мотонейронах, причем нередко даже в отношении антидромных потенциалов действия. Важно отметить, что соответствующий этому переходу перегиб на восходящей фазе потенциала действия был четко выражен в процессе восстановления клеток от начального повреждения, вызванного введениеммикроэлектрода, но практически исчезая при достаточно полном восстановлении СД компонента, после чего его не удавалось выявить, так же как и в зрелых нейронах с небольшими размерами сомы, даже с помощью электронного дифференцирования, хотя тесты с гиперполяризующими токами в ряде случаев позволяли это сделать. В исследовании антидромных потенциалов действия мотонейронов плодов кошки (Naka, 1964) было, наоборот, отмечено, что НС-СД перегиб в них выражен более резко на наиболее ранних из исследованных стадий, что было приписано более резкой границе между аксонным холмиком и сомой. В то же время в этой работе отмечалось, что на. более ранних стадиях наблюдались очевидные признаки повреждения клеток микроэлектродом. Поэтому, хотя наличие резкой границы между аксоном и сомой вполне может вносить определенный вклад в замедление распространения импульса при переходе через эту границу (см. Тимин, 1979; Dodge, 1979), ввиду явного повреждения клеток нет достаточных оснований считать это единственной причиной выраженности НС-СД перехода в работе Naka.
Отмечалось, что в зрелых интернейронах длительность потенциала действия сомы меньше, чем в мотонейронах, и он се сопровождается
столь выраженной следовой гиперполяризацией, как в мотонейронах (Костик, 1983). В незрелых нейронах до настоящего времени не было описано более быстрых по сравнению со зрелыми нейронами потенциалов действия. В отношении длительности следовой гиперполярнзации, однако, незрелые нейроны могут показаться более близкими к зрелым интернейронам, нежели к мотонейронам, хотя этот вопрос остается неясным ввиду крайне высокой чувствительности следовых потенциалов к введению микроэлектрода .
Роль наличия или отсутствия дендритов. Значительный интерес в плане функциональных особенностей дифференцирующихся нейробластов представляет вопрос о связи между электрофизиологическими свойствами нейронов и наличием или отсутствием у них дендритов. В этом плане можно отметить, что потенциалы действия зрелых нервных клеток, не имеющих дендритов, таких как, например, нейронов спинальных ганглиев, можно разделить, так же как и потенциалы действия зрелых мотонейронов, на СД, НС и М компоненты (Лев, 1964; Ito, 1959; Svaetichin, 1958). В дифференцирующихся нейробластах электровозбудимость появляется еще до появления у них дендритов (см. Шулейкина). Функциональное значение дендритов в незрелых нейронах детально рассматривается в обзоре К.В. Шулейкиной (1985), обращающем особое внимание на дендритные триггер-ные зоны инициации потенциалов действия в некоторых типах нейронов.
Соотношение между размером сомы и скоростью проведения импульсов в аксоне. Имеется довольно большая серия работ на зрелых нейронах, показавшая положительную корреляцию между размерами тел клеток и диаметрами их аксонов, или скоростями проведения в них импульсов, (Cull-heim, 1978; Cullheim, Ulfhake, 1979; Harper, Lawson, 1985a; Kernell, 1966; Lawson, Harper, 1985; Lee, Chung, Chung, Coggeshall, 1986, и др.). В отношении развивающихся нейронов специальных исследований этого вопроса не проводилось. Необходимо, однако, отметить, что такой очевидной связи, по крайней мере в отношении мотонейронов, на которых установлена рассматриваемая закономерность в зрелом состоянии, в раннем онтогенезе, по-видимому, не существует ввиду того, что в противоположность резкому увеличению диаметров аксонов от менее чем 1 мхм до 10-20 мкм и резкому увеличению скоростей проведения импульсов по аксонам в ходе миелияизации, размеры сомы увеличиваются за этот период не более чем в 2-3 раза.
Различия свойств потенциалов действия между нейронами с миеднннзи-рованньгми и немиеливизированвыми аксонами. На нейронах спинальных ганглиев показано, что имеются различия амплитудно-временного течения СД компонентов потенциалов действия (см. Harper, Lawson, 1985b) и, возможно, свойств аксонных компонентов потенциалов действия между
клетками с миеливизированным и вемиелинизированным аксоном, хотя это не подтверждается иллюстрациями (Gallego, Euzaguirre, 1978). В этом отношении ваша работа является, по-видимому, в настоящее время единственной, в которой изучались потенциалы действия до и после начала миелинизацня аксонов. Каких-либо качествевных изменевий амплитудно-временного Учения потенциалов действия с началом миелинизацяи нами отмечено aé было.
Исходя йз того, что НС и М компоненты были идентифицированы лишь в нейронах с мнелннизированным аксоном, имеющим структурно обособленный начальйый сегмент, мохво полагать, что в нейронах с немнелавизированным ate оном компонентный состав потенциала действия и пространственные свойства аксонных компонентов могут отличаться от таковых в нейронах с миеливизированным аксоном, что до настоящего времени было показано лишь в симпатических нейронах (Nishi, Soeda, Koketsu, 1965; Yoshimura, Polosa, Nishi, 1986) но, к сожалению, ве привлекло достаточного внимания, хотя эта особенность может иметь важное функциональное значение ввиду ключевой роли начального участка аксона в процессе инициации импульса в нейроне. Эта проблема, имеющая принципиальное звачевие для понимания изменений интегративвой деятельности нейронов в процессе дифференцировки начального сегмента аксова, детально рассматривается в последней главе диссертации.
ФОРМИРОВАНИЕ СИНАПТИЧЕСКИХ СВЯЗЕЙ И МЕЖНЕЙРОННЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ В РАННЕМ ОНТОГЕНЕЗЕ
Можво выделить ряд проблем, которые хотя и разработаны с той или иной степенью детализации в отношении некоторых нейронных систем (см. Шулейкива, 1975, Gaze, 1970), требуют дальвейшей конкретизации. Разработка этих проблем в раннем онтогенезе неизбежно поднимает ряд вопросов более общего характера - о соотношении возбуждения и торможения, об особенностях этих процессов, об электрической и химической природе межнейронзых взаимодействий, о становлении медиаторвой специфичности и т .д.
Функциональные взаимодействия между мотонейронами. В диссертации рассмотрены как прямые электрические, так и опосредованные через клетки Реншоу тормозные взаимодействия между эмбриональными мотонейронами.
Возвратное торможение. Это торможение является одним из наиболее детально изученных в зрелой нервной системе (BurKe, Rudomin, 1977; Eccles, 1957, 1964, 1969; Ессles, Fatt, Koketsu, 1954; Renshaw, 1941; 1946, и др.). Необходимо отметить, что в спинном мозге механизм возвратного Реншоу-торможения был показан лишь у млекопитающих, тогда
как у немлекопитающих животных его до настоящего времени выявить не удалось (хрящевые рыбы: Leonard, Rudomin, Willis, 1978; костистые рыбы: Bando, 1975; амфибии: Шаповалов, Ширяев, 1984; Czeh, 1977, 1979
----SzekelyvCzeh, 1976,рептилии:Ruigrok^Crowe, ten Donkelaar, 1984).
Нами возвратное торможение данного типа было обнаружено в спинном мозге куриного эмбриона, что позволило высказать предположение о том, что в ходе эволюции этот механизм впервые возник у общего предка птиц и млекопитающих в классе рептилий (Велумян, 1982).
Возвратное торможение в спинном мозге на пренатальных стадиях развития было показано в иследованиях на плодах кошки после 44-го дня внутриутробного развития (Naka, 1964). В исследовании Янсена с сотрудниками (Eide, Jansen, Ribchester, 1982) на мотонейронах 19-21-дневпых куриных эмбрионов в условиях in ovo не удалось обнаружить возвратного торможения, однако авторы не учли, что даже если бы оно и присутствовало, оно могло быть заблокировано в их опытах в холин-ергическомзвене из-за кураризации эмбрионов. В нашей работе возвратные ТПСП выявлялись в мотонейронах куриного эмбриона на всех исследованных стадиях в период с 10-го по 18-й день инкубации (Велумян, 1982; Velumian, 1984) , а в последующем удалось их выявить и у 9-дневных эмбрионов.
