Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование линадной специфичности, локализации и функциональной роли некаталитических участков межмолекулярного взаимодействия сериновых протеиназ

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование линадной специфичности, локализации и функциональной роли некаталитических участков межмолекулярного взаимодействия сериновых протеиназ"

НАЦЮ НАЛ ЬНА АКАДЕМ 1Я НАУК УКРА1НИ

1НСТИТУТ БЮХ1МН ¡MeHi O.B. ПАЛЛАД1НА

<°гб од

g 3 jqc.~> На пРавах рукопису

ЗЕРЬОВКА Серий Вжторович

Дослщження лЁгандноТ спецшф1чност'!3 локал/'зацп та функционально/ ролi некаталйтичних дшянок м!жмолекулярноУ взаемоди серинових протешаз

03.00.04 - Бюхшя

Автореферат

дисертацп на здобуття наукового ступени доктора бюлопчних наук

К и I в - 1 9 9 6

ДисертавдЕю в рукопис. Робота виконана в вцщШ xiMii та öioxiMii ферментов 1нституту öioxiMi'i iM. O.B. Паллад1на HAH Украгни

0ф±ц1йн1 опоненги: доктор С1олог1чних наук, професор

Ббл1к Якоб Васильевич

доктор бюлоПчних наук, професор Виноградова Руфхна Петровна

доктор бЮлоПчних наук, професор KiöipeB Володишр Костянтинович

Провздна устаяова - 1нстигут молекулярной бЮлогзЛ

i генетики HAH Украйни

Захист дисергацП В1дбудётъс.я "20* сДлеЖ&^Си 1997 р. о 14 годин! на вас1данн1 спещалпзовано! вчено! ради Д 01.84.01 для аахисту дисергащй в 1нсгктут1 öioxlMi'i 1м. О.В.Падладхна HAH Украши за адресою: 252501, ы.Ки!в-20, вул.Леонтовича,9.

3 дисертащвю можна ознакомиться в (51бл1отещ ¡нституту öioxiMi'i iM. О.В.Паллад1на HAH Украши

Автореферат розз.сланий грудня 1996 р.

Вчений секрету спец1ад1аовано1 вчено"! ради канд.б1ол.наук

KipceHKo 0. В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОЕОТИ

АКТУАДЬН ЮТЬ ПРОБЛЕМ. Визначення махаю зм!в регуляцП ферментов б одн!бю э кардинальних задач ензимодогП. Серинов! прогеана-зи, маючи едкяу для всього клаоу будову г1дрол1тичного центру, вадргзняються м1ж собою за спещфхчнютю, що обумовдюв виконання ксжаим коккретним ферментом його ф1заолог1чних функщй. Налравле-н!сть Д11 серияозкх протехназ на той чи 1ший пептндний зв'язок субстрат1в чи 1нг1б1тор1в здшснювться некаталНичними д1лянками м!жмолекулярно1 вза&мод!'! ферментов. На сьогодк! в1доыо дза види такого роду д!аянок - зв'язуюч! та ефекторы!. Вважаеться, що взав-мод!я зв'язуючих дхлянок з 21дпов1дяими ашнокислотними залшками субстрату сприяе ор1бнтацН г1дрод1тичного центру на вадповаднкй пептндний зв'язок, тод! як вз.дносно рол! ефекторно'1 д!лянки оери-нових проте!наг «одно! ¿нформацП немав. Все61чне вквченнн дхлянок обох тшпв являб собою задачу, актуалъну як з наукового, так 1 з практичного боку, оскхльки сгриман! дан! не т!льки дозволяють зро-зумИ-и мбхан1зш регуляцп протеолхзу, мокуть бути використан! для препаративних щлей, а також створюють необх!дн1 передумови для Цллеспрямованого втручакня в опосередковзн! сериновими проте!наза-ми б!ох!м!чн! процеси.

МЕТА I ЗАДАЧI. Метою дано! роботи Суло визначення локаизацП, л1гандно1 спецкф!чноот1 та функщ овально! род1 некатап1тичних д1-лянок м1шолекулярно1 бззбмод!! серинових проте!наз двох равйв структурно"! складности Вивчення д1лянок основного ферменту ф1бри-нол!тично1 систеыи кров1 - плаэм!ну та його проферменту - плазма.-ногену - було епрямозане на з'яоування л!гандно"! специфхчностх та розтаазування по домена}/ молекули присутшх в даному фермент! д1ля-нок зв'язування. Д1лянки сершгавих протеаназ найпрост!шого -- Х!МОТр1ШСИН-ТрИПСИКОВОГО типу - досл1дяуБалися головнш ЧИНОМ 3 нап1втехнолог1чною метою створення аф1нних сорбенИв, придатних для вкдыення та очистки зазначенкх проте1наз.

В зв'язку з Ц1ЕЮ метою Суло поставлено так! задач!г

- комб!нованим застосуванням метод!в афшно! хроматографа! та обыеженого протеолазу виэначитя л!гандну специф!чн!сть та встано-вити локагйзавдю за знаходжекням по доменам молекули зв'язуючих д!лянок плазм!ногену ладини;

- синтезуваги групу афшних сорбент1в з низькомолекулярккми

л!гандами га провести 1х поравкяння а точки вару х1мотршсик-трш-синово1 селевтивност1 та придатностх для препаративного видхлення сершових протекав;

Отримат дана свадодыш про наявнасть в серинових проте1назах додагково! дхлянки мажмолекулярно! взазмод!!. Для П досл1дження було поставлено додаткова задача розробки принципе методу фермент- ф1ксованого вощу, сформулюваякя структурних вимог та синтезу необхадних ефектор!в з подальцим досл1дженням дпгакдно! специфичности., локал1зацп та функщокзльно: рол! щб1 далянки.

НАЙТОВА НОВИЗНА I ПРАКТИЧНА ЗНАЧИМ1СТЬ. В наслхдок проведение доаШджень встаноЕлено ряд нових фундаментальнее даних щодо специ-ф1чностх, доказазацП та функцхокалъно! рол1 некатадатичних делянок м1зшолекулярно1 взавыоди сершових протегназ. Доведено асну-вакня в плазм1ноген! людини арг1н1л-8в'язуючих далянок, що дозволило обгрунтувати Оазовану на зх участ! модель регудяцЗЛ фЮрино-ло.гу. Вперше встановлено локалпзацхю в активному центр! та вивна-чеко фуккц!скальну роль ефекторноз да.лякки серинових протеа.наз, показано II роль в природн!й регуляцп протеолхзу та в цз.лз.й низщ аномальних проявзв ферментативно! актлвност1. Вкявлення в бикових 1нг1б1торах та проформах б!лк1в д1лннкк падвшцено! спорхднекоста до активного центру серинових яроге1наз, котра веобх!дна для вико-нання ними сво!х ф1з1олоПункх функщй, створюе передумови для цз.-леопрямованого втручання в обумовлен1 сериновими протеа.назами ре-гулящйн! процеси. Синтезовано груду аф1нних сорбентав та дослужено 1х придатШсть для препаративного видЛленкя серинових прогез,-наз,

ОСНОВЫ ШЮКЕННЯ, ЯК1 ВИНОСЯТЬСЯ НА ЗАХКСТ. В результата проведено! робота отримзно ряд нових фундаментальных даних про дз.лян-ки м1зшолекулярно! взаемодзЛ серинових протез.каз:

- Дослз.джено лхгандну специф1чн1сть та встановлеко локалазадаю д1лянок м1жмолэкулярно1 взаемодзЛ плазмхногену (плазм!ну) людини. Доведено 1снування двох видав зв'язуючих д!лянок плазмхногену -л!зин- та арганы-зв'язуючих. Л1зик-зв*язуюч1 д1лянки е двол!ганд-ними, тобто взаемод1ють з зарядженши парами типу л!зил-карбоксил чи арг1н!л-карбоксил. Доведено, що так! пари не обов'язково мають налехати до одн!в! С-юнцэво! молекули лазину чи арган1ну. Арга-нхл-зв'язуюч1 дз.лянки е однолхгакдними, тобто взазмод1ючкыи з ар-Г1кильнии аалшком полапептидного ланцюгу. Жзин-зв'язуюча д!лянки розтадювзн! в кринглах 1 та 4 молекули плазм1ногену, тод1 як аргх-

Н1Л-БВ'яэуш1 знаходяться в крингл! 5, легкому ланцюгу та фрагмен-И К1-3 плазкпну.

- В лхгандн1й специфичности л!зин-зв'язуючих д!лянок крингл!в 1 та 4 визначеко в1дмз.ну: коли перпгай 8 них здатен однаково ефек-тивно взавмодгяти як з парою л1аил-карбоксил, так 1 з парою арг1-Н1 л-карбоксил, то у другого Л1гандяа специфачшсть обмежена взав-мод1бю з парою лхзил-карбоксил. Доведено можлив1сть участ! лхзин-зв'язувчо! дишкки кринглу 4 в м1жбз.лковкх взаемод1ях.

- Еиявлення вхдмхнних е!д лазпк-зв'язуючих аргШл-зв'язуючих д1лянок дозволило обгрунтувати новий мехззпзм налравленост1 дП плазмхну на ф1брин, в основ1 якого лежать конкуренщя арг1н!л--зв'язухзчих д!лянок з активним центром, цо спричиняе до розщеплен-нл в ф1бршп одних лише л1ззш>них зв'язьпв.

- Досл!дження дХллнок мажмолекулярко! взабмодп зимотрипсин--трипсинових серггаовкх проте1нзз привело до виявленнн язица 52*-стимулящ5 - важливо! складозо"! частики механизму регуляц!! протеол!зу. Вперше встановлена локал1защя та з'яоовано функщо-кальну роль ефекторно! далянки оеринових проте1наз. Нею е Эг'-дх-лякка активного центру, котру зад!яко в основник регулкщйних процесач протеол1зу - активац!! б!лк!в-попередншив до активних форм та обмеження г!дрол!тичко1 дП фермент1в внасладок утворення стзб1льних комплексхв з сершнами.

- Досл1джэяня явища аг'-стимулящ! серкнових протез.наз проведено вперие розроблеким та не мэючиы аналог!в методом фермэнт-фш-соЕаного зонду, що базувться на стзореннх передумав для вмщення частини молекули ефектора в слабозв'язуючу д!лянку фермента за рахунок гарантованого захоплення !кпю1 структури ефектора сюгьно-зв'язуючою дХлянкою. Вм1щення в ефекторну дхлянку адекватного за специф1чн1стю л!ганду викликае посилеаня як каталИичних, так 1 зв'язуючих властивостей ферменту (г^'-стимуляц!!).

- 0триман1 дан! дозволили з'ясувати причини, вкасл!док яких б!лков! !нг1б!тори оеринових проте!наз не г1дрол1зуються ферментами, а утворюють з ними стаб1льн1 комплекс«, а такох пояснити висо-ку опор1днен!Сть фермент1в-активатор!в до д1лянок активащйного розщеплення в 6!лках-попередникзх.

- Показано, що яввде Бо'-стшуляц!"! лежить з основ! ц!лого ряду аномальних проявив ферментно"! активное?! в неф!з1олог!чних штучних умовах - суботратн!й активацИ фермент1в, перетворенн! слабозв'язуючкх сориеят!з в сильноБЗ'язуюч!, промотуванн! гадролх-

зу ацил-ензш!в та Анших.

- Синтезовано трупу аф1ннил оорбент1в та доведено првдазтстъ юлькох з них для препаративного видглення серинових протеаназ. Сформульовано структура вимогк, котр! дозволяютъ отримувати аф!н-Hi сорбенти з наперед задано® специф1чнз.стю.

