Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Холинергическая и моноаминергические системы в процессе развития амниона куриного эмбриона

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Холинергическая и моноаминергические системы в процессе развития амниона куриного эмбриона"

российская академия наук

ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ ИМ. Н. К. КОЛЬЦОВА

На правах рукописи УДК 577.175.82+591.339

БОЖО Ольга Владимировна

ЖШШГИЧЕСЯШ И ЫОНОАМИШРТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ В ПРОЦЕССЕ РАЗВИТИЯ А»,ШОНА КУРИНОГО ЭМБРИОНА

03.00.13 - Физиология человека и зетвотчшх

Автореферат диссертации яя соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1992

Работа выполнена в Институте биологии развития им. Н.К.Кольцова

Научный руководитель:

Офшиальше оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Б. Н. Манухин

доктор биологических наук, профессор Г. А. Бузников

доктор биологических наук Б. А. Шишов

Ведущее учреждение:

Московский государственный университет им. М, В. Ломоносова

Защита состоится "¿У"//^ К Р, Л/1992 года в/'^часов на заседании специализированного совета Д 002.85.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН (Москва, ул. Вавилова, 26).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института 'бйологии развития им. H.H. Кольцова.

Автореферат разослан

1992 Г.

Ученый секретарь специализированного совета

кандидат биологических наук Е.М. Протопопова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время плодные оболочки рассматривают как мощный адаптационный аппарат, обеспечивающий гомео-стэз плода, наделенный способностью связывать, синтезировать и еы-сзобождать биологически активные вещества. Большинство работ, посвященных этим проблемам, выполнено на амнжзне млекопитающих. Амнион куриного эмбриона в последние годы не привлекал должного внимания, несмотря на то, что он обладает несомненными достоинствами для эсперкментальной работы в силу детальной изученности развития зародыша кур и легкости получения датированного материала. Кроме тоге, примечательно, что диффорекцирозка его идет значительно быстрее, чем ди£ференцировка эмбриональных зачатков зародыша, период от закладки до начала дегенерации составляет менее двух недель.

В амвдотической ткани на всем протяжении ее существования полностью отсутствуют нервные элементы (Pierce, 1932; Evans, Evans, 1964; Müller et al., 1983). Вместе с тем, известна чувствительность амниона куриного эмбриона к широкому спектру биологически активных веществ, в том числе к нейремедиаторам - аце'тилхолину, адреналину, серотонжну (Xangley, 1905; Baur, 1923; Ferguson, 1941, 1957; Етапз. Sohlld, 1953;. Турпаев, Путинцева, 1957; Cuthbart, 1963, 1964; Bowers, 1939; Турпаев, Нечаева, 1990). Несинаптическов физиологическое действие моноаминов и ацегилхолина в безнервных тканях опосредуется взаимодействием их со специфичесгчми рецептор-ными структурами, во многом аналогичными по своим характеристикам рецепторам иннервироранных тканей. Однако особенности несинапти-ческих функций нейротрансмиттерных сист'м и механизмов регуля..,ш в ненервных тканях еще далеки от окончательной расшифровки.

Цель и задачи исследования. Учитывая вышесказанное, можно заключить, что амнион куриного эмбриона является перспективным объектом исследования медиатор-рецепторных взаимодействий в процессе развития неиннервированной провизорной ткани, представляющим возможность сопоставления характеристик функциональной активности медиаторных систем с изученной морфологической структурой гладко-мышечной ткани амниона при ее диф£еренцировке, созревании и дегенерации. а также с сократительной активностью амниона. В соответ-

ствии с гтим основная цель нашей работы заключалась в описании и характеристике холино- и моноамикергических систем амнионе, а также изучении динамики их активности в ходе эмбриогенеза. Были поставлены следующие задачи:

1). исследовать действие ацвтилхолина, серотонина и катехоламинов на изо^ованную полоску амниона куриного эмбриона, дать количественную оценку кинетических параметров этих реькций в процессе развитая амнисна;

2). провести идентификацию к количественное определение катехоламинов в амнионе и амниотической жидкости;

3). дать количественную характеристику мускариновым холинорэцепго-рам амниона методом радиолигандного анализа по связыванию блокато-ра 3Н-хннуклидишлбензилатз;

4). получить субстратно-ингибиторную характеристику холинэстеразь амниона, исследовать активность холинэстеразы.

Научная новизна и практическое значение работы. Впервые детально исследовано дейсг зие нейромедиаторов на амнион куриного гмбриона в процессе развития. Дана количественная оценка изменений в холино- и мовоаминергическшс системах амниона в ходе эмбриогенеза. Полученный экспериментальный материал позволяет не только оценить функциональную роль каадой из исследованных нейротрансмиттер-шх систем в регуляции спонтанной сократительной активности амниона, но и предподокить ее возможное значение в регуляции дифферен-цировки'и дегенерации амниотической ткани.

Выполненная работа может служить основой для развертывания практических исследований по изучению несинаптических регуляторных функций нейромедиаторов в процесса развития амниона. Экспериментальные данные, полученные в результате проведения настоящей работы, .представляют интерес для физиологов, эмбриологов, гистохями-ков, фармакологов, исследующих медиаторные процессы.

Апробация работа и публикации. Основные материалы диссертации докладывались и обсувдались на Мевдународном совещании "Онтогенэ-г'1чес; те и генегико-эволюцяошше аспекты нейроэндс.фишой регуляции стресса" (Новосибирск, 1988); Всесоюзной конференции "Механизмы действия медиаторов и гормонов на эффекторные клетки" (Суздаль, ТЭ8Э); У1 Всесоюзной конференции ¿о биохимии мшг- (Тбилиси, 1989); V Всесоюзной конференции "Физиология и биохимия медиаторшх про-

цессов" (Москва, 1930); Всесоюзном симпозиуме "Физиология медиаторов. Периферический синапс" (Казань, 1991).