Выявление в эмбриональных мотонейронах возвратных тормозных пост-синаптнчесхих потенциалов (ТПСП), так же как и других ТПСП, требует
особой тщательности ввиду того, что эти потенциалы могут легко извратиться в деноляризационные вследствие нарушения нормального траисмем-бранного распределения ионов хлора при введении микроэлектрода и быть неверно интерпретированы. Вопрос о качественном выявлении ТПСП в эмбриональных мотонейронах детально рассмотрен в диссертации (см. также Velumian, 1984). Так же как а другие ТПСП, возвратные ТПСП наиболее отчетливо выявлялись в мотонейронах в первые минуты после введения микроэлектрода при низких (-30 - -40 мВ) потенциалах покоя в виде гиперполяризационных ответов амплитудой до 5-10 мВ, и постепенно уменьшались по амплитуде, вплоть до полного "исчезновения" во многих клетках, по мере роста потенциала покоя в ходе восстановления клетки от начального повреждения, вызванного введением микроэлектрода, и без дополнительных тестов далее не выявлялись. В нашей работе было ис-пользовапо несколько способов выявления возвратных ТПСП, включающих поляризацию мембраны, антидромную коллизию, варьирование силы раздражения нерва и парные антидромные раздражения с целью блокирования СД компонента, следовая гиперполяризация которого осложняла выявление возвратного ТТ1СП.
Уже к 10-му дню развития куриного эмбриона возвратные ТПСП присут-
ствуют, по нашим оценкам, в примерно 30 % мотонейронов. С помощью ак-сонного транспорта пероксндазы хрена нами было также показано существование возвратных коллатералей в сходном проценте моторных аксонов на этой стадии развития (Велумян, Полякова, 1992).
Во многих клетках амплитуду возвратных ТПСП можно было достаточно тонко варьировать изменениями силы раздражения нерва, что указывает на конвергенцию возвратных влияний от многих моторных аксонов через клетки Реншоу к индивидуальным мотонейронам. Латентность возвратных ТПСП относительно антидромного потенциала действия варьировала в разных клетках от 2.5 мс до 12.0 мс, что близко к значениям, полученным на мотонейронах плода кошки (Мака, 1964), но значительно превышает величины, характерные для зрелого спинного мозга, где она составляет немногим более 1 мс (см. Eccles, 1957, 1969). Очевидно, что такая задержка, складывающаяся из нескольких компонентов, каждый из которых несет в себе элементы незрелости, не является неожиданной для незрелого спинного мозга. По-видимому, в основном она обусловлена крайне низкими скоростями проведения импульсов в терминалях коллатералей моторных аксонов и, что особенно важно, дисперсией времен'прихода импульсов по возвратным коллатералям к клеткам Реншоу, вследствие чего время нарастания постсинаптических потенциалов в клетках Реншоу до момента возникновения в них потенциалов действия должно быть значительно больше чем в зрелом спинном мозге.
■ Электрические взаимодействия мотонейронов. Широко распространено представление о том, что в раннем онтогенезе электрические взаимодействия между нейронами, так же как и между другими типами клеток, играют значительно большую роль, чем в зрелом организме (Bennett, 1966; Caveney, 1985; Goodnan, Spitzer, 1981; Griepp, Revel, 1977; Jacobson, 1970; Sheridan, 1978). В нашей работе при анализе антидромных эффектов в мотонейронах уделялось специальное внимание возможному присутствию электрически опосредованных ответов ввиду того, что такие ответы сохраняются и в зрелом спинном мозге (Шаповалов, Ширяев, 1984, 1987; Gogan, Gueritaud, Horsholle-Bossavit, Tyc-Dunont, 1977; Grin-nell, 1966; Magherini, Precht, Schwindt, 1974; Nelson, 1966; Shapo-valov, Shiriaev, 1978).
Выяснению возможности электрических взаимодествий между развивающимися мотонейронами уделялось внимание лишь в нескольких работах, выполненных на спинном мозге крыс в раннем постнатальном периоде (Мо-торнна, 1984; Arasaki, Kudo, Nakanishi, 1984; Fulton, Miledi, Takaha-shi, 1990). Имеются указания на присутствие электрических взаимодействий между мотонейронами спинного мозга 19-21-дневных куриных эмбрионов (Eide, Jansen, Ribchester, 1982), однако строгий контроль отсут-
ствия опосредования ответов через афференты в этой работе не проводился. В нашей работе такое опосредование было исключено тем, что все дорсальные корешки, адресующиеся в седалищный нерв, с которого вызы------вались антидромные ответы, были перерезаны. В этих условиях нам удалось выявить коротколатентные деполяризационные^ответы на антидромное---------
раздражение моторных аксонов в 15 из 81 тестированных мотонейронов 9-18-дневных эмбрионов. Эти ответы возникали в мотонейронах практически без задержки относительно антидромных потенциалов действия, градуировались по амплитуде изменениями силы раздражения нерва и несомненно представляли собой трансмембранные потенциалы, о чем свидетельствовало их исчезновение после выведения микроэлектрода из клетки.
Важно отметить, что указаний на какое-либо преобладание электрически опосредованных взаимодействий между мотонейронами эмбриона на исследованных нами стадиях в наших опытах получено не было. Можно полагать, что электрические связи между эмбриональными мотонейронами, так же как и между зрелыми мотонейровами, осуществляются предположительно в дендритных областях, что может объяснить низкую (редко превышающую 1 мВ) амплитуду соответствующих ответов.
Сенсо-мотонейронные связи. Роль афферентных процессов в формировании функций развивающегося мозга и осуществлении ранних рефлекторных актов привлекала в течение длительного времени и продолжает привлекать внимание (Богданов, Геворгян, 1984; Бурсяан, 1983; Войно-Ясенец-кий, 1974, 1982; Волохов, 1951, 1968; Максимова, Шулейкина, 1987; Шулейхина, 1979, 1985; Crain, 1976; Gaze, 1970; Hamburger, 1973, и др). В данном разделе дисертации основное внимание уделено выяснению сроков и закономерностей установления сенсо-мотонейронных связей в спинном мозге, а также природе синаптических процессов в соответствующих синапсах па ранних этапах их формирования.
Развитие рефлекторных механизмов в раннем онтогенезе изучалось вплоть до сравнительно недавнего времени преимущественно с помощью поведенческих тестов, основанных на стимуляции главным образом кожных афферентов и визуальной оценке вызываемых при этом ответов, а также морфологически с помощью метода импрегнации серебром. Эти исследования, проведенные на представителях различных классов позвоночных от рыб до млекопитающих, позволили выявить ряд важных закономерностей созревания рефлекторных процессов (см. Бурсиан, 1982, 1983; Войно-Ясенецкий, 1974, 1982; Волохов, 1951; Hamburger, 1973, и др.). В плане датирования прямых сенсо-моторных связей, рассматриваемых в данном разделе, имеющиеся в отношении куриного эмбриона данные значительно расходятся, от 7-го дня (Cajal, 1919) до 9-11-го дня (Visintini, Le-
vi-Montalcini, 1939; Foelix, Oppenheim, 1973). Четких данных об установлении прямых контактов первичных афферентов с мотонейронами в этих исследованиях, к сожалению представлено не было. Такие данные были получены лишь в последние годы благодаря использованию метода маркирования первичных афферентов и мотонейронов пероксидазой хрена (Полякова, Велумян, 1990, 1991; Davis, Frank, Johnson, Scott, 1989; Lee, Коebbe, O'Donovan, 1988) и регистрации ответов мотонейронов на раздражение дорсальнокорешковых афферентов (Велумян, 1987а,б; Lee, Koeb-be, O'Donovan, 1988).
В нашей работе (Полякова, Велумян, 1990, 1991; Polyakova, Velumi-an, 1991) исследовались сегменты как пояснично-крестцового, так н плечевого утолщения, иннервирующие соответственно дистальные части ноги и крыла. Благодаря этому имелась возможность сравнения сроков и особенностей формирования центральных проекций сегментарных афферентов на разных уровнях спинного мозга, что важно для уточнения вопроса о ростро-каудальном градиенте в развитии спинного мозга (Foelix, Oppenheim, 1973; Hamburger, 1948; Hughes, 1968; Jacobson, 1970).