Отриман! дан1 мають не лише наукове, але й практстчне значения, оск!лъки створюютъ передумови для регуляцН ферментативних проце-ciB на б1лып високому piBHi та можуть бути використат для роз-робки нових препаративних методав.

АПРОБАДШ РОБОТИ. OcEOBHi положения роботи викладено та обговорено на: IV Всесоюзному сшлозА'уш'Чнженерна ензимолог1Я"(Ктв, 1S83), IV Всесоюзному симпозиум! "XiMiH б1лк!в та пэптщЦв" (Рига, 1984), Всесоюзных конферетцГ'Методи отримання, акал1зу та гасто-оування ферментхв"(Юрмала, 1930), Всесоюзна нарад! "Б1олог1чно активыi речовини ПдробЮнт1в - нов! л1карсько-проф1лактичн! та технхчн1 препзрати" (Владивосток, 1991), VI Укра'Шському 6ioxiMi4-ному з''!зд1 (Kkib,1992), 2nd Conference on Molecular Recognition (Pecs,Hungary, 18-21 August 1996), 3-ifi конференцп 6ioxiwiKiB Уэбек1стона ( Ташкевт,11-13 листопада 1996).

ПУБД1КАДП. Оснсвний BMiOT роботи викладено в 21 науков1й

публ1кацп.

СТРУКТУРА I ОВ'Ш РОБОТИ. Дисертад1йна робота включав розд1ли: вступ, огляд латератури (4 ш.дрогд!ли). власн! досл!дження (3 Шд-розд1ли), обговорення отриманих результат, висновки та список використанох л1тератури (635 дкерел). Робота викладена на 321 сто-piHui машинописного тексту. Текст дисертацП 1люстровано 39 малинками та 8 таблицями.

ИАТЕР1АЛИ I КЕТОДИ

Отримання форм i фрзгм5нт!в плазьйногену людини. ГЛУ-плазм1но-ген лодини вид i ля ли is св1жл цитратно! плазми кров i методом аф!нно! хроматограф!I на лхзкн-агароз! (Deutsch, Mertz, 1970). Bei етали очицення для запоб1гання перетворенню ГЛУ-плазмшогену в Л18-плазм1ноген проводили при температур! 4°С в приоутност! панкреатичного iHriöiTopy трипсину ("Контрикал", НДР).

Л13-плззм1ноген вид!ляли в фракцП III плазми за Коном афанною хроматограф1ею на л1зин-агароз1 (Deutsch,Merts,1970). Bei етапи вщцлення проводили при к1мнатн1й температур! за в1дсутност1 isriGiTopiB плазмгну.

АктивнЮть отриманих препаратов плашокогеву визначали казег-нолхткчкш методом (Rabbins, Simiari а, 1970). Використан! в po6oii препарата плазмХногену мали потекщйну актившсть 14-20 каэе1нол1-тичних одиниць на мШграм б1лка. Препараты Л13-плагм1ногену ыали не больше 5' спонтанно! активносто.

Для визначення М-ыяцево! ашнокислоти використовувався дан-силхлориднкй метод (Chang1 J.,Brayer D.1978). К-ьакцезою ам!нокис-

LYS-ПЛАЗШНПГЕН

V.

|еластрл!з| (ме ацетшшвзння [

Ki-3 К4 М1к1плазм1ногэн Важкий i Легкий

сэ

га

со

Q

SB Г Л С К 3

ланцоги плазману _I

¡еласгод!з|

«5

Рис.1. Схема отримання та ДСН-електрофореграми застосованкх в poSoTi форм та фрагментов плазмакогену: А - ГЛУ-форма плазмо-ногену; Б -JIIS-форма плазьаногену; В - важкий ланирг плазмхну; Г - легкий лаквдзг плазмгку; Д - фрагмент Kl-3; Е - крингл 4; Е - мШ-плазмоноген; 3 - крингл 5.

лотою в ГЛУ-плагшноген1 була глуташнова кислота, в Л13-плазм1но-гек1 - л!зин si ол1дами зад1ну та лейцину.

Важкий та легкий ланиюгк плазм1ну було отримано обмеженим в:1дноЕленням плазм!ну (Wiiisn,1977).- Плазм1ноген активували до плазм1ку стренток1назою ("Streptase", Швещя), п1сля чого в1днов-дювали MixuiaHiporoBi вв'язки 0.1 М е-меркалтоетанолом. В1дновлен1 сулъфг1дрилън1 групи карбоксиметилювали О Л М монойодоцтовою кислотою з подальшш переведениям 61лку в 0.1 Ы Ка-фосфатний буфер рН 7.4 га допомогою гель-ф1льтрац11 на сефадекса G-25. Важкий та легкий ланцюги плазшну розд!ляли аф!нною хроматограф! ею на л1зин--araposi, гдсля чого д1ал1вували проти води та тддавали л1оф1ль-к1й сушц1.

Фрагмента К1-3, крингл 4 та мШпдазм1кагек отримували обмеженим протеол1зом Л13-плазы1ногеку еласгазон ("Sigma", США чи "Spo-fa", ЧССР) з подалыпим розподхлом на колонках з л1зин-агарозою та сефадексом G-75 (Novochatny et al.,1984).

Крингл 5 молекули плагм1когену отримували обмеженим еластолхзом важкого ланцюга плазмз.ну з подалышш в1дд1декнкм не маючого л1зин-зв'язуючкх властивостей кринглу 5 на л1зин-агароз1 (Novochatny et al.,1984). В дослхдах використовувались лише еле-ктрофоретично чист1 б!лки та ix фрагменти (Fho.1).

КонцектрацП б1лк1в в розчшп визначали спектрофотометрично за поглинанням при 280 нм в1дпов1дно до е!дош1Х з л1тератури коефщг-shtib. Для вквкачекня чкстоти прэпаратхв плазмгногеку та його фрагмент1в вккорштовували електрофорез в полаакриламгдному гел! з використанням трис-боратно! скстеми (Cummins,Perry,1973) га сис-теми сечовша-оцтова кислота (Panyim,Chalkey,1969).

1онообм1нна хроматограф1я на ДЕАЕ-сефадекс! А-БС застосовува-лаоь для розд!лення ГЛУ- та Л13-форм плазьцкагену (Wallen,Wii?ian, 1972), КМ-сефадекс С-50 застосовувався для очищения фрагменту гшазьйногеву Kl-3 (WinrijHochschwender, 1980).

Отримання та характеристика препаратов лротеол1тичного комплексу з п1лоркчних додатк!в лососевих риб. Наважку л1офШзоваких пглоричних додаткйв гомоген1зувэли з подалыюю екстракЩЕю 0.001 и розчином СаС12 та вадокремленням нерозчгапшх компонент!в центрифу-гуванкям при 6Q00 g. ВмЮт б!лку в центрифуга^ визначали за методом Лоур! (Lowry,Rosenbrough,1951). Визначення трипсин- та х1мотршсин-под1бних активностей проводили спектрофотометрично з використанням для визначення трипсину метилового чи еталового

e$ipiB N-ßensoiJi-L-apriHiHy, для х!ыотрипсину - в1дпов1дних eJipiB N-6eK3oia-L-Tipo3HHy (Schwert,Такsnaka,1955).

Синтез та характеристика афхнних сорбент-1в для вид1лення та дасл!дження форм та фрагмент1в плазмглогену дюдини. Для вид1лення форм та фрагмент1в плазм1ногеку, котр! мали л!зин-зв'язуюч1 влас-TKBocTi, використовували !ыобз.д!зований на ВгСН-активаван1й агаро-si л1зин (March et а1.Д374). ЫоСШззщю гексаметилендаатну та гл1цину проводили аналоггчким способом, з т1ею лише в!дм1кою, що зам!сть л1зкну брали у в!дпов!дн1й пропорцП гексаметиленд1ашн та гл1цин. Етериф1кад1я карбоксилъких труп проводилась етиловш еф1-ром д1азооцгово1 киолоти (Searle,1956). Гуаьпдуванкя ашногруп проводили сульфатом метшизосечовини (Roche et al.,1954).

Ильтсть 1моб1л!зованих ам!ноккслот вкзначали на автоматичному анализатор! ААА-881 п!сля 12-годинного г!дрол1зу 6 н соляною кислотою при 105°С. К1льк1сть б1льк1'1х aviiHorpyn визначали спектрофогометрично за допомогою 2!4;6-грин1тробензол-сульфокисло-ти (Satake et al., 1950).

Синтез аф1нного сорбенту та вид1лення на ньому трипоин-под1б-них ферм&нт1в з мульгиферментного комплексу Шлоричних додатюв лососевих. Синтез аф!нного сорбенту для вщцлення трипсин-под1б-них проте!наз проводизся за аналог1БВ з методом (Kumazaki et al., 1976) i складався з синтезу лхганду - гл1цт1-гл1цил-Ь-арг!н1ну -- та його ¿мобШзацП на активованз.й бромщаном агароз!.

Умови аф1нко-хриштограф1чного вщцлення трипсину на колонц1 з отриманим сорбентом було п1д!брано в!дпов!дно до поставлено! зада-4i. На зашвнену сорбентом колонку наносили розчин екстракту п1ло-ричних додатк!в лососевих б 0.1 Ы фосфатному буфер! pH 6.2. • Bei хромзтограф1чн! операцП проводили при 4°С. Несорбований матер1ал змивали 0.1 И розчином КаИ в 0.15 М фосфатному буфер! pH 6.2, П1сля чего елкзювали спецкф!чно зв'язаний б!лок за допомогою 0.1 М розчину б-зшногексаново! кислоти, pH 10.4. Досягнуто 19.5-кратне зб!льшення литомо! трипсиново'! активное!i за 71,"-ним виходом Bifl загально!. Уамогрипсиново! активност! огримании препарат не мав.

Синтез групи аф1нних сорбент!в з л1гандами Пдрофобно! природи та вщцлення на них х!мотрипсин-под10них проге1наз. За спейсер--вм1щувчу нерозчинку матркцю для групи сорбенпв з л!гандами Пд-рофобно! природи служила аШногексил-агарозз, отримана 1ММоб1л1за-ц1ею 1,6-д1ам!ногексану на BrCN-активованай arapesi (Cuatrecasas, 1970). BMicT вхльних ашногруп визнзчався спектрофотометрично з

використанням 2,4,б-трш1тробензол-1-сулшфокислоти (Satake,1960). N-BenBoiJibHi, N-тозшеьнз., М-трет-бутилоксикарбон!льн! та Н-карбо-бензокси-пох1дк! в!дпобЗднйх ам!нокислот синтезовано за в!домими методиками з подалъшою активаЩею отриманих поздних хлористим Пеналом та 1шоб1л1зац1ею на ашногексил-агароз1. BMiCT iM06iii-эоваких аминокислот вкзнаиався аналазом солянокислого г!дрол1зату ваважки сорбенту i в1дпов1дав йлькост! в!льних ам!ногруп ка вих1дн1й матриц!.