По теме диссертации опубликовано 8 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения и обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 145 страницах машинописного текста, содержит 9 таблиц и 29 рисунков. Список литературы включает 58 работ отечественных и 232 зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа Bi .толнена на эмбрионах кур породы белый леггорн с' 6-х по 15-е сутки развития. Изолированную полоску амниона помещали в термостатируемую инкубационную камеру с аэрируемым раствором Хенк-са. Исходная нагрузка на препарат составляла 50-100 мг в зависимости от возраста эмбриона. Исследуемые вещества в объеме ICQ мкл вносили в камеру после получасовой преинкубацш ткани. Сокращения регистрировали в изометрическом режиме с помощью механотрона 6МХ1Б с записью на самописцах'Н-339 и Н-399.

Расчеты основных параметров холин- либо монсаюгаергической реакции - кажущейся константа диссоциации (К), величины максимальной реакции (Р ) и ингибиторной константы•(Кд) - проводили по методу Хофсти-Скетчарда (Диксон, Уэбб, 1982), а также по программе методом наименьших квадратов.

При определении для амниотической ткани активности и специфичности холинэстеразы (ХЭ), а также при идентификации холиноре-цепгоров с помощью £3НЬхинуклвдинилбензилата (ХКБ) использовали тотальный гомогенат. Материал гомогенизировали в гомогенизаторе стекло-тефлон в 0,32 М сахарозе при 2000 об/мин яа чедяной бане (15 подъемов пестика). Гомогенат центрифугировали 20 мин при 9000 g; полученный осадок ресуспендироЕали при тех же условиях в 0,05 М фосфатном буфере.

Содержание белка з пробах определят по методу Лоури (Lowry et al, 1951). в качестзе стандарта использовали бычий сывороточный альбумин.

Радиолигандный анализ М-холинорецзпторов амниона. Чувствительность и количество Ы-холшгорецепторов в амнионе опредэ-

ляли по связыванию антагониста [3Н]-ХНБ, удельная активность 12,3 Ки/ммоль (Amorsham, Англия) по методу Иамамуры и Снайдера (Yainainura, Snyder, 1974). Инкубацию проводили при температуре 25°С в течение I часа. Не специфическое связывание оценивали в присутствии ЮмкМ атрошша. Тотальное связывание - без внесения атропина в том яе конечном объеме - 500 мкл - в трех параллельных пробах. Концентрация белка в пробах составляла 0,2 - 0,75 мг/мл. Реакцию останавливали овладением в ледяной бане и пропусканием аликвот инкубационной смеси через стекловолокнистые фильтры GF/B (Whatman) в условиях вакуума с последующей промывкой 8-кратным объемом холодного 0,05 М фосфатного буфера, рН 7,4. Затем фильтры переносили во флаконы с 5 мл сцинтиллятора ЖС-8. Измерения прорводили через 24 часа на счетчике sii-4000 (франция). Эффективность счета составлял» 37Я. Величину специфического связывания радиоактивного лиган-да с рецептором определяли по разности между общим и неспецифическим связыванием.

Определение активности и специфичности холинзстеразы.

Активность (ХЭ) определяли колориметрически по модифицированному методу эллмана (Gorun et al., Г978). Реакцию фермента с субстратом проводили при 37°С и рН 7,6 в течение 30 минут. Каждая проба содержала 20 мкл гомогената, приготовленного из расчета 6-II яшг энов/мл. При исследовании динамики изменения активности ХЭ конечная концентрация субстрата - ацетилтиохолина - составляла 5"10~3М. Активность ХЭ выражали в мкМ гкдролизованного субстрата/ мг белка/час. Величину экстинции измеряли на спектрофотометре Speooi-211 (ГДР) при длине волны 412 нм для ХЭ и 750 нм для белка.

Кинетические параметры ферментативной реакции - константу Ми-хаалиса (1^), максимальную скорость гидролиза (VMaKC) и шгибитор-ную константу (Кд) - определяли по методу Лайнуивера-Берка. Чувствительность ХЭ к фосфорорганическим ингибиторам оценивали по константе скорости взаимодействия фермента с ингибитором - К2 (Яковлев, 1965).

Ментификацдд и количественное определение с удержания кате-холамннов в амнионе и амниотической жидкости. Определение" катехол-аииноз и ДОЛ (3,4-диоксифенилалашш)' проводили- триоксшшдольным "^шуориыетрическим методом (Манухи.; и др., 1975) о некоторыми модификациями. В опыте использовали по 15-25 эмирионов. Амнионы выде-

ляли на холоду. К навеске ткани добавляли 5 мл 2% НСЬ04 с 0,5* ЭДТА и гомогенизировали. Амниотическую жидкость брали с помощью шприца in ovo. К амниотической жидкости добавляли соответствующее количество 30% НСЮ^ о 1% ЭДТА. Пробц оставляли 15 минут на холоду, а затем центрифугировали в течение 15 минут при 3000 об/мин. К сударнатанту добавляли 0,5 мл этанола и по внешнему индикатору нейтрализовали до pH 6,5 насыщенным раствором NagCO^.

Обработка проб проводилась с учетом оптимальных условий окисления и таутомеризацяи кагехоламинов для получения максимальной флуоресценции продуктов их окисления. Катехолашны окисля.ли раствором иода, ду i перевода адренохромов во флуоресцирующие продукты - адренолюгины - использовали щелочной сульфит, а для стабилизации и усиления флуоресценции - уксусную кислоту. Измерения проводили на флуоресцентном спектрофотометре ыру-4 фирмы hitachi. Дифференцировали в пробах адреналин (А), норадреналин (НА), дофамин (ДА) и ДОФА. Для идентификации аминов предварительно сканировали стандартные растворы катехоламинов и ДСФА и пробы в широком диапазоне волн возбувдения и флуоресценции. Оптимальные длины волн возбуждения и флуоресценции составляли для А соответственно 420'и 500 нм, ДЛЯ НА 395 И 485 НМ, ДЛЯ ДА 323 и 3G8 нм, ДЛЯ ДОФА 335 и 375 дм.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Холинергическая реакция изолированной полоски амниона.