Каких-либо существенных различий в характере прорастания афферентов и сроках перекрывания их с дорсальными дендритами мотоиейронов между этими-двумя отделами нет. В обоих отделах первичные афференты достигают спинного мозга до 6.5-го дня развития и формируют к этому времени длинные коллатерали, направляющиеся рострально и каудально в составе дорсальных канатиков белого вещества. Эти результаты свидетельствуют о том, что представление о ростро-каудальном градиенте в развитии спинного мозга применимо не ко всем спинальным системам, в частности, к сенсо-мотонейронным связям в отделах, иннервирующих конечности. В своем сегменте коллатерали, заходящие в серое вещество, обнаруживаются в обоих отделах лишь на 7рй день, и достигают дорсальных дендритов на 7.5-й день. Интересно отметить, что менее чем за одни сутки в этот период афферентные волокна прорастают в спинной мозг на значительные расстояния, от ста до трехсот микрон.
Выяснение особенностей сенсо-мотонейронных связей в сегментах, иннервирующих крылья, так же как и других особенностей организации мех-нейронных связей в этом отделе, представляет особый интерес ввиду стереотипно синхронного характера движений крыльев, позволяющего предполагать наличие контралатеральных связей, отличных от связей в сегментах, иннервирующих ноги, однако данная проблема в отношении как птиц вообще, так и других видов с билатерально синхронными типами движений конечностей одного пояса, ранее не ставилась (Полякова, Велумян, 1990, 1991; Polyakova, Velumian, 1991). Ни в пояснично-крест-цовом, ни в брахиальном отделе не было выявлено не только присутст-
вия, но даже признаков начала формирования контралатеральных проекций первичных афферентов в исследованный нами период развития. Эти данные не исключают возможного появления контралатеральных проекций
плечевом утолщении-спинного-мозга птиц-в-ходе - дальнейшего разви-____________
тия, но, могут, по-видимому, рассматриваться как свидетельство того, что по крайней мере на начальных стадиях развития отсутствует какая-либо специализация не только крыльев и ног, но и спинальных систем управления этими конечностями.
Хотя электрофизиодогический подход позволяет существенно уточнить особенности сенсо-моторвых взаимодействий, идентификация моно- и по-лисинаптической природы ответов мотокейронов в эмбриональном спинном мозге иредставляет значительно более сложную проблему по сравнению со зрелым спинным мозгом, а котором можно пренебречь временем проведения импульсов по интраспинальнын участкам афферентных волокон, поскольку скорости проведения импульсов в эмбриональных аксонах на стадиях формирования рефлекторной дуги настолько малы, что могут вносить значительные осложнения в оценки количества интраспинальных переключений афферентных сигналов. По нашим оценкам, основанным на двух способах - вычитании времени проведения афферентных импульсов даже по наиболее быстрым афферентным аксонам от места раздражения нерва до места входа дорсального корешка в спинной мозг из латентного периода ответов мо-тонепронов либо непосредственном определении латентности ответов при раздражении поверхности спинного мозга у места входа дорсального корешка, центральная задержка наиболее быстрого компонента ответов у куриного эмбриона была равна 4.75±1.87 мс (п=20) на 10-й день развития и 3.87+1.11 мс (п=27) на 15-й день развития (Велумян, 1987), что существенно ниже, чем в зрелом спинном мозге, где она составляет менее 1 мс (Eccles, 1957, 1964; Burke, Ruáomin, 1977).
На 10-й день развития на раздражение дорсального корешка реагировало лишь 20 из 59, или 34 % тестированных мотопейронов, тогда как у 15-дневных эмбрионов доля таких клеток превышала 90 %. Другим важным отличием ответов, регистрируемых на 15-й день развития, было то, что опн имели величину, достаточную для инициации в мотонейропе ортодром-ного потенциала действия, чего не наблюдалось ни в одном из тестированных нами мотонейронов 10-дневных эмбрионов. Эти данные позволяют объяснить некоторые трудности выявления рефлекторных реакций в поведенческих исследованиях эмбрионов и имеющиеся в литературе противоречия относительно их датировки.
В наших опытах впервые удалось четко показать, что раппий (предположительно моносипаптический) компонент ответов мотонейронов иа раздражение сегментарных афферентов имеет чисто возбуждающую природу и не
содержит тормозных компонентов. Хотя ранее этот вопрос не поднимался, возможность изменения модальности синапсов в раннем онтогенезе от тормозной к возбуждающей или наоборот полностью исключить в настоящее время нельзя. Нами было проведено сравнение вызываемых раздражением сегментарных афферентов ВПСП с ТПСП, вызываемыми в тех же клетках из других источников. Ввиду того, что тормозные постсиваптические ответы в эмбриональных мотонейронах весьма чувствительны к введению микроэлектрода и наиболее типично извращаются из гиперполяризационных в деполяризационные в течение даже нескольких секунд после введения микроэлектрода, сравнение ответов на раздражение сегментарных афферентов с ТПСП, вызываемыми раздражением вентрального корешка или вентрального столба белого вещества позволило однозначно исключить возможность примеси ТПСП в деполяризационных ответах на раздражение афферентов. Амплитуда переменное течение вызываемыхраздражением афферентов коротколатентных ВПСП практически не изменялась в ходе извращения ТПСП из гиперполяризационных в деполяризационные.
В моносинаптических ответах мотонейронов на раздражение первичных афферентов может присутствовать, наряду с химическим, также и электрически опосредованный компонент, который был впервые обнаружен нами в мотонейрояах лягушки (Велумян, Шаповалов, 1975; Shapovalov, Shiria-ev, Velumian, 1978; Велумян, 1979). В последующем было показано (Frank, Westerfield, 1983; Шупляков, 1986), что передача в сенсо-мо-тонейронных синапсах амфибий осуществляется, начиная с наиболее ранних стадий их формирования, так же как и в зрелом спинном мозге этих животных, смешанным (электрическим и химическим) способом. В противоположность амфибиям, у млекопитающих (новорожденные крысы: Fulton, Miledi, Takahashi, 1980; крысята 9-17-дневного возраста: Тамарова, Шаповалов, Ширяев, 1978; котята 3-17-дневного возраста: Shapovalov, Shiriaev, Tamarova, 1979; котята 5-22-дневного возраста: Радичева, Тамарова, Шаповалов, Ширяев, 1980) и птиц (Велумян, 1987а,б; Lee, Ко-ebbe-, О'Donovan, 1988) выявить электрический компонент в моносинаптических ответах мотонейронов на раздражение первичных афферентов в раннем онтогенезе до настоящего времени не удалось.
Ввиду того, что химическая передача в сенсо-мотонейронных синапсах куриного эмбриона блокируется глутаматными антагонистами (Lee, Koeb-be, O'Dono-van, 1988), нами была иследована чувствительность мотонейронов к глутамату. С помощью внутриклеточной регистрации потенциалов и микроионофоретической или тотальной аппликации глутамата начиная с 11-го дня развития, и с помощью анализа изменений фокально регистрируемого антидромного потенциала действия мотонейронов при действии глутамата начиная с 6.5-го дня развития (Велумян, Полякова, 1986; Be-
лумян, Полякова, 1990) было показано, что постсинаптическая мембрана
-------мотонейронов чувствительна к глутамату уже на наиболее ранних этапах
замыкания моносинаптической рефлекторной дуги.
ТОРМОЗНЫЕ ПРОЦЕССЫ НА РАННИХ СТАДИЯХ ОНТОГЕНЕТИЧЕСКОГО
РАЗВИТИЯ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ
Вопрос о сроках возникновения и роли торможения в развивающейся нервной системе является одним из наиболее слабо разработанных ввиду отсутствия в течение длительного времени четких представлений о природе и специфике тормозных процессов и по причине значительных трудностей, связанных с их идентификацией в незрелой нервной системе. В диссертации рассматриваются различные аспекты проблемы торможения в раннем онтогенезе, разработка которых важпа как в плаве задач функционального нейроонтогенеза, так и в плане проблем общей нейрофизиологии и закономерностей эволюции функций нервной системы.
Существуют ли особенности тормозных процессов в незрелых яейронах?
Возможность создания искусственного дисбаланса трансмембравого распределения ионов в незрелых нейронах в результате введения микроэлектрода и вследствие этого нарушения нормального соотношения между возбуждающими и тормозными постсинаптическими процессами требует особой осторожности в анализе постспнаптического торможения в раннем онтогенезе. В диссертации подробно проанализированы имеющиеся в литературе противоречия и показано, что в значительной мере они могут быть обусловлены некорректной регистрацией тормозных процессов.