Синтез субстрат!в та ефектор!в. Еикористан1 в робот1 субстрата та ефектори Суло синтезовано лабораторп зг1дно з описаними в л1-тератур! методиками. Застосовак! для визкачення х1мотрипсян-под1б-Ho'i aKTHBHQCTi еф1ри Ы-бензо1л-Ь-т1розину отримували етерифхкащвю N-6eH3oii-L-Tipo3iiHy в насиченому сухим хлористим воднем в метиловому чи етиловому спиртi (Kaufman,1949). Для вкзначення трипсин--nofliSHo'i активностi використовувались в1дпов1дн1 еф!ри N-бензо-ia-L-apriHiHy ф1рми "КеапзГ'(Угорщика). Я-глутарил-1_-фен1лалан1л--пара-н1троанхл1д (GPNA) синтезовано взаемодаею гадрохлориду Ь-фен1лалан1л-хлориду з п-в!троанШком з подальшою обробкою глу-таровим анПдридом (Erlanger et el., 1966). Пдрохлорид 1-фен1лала-нз.л-хлориду отримували взаемод1ЕВ Ь-фен1лалан1ну э п'ятихлористим фосфором (Blackwood et al.,1965). Пара-н1трофек1л-ацетат (AcONP) синтезовано ацилюванням п-нйтрофенолу оцтовим анггдркдом (Hug-gins, 1947). М-карбобензокс11-1-ам1но-5-фен1л-пентаЕ отримаво карбобензо-ксилшванням е-фенза-н-атдаману (Merck,1911). Ы-бензо1л-5-ам1но--1-фен1л-пентан отримували сполученням за Фр1делем-Крафтсом N-бен-зо1л-£-хлорам1лам1ну з бензолом (Merck,1911). К,Ы'-ди-карбобензок-си-1,3-д1ам1но-пропан синтезовано карбобензоксилюванням l,3-fiiani-нопропану в лужному середовизр. (Гр1кштейн,ВШц,19б5). l,5-6ic--дибензшгашно-пектан синтезовано сполученням 1.5-д1ам1нопентану э бензальдег1дом з подальшим в1дновленняы утвореного бензил1дену боргадридоы натр!ю (Lerman,1953). 1,2,3-тр1с-три-в-фен1летилам1но--пропан синтезовано взаещгцею в зяпаян!й трубц! в-фен1летилам1ну з 1,2,3-трибромпропаном в етанольному розчио протягом 18 годин при 105°С з подальшою трикратною перекристал1зац1вю отриманого тршчдробрашду. 0-фен1Л-етидатн отримано Б1дновленням бензшщ!а-н!ду алюмог1дридом л!т1ю (Беккер та Irani,1979).

Чистота та склад застосованих субстрат!в та ефектор!в контро-лювалась методами тонкошарово! хроматограф!'i, елементного анайзу та Б1дп0в1дтстга ф1зкчяих характеристик лгтерагурним даним.

?у'6ТРдИ БК5Н5Ч6НКЯ СП£ЦИф!чН0СТ1 ЗБ * ЯЗУТОЧКХ ДОЛЯНОК фирМ 1

фрагмент1в плазмоногену додини. Специфачшсть зв'яэуючих дглянок плазм!ногену та йсго фрагментов вкзначали двома способами:

а) Дослхдженкям десорбушо! дп л!ганду. На уровноважену 0.05 М фосфатним буфером рН 7.4 колонку з аф1нним сорбентом наносили досл!джуваний С!лок в тому ж буфер!. В!д неспециф!чно! сорб-ц!! звольнялись промивкою колонки 0.5 М розчином хлориду натр!ю в тому ж буфер! дота, поки потдинання елюату при 280 нм не досягало 0. Шсля цього проминали колонку робочим буфером* та елкковали специф1чно сорбовзний С!лок разними концентращями досл!джуваного логанду. Воо розчини мЮТили 0.05 М фосфатний буфер рН 7.4.

б) Сорбщя б присутносП л!ганду. Колонку з сорбентом поперед-ньо ур!вноБажували розчином л!ганду. Дослодкуваштк б1лок наносили на колонку в розчик! л1ганду, пЮля чого коленка проминалась розчином того ж л1гзнду. Проминали колонку 0.05 м фосфатним буфером рН 7.4 та вкзначали десорбуючу д!ю 3.ншого л1ганду.

В ;-сроматограф!чйкх досл!дах Еикоркстовувади реакткви квалаф!-кац1! не нижче "ЧДА" або перекркстагпзовак!.

Методи визначнння залежност! х!мотрипсин-трипскново1 селектив-ност! аф!нних сорбент1в в!д структури !моб!л!зованого л1ганду. Пор!вняльне розд!лекня хомотршеин-трипоин-подобних протехназ на груп! сорбент!в з л!гандами г!дрофобно! природи проводклося по стандартной методищ, розробленой з урахуванняы раноше отриманих даних про рН-оптимум протеол1тшно! активност! комплексу (Швненко тз !шп1,1989) та биходячи з емтастних характеристик ран!ше досл1д-жуваних сорбентов (Ашшн,1985). На колонку, запевнену досл!джува-ним сорбентом, наносили розчия л!оф1льно висушеного екстракту полоричних додатк!в лососевих в 0.05 М фосфатному буфер! рН 7.7. Во! хроматограф!чн! операцП проводились при температур! 4°С. Несорбований матер!ал змивали 0.05 М фосфатним буфером рН 7.7, а потом - 0.04 М натрой-ацетатним буфером рН 5.3. Десорбц1ю специ-фочно зв'язаного б!лку проводили 0.001 М НС1 з негайним доведениям рН елюату до 7.8. Отршан! дано щодо Емкостей сорбенПв, колькосто спецкф!чно зв'язаного болку, кого питомоо та загально! трипсинозоо та х1мотрипсиново1 активностей наведено а Таблиц! 1.

Мбтоди досл1дження впдиву ефектор!в на активность а-хомотрип-сину. Вплив ефэктор!в на г1дрол1тичну актившеть й-х1мотр1шсину вкзначали з використалням кизькомолекулярних сштегичних та висо-комолекулярних болкових су5страт1в. В ус!х дослодах ааптосавано

кристалйчний а-х!мотрипсик марки "А" Олайнського заводу х1мреакти-в1в (JlaTEia). Визначення естеразко! активност1 «-хшотрипсину в присутност! р!аних концентрац!й и-карбобензокси-1-ам!но-5-фен1л--пентану проводили спектрофотометрично з використанням субстрату -- М-бензо^-Ь-тхровил-метилового e$ipy (Schwert,Takenaka, 1955). Вплиз концентраци досл1джувэких ефектор!в на ам1дол1игану активность проводили спектрофотометрично з вастосуваннам в якоот1 субстрату М-гх/гарил-Ь-фен!лалан1л-пара-нхтроан!д1ду (Erlanger et al. ,1956). Кхнцева концентрац!я субстрату становила 400 мкМ, тодх як кондентрад1я ефектору ксливалась в1д 0 до 12 Ш в концентрац!й-ним 1нтервалом 1 мМ. Протеслхтичну активн!сть визначали спектрофотометрично по поглинанню при 280 нм з вкористанням в якостх субстрату 2%-ного розчину кристаичного алъбуьпну людини ("P.eanal", Угорщина) та осадженням нег!дрол1зовавого б1лку 10"-ною трихлороц-товою кислотою. Визначення впливу кокцентрацхх 1,5-б1с-дибензил-ашно-пентану на к!н&тичн1 пзраметри опосередкованого cc-xiMOTpîin-сином катал!гичкого процесу проводилося з використанням в якост1 cyGcTpariB М-глутарил-Ь-фен!лалан!л-пара-н1троан1л1ду та пара--н!трофен1л-ацетету. Визначення ашдолхтично"! активност! по GPNA проводили за дещо змхнениму методом (Erlanger et al.,1966) в flianasoHi концентращй субстрату в1д 0.1 до 1 ыМ. Вплив 1,5-б!с--дибензилам!но-пентану на г1дрол!з пара-н!трофен1л-ац9тату визначали спектрофотометрично (Клесов та !нш1,19?4). Кондентрац1я субстрату стал овила 0.5 Ш чи 1 мМ, концентрац!я ефектора коливалась в fiianaaoHi в!д 0 до 10 Ш з ¿нтервалом в 1 мМ. Константа дисоща-lii'i взавмодН й-х!мотрипсину з 1,5-и!с-дибекзилашно-пентаном визначена методом флуоресцентно'! спектроскоп! ï з тдрахуванням результатов за Скетчардом (Chumachenko st al.,1990,Scatchard,1949) i становить 1.6±0.14 мМ.

РЕЗУЛЬТАТА TA ÏX 0ЕГ0В0РЕШШ

1. ХАРАКТЕРИСТИКА ТА Л0КАЛ13АЦШ Д1ЛЯН0К М1ШЖКУЛЯРН01

ВЗАШОДП ПЛАЗШНПРЕНУ ЛВДИНЙ

Для дослхдження лхгандко! специфхчностх зв'язуючих дхлянок плазмхногену людини Суло застосовано сорбенти на основ! агарози, KOTpi мхстили лхганди - структуры! аналоги л!зину та apriHi-ну в полхпептидному лакцюв! (рис.2). Сорбенти А та Б, окр!м анало-riB л1зильних залишкхв, мхстять в!льнх карбоксильнх групи. Карбок-сильн1 групи сорбенту А знакодяться на задзн!й структурою молекули

JliSHHy BiflCTSHi в!д 3MÍH0-груп, ЩО flOpiBiroS 0.68 HM, Tofli як карбоксилън! та ам1-ногрупи сорбенту Б знаходять-ся на випадкових в1дстакях. Аналог!чно, в сорбентах Г та Д карбоксидьн1 групи знахо-дяться або на ф1ксован!й вздетая! з1д гуаяхдильних труп (Г), або на випадкових в!д-станях (Д). В сорбентах В та Е карбоксильн! групп блокова-Ki етериф!кац!вю i в!льними в липе oMiHO- чи гуан!дильн1 групи.

Л1гандна специф!чн!сть лхзин-зв'язуючих дыянок плазм!ногену дздкки. На рис.3 подано результаты взаЕмод!! Л13-плазм!когену з сорбентами, ща м!стять бм!но- та карбоксильн! групи (рис.ЗА) та лише атногрупи (рис.35). В пор!внянн! з л!зин-агарозою сорбент з комбiвовзним л!гзвдом в!др!зняеться С!льшою неспециф1чною та мен-шою специфичная сорбщяш. Оск!льки для л!ганд1в л1зин-зв'язуших д!лянок оптимальна в!дстаяь м!ж ам!но- та карбоксильной групою стаковить 0.68 нм (Winn et al. ,1980), зрозум!ло, що лише частика пар aMiH-карбоксил виявиться придатною да вззгмод!'! з л!зин--зв'язуючиш дздянкэыи плазыхногену. В той же чао наявнхеть специ-ф!чно! взаемодП плазм!ногену э сорбентом, у котрого ам!но- та карбоксильн! складов! л!ганду не належать до одкхе! молекули д1зи-ну св!дчить про те, цо у вкладку míxCískobik взавмод1й лхгзядом л!зик-зв'язуючо'1 д!лянки можэ бути не лише С-к!нцевик л!зин, зле й пара л1 зил-карбоксил, що належить до р1зних залилтз ам1нокислот. Взабмодхя плазм1ногбну з сорбентом, зцо кастить лише амхногрупи, як i у випадку сорбц!! плззм1ногену кроля на ам!нопентил-агарозх (Hatten, 1975), повнЮтю руйнувться 0.5 M розчином NaCl. За менших зязчень йонко! сили цв взавмодхю може бути зареестровано та досл1джено методаШ'1 фронтально-KiübKic .-но! афгино"! хроматограф!ï. Отркман! дан! глдтверджують припущення (Christensen,1984) про юнування в плазм!ноген! вхдмхнних в!д л1зин-зв*язуючих д1лянок, що потребують в hkoctí л!ганду лше задгаюк ооновно! ам1нокислоти - л1зину чи apriHiHy.

А i СООН ^Н-СН-Щ)^ г à СООН » 1 лщ г'-сма^-сЦ

Б |N-(CH2)6-!ÍH2 А ж iK-CHj-COOH

в ч ;=N-CCHj)6-KKJ, Е

Рис.2.

л о - -Ii.

is

2

1

2

l

л

70

В

А

Проф1лх елюцп Л13-плазм1ногену з оорбент1в, що ы1сглть auiHO-тз кзрбоксильш групи (А) та тхльки амхногрупи (Б). Стр1лками в1дмхчено елюцП: 1-0.5 М роачкном NaCl; 2 - 0.2 М розчином 6-аыхногек-сзнобох кислоти.