Спонтанную сократительную активность изолированной полоски амниона и эффективность действия ацетилхолина (АХ) исследовали с 8 по 14 сутки инкубации эмбриона. Наибольшая спонтанная сократительная активность характерна для 8 - 9 сток инкубации. В усж чаях наших опытов (время преинкубации 30 минут, температура - 38°С) она составляла 6,7+0,3 сокр/мин. На 12 - 14 сутки часто.а сокращений существенно снижена - 3,2+0,6, часто спонтанные сокращения отсутствуют. Такую динамику отмечали и другие авторы как для изолированных препаратов, так и для амниона in vivo (Pierce, 19ЭЭ; Ferguson, 1941; Clements, Ferguson, 1951; Romanorf, 1952; Бункина, 1958; Полякова, 1970; Турпаев и соавт., 1990).

Действие АХ на изолированную полоску амниона вызывает дозоза-висимые хронотропяую и тонотропную реакции. При концентрациях АХ, близких к пороговым, наблюдаются положительные хронотропный и ико-

трошшй эффекты, дальнейшее увеличение концентраций ведет к появлению тонотрошой реакции (частота и амплитуда сокращений могут при этом меняться несущественно). СуОмаксимальные концентрации АХ приводят к длительному угнетению ритмики и тоническому сокращению. Кроме того, для ряда препаратов наблюдается преобладание тонической или хронотропной реакции. Вызванные АХ реакции длительно сохраняются во времени. При отмывании исходный гонус восстанавливается очень быстро.

Анализ полученных количественных характеристик холинергичес-кой хронотропной реакции амниона показал, что в период с 8 по 10 сутки инкубации не изменяется ни чувствительность к АХ - К составляет 2,8+0,8 мкМ, ни величина максимальной реакции - 27,7+2,0 сокр/мин. Дозозависимая хронотропная реакция без тонического компонента после 10 суток инкубации не выражена. Исследование гоно-тропной реакции амниона на АХ с 8-х по 14-е сутки развития также не выявило значимых возрастных изменений К и Рм (табл.1). И в том, и в другом случае выявляемся один пул холинорецепторов.

Таблица I.

Зависимость К и Рм тонотрошой холинергической реакции амниона от возраста эмбриона.

Возраст К Рм

эмбриона (мкМ) (мг/мг ткани)

в' - 10 3,7 - 0.7 (19) 47.1 ± 4,8 (19)

12 - М 4.5 ± 1.9 (5) 42,2 ± II.9 (5)

М-холинолитик атропин является высокоактивным ингибитором в отношении холинергической реакции амниона. Величина ингибиторнсй "онстанты (Ки) атропина в наших опытах составила 2,68 нМ для тонической реакции и 3,01 нМ для хронотропной. Следует отметать, что атропин подавляет и спонтанные сокращения изолированной полоски с~дниоь.э. Другой специфический • антагонист • М-холинорецепторов -хинуклидинилбензилат - обладает 'более выраженными литическими свойствами: Ки для хронотропной реакции - 0,31 нМ, для тонической 0,85 нМ.

Н-холшолитик й-тубохурарш в концентрациях Ю-5 - Ю-3 М не

проявлял блокирующего действия на АХ-реакдаю. Ганглерон, оказывающий сильное блокирующее влияние на ряд Н-холинореактивных систем организма - в вегетативных ганглиях, ВДС, поперечнополосатой мышце кивота лягушки - способен снижать АХ-реакцию амниона, однако К^ для этого антагониста на три порядка выше, чем для атропина, и составляет 3,02 мкМ. Н-холиномиметик никотин в концентрациях до 10~4 М либо не вызывал реакции совсем, либо приводил к возникновению одиночного сокращения амниотической ткани. Зти данные указывают на наличие в амниотической мембране М-холинорецепгоров.

Блокатор ХЭ эзерин в кониентрации Ю-6 - Ю-5 М не оказывал действия на прпарат, при концентрации его ГЮ"4 М часто наблюдались ритмичес^е сокращения. Сократительные ответы, вызванные 'экзогенным АХ, под влиянием эзерина возрастали более, чем в 3 раза. Эффект ингибитора другой природа - армина (4'10~6 М) проявлялся примерно в трехкратном увеличении чувствительности препарата к АХ.

Известно, что антихолинэстеразные препараты обладают довольно широким спектром неспецифических эффектов, в том числе для эзерина показана способность к инактивации калиевых каналов мышечной мембраны (Кривой и др.,' 1937). По-видимому, сократительная'активность амниона, вызванная эзерином, может быть обусловлена его нэ-специфическим действием, выражающимся в' снижении калиевой проводимости и, соответственно, в снижении'йорога генерации ОД.

Реакция амниона куриного эмбриона на индоламинн.

Наряду со стимулирующим действием АХ на амнион ранее в кратких сообщениях отмечалась и способность серотонзша - 5-окситрш-тамина (5-ОТ) - стимулировать сократительную активность амвона куриного эмбриона (Evans, Schild, 1953: Ferguson, 1957), при этом авторы указывали на большую вариабельность реакций, затрудняющую их количественную оценку. В работа мы использовали также трип-тамин, фармакологические свойства которого часто рассматривают в связи с его действием на рецепторы 5-ОТ.

Проявление стимуляторной реакции на исследуемые индоламины зависит от возраста эмбриона. На 7-9 день инкубации эмбриона чувствительность амниона к 5-ОГ и триптамину невелика, пороговые концентрации составляют не менее 5-10 мкМ, характерно наличке латентного периода длительностью до 2-х минут, предшествующего

развитию фазных сокращении в ответ на предъявление 5-ОТ или тркя-тамина. Сократительная активность не снижается при продолжительной записи. Следует отметить, что для этих сроков выраженность стимулирующего действия АХ значительно превосходит таковую для 5-ОТ и трилтамина той же концентрации. В этот период для прекращения сократительной активности, вызванной трилтамином или 5-ОТ, необходимо длительное отшвавде (0,5 - I час). Реак"ии и на 5-ОТ, и на триптамин, как правило, лишены тонического компонента, может иметь место пачечная активность в ответ на воздействие. Регистрация до-зозависимых реакций затруднительна из-за нестабильности эффектов.