Собственный экспериментальный материал и данные иследований других авторов за последнее десятилетие показывают, что основные электрофизиологические свойства тормозных постсинаптических потенциалов (ТПСП) в эмбриональных нейронах принципиально не отличаются от свойств ТПСП в зрелых нейронах в том отношении, что они имеют близкие к потенциалу покоя мембраны потенциалы реверсии и так же высокочувствительны к изменениям трансмембранного распределения ионов хлора. Так же как и в зрелых нейронах, при генерации ТПСП в эмбриональных нейронах, помимо изменений потенциала мембраны, которые могут быть как гиперполяриза-ционяыми, так и деполяризациовными или "электронейтральными", имеет место уменьшение входного сопротивления постсинаптической мембрааы и стабилизация потенциала мембраны, препятствующая возбуждению нейронов .
Когда возникает торможение в онтогенезе? Исторически сложилось так, что процессы торможения в раннем онтогенезе были как бы оттеснены на второй план из поля зрения исследователей по причине того, что внешние проявления тех или иных процессов возбуждения были на-
столько яркими, что не давали прямых оснований предполагать наличие торможения, тем более что оно, в отличие от возбуждения, не имеет столь ярких внешних проявлений.
В диссертации рассмотрены различные непрямые данные о торможении в раннем онтогенезе и показано, что существенным недостатком исследований с оценками тормохения по эффектам аговистов илй антагонистов тормозных медиаторов на поведенческие или суммарные электройзиологи-ческие показатели является то, что они выявляют лишь г с процессы, которые связаны с возникновением импульсных разрядов в нейронах, в то время как значительная часть эффектов мохет оказаться подпороговой для мотонейронов и не выявляться при таких подходах. Применяющиеся во многих нследованиях "количественные" оценки уровня спонтанной двигательной активности в виде количества двихений за определенный интервал времени, обычно от 5 до 15 минут имеют тот недостаток, что отсутствует четкая идентификация единичного события (двихение части конечности или всей конечности, иные двихения эмбриона с сопутствующими смещениями конечности, отдельное двихение или комплекс двихеиий и т.д.), что вносит значительный субъективизм в эти исследования и по-рохдает противоречня^литературе.
В наших опытах с помощью внутриклеточной регистрации потенциалов мотонейронов были изучены эффекты стрихнина в спинном мозге куриного эмбриона (Уе1ит1ап, 1984), что позволило оценить не только пороговые эффекты в мо-тонейронах, но и лехащие в их основе подпороговые процессы. Показано, что стрихнин (2.5 х 10~5М) вызывает в мотонейровах дахе наиболее младших из исследованных эмбрионов, 11-дневных, появление пароксизмальных вспышек высокоамплитудных деполяризаций, на вершине которых могут возникать ймпульсные разряды. Однако по сравнению с эффектами бесхлорной среды эффекты стрихнина были выражены значительно слабее, что указывает на участие не только глицинергических, но и других тормозных синапсов с хлорным постсинаптическим механизмом в ограничении распространения залповой активности от ее источника в ннтернейронных цепях к мотонейронам. Важно такхе отметить, что хотя спонтанные деполяризации в мотонейронах при действии стрихнина имели достаточно большую амплитуду и длительность они приводили к появлению лишь редких разрядов в мотонейронах, что, по-видимому, мохет объяснить невыявление эффектов стрихнина некоторыми авторами в опытах с поведенческой оценкой его действия.
Поскольку регистрируемые внутриклеточно тормозные постсинаптичес-кие потенциалы (ТПСП) в эмбриональных нейронах могут быть не только гиперполяризационными, но и деполяризационными или "электронейтральными", требуется особая осторохность в трактовке экспериментальных
данных, что, к.сожалению, в онтогенетической литературе делается далеко не всегда. Поэтому большинство из имеющихся в литературе сведений о наличия или-отсутствии_ТПСП а раннем онтогенезе не могут считаться исчерпывающими, и сроки возникновения постсинаптичесжого торможения в этих случаях могут быть сдвинуты в более раннюю сторону дальнейшими более тщательными исследованиями.
Представленные в днссертациксобственные и литературные данные показывают, что постсинаптическое торможение формируется, по крайней мере в спинном мозге и в некоторых структурах головного мозга, включая кору, задолго до рождения, на довольно ранних стадиях становления нейронной организации ЦНС. Вопрос о пресинаптическом торможении рассмотрен в диссертации исключительно по данным литературы, анализ которых показывает, что и этот вид торможения возникает задолго до рождения.
Эффекты гамма-аминомасляиой кислоты (ГАМК) и глнцииа на постсинап-тическую мембрану незрелых нейронов. Прямые сведения о характере действия этих веществ, являющихся наиболее вероятными медиаторами торможения, на постсинаптическую мембрану незрелых нейронов крайне ограничены (Баев, Русин, Софронов, 1986; Русин, 1987; Bayev, Rusin, Sofro-nov, 1990; Clarke et al., 1984). В вашей работе с помощью аппликации веществ тотально через систему перфузии или микроионофоретвческя (Ве-лумян, Полякова, 1984) удалось показать чувствительность эмбриональных мотонейронов к ГАМК и глицину начиная с 6.5-го дня развития. К сожалению, ввиду сложностей работы с эмбриональными нейронами на ранних стадиях, рассмотренных выше, нам не удалось получить удовлетворительных внутриклеточных записей от мотонейронов до 10-го дня развития, которые могли бы внести ясность в механизмы действия ГАМК и глицина на мотонейроны на этих стадиях. В отношении более поздних стадий проведенные нами опыты с внутриклеточной регистрацией эффектов микроаппликации ГАМК и глицина показали принципиальное сходство этих эффектов с известными в отношении зрелых нейронов. Так же как и в случае с ТПСП, знак и величина ответов на аппликацию ГАМК и глицина зависели от качества регистрации и были преимущественно гиперполярнза-циоиными в первые минуты после введения регистрирующего микроэлектрода в клетку, а по мере улучшения состояния клетки и повышения мембранного потенциала величина гиперполяризации постепенно уменьшалась и в некоторых клетках ответы могли практически "исчезнуть", но выявлялись при смещениях потенциала мембраны током, пропускаемым через внутриклеточный микроэлектрод или с помощью тестов на изменения проводимости мембраны.
Как и в зрелых мотонейронах (см. Велумян, 1977, 1979), ответы на
ГАМК и глицин в эмбриональных мотонейронах были значительно более чувствительны к трансмембранной поляризации по сравнению с ответами на глутамат, и легко извращались при пропускании через мембрану небольших токов. Аппликация ГАМК и глицина могла вызывать в эмбриональных мотонейронах как гиперполяризационные, так и деполяризаций иные ответы, причем в отличие от неизменно деполяризующих ответов на глутамат, не сопровождавшихся значительными изменениями проводимости мембраны, эти ответы, независимо от того, были они деполяризационными или гиперполяризационными, были связаны, как правило, с резким уменьшением входного сопротивления мембраны. Импульсные разряды, возникающие в мотонейроне при пропускании через мембрану деполяризующих токов, прекращались во время действия ГАМК и глицина, но не глутамата, что подтверждает тормозный характер действия этих аминокислот.
Формирование тормозных путей спинного мозга в раннем онтогенезе. Выше было отмечено раннее формирование возвратного тормозного пути к мотонейронам в спинном мозге теплокровных. В диссертации рассмотрены данные литературы о реципрокном торможении и делается заключение, что раннее возникновение реципрокных отношений в спинном мозге куриного эмбриона вполне вероятно ввиду показанной возможности генерации в мотонейронах 11-дневных эмбрионов, наряду с моносинаэтическими ВПСП, также и более длиннолатентных ТПСП при раздражении дорсальных корешков (Велумян, 1987).
Исходя из представлений о переходе в ходе развития от диффузного к координированному типу нервной системы, особо рассмотрены факты о роли торможения в ограничении распространения возбуждения в незрелой нервной системе.