Рис.3.

о

10

is го. номер Фраки,! i

Вхдмхни в л1тандн1й спедифхчност1 д1зин-зв'язуючих д!лянок Р1эних форм шгазманогену дгодинк. ВзаемодП з константами дисоща-цП понад 10_ЭМ для aiiEKO'i хроматограф! i практичного значения не мають (Graves,Wu, 1374). Е ГЛУ-плазм:шоген1 в лише одна, локал!зо-Еана в кринглх 1, досгатня для афхнного зв'язування д!лянка взав-модП з й)-ам1нокарбоновими кислотами (Marcus et al.1980). В Л13--плазм1ногенх таких дхляяок дв1 - в першому та четвертому кринглах (Marcus et al.,1979). Взажаеться, що л1аин-зв*язуюча д!лянка крин-гда 4 не придзтна для афхннох сорбщЗ, а отясе - i для м1жмолеку-лярних вза5Мод1й плазмхногену (Valx,Pathy,1982). Пор1вняння профх-д1в елацП оорбованих на л1зин-агарозх ГЛУ- та Л13-форм плазм!но-гену лШйним гард1ентом аргШну (рис.4) дозволяе припустити участь лхзин-зв'язуючо1 дхлянки кринглу 4 в оорбц1йному процесх. Якщо ГЛУ-плазмхноген елюеться гоотрим синглетним н!ком, то проф!ль елюцх! Л13-плазмхногену мае "плече", котре свхдчить про участь у сорбцхйному процесх двох д1лянок взаемодИ з л1зин-агарозохз, що в!дрхзняються Mi» собою за стхйкостю до елюци apriHiHOM. За елю-цх 1 0.1 Ы apriHiHOBHM розчином сорбованих на л1зин-агарозх форм плазмхногену ГЛУ-плазШноген десорбувтьея noBHicno, тодх як Л13 -- лише частково (рис.5). Отримат дан1 дозволяють припустити наяв-н1сть в Л13-плазмхноген1 двох, вхдьйнних MiK собою за д!гандною специфхчнхстю, л1зин-зв'яауючкх д1лянок. Мэнш специфхчнз здатнз конкурентно взаЕмодхяти нк з парою л1аил-карбокскл, так i з парою арПнхл-карбокоил. Б1льш специф!чна переважно взавмодхв з парою

£2аз

0.8" АРГИНИН, Н А о.р I \ 1 X

0.6- А \ ' 1 х / \ ' 4 / 1 \ 10,3'

о.г- 11 1 \ 1 /' А I М ' \ 0-г' 2 1 ' уЛ V 1 \У\ ^ * \ \ ..., .. -___

0 5 ¡0 15 20 25 30 номер фракцП

Бис. 4.

ПрофШ елюцп ГЛУ (-) та Л13 (---)-форм плазм!ногену,

сорбованих ка л1аин-агароз13 л1н1йн1ш град1Ентом арПн1ну. Стрдлками в!дм!чено елюцП: 1 - 0.5 М роэчином МаС1; 2 - Л1-нхйнкм град1ентом арПнгяу.

л1зил-карбоксил. Визначене язшце може бути застосоване для в1дд1-лекня нативного плазм!ногвау в1д деградозаних форм: при нанесенк! на ур1ЕН0важену 0.1 М роэчином аргШну колонку в лдзин-агарозога сушт розчинешх в тому ж розчлнд ГЛУ- га Л13-форм плазм!ногену аф!нно зв'язуеться та моле Сути десорбована роэчином б-ам1ногекса-нобо! кислоти лгаде Л13-форма плазм!ногену. ГЛУ-форма проходить через колонку розтягнутим тком, що св!дчзш> про конкуренцию за л!зик-зв'язуючу дЫянку м!ж молекулами дмобШэованого л1зину та розчивеного арпн1ку.

Рис.5.

ПрофШ елюцп 0.1 М арг1-ндковим роэчином сорбованих на л!зкн-агароз1 ГЛУ (- - -)

та Л13 (-)-форм плазм1во-

гену. Стр1лками в1дм!чено елюц!!: 1 - 0.5 М роэчином Май; 2 - 0.1 Н роэчином аргШну; 3 - 0.2 М роэчином 6-ам1ногекоаново1 кислоти.

Локал1зац1я д1зин-зв'язуючих дЦянок плазм1ногену дюдини. За нашими дакимк ГЛУ-плазма, ног ен мав лише одну, менш специфхчну, л1зин-зв'язуючу дишнку (рис 4 та 5). В Л13-плазм1ноген1 наявн1 як менш, так i б1льш специф1чнз д1лянки взаЕмодН з л1зин-агарозою. Виходячи з даних ¡подо докал1зац11 в зазначених формах плазмхногену далянок взаамодп з щ-амакокарбоновими кислотами (Marcus et al., 1979,1980), лог1чно припустит, що менш специфгчнз л1зан-зв'язуюча дхлянка знаходиться в першому крингл1, а б1льш специфична - в четвертому. Для лерев1рки цього припущэння досл!джувалися аф!кно--зв'язукт властквост! вшщуточих л1зин-зв'язуюч1 дЬтянки фрагмен-TiB плазм1ногеку по в1дношенню до л1зин-агарози та гомоарг1к!н--агарози - сорбенту з л1гандом - аналогом аргШну. 3 л1зин-ага-рози фрагмента К1-3 та крингл 4 повн1стю десорбуються 0.1 М apri-HiHOBioj розчином, тод1 як взжкий ланцюг плазм1ну веде себе подхбно до Л13-плазм1ногену, тобто частково десорбуЕТЬся 0.1 Ы apriHiHDBmi розчином i noBHicra - розчином б-ашногексаново! кислоти. 0.5 М розчин хлориду Harpiio noBHicrra десорбув з л1зин-агарози крингл 4 та мало вшшваБ на сорбц!ю важкого ланцюга плазм1ноу та фрагмента Kl-З. При нанесешп б2.лк1в на ур!вноважену 0.1 М аргШ-новим розчином колонку л1з!Ш-агарози ЗЕ'яэуеться та десорбуеться 0.2 М розчином 6-ам1ногексанов'1 кислоти один лише важкий ланцюг плазм1ну. 3 гомоарг1н1н-агарозою ЛШ-плззмхноген, важкии ланцюг плазы!ну та фрагмент Kl-З взаемодхють практично ^ентично, тобто специф1чно сорбуються, частково елюютъся 0.2 М розчином 6-aMiHO-гексаново! кислоти i познЮтю - 0.1 М розчином apriHiHy. Крингл 4 з гомоарПн1н-агарозою не Езавмод1Е (рис.6).

Рис. 6.

О • 5

10

15 20 2S- 30

_номер фрагащ

Профхл! елюцП з гомо-apriHiK-araposH взжкого

ланцюга плазм1ну (-),

фрагменту Kl-З (—) та крингла 4 (—). Строками в!дм1чено елюцП:

1 - 0.5 М РОЗЧИНОМ NaCl; 2 - 0.2 М розчином 6-ам1ногексаково1 кислоти; 3 - 0.1 М розчином apriHiF/.

При H3HscsHHi на вр1внозажеку 0.2 М роэчином 6-ам1ногексаново1 кислоти колонку з roMoapriHiH-агаровой важкий ланцюг плазм!ну та фрагмент К1-3 ведуть себе однаково - сорбуетъся та можуть бути десорбован! 0.1 М розчином apriHiHy. Отриман! дан! дозволяить

ПРИПУСТИТИ НЗЯВНХСТЬ ШИР0К0СПеЦИф1ЧН01 Л13ИН-ЗВ*ЯЭУЮЧ01 Д1ЛЯНКИ в

першому крингл1 молекули плаэманогену, а вузькоспецифйчно! - в четвертому кршгл!. Десорбщю 1зольованого крингла 4 0.1 М apriHi-новим розчином г лпзин-агарози може бути пояснено зменшенням зв'я-зувчих властивостей д!лянки крингла 4 в каслхдок його 1золяц15 з кативного оточення. Це припущення падтверджуеться численими даними (Lerch,1980,Winn et al.,1980,Marcus,1378) про значМ розбажност! у зз'язуючих властивостях плазыаяогену та його фрагмент1в. Нездакпсть хзольованого крингла 4 до сорбцП нз roMoapriHiH--araposi св!дчить про слабку спор1днен1сть кого зв'язуючо"! далянки до бзэбмодП з парою аргжл-карбокскл.

Арг1н1л-зз*язуюч1 д1дянки пдазм!ногену. Для перев!рки припу-щення про здатн!сть лШш-зв'язуючих далянок ефективно взаемод!яти з парою арг1н1л-карбоксил було синтезовано сорбенти, що мали як гуанадильн!, так i карбоксильн! груш. Б одному випадку в1дстань Mi» гуанздильною та карбоксильного трупами в nopiBHHHHi з молекулою apriHiny було aöiasaeHO на одну метиленову ланку (рис.7А), в другому ж випадку в1дстэш. м!ж гуан1дильними та карбоксильними трупами носили згазадковпй характер (рис.7Б). Як вт!кае з результат1в аф1нно-хроматограф1чних дослшв, зв"язуюч1 вдастивост! обох сор-CeKTis практично однаков1. В обох зипадках плаааноген спещ!ф1чно сорбувться, витримуэ промизку 0.5 М розчином NaCl, частково десор-буеться 0.2 М розчином В-ам1когексаново"1 кислоти i повнЮтю -- О Л М розчином apriHiny.

В присутност1 0.1 М apriHiHy зв'язуззння бхлку з сорбентами не в1дбуваеться. Отркман! результат« падтверджують припущення про 3flaTHicTb лззин-зв'язуючих д1лянок ефективно взаБмод1яти з парою apriHiл-карбоксил та св!дчать про наявндсть в плазм1ноген1 BiflMiH-них в1д л1зин-зв*язутих делянок взаемодП з аргШльними залишка-ми в пол!пептидному ланцет. Для з'ясування необХ1Дност1 для д1ля-нок цього типу каявност1 в л1ганд1 в1льно! карбоксильно'1 групп було синтезовано сорбент, що мЮтить одн! лише аналог-i арг1н!льних груп. Плазмхноген специф1чно зв'язуеться з сорбентом i не десорбу-еться Hi 0.5 М розчином HaCl, Hi 0.2 М 6-ам1ногексаново"1 кислоти. Десорбщя досягазться лише ОЛ М розчином apriHiny (рис.8).

Рис.7. Проф1л1 едюцП Л13--плазм1ногеку в гомо-аргШн-агарози (А) та в сорбенту, що МХСТИТЬ гузтдильн1 та карбок-сшька групи на вкпзд-кових в!дстанях (Б). Строками в1дм1чено елющл: 1 - 0.5 М розчином МаС1; 2-0.2 М розчином 6-ам1ногекса-Н0301 кисдоти;3 - 0.1М розчином арг!н1ну.

Рис.8.

Проф1дь едюцП Л13-плаз-м1ногену з сорбенту, що шстить л1ганди - аналоги аргШльних залшгав. Стрелками В1Дм1чено елю-ц!1I 1 - 0.5 М розчином КаС1; 2-0.2 М розчином 6-ам1ногексаново1 кисло-ТИ; 3 - 0.1 М розчином аргШну.