Иная картина наблюдается на 13 - 15 день инкубации. Для трип-тамина по-прекнему характерно отсутствие тонического компонента реакции, возможны пачечные сокращения. Однако в целом сокращения становятся более мощными, стабильными, реакция развивается быстро, хорошо отмывается. Реакция на 5-ОТ в этот период сопровождается повышением тонуса, близка по своему эффекту к реакции на АХ в той . же концентрации, не требует длительной отмывки. Минимальная действующая концентрация составляет 0,3 мкМ, К для тонической реакции - 3,4 ыкМ, Рм - 65,2 мг/мг ткани.

Возрастные изменения особенно проявляются при сравнении с АХ-реакцией. Эффективность действия 5-ОТ на 7 - 9 день развития много мевт,ве. чем АХ, тогда как на 14 - 15 день величина К приближается к таковой для АХ, а величина максимальной реакции нередко превышает Рм реакции, вызываемой АХ. Более того, нами была предпринята попытка оценить действие исследуемых веществ на амнион 19-дневного эмбриона. Ткань брали вблизи пупочного кольца, где еще можно выделить не сросшийся с аллантоисом амнион. Сравнение реакций на АХ. триптамин и 5-ОГ выявило явно меньшую, чем на ранее исследованных сроках развития реакцию на АХ, возрастание реакции на триптамин с • появлением тонического компонента и еще большее развитие «-еротони-.овой реакции с существенным превышением ее над реакцией на АХ.

Таким о .'разом, проявление реакций амниона на индоламины -5-ОТ у триптамин - отличается выраженными возрастай"® изменениями. По мере эмбрионального развития.процессы реализации серотонинерги-ческих аффектов становятся Солее регулируемыми: повышается чувствительность, увеличивается диагззон ' действующих концентраций, реакция быстрее ■ развивается и быстрее прекращается. Изменение

реакций на триптамш и 5-ОТ в процессе развития амниона протекает однотипно. Шшрогептадин, антагонист 5-ОТ, равноэф^ективен в подавлении реакций, вызываемых 5-ОТ и трмиашном. По-видимому, действие 5-ОТ и триптзмина на амнион опосредуется одним и тем же рецептором .

Адренергическая реакция изолированной полоски амниона.

Адреномиметики эффективно блокируют спонтанную сократительную активность амниона. Б наших опытах спонтанные сокращения выявлялись нерегулярно, чаще мы работали на препаратах не проявляющих спонтанной акэ шюсти. В таких случаях адреномиметики не изменяют тонус амниона. На фоне действия АХ они вызывают тормознув реакцию, которая проявляется как в снижении тонуса препарата, так и частоты его сокращений. Чувствительность к адренергическим агонистам снижалась в следующей последовательности: ИЗО > КА > А.

Пропранолол (10 мкМ), специфический антагонист р-адрзнорецеп-торов, эффективно блокирует тормозные реакции, обусловленные адре-номиметкками. Кроме того, в ходе опытов было обнаружено, что пропранолол в ряде случаев'трансформирует эфркт агонистов в потенцирующий, сопровождающийся увеличением амплитуда сокращений амниона, ffa фоне фентоламша данная реакция не проявляется.. Это предполагает, что в условиях блокада р-адренорецепторов проявляется активность а-адренорецепторов амниона. Использование а-агошста фенил-эфрина показало, что он может вызвать только сгимуляторную реакцию, которая, однако, проявляется не всегда даже на концентрацию Ю~4М. По-видимому, р-адренорецепторы амниона более чувствительны к катехоламинам, чем а-рецепторы.

Подробно нами исследована тормозная реакция, опосредованная p-адренорецепторами. Следует отметить,что для тормозной адренерги-ческой реакции характерно явление .десенситизацш. В этой серии опытов чувствительность оценивали по величине ЕС^д. Полученные нами величины ECgQ для 8 и 12 дая инкубации - 4,95'Ю-8 и 5,5*10_8М соответственно не еыявляют достоверных изменений в чувствительности р-адренорецепторов амниона к изопропилнорадреналину. При работе с культурой клеток 4-7 -дневного амниона куриного эмбриона также не установлено возрастных изменений для р-адренергической реакции (Bowers, 1989). Эти данные в совокупности с нашими результатами

дают основание полагать, что чувствительность адренергической реакции, опосредуемой р-адренорецепторами, не подвергается существенным изменениям в процессе развития амниона с 4-х по 12-е сутки инкубации эмбриона.

Катехоламивы и ДОФА в амниотической жидкости и амнионе. • содержание катехоламинов и ДОФА в амниотической жидкости определяли с 6 по 13 сутки инкубации вмбриона. На 6-8 сутки инкубации содержание катехоламинов и ДОФА минимально, с 10 суток инкубации их концентрация начинает возрастать. Содержание ДОФА, А и НА и далее прогрессивно возрастает, тогда как содержание ДА растет до 12 суток, а на 13 снижается почти в 3 раза с 6,8 нг/мл до 2,4 нг/мл (рис. I).

Содержание катехоламинов и ДОФА в амнионе определяли с 8 по 14 "утки инкубации эмбриона. При этом в отличие от амниотической жидкости достоверных возрастных различий не выявлено. Показано,' что на протяжении исследованного периода содержание ДА (104-164 нг/г) ьсегдь превышало содержание ДОФА (13-47 нг/г), а содержание А (91138 нг/г) было выше, чем содержание НА.' (15-47 нг/г).

Важнейшие составляющие адренергической системы куриного заро дыша появляются в очень короткий период раняей.эмбриональной хиз-

ни. Имеются гистохимические данные о параллельном развитии хромаф-финной ткани надпочечников и аортального сплетения куриного эмбриона (Enemar et ai, 1965), которая, по-видимому, и является основным источником катехоламинов в амшотической жидкости. Зависимость между содержанием катехоламинов в амшотической жидкости и надпочечниках подтверждается данными литературы. Так, показано, что в надпочечниках концентрация ДА на 14 сут инкубации снижается в 4 раза, при значительном увеличении концентрации ДОФА и НА (Ма-нухин и др., 1969).