Вопрос о нисходящем торможении на ранних стадиях развития представляет особый интерес с позиций представлений Л.А.Орбели о закономерностях установления иннервационных отношений. Согласно этим представлениям, отношения иннервирующей системы с ее мишенью проходят три основных этапа, которые можно вкратце суммировать следующим образом. На первом этапе, до установления иннервации, презумптивная мишень функционирует в собственном, автоматическом режиме. На втором этапе, когда начинается установление контактов иннервирующий системы с мишенью, происходит подавление эндогенной активности мишени благодаря тормозящим влияниям со стороны иннервирующей структуры, и лишь на третьем этапе функция иннервирующей системы становится пусковой. Хотя аргументация в пользу такой закономерности приводится в основном из области нервно-мышечных отношений, можно полагать, что те же закономерности претерпевают и отношения супраспинальных структур с сегментарным аппаратом (Войно-Ясенецкий, 1974, 1982; Бурсиан, 1983), однако
конкретных фактов в пользу второго, тормозного этапа в развития отношений головного и спинного мозга, до недавнего времени не представля-------лось__________
Некоторый интерес в этом плане могут представлять^полученные нами данные (Велумян, 1987; Velumian, 1984) о преимущественно тормозном-характере нисходящих влияний на поясничные мотонейроны куриного эмбриона в период с 10-го по 16-й день развития, опосредуемых через ип-силатеральные вентральные и латеральные канатики белого вещества. Раздражение этих канатиков на любом уровне от каудальных грудных до верхних шейных сегментов вызывало в поясничных мотонейронах ТПСП, которым лишь в редких случаях предшествовали ВПСП. Обдаруженые нами нисходящие тормозные влияния с вентральных и латеральных канатиков белого вещества на поясничные мотодейроны у куриного эмбриона отличаются от соответствующих влияний в зрелом спинном мозге в том отношении, что в последнем они содержат выраженный возбуждающий компонент (Шаповалов, 1975; Костюк, 1972). Эти данные о тормозном характере нисходящих влияний на сегментарный аппарат в раннем онтогенезе хорошо укладываются в общую схему развития инвервационных отношений, сформулированную Л.А.Орбели, и могут рассматриваться как подтверждение существовавания второго, тормозного этапа в развитии иннерваци-оняых отношений не только на периферии, но в цевтральвой верввой системе .
Растормаживающие эффекты антагонистов тормозных медиаторов а бесхлорной среды, проявлявшиеся в наших опытах в появлении пароксизмаль-пых вспышек активности в спинном мозге 11-дневных эмбрионов, и данные литературы дают основания полагать, что тормозные системы, включенные в интернейронные цепи центральной нервной системы и ограничивающие диффузное распространение в ней процессов возбуждения, также начинают функционировать на довольно ранних стадиях развития.
Роль тормозных синаптических процессов и раннем онтогенезе. В диссертации проанализированы различные оценки роли торможения в раннем антогепезе, исходящие как из общих представлений о роли торможевия как фактора координации нервных процессов (Орбели, 1923, 1955; Jasper, 1960; Sherrington, 1906) , так и несомненно важных для понимания закономерностей если не развития, то по крайней мере функционирования нервной системы на ранних стадиях развития представлений о торможевни как "факторе активного ограничения" спонтанной двигательной активности (Crain, 1976) или факторе, ограничивающем диффузные свойства нервной системы (Орбели, 1923, 1955).
Роль торможения в становлении центральных координации. Раннее формирование отдельных тормозных путей в сплином мозге плодов и эмбрио-
bob дает основания полагать, что координирующие функции торможения также начинают проявляться в онтогенезе очень рано. Важно также иметь в виду, что организм, даже эмбриона, является целостной системой, кажущееся несовершенство которой, как об этом свидетельствует последовательное опровержение различных представлений о "незрелости" по мере совершенствования экспериментальных подходов, лишь отра,жает несовершенство наших о нем представлений. Это, возможно, относится и к представлениям о координации, которые у эмбриона могут быть иными, диктуемыми условиями его существования.
Роль торможения в активном ограничении процессов возбуждения в незрелой нервной системе и функциональные последствия нарушения этого ограничения в незрелой и зрелой нервной системе. Диффузные свойства считаются присущими нервной системе не только на ранних этапах онтогенетического н филогенетического развития (см. Карамян, 1972), но, по-видимому, сохраняются также и в зрелом состоянии даже у наиболее высокоорганизованных животных, включая млекопитающих и человека (Ор-беди, 1923, 1955), хотя в нормальных условиях они не проявляются благодаря выработавшимся в процессе эволюции тормозным процессам.
В отношении возможной роли синаптического торможения в ограничении диффузного распространения процессов возбуждения в ЦНС приведенные в диссертации собственные и литературные данные о появлении пароксиз-мальных деполяризаций в нейронах при блокировании иди извращении тормозных постсииаптических процессов могут оказаться полезными не только для понимания механизмов управления диффузными свойствами нервной системы, но н для объяснения нейронных механизмов широко распространенного в раннем онтогенезе явления - "спонтанной" нейрогенной двигательной активности, а также некоторых изменений свойств ЦНС при таких клинических нарушениях, как эпилепсия.
Важно подчеркнуть, что имеется значительное внешнее сходство между различными описаниями пространственно-временой картины "спонтанных" вспышек возбуждения в незрелой ЦНС (Богданов, Геворгян, 1984? Бурси-ан, 1983; Войно-Ясенецкий, 1974; Mares, Rokyta, Trojan, 1983; Provine, 1973; Provine, Rogers, 1977) с эпилептиформной активностью в зрелой ЦНС (Schwartzkroin, Prince, 1978; Traub, Wong, 1982; Matsumoto, Ajnone Marsan, 1964; Gutnick, Connors, Prince, 1982). Сходство эндогенных вспышек нейронной активности в незрелой нервной системе и при эпилепсии в зрелой нервной системе, а также в изолированных структурах ЦНС при различных растормаживающих воздействиях позволяет проводить некоторые аналогии, которые могут оказаться полезными для понимания генеза этих процессов.
В плане обсуждения роли торможения в ограничении диффузных свойств
нервной системы можно отметить, что-в то время как для возникновения эпилептиформных процессов в зрелой нервнойсистеме необходимы, так или иначе, нарушения нормального баланса между процессами возбуждения и торможения в пользу возбуждения, в незрелой нервной системеэтот баланс, по-видимому, уже в норме несколько смещен в ту же сторону. Тот факт, что даже в незрелой нервной системе, как показано в диссертации, возможно усиление этого дисбаланса с помощь» различных воздействий на тормозные синапсы, позволяет заключить, что и в раннем онтогенезе имеет место ограничение, хотя и не в столь полной мере, как в зрелом состоянии, диффузных свойств нервной системы благодаря тормозным сииаптическим процессам. Причина такого дисбаланса может крыться не только в "слабости" процессов торможения, но и в большей эффективности возбуждающих синаптических воздействий, что подтверждается некоторыми фактами о большей по сравнению со зрелыми нейронами амплитуде ВПСП на ранних стадиях развития (Naka, 1964; Шулейкина, 1979, 1983? Максимова, 1979). Нельзя также исключить и роль такого фактора как возрастные различи* в организации возбуждающих и тормозных связей в иптернейронных цепях ЦНС.
Роль торможения в подчинении режимов функциональной активности ин-вервируемых систем режимам управляющих систем. Вопрос о второй, тормозной фазе в постулированной Л.А.Орбели схеме развития иннервацион-ных отношений является наименее разработанным. В отношении природы тормозной фазы в установлении внутрицентральных отношений, хотя она, несомненно, присутствует (Войно-Ясенецкий, 1974; 1982), данных до настоящего времени, так же как и в отношении тормозной фазы в нервно-мышечном соединении, получено не было. Хотя можно допустить определенное сходство этих механизмов в центре и на периферии, в отношении ЦНС, где на индивидуальных нейронах имеются многочисленные синап-тическяе контакты, образованные локализованными па разных уровнях нейронами, вероятность какой-то исключительной по сравнению с другими нейронами трофической функции у какой-то одной группы нейронов, по-видимому, не очень велика. На основании полученных нами данных о тормозном характере нисходящих влияний на поясничные мотонейроны куриного эмбриона представляется весьма заманчивым предположение о том, что угнетение эндогенной активности сегментарного аппарата надсегмен-тарными структура;-® может осуществляться в ходе установления соответствующих иннервациопных отношений, в отличие от сходных процессов на периферии, с участием синаптического торможения.