Специф1чне зв'язування в1дбузавтьск 1 за наявност1 0.2 М розчину 6-ам1ногексаново! кислоти. Сорбщя плазм!ногену на сорбента з л1гандом - аналогом арг1н!лького залишка в пол!пептидному ланцюгу як!сно в1др1гнявться в!д сорбцП на сорбент! з лхгандом - аналогом л1зидькнх залшк1в (рис-.З Б). Отркмак! результат« свхдчать про наявнЮть в плазманогена ладини в!дмхнних в1д д1зин-зЕ'язуючих дхлянок з яскраво вираженою спор!днен1стю до арг1н!льних валишкав. Попередньо зисловлене припущення про в!дсутн1сть в плазм3.ноген1 лвдини в1дм1нних в1д л1зин-гв'язуючих д1лянок взаемоди з арг1н1-ном ('Лгш еЪ а!.,1980) базовано на даних про десорбд!ю сорбованого

на apriHiH-araposi алазьпногену машши концентрац1ями б-зшногек-саново! кислота - л1ганду лхзин-гв'язуючих делянок. Однак хмобхлх-зований за сс-ам!ногрупу аргхнхн не може розглядаткся як аналог арг!н!льного залшку в лод!пептидному ландюгу через бхизько розм1-щену карбоксилъну трупу, здатну ефектквно БэаБмод1яти з гуанхдиль-ною та створювати перешкоди для ззаемодх! з одкокошгонентними зв'язуюш-ши д1ляккзми. В той же час завдяки наявност! негативно! та позитивно! складових частш хмобШзований apriHiH придатний до взаемодх! з л!зин-зв*язуючими дХлянкаш, чим i може бути пояснено вразлкве до елюцп 6-ам1нагексанозою кислотою зв'язузання плазм!-когену з !моб!л!зованим apriHiHOM (Winn et al.,1980). 3 наведених даних також витхкае, до ранше описан! ам!ногексил-зз*язувч! д!-дянки (Christensen, 1984) б лше проявов взагмодП арПнхл-зв'язую-чих д1лянок з малохспецифхчним лхгакдом.

Локал1з5д1я арг1Kiл-зв'язточих д1дякок: плазм!ногену. Для лока-л!зад11 знаходження арг!н!л-зв'язувчих дхлянок досл1джували взавмодла фрагменпв плазм!ногену з roMoapriHiH-araposoB та з гуатдилгексид-агарозок). Крингл 4 s цими сорбентами не вэзбмодхб. Важкий ланцкг плазм!ну, фрагмент К1-3, м!н1плазмхноген, легкий ланцюг плазы!ку та п'ятий крингл спецкфхчко зв'язуються з гомоар-гхнхн-агарозою, при чому маюч! д!зш-зв'язузоч! дхлянки важкий лан-цвг плазм!ну та фрагмент К1-3 можуть бути частково дессрбозан! резчиком б-ашкогекезново! кислоти (рис. 9), котра не спричкняв до десорбцГх позбазленлх л!зкк~зв'язуших д!лянок м!н!плазм!ногену,

Рис.9. ПрофШ елкзцП легкого

ланцюгу плазмiну С-),

кркнглу 5 (- —) та фрагменту К1-3 (-•-) з сорбенту, ¡до мхетить лхганди-аналоги apri-нхлних залилпив. Стр1лками вхдмхчено блюди: 1 - 0.5 М роз-чином NaCl; 2 - 0.2 М розчзшом б-ам1ногекса-HDBo'i кислоти;3 - 0.1М розчином apriHiHy.

легкого лавцюгу плазмхку га кринглу 5. Повна десорбция вохх дослоджуваних 61ЛК1В досягавться лише 0.1 М розчином арг!н!ну. Отриман! результата св1дчать про наявность аргШл-зв'язуючих дхлянок в крингл1 5 та легкому ланпюз! плазм1ну, що подтверджув припущення CVaгodi,Patthy,lS8l) про те, до бензам1дин-зв'язуючх д1лянки цих фрагментов в дхлянками взаемодП з арг!ноном. У фрагмент! К1-3 бензам1дин-эв'язуючих долянок немав, однак з гомоарг!-нхн-агарози в!н повнютю десорбувтаоя лше аргШновим розчином (рис.6), а з гуан1дилгекоил-агзрОБиЮ взавмодхв подобно до легкого лащдогу плазмону та п'ятого кринглу (рис.9). Отриман! дано св!д-чать про наявно.сть у фрагмент! К1-3 арг!н!л-зв'язуючо! долянки, котра не в иёкзатдин-зв'кзуючою.

Анайз отркманого експериментального материалу дозволяе зроби-ти ряд висновгав щодо логандно! специфочносто та локалозадо! д!дя-нок м!жмолекулярно! взавмодоо глазмоногену (плазмону) людкни. Показано !скування двох видов д!лянок зв'язування - двокомпонент-них та однокошокектних. До двокоыпонентнкх в1дносяться л1зин--зв'язушо д1еякки, котро ефективно взавмод1ють з зарядженою парою л1зил-карбоксил чк аргШл-карбоксил. Доведено, що необх1дна для взавмодП з двокомпонентними зв'язуючими долянками пара л!ганд!в не обов'язково повинна калежати до одн1во С-к!нцево! молекули лхзршу чи ад>Пнону. В частково деградованому плазм1ноген1 знахо-дяться дво двокомпоневтн! долянки можмолекулярно! взавмодП, що водроэняються мож собою за специф1чноста. Больш специфочна д1лянка вхддае перевагу л!гандя!к пар! л!зил-карбоксил, тод! як менш специф1чна легко взаБЫОд!е як з парою л!зил-карбоксил, так ! з парою аргШл-карбоксил. В натквному плазмхногено проявлявться лше одна - менш специф!чна - двокомпонентна д1лянка зв'язування. На Шдстав! аф!нно-хроматограф!чного досл!джэння форы ! фрагментов плазм1ногену зроблено висновок про локал!зац1ю б!льш спедифочно! л!зин-зв'язуючо"1 д1лянки в крингл1 4, а менш спе1даф1чно1 - в крин-гл1 1. Доведено можливЮть участ! лозин-зз'яэушо'1 д!лянки кринглу 4 в м1жмолекудярних взавщгцях Л13-пдазШногену та плазмону. На подстав1 в1дм1ченс! р!зниц1 в специфочност1 л!зин-зв*язуючих д!лянок крингл!в 1 та 4 розроблено метод розд!лення нативно! та частково деградовано! форм плазм!ногену на л1зш-вм1щуючих сорбентах.

До однокомпенентних д1лянок можмолекулярноЗ взавмод!! в!дно-сяться водмонн! в!д лйзин-зв'язуючих д!лянки взавмод!! з арг!н1ль-

ними залишками, котрх не потребують присутност1 вальних карбок-сильних труп. Експериментально встановлено ïx лхгандну специфхч-HicTb та локалззащю по доменним субодиницям молекули плазм!ногену (плазм1ну). Дв1 з д1лянок такого типу, локал1зован1 в кринглх 5 та легкому ланцюгу плазману, !дентиф1ксвано як ранхше в!дом1 бензат-дин-зв'язукт д1лянки. Третя ж, що знаходитьоя у фрагмент! К1-3, з бенааШдином не взаемод!е.

На niflCTSBi отримзних даних про л!гандну специф!чн!сть та ло-кал^ащю д!лянок мхжмэлекулярно! BaasMDfli'i плазм1ногену залропо-новано г!лотеткчний механизм направлено! д1! плазм!ну на ф1брин, в основ! якого лежить конкуренция аргхЕ^д-зв'язузочих д1лянок з актизвим центром плазм!ну, котра веде до розщеплення в ф1брин1 лише л1зильних зе*язк!в.

2. Д0СЛ1ДНЕННЯ EŒEKTDPEDÏ ДЗЛЯНЮ1 СЕРШОЕЙХ ПР0ТЕ1НАЗ

Афхнко-хроматографгчне роздздення протеод!гичного комплексу з п1лоркчних додатк1в лососевих на сорбентах з л!гандами г1дрофобно'! природи. Результата кроматограф!чних досл1д!в по розд!ленню муль-тиферментного комплексу св!дчать про ¿скування ззлежност1 Mis структурою !моб!л!эованого л1ганду та влаотивостями сорбенту: за наявност! в л!ганд! двок г!дрофобних труп зростання отупеню ïx стеришю! доступност! для контакту з б1лком веде до зростання за-галъно! сорбц!! протеол!тично'П активности котре оупроводжувться пад1нням х1мотрипсин-трипсиново! селективност! сорбенту (Табл.1). В1дм1чену залежн!сть не можна Оуло яояокити з точки зору в!дошх даких про зв'язукт властивост! га будову активного центру сери-кових проте1наз, котр! виключали мозыивхсть зв'язузання б1льш н!ж oflHisï г!дрофобно'1 групи. Ферментативний гадрол!з пептидного зв'язку nepeöirae через утворенння ковалентного ацил-ензиму, при чому карбокси-компонента розщеплюваного зв'язку утворюв ковалент-ний зв'язок з серином г!дрол!тичного центру. Розщешшваний пептид под!ляеться на групу, що залшаеться (.. .-Pa-Pi-COOH) та групу, що в1дходить (H2N-P1*-Ра'-...). За утворення фермент-субстратного комплексу ашнокислотн! залижи обох груп взаемодшть з субд1лян-ками ферменту (S- та 5*-зонами, в!дпов1дяо) (Schechter I. .Berger А. ,1957). AHaais числених даних щодо розм!щення низькомодекулярних субстрат1в та !Hri6iTOpiB в активному центр! серинових проте!наз (Erlanger,i960,1963, Cohen,1964,1973, Hein,1960,1951,19БЗ та imni) дозволяв вид1лити чотщзи субд1лянки взаемодП з структурами -

nn - <CU -

Табдиця 1А.

Залелшстъ сорбцГ! х!мотрш10кн-под15ко:1 актизност! в!д структура хмобШзованого пдрофобкого дхгакду.

N На!мекування п/п л!ганду Десорбо-вано CÍJIKy, ыг akthbhíctb по БТМЕ Питома, 301льшення Загальна, од/мг пит0м01 в 7. бз.д активное- нанесено! Ti, раз

1 2-тозилаы1но- 0.88 5995 22.8 91

-3-нэфтойка к-та 21.0 88

2 N-карбобензокои- 0.92 5523

-0,Ь~фен1далан1н 19.1 87

3 о-тоБШиьино-бэн- 1.00 5023

зойна к-та 81

4 К-бутилоксикарбо- 0.97 4813 18.3

Hin-L-лейцин 14.4 72

5 ы-тозилам1но-бен- 1.10 3787

зойна к-та

6 N-to3ju-L-лейцин 1.42 2814 10.7 69

7 п-тозиламхно-Сен- 1.47 2630 10.0 67

зойна к-та 10.0 63

8 Н-бензохл-Ь-гду- 1.39 2630

таыхнова к-та

9 N-6eH30ií-L-asaHiH 1.27 1439 5.7 33

10 Ы-Сензо!л-Ь-вал1н 1.05 1210 4.6 22

11 Н-бензо!л-Ь-аспа- 1.06 710 2.7 13

раггнова к-та

- гамгсникамк а-вуглицевого атому субстрату:

- "пдрофоСна кишеяя", або аг-дхлянка, що взавмодхв э Fi-за-

липком субстрату, задавчи тим самим видову спецкфхчнють ферменту;

- ацилаШдна (зго) дхлянкз, комплементарна Pg- та Рэ-залишкам субстрату. Структура адекватно: ат-дХлянщ частики субстрату чк хнгхбхтору вшивав на орхвктацхв потр1бкого зв'язку в зону дЗл г:дрол1ткчного центру, не егшивзючи на силу зв'язуванкя ферментом субстрату;

- зона взавмод!! з к-водкевнм атомом (a-h), характерна егоiми малими розы!рами. Вшщеннк в 150 зону ск!лъки-кебудь об'емно! структури рхзко noripmys реактивность субстрату чи хнгхбхтору;

- четвергов субд1лянкою взаемодИ з субстратами серинових проте!наз в зона, що адекватна "в!дходяч1й rpyni" субстрату -залишкзм Pi"-.. .-Рэ* з N-kíhhh розщеллюБзного зв'язку. Скхлъки-небудь скстематичких досл1ддень рол! адекватких ц!й труп! структур не проводилося - як через ц1лу нивку методичних

Таблица 1Б.