Получении» наш результаты о содержании катехоламинов в безнервной ткани лниона, очевидно, отражают процессы, протекающие по типу экстранейронального захвата. Есть данные, что сердечная мышца куриного эмбриона поглощает экзогенные кзтехоламины с первых дней развития, когда симпатическая иннервация органа еще отсутствует (Ignarro, Shideman,i968). Авторы отмечают, что способность к захвату А несколько превышала таковую к НА на всех исследованных стадиях (до 10 дней). Это можно отметить и для амниона куриного эмбриона, • так как содержание А в амниотической жидкости в 1,5 - 2 раза выше, чем НА, а содержание А в амнионе превышает содержание НА в 3 - 6 раз.

Экстранейроналышй захват в неиннервированных тканях - амнионе куриного эмбриона и пупочной артерии человека - существенно отличается от экстанейронального захвата в иннервированных гладких мышцах: более низким порогом захвата НА, медленным отмыванием. Предполагают, что особенности экстранейронального захвата в неиннервированных тканях.могут быть связаны с низкой активностью в них моноаминоксидазы и кагехол-О-метилтрансферазы (Bamatook et al., 1971). Действительно, гистохимическое исследование выявило лишь незначительную активность моноаминоксидазы в. амнионе куриного эмбриона (Müller et al., 1983).

При исследовании функциональных взаимодействий между катехол-аминами околоплодных вод и амшотической тканью использовали амнион человека. Проведен анализ метаболизма ^Н-ДА в амниотической ткани in vitro (Phillippe, ifiloif, 1982). Показано, что изопропил-норадреналин и НА вызывают повышение внутриклеточного уровня цАМФ в амнионе, и эти эффекты блокируются пропранололом (Kirkpatrick et al., 1981; Di Rerero et al., 1934). С помощью связывания

*2®1-ж>дциашп1ндолола, конкурентно блокируемого пропранололом, в амниотической оболочке идентифицированы р-адренорецепторы.'Предполагается, что катэхоламины амниотической жидкости модулируют метаболизм амниотической клетки; возможно, участвуют в регуляции синтеза простагландиков в амнионе (Di p.enzo et al., 1984).

Установленное наш нарастание содержания А и НА в амниотической жидкости на 12-13 сутки инкубации куриного эмбриона согласуется с представлением о возможном участии катехоламшюв в регуляции сократительной деятельности амниона, так как именно в эти сроки происходит естественное снижение спонтанной активности амниона, а катехоламины являются блокаторами его констрикторных реакций.

Радиолнгандннй анализ мускариновых холинорецепторов амниона.

Отсутствие четко выракенных изменений в холинергической реакции амниона куриного эмбриона в процессе развития побудило нас попытаться выявит^ возрастные изменения в воспринимающих холинерги-ческих структурах с помощью радиолигандного анализа по связыванию специфического меченого антагониста (3Ш-хинуклидинилбензилата (ХНБ). Для тотального гомогената амниотической ткани показано, что специфическое связывание [3Н]-ХНБ насыщаемо-; неспецифическое связывание, оцениваемое в присутствии 1(Гб М атропина, возрастает линейно с увеличением концентрации радиоактивного лкганда. Для гсех исследованных сроков развития выявлена одна популяция связывающих мест. Kd комплекса L^Hl-XEB - холинорецептор составляла 0,34 - 0,43 нМ. Эта величина достоверно не изменялась с 8 по 15 день инкубации куриного эмбриона, что означает постоянство аффинитета М-холинорецепторов амниона к данному антагонисту. Максимальное специфическое связывание с возрастом снижается, составляя на 8 день инкубации 404 фмол/мг бежа, а на 15 - 230 фмол/мг белка.

Многими авторами отмечалось несоответствие между параметрами холинергической реакции, исследуемой в условиях физиологического эксперимента, и характеристиками связывания.радиоактивного лиган-í.-.. Эт^ несоответствие может выражаться в изменении эффективности действия холнаергических агентов при .'относительной неизменности количества выявляемых рецепторов (Galper et al., 1977; Obata, (ida, 1980). Показано, что эффективность чейс^вия карбахола в

предсердиях эмбрионального сердца цыпленка много выше, чем в желудочках, тогда как плотность мест связывания в этих отделах практически одинакова, что наблюдалось для связывания [3Н]-ХНБ и ["^Ш-метилскополамжна и подтвердилось данными авторадиографии (Siegel, Fischba-h, 1984). Более того, обработка за сутки экстрактом мозга увеличивает процент чувствительных клеток желудочка в 2,6 раза, при этом количество сайтов, связывающих метилскополамш не меняется. Снижение количества рецепторов, вызванное экспериментальными воздействиями, либо выявленное при естественном развитии, также не означает р-знозначнсго снижения эффективности холинерги-ческого воздействия (Ealvorsen, Nathanson, 1981; Ordway et al., 1986).

В нашей работе величина Кц, характеризующая блокаторные свойства ХНБ в отношении сократительной реакции амниона на AI, была близка к Kd ["^Ш-ХНБ с мускариношми холинорецепторами амниона. В то же время снижение плотности холинорецепторов с 8 по 15 день инкубации не сопровокдается выраженным падением максимальной реакции на АХ изолированного препарата (табл. I).

Для объяснения виявляемых несоответствий между параметрами ходинергической реакции и связывания радиоактивных лигандов выдвигается несколько гипотез: это подвижность процессов дальнейшей передачи информации, то есть пострецепторные изменения (Halvorsen, Nathanson, 1981; Siegel, Fischbaoh, 1984; Ordway et al., 1986); существование неактивных холинерги< ских рецепторов (Gaiper et al., 1977; Obata, Olde, 1980; Hunter, Nathanson, 1984). Существенная роль отводится изменении баланса разноаффинных сайтов (Hal7orsen. Nathanson, 1981).

Радаолигандный анализ обычно выявляет гомогенность популяции М-холинорецепторов в отношении связывания антагонистов и гетерогенность в отношении агонистов (Halvorsen, Nathanson, 1981; Murlas et al., 1982'; Delhae et al., 1984). В сердечной мышце цыпленка показаны связанные с развитием различия в аффинитете для агонистов, но не для антагонистов (Нозеу, Fields, 1981; Hosey et al., 1985).

Активность и субстрагно-ингибиторная характеристика холинэстеразы амниона.