МИЕЛИНИЗАЦИЯ АКСОНОВ, ДИФФЕРЕНЦВРОВКА НАЧАЛЬНОГО СЕГМЕНТА АКСОНА И ИЗМЕНЕНИЯ ШШГРАТВВНЫХ СВОЙСТВ НЕЙРОНА: НОВЫЙ ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АСПЕКТ МБШШНИЗАЦИИ
Согласно современным представлениям, основывающимся на результатах исследований, проведенных на нейронах с миелинизированным аксоном (Со-отЬэ, Ecc3.es, 1955 а,Ь; ЕссХеэ, 1957, 1964), местом инициа-
ции импульса в нейроне является начальный сегмент аксона, откуда возникший при деполяризационных воздействиях на сомадендритную мембрану клетки потенциал действия распространяется как вдоль аксона, так и обратно на тело клетки. В отношении нейронов с немиелинизированным аксоном применение этих представлений осложняется тем, что ввиду отсутствия у них структурно обособленного начального-сегмента границы аксонной зоны инициации импульса становятся неопределенными. Такая ситуация имеет место в большинстве нейронов беспозвоночных, в зрелых нейронах позвоночных на ранних этапах фил о- и онтогенетического развития, в определены* типах зрелых нейронов высших позвоночных в норме, а также, возможно, при демиелинизирующих заболеваниях. Вопрос о возможной роли миеливизации в формировании аксонной зоны инициации импульса до настоящего времени не поднимался, и целенаправленных работ по этому вопросу в литературе нет.
Потенциал действия, регистрируемый введенным в тело нервной клетки микроэлектродом, можно разложить на три пространственных компонента, соответствующим возбуждению сомадендритной мембраны клетки, лишенного миелиновой оболочки начального сегмента аксона и более дистальной миелинизированвой части аксона (СД, НС и М компоненты по классификации Экклса). Ввиду отсутствия у аксонов до определенной стадии развития миелиновой оболочки и, соответственно, структурно обособленного начального сегмента, представляет особый интерес выяснение компонентного состава потенциалов действия незрелых нейронов на домиелиновых стадиях развития.
В диссертации на основе анализа существующих представлений о механизмах возникновения и распространения потенциалов действия в аксонах и обусловленного кабельными свойствами мембраны электротонического распространения сдвигов потенциала, позволяющего воздействовать на аксонные зоны инициации импульса пропускаемым через внутрисо-матический микроэлектрод током, показано что выяснение наличия или отсутствия в начальном участке аксона дискретных зон активного распространения потенциала действия требует графического анализа характера экспериментальных данных о зависимости амплитуды аксонных компонентов антидромного потенциала действия от гиперполяризацин соматической мембраны. Такой анализ был применен нами для изучения топо-
графических особенностей аксонных компонентов антидромных потенциалов действия эмбриональных мотонейронов до и после-начала миелинизации.
Электрофизиологические свойства аксонах компонентов'антидромного
потенциала действия в эмбриональных мотовейронах до и после начала------
миелинизации. Материал данного раздела диссертации основан на анализе компонентов антидромного потенциала действия в 59 мотонейронах 11-18-дпевных эмбрионов, отобранных из 145 клеток 9-18-дневных эмбрионов, в которых антидромные потенциалы регистрировались внутрихлеточно, на основе оценки качества регистрации, рассмотренного выше в разделе, посвященном электровозбудимости.
В нашем исследовании удалось выделить два типа мотонейропов по изменениям, вызываемым в аксонных компонентах их антидромных потенциалов действия гиперполяризующими токами, инъецируемыми через внут-рисоматический электрод. Первый тип мотонейронов обнаруживал, после скачкообразного исчезновения СД компонента при определенной силе ги-перполяризующего тока (обычно порядка 0.1-0.3 нА), лишь градуальное уменьшение амплитуды и замедление временного течения остающегося ак-сонного компонента. Такой характер изменений аксонных компонентов может быть объяснен постепенным отодвиганием, от тела клетки под влиянием гиперполяризующего тока переднего края области активного распространения антидромного импульса по аксону. Для этого типа нейронов было характерно наличие лишь одного ахсонного компонента антидромного потенциала действия, который можно было, так же как и в зрелых симпатических С-нейронах (Nishi et al.,1965; Yoshimura etal., 1986), градуально отодвигать от сомы клетки постепенно увеличивающимися гиперпо-ляризующими токами, Что, в свою очередь, свидетельствовало об отсутствии миелинизации или иных значительных неоднородностей в начальной части аксона. Такие клетки преобладали у младших эмбрионов и ни разу не наблюдались после 14-го дня развития.
В некоторых мотояейропах 11- и 12-дневных эмбрионов и во всех исследованных мотонейронах более старших эмбрионов потенциалы действия можно было четко разделить с помощью гиперполярязующих токов, пропускаемых через внутрисоматический микроэлектрод, на три основных компонента, характерных для зрелых мотонейронов. Как сомадендритный, так и аксонный компоненты, которые можно было четко различить по перегибу на восходящей фазе потенциала действия, при действии небольших гипер-поляризукяцих токов линейно увеличивались в этих клетках по амплитуде с увеличением силы тока вплоть до скачкообразного исчезновения при определенном уровне гиперполяризации. Аксонный компонент потенциала действия в этих нейронах обнаруживал, таким образом, свойства пространственной дискретности и мог быть разделен с помощью гяперполяри-
зующих токов на НС и М компоненты.
Важно отметить, что внешне потенциалы действия в нейронах обоих типов практически не различались, и различия между ними в плане ак-содаых компонентов выявлялись лишь с помощью описанного выше топографического анализа.
Гипотеза о роли мислинизации и структуры начального участка аксона в определении типа интегративной деятельности нейрона. Представленные в данном разделе диссертации результаты позволяют сформулировать гипотезу о различиях типов интегративной деятельности в зависимости от наличия или отсутствия у аксона миелиновой оболочки. В основе гипотезы лежат следующие положения:
1. Областью инициации импульса в ответ на деполяризующие влчяния на сомадендритную мембрану клетки в нейронах, независимо от наличия или отсутствия у их аксонов миелиновой оболочки, является проксимальная к соме часть аксона, порог возбуждения которой ниже порога возбуждения сомадендритной мембраны (Есс1еБ,1957, 1964).
2. В нейронах с миелинизироваввым аксоном аксоввая область инициации импульса пространственно ограничена и локализована в начальном сегменте аксона, дистальвой границей которого является начало миелиновой оболочки (Есс1еБ, 1957, 1964). В вейронах с немиеливизированным аксоном, как показывают исследования иа зрелых симпатических С-нейро-вах (ШаМ et а1., 1965; Уоз11;ишга еЪ а1., 1986) и приведенные в диссертации данные об эмбриональных мотовейровах ва домиеливовых стадиях развития, такой четкой дистальвой границы аксонная зона инвциации импульса ве имеет.
3. Гиперполяризационные смещения потенциала сомадендритной мембраны ве влияют ва локализацию аксонной зовы инициации импульса в нейронах с миелинизированным аксоном, а в нейронах с немиелинизированвым аксоном эта зона, как показывает анализ аксонного компонента потенциала действия, при таких смещениях удаляется от тела клетки.
4. В нейронах с немиеливизированным аксоном благодаря удалению аксонной зоны инициации импульса от тела клетки при гиперполяризационных смещениях потенциала сомадендритной мембраны, эта зова становится менее доступной для токов, генерируемых в сомадендритной мембране при ее синаптической активации, что должно выражаться в зависимом от степени этого удаления повышении порога возбуждения клетки. Таким образом, в противоположность нейронам с миелинизированным аксоном, в этих вейронах имеется дополнительный пространственный фактор детерминации порога возбуждения.
5. В естественных условиях гиперполяризация, способная вызывать смещения аксонвой зовы инициации импульса, может создаваться разными
способами: постсинаптическим торможением,-действием некоторых гуморальных факторов, а также следовыми процессами от предшествующей импульсной активности клетки, которые особенно выражены после серий импульсов.