Задежкз.стъ сорбц!! трилсин-подхбно! активное?! в1д структури !мобШзованого лхганду.

Деоорбо- Активн!сть по БАЕЕ

N На1менування зано Питома, Зб1дыпення Загальна,

п/п бйгку, од/мг пит0м01 в 7. в1д

луанду мг активнос- нанесено!

ть раз

1 Ы-карбойензокси- 0.92 955 4.1 17.1

-0,Ь-фен1лалан!н

2 2-тозилаш.ко-- 0.88 885 3.8 15.2

-3-нафтокка к-та

3 Н-тоеил-Ь-лейцин 1.42 839 3.6 23.2

4 Н-СутилоксикарОо- 0.97 629 2.7 11.9

н1л-Ь-лейцин

5 о-тозшгашно-бен- 1.00 559 2.4 10.9

зойна к-та

6 м-тозилам!но-бен- 1.10 512 2.2 11.0

зойна к-та

7 Н-бензекл- Ь- глу- 1.39 489 2.1 13.3

там!нова к-та

а Н-Сенэо!д-Ь-вал1н 1.05 466 2.0 9.5

9 п-тозилам!яо-бен- 1.47 373 1.6 10.7

зойна к-та

10 Н-бензо1л-Ь-аспа- 1.06 303 1.3 6.3

рагзнова к-та 5.8

11 И-бензо!л-Ь-алан1н 1.27 233 1.0

труднонцв, так 1 через езого роду традиции!сть досл!дження субстратно! специфачност! фермент!в лише в б!к С-кгнцевох частини молекул субстрат1з та !кг!51тор!з.

3 !клюго боку, деяку, хоч ! вкрай обмежену, !нформац!ю ¡додо зластивостей субд1лянки зв'язуванкя "з1дходячоз групи" можна отримати, провхвши систематизавдю та анайз наявних даних про "непродуктивне зв'язування" низькомолекулярних субстрат!в а-'/Лма-трипсином. Утворення непродуктивного аддукту, що не тдлягав подальшому розщепленню ферментом являв собою окремий випадок конкурентного 1нг!б!нвання ферменту, за якого в !нг!б1тором е сам субстрат, та в!дбувз5ться за схемою (Антонов,1991):

Кз ка Е + 5 < > ЕБ -Е + Р

Е5*

Ступ!нь впливу непродуктивного зв'язування субстрату на фермента-

пиний Ерацес заложить в1д сп1ББ1дношекня Ks/Ks', тобто в!д скли зв'язування субстрату в продуктивному та аномальному положениях. Виходячи з неможливост! вшщення в s-h-зону сгальки-небудь об'вм-них труп та з BifiOMO'i здатност! аг-д1лянки ефективно зв'язувати бензо1лам!дну групу, анал!з структур аномальких субстратiB ot-xiMO-грипсину (Bergman,1938,Ebata,1959,Hogness,1953 та !нвп) дозволяв д1йти висновку про те, що ефективне непродуктивна зв'язування стае, можливим лише за ор!вкгзц!! в зону взаЕмодх! з "б1дходячою групои" об'вмно! гхдрофобно! сгрукт'ури. Вхдносно до наших експерименталь-них даних цей висновок дозволяе припустити за найбхльш вхрог1дне ыхсце гкаходження дхлянкк взавмодШ з додатковою г!дрофобною гру-пою афхкного лхганду зону Бзаемод!! з "в!дходячою групою"субстрату.

Анал!в д1тературних даних з метою локалгзацП додатково! дхлянки оеринових протехнаэ. Лерев1рка зоки взавмодх! з "в1дходя-чов групою" субстрату градищйними методами пор!вняння субстратних чк iHFiCxTopHi'K влаотивостэй групп лолхпептидхв потребувала синтезу кхлъкох десяткхв пентзлепткдхв з вархвваккям амхнокислотких залшшв по Pi'-, Fg'- та Рз'-позиц1ях. За наявних умов викокання под!бнох роботи було практично неможливим, нэ кажучи вже про неод-нозначнхстть отримуваних у такий спос!б даних через можлив1сть альтервативних зв'язувань. В той же часа необх1дна !нформацхя щодо локзлхзацИ додатково! д1ляеки м1жмолекулярно1 взавмод!! серкнових протехназ могла бути отршана за допомогов систематичного анагйзу нзявних даних про структуру реэктнвких центров бхлкових хнгхбхто-pis оеринових протехназ (сбрл!к!в), котрх за кхнетичними параметрами являють собою чи не хдеальнх субстрата в1дпов1дних фермент1в (La5kowski,lS81). Видова опециф1чн1сть серп!на задавтьоя, хоч i не строго, природою амхнокислотного залишку в Pi-положенн! реактивного центру, причоыу ш!коккслотка газика б ц!й позицх! веде до в1дповхдно1 3Miей спецкф!чност1 cepniny. Структуру б1лызост1 сер-niHiE жоротко ф1ксовано численими дисульф!дними зв'язками, що вважавться за необх1дне для лхдтриыки реактивного центру в оптимально для взавмодх! з проте!казами конформацШ. За велико! pisHOMaHiTHOOTi вщце cepniKis (на сьогодн1 в1доыо б1льше дванад-цяти в1дмхнних мхж собою с1мейств) конформацх! 'ix реактивяих цент-pis практично 1дентичнх (Laskowskx,1980). Будь-HKi фактори, що порушують цю конформащю, призводять до р1зкого пзд1ння iHriöiTop-них властивостей cepniHy (Holmes,1987, Bruch,1988, Potempa,19Sl). За утворення фермент-серп1кового комплексу як у фермент!, так i в

iHriGiTopi практично однаков1 поверхк1 плотиною 1400 А2 стають екранованими в1д молекул води, при чому на долю Р3-. ..-Рэ'-дхлянки реактивного центру припадав до 77% укрито! поверхн! iHriOiTopy (Janin,1975). В склад1 фермент-серп!нового комплексу ам!нокислотн! залишки у Pi- та Ра'-положениях мзють п1двищенш ступ1нь маскуван-ня та аномально зксоку к!льк1сть контакта з в1дпов!дними трупами ферменту (Blow,1972). Дан1 рентгеноструктурного досл1дження фер-мент-серп1нового комплексу привели до припущення, що Ра'-залшок cepniHy rpas в процес! комплексоутворення не меншу роль, н!ж зали-шок Pi (Sweet,1974). Рг'-положениям реактивних центр1в cepniHiB piSHim вид!в притаманне яскраво виражене дом1нування амгнокислот гхдрофобЕо! природи, що неодноразово выкачалось багатьма авторами (Janin,1975,Carrel,198В,Seeinuller,1985 та iHini). Hi для Pi'-, к! для Рз'-положень жодно! законом!рност1 не спостер!гавться. При досл1джеян1 к!нетичнкх пзрзметр}в групп високогомолог1чних овому-ко!д!в було вадмзчэно, що зашна в Р^'-положенн! т!розину на мекш гiдрофобний г1ст!дия приводить до змэшпення iHri6iTcpn;-x власти-гостей, тод1 як овомуко!д, що м!сткть в цьому положенн! acnapari-нову кислоту, вззгай не мае властивостей серглну (Laskowski,1981).

Наведен! дан! про структуру реактивних центр!в cepniHiB дозволили еисловити пршущекня про !дент1гчн!сть додатково! д!лянки м!жмолекулярно! взаемод!! серинових протешаз адекватнхй Р2'-залижу Зг'-ддлянц! активного центру ферменту.

Експериментальна дерев! рка припущення про роль 52'-д!лянки серинових проте!наз. Перез!рку припущення про осбливу роль Ss'-fli-лянки серинових проте!нзз було проведено новим, не маючим анало-riB, методом фермент-ф1ксованого зонду, Сазованим на створенн1 передумов для вм!щення в досл!джузану д1лянку однхе! групи л!ганду за рахунок гарантованого зв'язування друго! групп "гидрофобной кишенею" ферменту з подалыпим визчешям впливу такого роду ефектора на каталхтичн! вдастивост! ферменту. Дослхджуваним ферментом було вибрано а-х1мотрипсин через в1дому спор1днен!сть його "г1дрофобно"1 кшлен1" до лагащцв - аналог1в залишк1в г1дрофобних ам1нокислот. Молекула доал1джуваного ефектора мусила правити за свовр1дний аналог Pi~...-Pg*-району реактивного центру cepniHy. Шсля щло! низки попередн1х екоперимент1в було сформу-льовано наступи! структуры! вимоги:

- молекула ефектора мала м1стити дв! г1дрофобн1 (наприклад -- бенаольн1) групи на вметан!, достатки для одночасно'! взаемод!'!

як з 51-, так 1 з Бг'-дз-лянками ферменту;

- за такого розмщэння в зон1 дП г1дрол!тичного центру мав знаходитиоь зв'язок, нездатний до взазмодП з "пдролхтичною тр1а-дою" ферменту,

- молекула ефектора мала бути симетричною - для забезпечення однозначного тлумачення отримуваних результатхв;

- спектрзльн1 характеристики дослхджуваного ефектору не повинна сп1впадати 31 значениями, котр1 втарюютьсн при вкзкачешй г1дрол1тично"1 активное?! на в!дпов!дних низькомолекулярних субстратах ;

- ефектор мав бути достаткьо розчинккм у еод!.

Зазначенда вимогам в повк!й ы!р! в1дпов1дав дигхдрохлорид 1,5-б!с-дибензилам!но-лентану (рис.ЮГ). Вплив ц!е! ополуки на Г!ДР0Л!ТИЧНу Д1Ю й-х1М0ТрИПСИНУ ЯК!СТНО ВХДр!ЗНЯВСЯ в!д дП

низькомолекулярних конкурентник !нг!б!тор!в: вамхсть я!н!йното зменшення г1дрол1Тично"1 д!1 зроотання концентраци ефектору викли-кало активащю ферменту як по в1дношеншо до М-глутарил-Ь-фенялала-н!л-пара-н1троан!л!ду (рис.НА), так 1 по в1дношенню до б!лкового субстрату- альбутну лвдини (рис.ИБ). Визначена спектрофлуори-метричним методом (ЙплпасЬепко е1 а1.,1990) константа дисощацГх взавмодП а-х1мотрипсину з 1,5-б1с-дибензилэм1Но-пентаном станови-ла 1.6 пМ, щр свхдчило про !стотко бхльшу силу зв'язування, н!ж

Рис.10

Реактивюш центр 1нПб1тора XI-мотрипсину та його низькомоле-кг/лярнх структуры! аналоги:

Г - 1,5-б!с-дибензилам1но-пен-

ТЗН;

Д - 1,233-трис-три-0-фен!лет:-ы-амхно-пропан.

А

Б

GPNA

АЛЬЕУШН

в

s

fs

(Ефектор, Ш)

о

s

(Ефектор, niM)

Пт«™ -1 л

гаи. a j..

Залежн1сть гхдрол1тично! дП а-ххмотрипсину в!д концентрахи'! дослхджуваних г!дрофобних ефектор1в. Субстрата: А - N-глута-рил-Ь-фен1лалан1л-пзра-натроая1л1ду; Б - альбушн. Ефектори: 1- 1,5-б1с-дибенгшгзм1но-декган; 2 - 1,2,3-трис-три-0-фев1л-етиламхно-пропак; 3 - анШн.