При исследовании каталитических свойств ХЭ использовали ам-

ниотические оболочки 8-суточных эмбрионов. В интервала концентраций тиохолиновых эфиров 1"1СГ5 - I'10~z М не наблюдается ингибиро-вания фермента высокими концентрациями субстрата. Обнаружено, что ХЭ амниона с наибольшей скоростью гидролизует ПрТХ - vMaRC составляет 5,6 мкМ/мг белка/час, vMaKC для АТХ и БуТХ составляет 45 и от этой величины. Величины Км при этом очень близки: 0,69; 0,45; 0,50*Ю~3 М соответственно. Константа скорости взаимодействия фермента с ингибитором не зависела от выбора субстрата: с ГД-42, специфическим ингибитором ацетилхолинэстеразы, составляла (4,12-0,40)'Ю5 М-1'мин-1 для всех трех использованных субстратов. ГД-42 имеет К2 для ацетилхолинэстеразы эритроцитов быка 2,5'Ю8, для ХЭ сыворотки лошади - 3,6'Ю6 М-1 "мин-1 (Михельсон, Зеймаль, 1970). Сравнение этих величин с полученной нами указывает на наличие в ткани амниона неспецифической холинэстеразной активности. Кроме того, значения полученных нами Ки для специфического ингибитора бутирилхолкнэстеразы изо-ОМПА при сравнении с данными литературы также приближаются к величине АИ50 для неспецифической ХЭ сыворотки человека.

Таким образом, совокупность данных по субстратно-ингибиторной характеристике ХЭ амниона указывает на то, что гидролиз различных холиновых субстратов идет благодаря одному ферменту мышечной ткани. Наличие только одного энзима - неспецифической ХЭ показано электрофоретически для амниона 12 - 16-суточного эмбриона (Wilson et al., 1973). В связи с тем, что ХЭ амниона гидролизует с наибольшей скоростью ПрТХ, ее следует отнести' к пропионилхолин-эстеразам, которые входят в группу ацилгидролаз ацилхолинов (КФ 3.1.1.8).

Исследование динамики активности ХЭ в процессе развития' амниона ' куриного эмбриона показало, что наибольшая активность фер-•мента наблюдается на 8-е сутки инкубации зародыша. С 6-х по 8 о сутки идет нарастание активности, а затем постепенное снижение; к 12-м суткам она составляет 40£ от максимальной и б дальнейшем держится примерно на этом же уровне (рис. 2). Эти данные согласуются с результатами гистохимического исследования ХЭ амниона развивающегося куриного эмбриона: препарат амниона 6-сугочного эмбриона окрашиваются слабо; наиболее плотно окрашенными являются так называемые крестообразные фигуры, образуемые мышечными элементами ам-

1Д

ниона, которые особенно (Cuthbert, 1963).

многочисленны на 7 - 9 сутки развития

ukU/ыг 6eiuta/txao 3.1

3

2.3

Рис.3 Активность

хопинэотерааы ыхаиояа

активность феркеят*

< Б < 7 9 » 1011 12 13 1« 1610 дни инкубации

Развитие амниогической оболочки сопровождается прогрессивной дифференцировкой мезодермалышх клеток в длинные веретеновидные гладкомышечные клетки. На 7 - 9-е сутки беспорядочное расположение клеток сменяется появлением большого числа крестообразных фигур. На 12-е сутки мезодерма представляет собой многослойное образование. С 12-х суток начинается дегенерация и гибель мышечных элементов амниона (?iers, 1933; Prosser, Rafferty, 1956; Bautzmann, Hertenstein, 1957). Следовательно, наблюдается параллелизм активности ХЭ с созреванием, и морфологической дифференцировкой амниотической ткани. Нарастание активности фермента соответствует периоду прогрессивной диф^еренцировки ткани. Снижение активности ХЭ предваряет начало дегенеративных Изменений в структуре мышечных элементов.

На основании биологического тестирования установлено, что содержание АХ в амнионе начинает повышаться на 7-е сутки, на 8-е достигает максимума, а затем опять снижается и к 13-м суткам находится на самом низком уровне (Бункина, 1963), то есть изменения в активности ХЭ и содержании АХ в ткани идут параллельно; Спонтанная сократительная активность амниона коррелирует как с содержанием АХ, так и с величиной активности ХЭ. В то же время, способность амниона к сокращениям в ответ на экзогенный АХ хорошо сохраняется

и на 12 - 14 сутки развития. Го есть система реагирования еще способна отвечать пропорционально приложенному стимулу, хотя уже произошли изменения в холинергической обеспеченности ткани (содержание АХ, активность ХЭ, плотность холинорецепторов). Спонтанная сократительная активность связана с этими изменениями.

Обращает на себя внимание взаимосвязь между активностью ХЭ и осуществлением двигательных процессов различного происхождения. ХЭ всегда выявляется в клетках, которые в течение формирования органов активно движутся (Drewe, 1975). В ходе эмбриогенеза, как было показано на зародышах амфибий, активность АХЭ тесно коррелирует с их подвижностью, причем особенно резко активность АХЭ возрастает с развитием координированных плавательных деижений (Sowyer, 1943; GincLi, Knowiand, 1979; Семенова, Турпаев, 1983). Предполагается, что одним из возможных факторов , определяющих функциональную сократительную активность мышц, является активность несинапгической мышечной ХЭ.

Таким образом, исследование холинергической системы амниона куриного эмбриона выявило тесную взаимосвязь мевду изменениями в спонтанной сократительной активности амниона и холинергической обеспеченностью ткани.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

■Физиологические свойства гладкомышечной ткани амниона, лишенной нервных элементов, во многом сходны с таковыми иннервированных висцеральных мышц. Потенциалы действия амниона продолжительны (1-5 сек) и напоминают потенциалы действия иннервированных гладких мышц: желудка, мочеточника, сосудов (Cuthbert, 1964). Как и в амнионе, АХ вызывает сокращение почти всех несосудистых гладких мышц, а в большинстве сосудов его далятаторная реакция изменяется на вазоконстрикторную после удаления эндотелия (Щуба, Кочемасовэ, 1988). Анализ действия использованных наш М-холиноблокаторов -атропина и хинуклидинилбензилата - на холинергическую реакцию амниона показал, что соотношение в силе действия этих антагонистов (Ки отличаются на порядок) аналогично выявляемому в иннервированных мышцах (Yamamura, Snider, 1974¡ Obata, Oide, 1980; Murías et al.-, 1982). По-видимому, как и в других мышцах, не специфическое

стимулирующее действие ингибитора холинэстеразн эзерина на амнион проявляется в снижении порога генерации потенциала действия (Кривой и др.. 1987).