Выдвигаемая гипотеза о зависимости типа интегративной деятельности нейрона от наличия или отсутствия у его аксона миелиновой оболочки и, соответственно, наличия или отсутствия дискретной зоны инициации импульса в аксоне, формулируется следующим образом:
Аксонная зона инициации импульса в нейронах с мнелинизированым и немиелинизированным аксоном имеет функционально значимые топографические различия. В то время как в нейронах с миелинизироваиным аксоном 5та зона строго локализована и ограничена начальным сегментом аксона, в нейронах с немиелинизированным аксоном она не имеет четких границ и может функционально-зависимо смещаться вдоль аксона, становясь более или менее доступной действию генерируемых в сомадендритной мембране токоп. Благодаря этим различиям можно ожидать, что нейроны с немиелинизированным аксоном будут иметь значительно более широко варьируемый порог возбуждения по сравнению с нейронами, имеющими мие-линизированный аксон. Поскольку изменения порога возбуждения нейрона имеют отношение к регуляции возникновения импульса в результате интеграции различных влияний, указанные различия аксонных зон инициации импульса в этих двух типах нейронов могут играть существенную роль ж в детерминации типа интегративной деятельности нейрона. Так, следует ожидать более жестких характеристик "вход-выход" в нейронах с миели-низировашшм аксоном по сравнению с нейронами, аксоны которых лишены миелиновой оболочки.
В диссертации намечены несколько направлений, в которых разработка выдвигаемой гипотезы может привести к уточнению и, возможно, некоторому пересмотру существующих представлений - в нейроонтогенезе, филогенезе, в нормальной физиологии различных структур ЦНС в зависимости от миелинизации их клеточных элементов, и в клинике демиелинизирующих заболеваний. Наиболее важным в клиническом аспекте представляется выяснение проксямо-дкстальной последовательности процесса демиелиниза-ции в индивидуальных аксонах, поскольку в случае опережающей демиели-низации в начальном участке аксона следует ожидать, с позиций предлагаемой гипотезы, ранних изменений типа интегративной деятельности нейронных структур, что мояет дать основания для разработки соответствующих функциональных тестов для ранней диагностики этих заболеваний. К сожалению, ввиду отсутствия до пастоящего времени постановки задачи в таком аспекте ни клинических, ни экспериментальных данных в этом плане в доступной нам литературе обнаружить не удалось.
ВЫВОДЫ
1. Развивающиеся вейроиы достигают близких к зрелым величин потенциалов покоя и потенциалов действия ухе на довольно ранних стадиях пренатального развития. В период с 11-го по 18-й день инкубации куриного эмбриона величины потенциалов покоя и основные электрофизиологи-чесю^характеристики потенциалов действия (амплитуда, Время нарастания, наличие перегиба на восходящей фазе, указывающее на переход воз-бухдения с аксовной зоны инициации импульса на сомадендритную мембрану и уровень этого перегиба, характер спада потенциала действия) практически не отличаются от соответствующих характеристик в зрелых мотонейровах.
2. Аксоны развивающихся нейронов способны к проведению нервных импульсов ухе на наиболее ранних стадиях пренатального развития, однако скорость их проведения при этом крайне низка по сравнению со зрелыми аксонами сходного диаметра. У куриного эмбриона скорость проведения импульсов в моторных аксонах закономерно изменяется в ходе развития от средних величин порядка 0.3 м/с на 6.5-й день развития до 2.3 м/с ва 18-й день развития. В указанный период развития отсутствуют признаки дифференцировки мотовейронов ва альфа и гамма типы. В то хе время в нейронах свивальных ганглиев, имеющих также крайне низкие скорости проведения импульсов в периферических отростках, ухе к 13-му дню имеется четкое разделение на две группы, соответствующие, по-видимому, А- и С-,типам в зрелых спинальвых ганглиях.
3. Уже на довольно ранних стадиях пренатального онтогенеза в спинном мозге можно обнаружить различные высокоспециализированные синап-тические связи. У куриного эмбриона уже к 10-му дню развития в спинном мозге выявляется возвратное торможение Реншоу-типа и электрические взаимодействия между мотонейронами. Данные о Реншоу-торможении являются первой демонстрацией данного механизма в спинном мозге немлекопитающих и дают основания для предположения, что в ходе эволюции этот механизм возник у общего предка птиц и млекопитающих в классе рептилий. Электрические взаимодействия между мотонейронами на исследованных стадиях развития были выражены не более, чем в зрелом спинном мозге. Рефлекторная дуга замыкается в спинном мозге куриного эмбриона на 7.5-й день развития.
4. Начиная с наиболее ранних стадий формирования прямых сенсо-мо-торных связей модальность соответствующих синапсов и природа передачи в них мало отличаются от зрелых стадий. В работе показана чисто возбуждающая, без примеси торможения, природа прямых синаптических влияний первичных афферентов на мотонейроны 10-дневных и более старших куриных эмбрионов. Не удалось получить данных в пользу наличия элек-
трически опосредованного хомпонента~в" ответах мотонейронов куриного эмбриона на раздражение первичных афферентов. Чувствительность эмбриональных мотонейронов к глутамату, являющемуся наиболее вероятньшм«-
диатором возбуждения в зрелом спинном мозге, выявляется начиная ~с~—__
б.5-го дня развития, наиболее раннего из исследованных.
5. Тормозные процессы в эмбриональном спинном мозге также присутствуют на довольно ранних стадиях развития, а основные электрофизиологические свойства тормозных постсинаптических потенциалов в мотонейронах, включая их зависимость от трансмембранного распределения ионов хлора, близость потенциала и* реверсии к потенциалу покоя и шунтирующее действие на мембрану, проявляющееся в эффективном угнетении потенциалов действия, практичекски не отличаются от соответствующих в зрелых нейронах. Постсинаптическое торможение присутствует в спинном мозге куриного эмбриона уже на 10-й день развития. Установлено существование в спинном мозге куриного эмбриона различных тормозных путей к мотонейронам: возвратного, нисходящего, а также сегментарного вовлеченного в рефлекторные полисинаптические пути. С помощью выявления растормаживающих эффектов стрихнина и бесхлорной среды показана возможность существования тормозных процессов также и в интернейронном аппарате.
6. Чувствительность постсинаптической мембраны эмбриональных мотонейронов к гамма-аминомасляной кислоте (ГАМК) и глицину, являющимся наиболее вероятными медиаторами торможения в зрелом спинном мозге, выявляется в мотонейронах куриного эмбриона начиная с 6.5-го дня развития. С помощью антагонистов данных аминокислот ппхротоксина и стрихнина показана специфичность действия этуях аминокислот уже на наиболее ранних из исследованных стадий развития.
7. В работе выявлен новый важный аспект миелинвзации, связанный с дифференцировкой начального сегмента аксона и обуславливающий качественные изменения в характере интегративной деятельности нейронов. Показаны принципиальные различия в топографии ахсонной зоны инициации импульса в эмбриональных мотонейронах до и после начала миелинизации, позволившие сформулировать гипотезу о двух типах интегративной деятельности нейронов в зависимости от наличия или отсутствия в их аксоне структурно дифференцированного начального сегмента.
ПУБЛИКАЦИИ АВТОРА ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. ВелумяпА.А., Шаповалов А.И. Неодинаковая чувствительность различных синаптических входов мотонейропов амфибий к недостатку ионов кальция и ионам магния. Доклады АН СССР, 1975, Т.225, К* 2, с.466-469.
2. Велумян А.А., Шаповалов А.И., Ширяев Б.И. Ионные механизмы дей-
ствия jf-аминомасляной кислоты и глицина на постсинаптическую мемб- j рану мотонейронов амфибий. Доклады АН СССР, 1976, Т.230, № 2, с.485- ] 488.
3. Велумян А.А. Внутриклеточный анализ эффектов микр о аппликации некоторых аминокислот на поясничные мотонейроны лягушки Rana ridibunda. Журн.эвол.биохим.физиол., 1977, Т.13, N 3, С.407-409.
4. Shapovalov A.I., Shiriaev B.I., Velumian A.A. Ionic mechanisms of postsynaptic excitation and inhibition in amphibian motoneurones. In: Proc. of the International Union of Physiol. Sci., Paris, 1977. V.XIII, p.689.
5. Shapovalov A.I., Shiriaev B.I., Velumian A.A. Mechanisms of postsynaptic excitation in amphibian motoneurones. J. Physiol. (Gr. Brit.), 1979, V.279, p.437-455.
6. Велумян А.А. Ионные механизмы действия глутамата, гамма-амино-масляной кислоты и глицина на постсинаптическую мембрану мотонейронов. Автореф. дис. ...канд.биол.наук. Л., 1979, 22с.
7. Велумян А.А. Механизм спонтанного синхронного возбуждения пояс-нйчных мотонейронов лягушки. В сб. Материалы VI всесоюзн. конф. по электрофизиол. центр, нервп. системы. Ереван, Изд-во АН Арм.ССР,
1980, С.235.