за взазмодП з бензолом, толуолом та анхл!ном (Ко 25, 13 i 6.6 гпМ, вхдпов1дно (Wallace,1963)). Отриман! дак1 дозволявть 1дентиф1кува-ти дослхджувану 5а'-д1лянку як давно вхдому, але не локал1зовану за мЮцем зкзходжекня, ефекторну дхлянку серинових проте!наз. Зростання активност! ферменту однозначно вказуе на ефекторний характер дослхджувако! дЗлянки. I'i зв'язуюч! влаотивост1 можуть бути кезр1вкякно слабшши в!д "гЗдрофобно! кишеш", оск!льки захоплення останньок однхбх з ПдрофоСних груп ефектора створив достатньо виоокх передумови для вмщення другоз групи в ефекторну дхлянку. Завдяки гнучкост! лззщогу, що поздкув обидз1 групи ефек-тору, Бит1снення молекулою субстрату першо'1 з них з "г1дрофобно1 кишен!" ферменту не веде до обов'язкового вктхснення другох групи з ефекторно! д!лянки ферменту. Зрозушло, що реал!зад1я зазаначе-ного механхзму мае уокладшватися за зростання гром1здкостх. молекул як субстрату, так i ефектору, що й спостерхгавться в випадку 1,2,3-трис-три-3-фен1летила)л1но-пропану (рис.11).

Досл1дження впдиву S2'-сгииулящ1 на pi3Hi стадп гхдрод1зу. Катал1з протеод1тичзпши ферментами односубстратних реакцхй проходить через у творения нековалентного фермент-субстратного комплексу ES, котрий перетворнвться в ковалентний ацил-ензим ЕА з видхленням первинного продукту Pi та подалыпим г!дролхзом ацил-ензиму да вхльного ферменту та вторинного продукту р£ (Антонов,1991):

- 26 -

ка кг кз

2 + 2 ^ ..... ■ > Е5 -*• ЕА -» Е + ?2

к-1 + Р1

або, в спрощеному вигдяд1: к1 кСаЪ

Е + 5 с * -Е + Р

к-1

За Пдрсшеу ам1дних субстрат1в швидк1оть процесу л1м1тувться •/творениям ацкл-ензиму, тобто ксеп: = кг, тод1 як у випздку кладноеф1рвих субстраИв л1матуючою отадЗвю в г3.дрол1з ацил-ензи-му 1 в1дбувавться його какопкчення Скса-ь = кз).

Пор1вняння кднетичних параметрЗв г1дрол!зу Ы-глутарил-Ь-фендл-аланЗл-ларз-ндтроаяШду 2 присутностд р!зних концентраций 1,5-б1с-дибензилзш.но-пентаку (Табл.2) свхдчать про те, що як

ТАБЛИЦЯ 2. ЗалежнЮть к1нетич-них параметр1в г!д-ролдзу (ЗРМ сг-х!мо-трипсиком в!д концентрат I 1,5-б1е--дибензиламхно-пен-тану

СП, Х10-3Ь! ксаЬ» хН^зес"1 Кат Х103 М Кто Х10э и Хт /'Кт

О С1971 13.0 0.28 - -

0 12.8 0.33 - -

1 16.4 0.40 0.53 1.32

г» 23.9 0.53 0.74 1.40

3 27.2 0.66 0.95 1.44

4 28.8 0.68 1.16 1.71

5 29.1 0.71 1.36 1.92

утворення нековалентного фемент-субстратного комплексу, так 1 процес його перетворення на ацил-ензим пддлягаить Зг'-стимуляци. Зростання уявно! константи Шхаелюа Кл* носить нелШйний харктер з наростаючим вддставанням в!д розраховаШ за вддомим значениям константи дисохцацП взаемодИ хдмотрипсину з 1,5-б1с-дибензилам1-но-пентаном величини Кш* (рис.12), цо свЗдчить про зростання зв'язуючих властивостей "Пдрофобно! ккшен1" х1мотрипсину в наслд-док Зг'-стимулящл активного центру. Таке припуцення добре узгод-жувться як з нашими данный про вза&моддю серинових проте1наз з абднними л1гандами, що мЗстять дв1 г1дрофобнд групи, так 1 31

эС1льшенням сили зб'язуезняя й-х1мторипсином !мобШзозаного фен!л-бутил-ам!ну в присутноста К-карбоСекзокси-похадних гадрофоб-них ам1нокислот, тобто сполук, що мЮтять два розкесен! у простор! г!дрофобН1 групи (Dunn,Gilbert, 1979). Викликане 52'-стимуляц!ею активного центру посилення зв'язуотих властивостек "г1дрофобно1 кишен!" дозволяе також пояснити утворення стаб1льних комплекс1в

1.5 - Kn, X Ю^М kcat«

1.0 - Km X 1Q3 S90"1 • 40

0.5 у- " Z*o------- - 30 • 20" • 10

0

1 I 1 2 i i i 3 4 5 Ефэктор, Ш

Рис.12.

Залелапсть к!нетктаих параыетр!в г!дрол1зу а-х!мотр1-шсином

К-глутарил-!_-фен!лалак!л-яара-к!трознШду в!д концентрац!!

1,5-б1с-дибензилатно-пект5ну,

м1ж серп!нами та анПдро-ферментами з !вактивованими за рахунок перетворення серкну в дэг!дроалан1н г!дрол1тичним центром (Ако et а!.,1372). 3 !нпюго боку, низьку с~1йк!сть комплексов ангадро--фермент1в з сергпнами пдазми кров1 - «¿-антитрипсяном та «¿-анти-плаэм1ном (Кого!, 1375, Еп^Ш et а1.31994) - може бути пояснено заявнЮтю в Р1-положеннях '1х реактивних центр!в мет1он1ну - ам!но-кислоти, не характерно! по спецкф1чност! Н1 для трипсин-, н1 для х!мотрипсин-под!бних фермент!в.

За досл!джувэних концентрзцп субстрату, ферменту та ефектора 1,5-010-дибензилзм!но-пентан не вплквав на г!дрол1з пара-н1трофе-н!л-ацетату (рис.13). В!дсутн1сть як активуючо!, так ! !нг!бувчо1 дп може вважатися за идтвердження механ!зму Зг'-отимуляцП, оск!лки дослдаувании субстрат не конкурув з ефектором за сильно-зв'язушу д!лякку 31, однак утворення ацил-енззшу веде до

Е400

0.6 •

О.Б • 0.4 ■ -С- в-О-°-о-в-°-в-в-в-в-0

0.3 -

0.2 ■

0.1 ■

п

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 4 в в- 10 12 Ефегаор. Ш

Рис.13

Пдрста a-xiMDïpimcHHOM пара-нд.трофенол-ацегату в присутно-CTi рхзних концентрацхй 1,5--51с-дибензилам1но-пентану.

вит!снення пентзметкленоЕОГо ланщзга з зони дП годрол!тичного центру, виводячи тин самим друге ядро ефектору з сяабозБ'язушо! ефекторно'1 дхлянки. Через це л1мхгузоча стад!я процесу - Г1Дрол1з ацил-ензшу - 'в1дбувавться за звичайного, не активованого стану фермента. Таке припущення добре узгоджувться з численими даними про прискорюючу (промотузочу) д!ю велико"! к1лькосто г1дрофобних сполук на г1дрол1з ацетил-«х-х1мотрипсину (Moore et al.,1970). Осюльки м!ж промотуючою довю г1дрофо5них сполук та силою ïx зв'язування "г1дрофобною кшенею" ферменту немав жодноо кореляцП, групою авторов (Клесов .и др.,1974) зроблено висновок про достат-ностъ для промотування Пдролозу самого лище факту зв'язування сполуки-промотора "г1дрофо5ною кишекею" ферменту. В CBiwii отрима-ких даних про Б2'-сгимуляц1ю серинових проте1наз таке пояснения не може бути визкане ва задоЕ1дьке. Еолып ворогодним вкдавться пояснення промотуючоЗ доз гiдрофобних сполук взавмодоЕю останяох з ефекторною 52'-д1лянкою ферменту з подальшою активац!вю активного центру га прискоренням стадП годрал1зу ацил-ензшу. Як в вкладку 1,5-б1с-дибензилам1но-пентаку, так, ймов1рно, 1 в вкладку похгдних азобензолу (Erlanger,1975) в!дсутнз.сть впливу ефектора на гЛдролоз пара-н1трофен1л-ацетату може Сути пояснено поручениям молекулою субстрату Sa'-стимульованого стану ферменту.

Наведен1 дан! дозволявть припуститк вплив мехак!зму Sg'-стиму-ляцП та Bei три стадо'i годрол1тичного процесу - утворення неко-валентного комплексу М1хаел1са, його перетворення в ковалентнкй ацил-ензим та г1дролхз останнього. Наявн1стъ такого роду механ1зму становить основу нативного обмеження протеолозу за рахунок утворення стаболъних ферыБнт-сершноБИХ комплексов.

Анапа первинних послЗдовностей опосередкаваних серкяовими протб1назаш функционально предетершнованих розщеплень. 0дн1бю з важливих ф1з1олог1чних функщй трипсин-подißHHX серинових проте-1наз в активащя неактивних б1лк1в-гояередник1в (проформ, проензи-MiB) до в1дпов1дних активних форм за рахунок строго визначених розщеплень на'певних стад1ях визр1вання молекули. ОскХльки натив-ний механ!зм обмеження протеол1зу бззувться на п1двщен1Й спор1д-HeHocTi активних центр1в проте1каз до реактивних центр1в iHri6iTo-рхв, здавалося за доцШне провести пор1вналький акал!з первинних послздовностей дхлянок активацпгаих розщегзлень в проформах якомога зирпого ряду 61олоПчно активних CiaKiB. В нашпдок такого nopiB-някня встановлено структурну аналогiB mik дхлянками активяцхпних розщеплень та реактивними центрами cepninia трипсзгаового ряду: в Pi-положеннях зяаходягься, як правило, амшокислоти тр_ипсиново1 специф!чност1, тобто аргШн чи л!зия, год! як для Ро'-положень характерно яскраво виражене дом1нузанкя ам!нокислот гхдрофобно! прзфсди. Основна ж В1дм1на дглялок актизагцзгаих розщеплень в!д реактивних центр1в cepniHiB полягав в Е1дсутнооП жороткоз фхкса-ц! 1 розщеплюваного зв'язку, котра спричкнзов подалълй конформацзйн! активащшп змзни. Своврадним виявом дГз такого механ1зму в взав-модая серинових npoieiHas з «2-макроглобул1ном - вдз-шим б!лковим iHrißiTopoM, що зв'язув npuTeinasii поза активним центром. Зв'язу-вання проте1нази молекулою макроглобул1на в1дбувавться внаазпдок конформаЩйких зм1н, викликанкх розцепленням в так ззан!й прима-H04Hiii далянщ (bait site) на невелший посл1довност1 -Arg*-Leu--Val^-His-Val-, Трипсин, плззмЗн та тром51н г1дрол1зують зв'язок, утворэний apriHiHOM, год1 як еластаза розщеплюв валзновий (Sot-Äfltrup-Jensen et al., 1380,Roberts, 1985). В обох випадках в Pg'-—положениях в1дпов1дних розщеплень знаходиться г!дрофобний вал1н.