Радиолигадвшй анализ М-холинорзцепгоров амниона показал, что Kà комплекса ^-ХНБ-холинорецептор (0,34 - 0,43 нМ) близка к величинам, полученным для иннервироваиных тканей (Yamamura, Snyder, 1974; Renaud et al., 1980; Crankshaw, 1984). Концентрация мест связывания лиганда в амнионе достаточно высока (230 - 404 фмол/мг белка) и сравнима с их количеством , выявляемым в аналогичных условиях в эмбриональном сердце цыпленка (Obata, Oide, 1980; Нозеу et al., 1985; Oettling et al., 1989).

Совокупность данных по субстратно-ингиОиторной характеристике ХЭ амниона указывает на наличие в ткани только одного энзима, представляющего собой неспецифическую ХЭ - прогмонилхолинэстеразу. В отличие от АХЭ для неспецифической ХЭ в иннервированных мышцах не установлена определенная физиологическая роль. Известно, что у людей с генетически относительно неактивными формами псевдохолин-эстеразы не обнарукено признаков нарушения холинергической функции (Chatonnet, Lockridge," 1989). Однако, авторы отмечают, что у позвоночных активность неспецифической ХЭ в мозге и скелетных мышцах невелика, а там, где она более существенна, ее всегда сопровоэдает АХЭ. В то же время экспериментально показано, что избирательное торможение бутирилхолинэстеразц гладких мшиц трахеи приводит к выраженному возрастанию амплитуда электрически вызванных сокращений, причем эти воздействия значительно потенцируют реакцию на блокаду АХЭ (idler. Filbert, 1990). Авторы полагают, что значение бутирил-холинэстеразы в данном случае возрастает в условиях увеличения секреции АХ. Значительное усиление реакции на АХ в условиях блокады неспецифической ХЭ амниона означает прямое участие этого фермента в осуществлении холинергической реакции.

Адреномиметики (А, НА, изопропилнорадреналин) вызывают тормозную реакцию, опосредуемую стимуляцией ß-адренорецепторов амниона. В условиях блокада ß-адренорецепторов выявляется активация а-адренорецепторов. Как и для многих других гладких мышц (Шуба, Кочемасова, 1988; Keitz et al., 199Ö), чувствительность ß-адренорецепторов амниона выше, чем а; для ß-адрэнорецепторов характерно явление-десенситизацш.

Действие 5-ОТ и триптамина на амнион куриного эмбриона опосредуется одним и тем же рецептором. Выявлена лишь меньшая активность триптамина. Подобные данные получены на различных гладкомы-шечных Объектах (Handsch.umac;her, Vane, 1967).

Таким образом, исследование холин- и моноаминергических механизмов в амнионе куриного эмбриона выявляет много общих с иннерви-рованными тканями характеристик. Тем более интересно проследить связь изменений в этих системах с функциональной активностью бэз-нервного амниона, для которого свойственна быстрая смена процессов развития процессами дегенерации ткани.

Выявлены значительные возрастные изменения во всех исследованных системах. Однако проявляются они по-разному. Для холинерги-ческой реакции мы не обнаружили достоверных изменений ни в чувствительности, ни в величине максимальной реакции на АХ (табл. I). Однако, плотность мускариновых рецепторов, определяемая по связыванию 3Н-ХНБ, в период с 8 по 15 день инкубации снижается с 404 фмол/мг белка до 230. Кроме того, активность ХЭ, возрастая с 6 по 8 день инкубации, затем снижается , составляя на 12 - 15 день около 40й от максимальной (рис. 2). Эти изменения находятся в тесной корреляции с изменениями в спонтанной сократительной активности амниона, максимум которой приходится на 8-9 день развития.

Для адренергической реакции, обусловленной стимуляцией ¡З-адренорецепторов и проявляющейся в торможении вызванной и спонтанной сократительной активности, возрастные изменения в чувствительности нами также не выявлены. Однако значительное нарастание концентрации катехоламинов - А и НД - в амниотической жидкости на 12 - 13 сутки инкубации (рис. I). согласуется с данными о снижении спонтанной сократительной активности амниона и Олокаторной роли катехоламинов.

В отличие от холино- и адренореакции ответы на воздействия 5-ОТ и триптамина существенно зависели от возраста эмбриона. Сравнение латентного периода, длительности действия препарата, чувствительности амниона к эти агентам на 7 - 9 и 13 - 15 день развития свидетельствует о кардинальной перестройке в системе восприятия и дальнейшей трансформации сигнала.

Кроме того, сведения о способности 5-ОТ понижать клеточную пролиферацию в эмбриональных тканях (Пухальская', 1966; Beele et

al., 1990) наряду с возрастанием к нему чувствительности позволяют 1редоолагать возможность участия его в регуляции развития амниотической ткани. Известно, что нейротрансмиттеры играют большую роль в регуляции делрчия клеток на разных стадиях онтогенеза (см. Буз-ников, 1967, 1987). Есть данные об участии трансмиттеров в процессах, приводящих к запрограммированной гибели нейронов или других клеток. Действие вторичных мессеаджоров предотвращает отмирание мотонейронов (Weill, Greene, 1984). Показано, что нарушение созревания плаценты сопровождается значительным падением содержания АХ и активности холинацетилтрансферазц по сравнению с величинами, наблюдаемыми в норме (Sastry et al., 1978). Наш обнаружена тесная взаимосвязь между сократительной активностью амниона и активностью ХЭ. Кроме того, возрастание активности ХЭ сопровождает процесс дифференцировки 'амниотической ткани, а снижение активности ХЭ, содержания АХ и плотности'холинорецепторов предшествует началу дегенеративных процессов в амнионе.