8. Велумян А.А. Спонтанные синхронные залпы возбуждения в изолированном спинном мозге лягушки. Журн.эвол.биохим.физиол., 1981, Т.17, № 1, с.74-77.
9. Velumian A.A. Intracellular recordings from embryonic chick motoneurones in the isolated perfused spinal cord. Brain Research,
1981, V.202, N 2, p.502-506.
10. Велумян А.А. Внутриклеточные потенциалы нейронов изолированного перфузируемого спинного мозга куриного эмбриона. Журн.эвол.биохим.физиол., 1982, Т. 18, N* 1, С.105-106.
11. Велумян А.А. Постсинаптическое торможение в мотонейронах спинного мозга куриного эмбриона. В сб.: Вопр.эвол.физиол. (V1Q совец. по эвол. физиол.), Л., Наука, 1982, с.64.
12. Велумян А.А. Возвратное торможение в мотонейронах спинного мозга птиц. Доклады АН СССР, 1982, Т.263, N 6, с.1500-1502.
13. Велумян А.А. Электрофизиология изолированного перфузируемого спинного мозга куриного эмбриона. XIV съезд всесоюзн.физиол. об-ва им.И.П.Павлова. Ба^ку, 1983, т.1, с.173-174.
14. Velumian A.A. Direct evidence for postsynaptic inhibition in the embryonic chick spinal cord. Developmental Brain Research, 1984, V.14, N 2, p.229-239.
15. Велумян А.А. Потенциалы действия эмбриональных мотонейронов. В
сб.: Развивающийся мозг. Тбилиси,-1984, с.48-49.
16. Велумян A.A. Антидромные потенциалыдействия в мотонейронах спинного мозга куриного эмбриона. Нейрофизиология, 1985;-Т. 17, I? 1, с. 70-77.
17. Велумян A.A. Свойства тормозных постсинавтических потенциалов в эмбриональных мотонейронах. В сб.: Физиол.и биохим.медиаторн. процессов. М., 1985, с.18.
18. Velumian A.A. Synaptic interactions in the embryonic chick spinal cord studied by intracellular recordings from motoneurones in the isolated superfused preparation. In: Symposium Neuro onto gene tic un Qu&rtum, Praga, 1985, p.143.
19. Велумян A.A. Изменения компонентов потенциала действия эмбриональных мотонейронов при миелинизации аксона. 4-й съезд армянского физиол. об-ва. Ереван, 1987, с.39-40.
20. Велумян A.A. Исследование нейронных механизмов сегментарного аппарата куриного эмбриона с помощью внутриклеточной регистрации потенциалов мотонейронов. В кн.: Роль сенсорнрго притока в созревании функций мозга, (отв.ред. Е.В.Максимова, К.В.Шулейкина), М., Наука, 1987, С.88-92.
21. Велумян A.A. Исследования глутаматергических процессов на спн-нальных нейронах позвоночных. В сб.: Исследование глутаматергических синапсов. Теоретические и прикладные аспекты. Л., Наука, 1987, с.18.
22. Велумян A.A. Идентификация возбуждающей природы сенео-моторных влияний на ранних этапах их формирования в спинном мозге куриного эмбриона. В сб.: V всесоюзн.конф. "Биология клетки". Тбилиси, Изд-во ТГУ, 1987, 4.1, С.434-436.
23. Велумян A.A. Изменения топографии аксонных компонентов потенциала действия эмбриональных нейронов при миелинизации аксонов. Доклады АН СССР, 1989, Т.304, № 2, с.486-439.
24. Велумян A.A. Исследования глутаматергических процессов на спи-нальных нейронах позвоночпых. В сб.: Физиология и биохимия глутаматергических синапсов, (ред.Ю.Е.Мандельштам). Л., Наука, 1989, с.141-151.
25. Велумян A.A. Гипотеза о различных типах интегративной деятельности нейронов с миелиннзированным и немиелинизированным аксоном: эволюционный и клинический аспекты. В сб.: X всесоюзн.совещ. по эвол. физиол., Л. Наука, 1990, с. 152.
26. Велумян A.A. Дифферепцировка начального сегмента аксона в развивающемся нейроне: основа для перехода от пластического к триггер-ному типу интегративной деятельности при миелпнпзлщга? В сб.: 3-я всесоюзн.конф. по нейронаукам. Киев, 1990, с.б5-бб.
27. Velumian A.A. Electrophysiological evidence for conversion from spatially variable to confined axonal spike-triggering zone in embryonic chick aotoneurones: possible basis for changes of integrative features of the neuron? In: 3rd World Corgress of Neuroscience. Montreal, 1991,
28. Велумян A.A., Полякова Л.А. Чувствительность мотонейронов спинного мозга куриного эмбриона к микроионофоретически апплицируемым ГАМК и глицину. В сб.: Вопр.эвол.фиэиол. (IX совещ.по эвол.фиэиол.). Л., 1986, с.54.
29. Велумян А.А., Полякова Л.А. Замыкание моносинаптической рефлекторной дуги в спинном мозге куриного эмбриона и чувствительность мотонейронов к глутамату. В сб.: Фиэиол.и биохим.медиаторн.процессов. М., 1990, с.53.
30. Полякова Л.А., Велумян А.А. Формирование сенсо-моторных связей в отделах спинного мозга, нннервирующих крылья и ноги куриного эмбриона. Веб.: X всесоюзн.совещ.по эвол.физиол., Л., Наука, 1990, с.120-121.
31. Велумян А.А., Полякова Л.А. Демонстрация возвратных коллатера-лей моторных аксонов у куриного эмбриона с помощь» аксонного транспорта пероксидаэы хрена. Хурн. эвол. биохим. физиол., 1992, т.28, №2, С.86-89.
32. Полякова Л.А., Велумян А.А. Формирование сегментарных проекций первичных афферентов крыла и ноги в спинном мозге куриного эмбриона. Хурн.эвол.биохим.физиол., 1991, Т.27, №4, С.496-502.
33. Полякова Л.А., Велумян А.А. Морфология и функциональные взаимодействия поясничных мотонейронов куриного эмбриона на ранних этапах замыкания моносинаптической рефлекторной дуги. В сб.: 3-я всесоюзн. конф.по нейронаукам. Киев, 1990, с.81-82.
34. Polyakova L.A., Velumian A.A. Development of segmental projections of primary afferents from wings and legs in the chick embryo: a comparative HRP study. In: 3rd IBRO World Congress of Neuprosci-ence. Montreal, 1991,f>.342.,
35. Velumian A.A., Polyakova L.A. Is there specificity of spinal pathways involved in the control of limb activity in birds as compared to mammals? In: Xlth International Symposium on Posture and Gait: Control Mechanisms. Portland, OR. (USA), 1992, р.ЬН-ЧЪ.
36. Velumian A.A. Functional differentiation of the axonal spike-triggering zone in embryonic motoneurones: electrophysiological evidence and a hypothesis explaining drastic changes of embryonic motor behavior due to changes of neuronal integrative features at early stages of myelination. In: Xlth International Symposium on Posture
and Gait: Control Mechanisms. Portland, ORV~ (USA), 1992, p.82-2iT,
37. Велумян A.A., Полякова Л.А. Специфичность эффектов ГАМК и глицина на эмбриональные мотонейроны на ранних стадиях их развития. В кн. Нейрофармакология на рубеже двух тысячелетий. Междунар. конф. поев. 100-летию со дня рождения акад.С.В.Аничкова. С.-Петербург, 1992, с.28.
Подписано к печати 2. Заказ 99 . Тираж Формат бумаги 60x84 1/16, 2 печ.л. Бесплатно. »10-3. 191104 С.-Петербург, Литейный пр., дом № 55.
\
-
Велумян, Александр Агасиевич
-
доктора биологических наук
-
Санкт-Петербург, 1993
-
ВАК 03.00.13
- Спинальные механизмы инициации локомоции
- Исследование локализации источника двигательной ритмики в изолированном спинном мозге куриного эмбриона
- Морфометрическая характеристика спинного мозга беспородных собак в раннем постнатальном онтогенезе
- Морфометрические и цитохимические особенности нейроновспинного мозга и спинномозговых узлов грызунов
- Онтогенез медиаторных систем мозга