Таким образом, рассмотренный экспериментальный материал и данные литературы позволяют не только оценить функциональную роль каждой из исследованных несинаптических нейротрансмитгерных систем в регуляции спонтанной сократительной активности амниона, но и предположить ее возможное значение в регуляции дофЗЕвренцировки и дегенерации амниотической ткани, хотя последнее можно рассматривать лишь как рабочую гипотезу.

ВЫВОДЫ

1.B исследованный период спонтанная сократительная активность изолированной полоски амниона куриного эмбриона была наибольшей на 8-9 сутки инкубации, на 13 - 14 сутки частота сокращений сущест-вбнно снижалась.

2.Действие ацетилхолина на изолированную полоску амниона вызывает дозо'зависимые полокительше хронотропную и тонотропную реакции, опосредуемые М-холинорецепторами. Основные параметры (К, Рм) холинергической реакции амниона не претерпевают существенных изменений для хронотропной реакции с 8-х по 10-е сутки инкубации, а для тонотропной реакции - с 8-х по 14-э сутки. Дозозависимая хрокотропная реакция без тонического компонента после 10-х суток

Инкубации не выражена.

3.Плотность мускариновых холинорецепторов в амнионе куриного эмбриона, определяемая по связыванию специфического лиганда ^Н-хинуклидинилбензилата, снижается в процессе развития с 8-х по 15-е сутки инкубации более, чем в 1,5 раза. К^ при этом достоверно не изменяется.

4.Показано, что по субстратно-ингибиторной специфичности хо-линэстераза амниона куриного эмбриона представляет собой неспецифическую холинэстеразу - пролионилхолинэстеразу.

5.Описана динамика активности холинэстероазы в процессе развития амниона. Показано, что наибольшая активность фермента наблюдается в период 8-9 дней инкубации, что соответствует периоду морфологической зрелости ткани и ее максимальной сократительной активности.

6.Проведена идентификация и количественное определение содержания ДОФА, дофамина, яорадреналина и адреналина в амниотической жидкости и амнионе куриного эмбриона. Обнаружено значительное возрастание концентрации ДОФА, норадреналина и адреналина в амниоти-ческой жидкости с 6 по 13 сутки инкубации, концентрация дофамина на 13 сутки резко падала. Содержание аминов в амниотической ткани в исследованный период достоверно не изменялось.

7.На фоне сгимуляторного действия ацетилхолина адреномиметики вызывают тормозную реакцию, которая проявляется как в снижении тонуса препарата, так и частоты его сокращений. Чувствительность к адренергическим агонистам снижалась в следующей .последовательности: изопропилнорадреналин > норадреналин > адреналин. Пропранолол блокирует тормозную адренергическую реакцию, что свидетельствует об участии в ее реализации р-адренорецепторов. Изопропилнорадреналин зфективно блокирует спонтанную сократительную активность амниона. Достоверных возрастных изменений в чувствительности к изопро-пилнорадреналину нами не выявлено.

8.В условиях блокады р-адренорецепторов амниона адреналин и норадреналин активируют а-адренорецепторы, что приводит к усилению сокращений, а-агонист фенилэфрин вызывает только стимуляторную реакцию.

9.Проявление стимулягорной реакции на индоламины - серотонин и трипгамин - зависит от возраста эмбриона. В период 7-10 дней

го

инкубации характерно наличие латентного периода длительностью до 2 минут и низкой чувствительности (пороговая концентрация для серо-тонина 5 мкМ). для прекращения реакции необходимо длительное отмывание. На 13 ~ 15 день инкубации величина максимальной реакции и чувствительность существенно возрастают (К реакции на серотонин составляет 3,4 мкМ), при отмывании исходный тонус быстро восстанавливается.

10.Изменение реакций на триптамин и серотонин в процессе развития амниона протекает однотипно. Чувствительность во все сроки развития к' серотониь/ выше, чем к триптамину. Ципрогептадин блокирует эффекты как серотошша, так и триптамина. По-видимому, действие этих индоламинов на амнион опосредуется одним и тем ке рецептором.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Бойко О-В. Онтогенез холинергической системы амниона куриного Ембриона // Тез. докл. Междунар. совещ.."Онтогенетические и генетико-эволюционные аспекты нейроэндокринной регуляции стресса". - Новосибирск. - 1988."- С. 15-16.

2. Бойко О.В. Холино- и адренорецепторы амниона куриного эмбриона // Тез. докл. Всесоюзн. конф. "Механизмы действия медиаторов и гормонов на эф$екторные клетки." - Суздаль. - 1989. - С. 26.

3. Бойко О.В. Регуляция сократительной активности амниона куриного эмбриона в процессе его развития // Тез. докл. vi Всесоюзной конф. по биохимии мышц. - Тбилиси. - 1989. - С. 26-27.

4. Бойко О.В., Манухин Б.Н. Холинэстераза в амнионе зародышей кур // Онтогенез. - 1989. - Т. 20. - N 3. - С. 258-262.

5. Бойко О.В., Манухин Б.Н. Холинергическая реакция амниона куриного эмбриона // Я. эвол. биохим. физиол. - 1989. - Т. 25. - Н 6. - С. 742-748.

6. Бойко О.В.. Селиванова Г.П. Динамика содержания катехол-аминов и ДОФА в ашгаогической жидкости и. амнионе куриного эмбриона в процессе развития. // Тез. докл. V Всесоюзной конф. "Физиология и биохимия мэдиаторннх процессов." - Москва. - 1990. - С. 41.

7. Бойко О.В., Селиванова Г.П., Манухин Б.Н. Катехолемины и

.ДОФА в амшгатической жидкости и амнионе куриного эмбриона /7 Ж. ввол. биохим. физиол. - 1990. - Т. 26. - N Б. - С. 630-635.

8. Бойко О.В. Особенности реакции амниона развивающегося куриного эмбриона на индоламины // Тез. докл. Всесоюзного симп. "Физиология медиаторов. Периферический синапс." - Казань. - 1991. -С. 17.

Подписало в печать 21.02.92. Заказ 534. Формат 60x84/16 Тираа 100

Москва. Типография РАИН