Результати пор!вняльного анализу первинних посл1довностей д!лянок активащйнзя розщеплень доэволяють з високим ступеней BiporiflHocTi висловити припущення про участь механизму За'-стзшу-ляцп в процес1 активаци б1лкових проформ. Функц1ональнз1й зм!ст Зг'-стимуляцГз фермента-активатора полягав в забезпеченн1 швидкоз активацп проформи на в1дпов1дн!й стадП 'i'i визр1вання, що добре ыпввдаоситься з paHHiM припущенням про прискорений гiдpoлiз 61л-ку за одночасно! його взаемодП як з основною, так i з ефекторною ¡йлянками ферменту (Trowbridge et al.,1963). На жаль, досл1дження «знформац!й багатьох б1лкових проформ проведено без належжл уваг-и

до делянок активащкного розщеплення, що не дав можливост! провести 1х поравнякнк з кокформащяю! реактиБнях центр!э cepniHiB,

Про ефекторний характер переходу аф!нного зв'язування серкно-вих проте!наз в г1дрофобне. 1дентиф1кац1я ефекторно"! д!лянки та встановлення Г! впливу на катал!тичн1 та зв'язуюч! властивост! серинових проте!наз дозволяе пояснити аномальнии характер вааемо-Д21 останн1Х а аЗднними сорбентами, що м1стять низькомолекулярш Пдрофобн! лхганди. Згчдно э клаоичними положениями аф1нно1 хроматографа, взаешдШ з Kd, б!лыяими за 10~3М, не здатн1 забезпечи-ти ефективну сорбц!к, оскЗльки зашсть зв'язуваккя мае в1дбузатися розтягнута елюц!я б!лку у вигляд1 розтягнутого тку (Graves,Wu, 1374). В той же час для вид3.лення серикових проте1наз давно i ycnimHO застосовуються 1ыо51л1зован1 фен1л-бутил-ам1н та метиловий еф!р D-триптофану - речовини, що характеризуются Kd 2.8 та б!лыпе 2 шМ, в1дпоз1дно (Тот11nson,1974,Foster,1955). Для випадку фен!л--бутил-ш!ну показано, що вв*язуюч1 властквост! сорбенту залежать в!д концентрацп 1моб1л1зозаного л!ганду (Hofstee,1973,1975): до досягнення останкьою певно! величини спостер1гзеться вкрай слабке зв'язування ххмотрипсзшу, тод1 як перевищення цього значения веде до виключно сильно! сорбц!!, котру може бути порушено лише так званими "деформуючими розчинами". Не менш ц!кавими б зластизост! сорбент!з, що шстять О-гриптофанЗл-метиловий еф!р: за його !мо51-Л1заци безпосередньо на ВгСК-активовану агарозу спостер!гаеться вкрай слабке зв'язування х!ыотрипсину, тод1 як застосузання спей-сера - Б-ам1ногексаново1 кислоти - спричинюе виключно сплънэ зв'йзувакня, за якого десорбщя досягавться лише "деформуючими розчинами"(Cuatrecasas, 1968). Отримай нами дан! дають змогу пояснити зазначек1 аномал!! включениям в сорбц!йний процес додат-koboI - ефекторно"! - дглянки ферменту. Якщо у випадку !мобШаова-кого фен1л-бутил-аШну стрибкозий характер зшки властивостей сорбенту е насл!дком досягнення кондентрад1БЮ !моб!л!зованого л1ганду р1вня, що забезпечуБ отатистичну BiporifiHicTb одночасно! взавмодП зв'язуючо! та ефекторно'! д1лянок ферменту з двома молекулами !моб1льзозаного л!ганду, то заотосування опейсера у випадку !мобШвованого D-триптофан!л-метилового еф!ру екв!валентно зб1ль-шенню ефективно! концентрацп останнього в E(4R+C)/C3K раз1в, де С - в!дстань, необх!дна для одночасно"! взаемодп двох молекул л1галду si зв'язуючою та ефекторною д1лянками ферменту, а Н - ра-fliyc в!льно1 Mirpaqi"! л!ганду на cneiicepi (рис.14). За умов R~C

застосування спенсера екв1валентно 25-кратному з01лыпенни концен-традП з.мобШзованого л!ганду. Таке пояснения добре узгоджувться з властивостями сорбентов з вхдносно нкзькою концентрадтвю 1моб1-л!зованого фетл-бутил-аьйну та хмобШзованим без спейсеру

Б-трз-штофано-метилозим еф!ром, ко-тр1 в повнхй в1дпов1дкост! до теорГз виявляють вкрай слабк! зв'язуюч! властивостх. 1шшми словами, спричи-нений зростанням ефективно! концен-трздх з хмобхлхзиЕзкого ляганду пере-кз.д в1д афхкного до пдрофобного зв'язування в н! чим 1ншш, як под!бним до випадку статистичних синзим1в взшадком моделзовання реактивних центрхв серп!нхв. Ка особлкву узагу заслуговув подхб-нхсть до випадку серинових протехнзз залеж-юстх характеру зв'язування "г-глобулШв в!д концентрата! !моб!л!зовзного фен1л-бутил--аш.ну (НоГз1ее,1973), що дозволяв постазити питания про под1б-н!сть механ!зму взаемодИ осташпх з комплемектарними структурами до роэглякутого випадку стимуляцП серинових протехназ.

Результат лрсведеного досл1дження дозволяють зробити ряд висновкхв як практичного, так 1 теоретичного харктеру. Доведено првдаттсть гл1дкл-гл1цз-1л-арг1н1ну для аф1нно-хроматографхчного видхлення трипсину ркб. При дооиджешп сор5д1йких властивостей групп афз.кних сорбентхЕ з л!гандами г!дрофобно1 прирсди не т1льки досягнуто початково! мети - зкаходження ноеих патентнопридатних л!ганд!в для аф!нно-хромзтографхчного вид!лення х!мотршзеик-под!б-них проте1наз, але й в1дмхчено цхкаву закономхрнЮть: в рядх сор5ент1в з л1гандами г!дрофоСно! природи за наявност1 в молекул! лхганду двох гхдрофобних труп зростання ступени доступност! цих груп для контакту з бхлком та збхльиення в!дотан! мин ними веде до падз.ння взэдовоз селективностх сорбенту, тод! як загальна сорбщйна здатн1сть по в1дношенню до проте1наз зростав. ОскНьки зазначену законом!рн!сть не могло бути пояснено ав'язуючими властивостями "г1дрофобноз ккшек!" ферменту, було припущено участь в сорбщйному процесх додатковох дыянки мхжмолекулярно! взавмодП. Аналхз даних про числен! акомалп б субстратних та !кг!б!торних властивостях кизькомолекулярних сполук дозволив визнати за найб!льш в1роПдне м1сце знаходження цхб! д!лянки зону вззбмод!! з "з!дходячою

Рззс. 14,

групою" субстрату, сгатистична ж обробка даних при структуру та первинну послз.довш.сть реактивных центров б1лкових 1нПб1торн1в серинових проте1наз привела до припущення про ¿дентичнХсть щез д1лянки Бг'-локусу найближчого оточення г1дрол1тичного центру ферменту. За л1гандною специф1чЕ1ств Зо'-д1лянка под1бка до "гз.дрофобно1 кишенз." хомотрипсину, осшльки в реактивних центрам: сершн!в адекватна зй Ра'-позшця лерезажно зайнята гз.дрофобнзши та - р1дше - позитивно зарядженими ам1нокислотаыи. Для експеримен-тальноз перев1рки припущення про роль Б2'-дз.лянки серинових проте1каз розроблено принципи га застосовано принципово новий, не маючий аналоПв, метод доопджеяня активности ферменту за допомо-гозо фермент-фшсованого зонду. Дослужено вплив на актквн1сть сс-х1мотрш1сину групп ефекторов, шр мгстять дв1 г!дрофобн1 групи, одна з котрих гарантовано зв'язуеться "г1дрофобною кишенею" Ферменту, спричинкшчи тш самим високу Б1рог1днз.сть вмздення другой групи .в дослхджувану 52*-д1лянку. Отриман! результата не лише Шдтвердили припущення щодо зденткчност! невз.домоз додаткоЕоз дыянкк м1жмолекулярноз взавмодоз Бя'-дзлянщ активного центру, але й дозволили визначиги ефекторний характер останньоз, що, в свою чергу, призвело до виявлення явища Ба'-стиыуляцП серинових проте1наз - виключно важливоз складовоз частини механизму регуляцГз протеол!зу. Вмщення в Б^'-долянку адекватного за специ-ф1чнз.стю л1ганда призводить до посклення як каталзтичних властивостей Пдролзтичного центру, так 1 зв'язукчих властивоотей "г1дрофобноз кшен1" ферменту. Наивно дан1 дозволяють обгрунтувати припущення про щонайменшэ три види фхзЮлог1чно важливих проявзв 22'-стимуляца1 серинових проте!наз. За взавмодП в реактивними центрами серпз.нзв Б£'-стимуляцзя забезпечув утворення стабз.льних Фермент-онг1бз.торних комплекс1в, тобто в складовою частиною наткв-ного мехзнззму обмеження протеол!зу. В випадку до.лянок активащй-кого щеплення болков-попередникз.в Бг'-сишуляцоя фермента-активатора забезпечув ефвктивне розш.знавання та швидке розщеплення необходного зв'язку, тобто оприяв переходу проформи в актквну форму. За взавмодоз з "приманочною д1лянкою" сгг-макроглобулону Бг'-стимуляция протеонази сприяЕ конформавдйним змонам в глобуло-кз., котрз ведуть до захоплення, а фактично - до 1нактивац1з - ферменту. йкр1м того, 1снув цз.ла низка прояв1в За'-стимуляцП в пзтучних неф!зз.олог1чних умовах. До такого роду проявзв може бути взнесено субстратну активацою серинових протез.наз, промотувакня

гз-дрофобними сполукзми г1дролхзу ацил-ферментних комплегслв, г!дрофобну хроматаграф!ю та !шп випадки ефекторного впиву ка каталттичн! чи зв'язувч! властивост! серинових протезназ.

ЕНСЙОБКИ

1. В плазм1ноген! людини вкявлено дза види д!лянок зв'язуван-ня - двокомпонентн! та однокоыпоненткх. До двокомпонентних належать лЗзин-зв'зуят д!лянкк, котр1 ефективно вэземодзлоть а заряд-хааою взрою л!зил-карбоксил чи арг1нхл-карбоксил, тод1 як одноком-понентн! д!лянки ззаемодхють з л!зильними чи арг1нильними залшпка-кк за в1дсу'тяосг1 карбоксильно! групп.

2. Двокомпонентн! д!лянки першого та четвертого кринглгв молекули плазмхногену вхдрхзняються м!ж собою за л1гакдною специф1ч-н!стю. Бхлып специф!чна дхлянка маз тдзищену спор1днен1сть до пари Л1зил-карбоксил, тодх як менш специф!чна ззазмод!в як з парою л1 зил-карбоксил, так 1 з парою арг!нхл-карбоксил. Доведено, що необх3.дна для взавмодГх з двокомпонеятвимк зв'язувчши д!лянкаыи пара л1гандхв не обоз'язково мае належзти до одного С-кХнцевого залкику лхзину чи аргхнхну.

3. Доведено, що в яативному плазм!ноген1 проявляеться лише одна л!зин-зв'язуюча д!лянка з мэншо специф1чк1стю, а пхсля в1д-щеплення преактиващйного пептиду з'язлявться й бхлып специфична. Б!лыл спецкфхчна л!зкн-зв*язуюча д!лянка локалхзована в крингл! 4, а менш специфхчяа - в крингл! 1. Показано можлкв1сгь учасг1 д!лян-ки кринглу 4 в мхжмолекулярних взаемод1ях та запропоновано базова-ний на ц!й мсжлизост! способ роздхлення ГЛУ- та Л13-форм плазмхно-гену.

4. Встановлено виражеку спор!дненхсть однокомпонектних д1хянок до л!гзнд!в - структурних аналогов арг!н1льних затшйв, що дозволяв хменувати !х арг!тл-зв'язуючими. Доведено, що аргШл-зв'язу-юч! д!лянки кринглу 5 га легкого ланцюгу плазмхну !денткчн1 ран!ше в1домим бензам!дин-зв*язуючим, третя ж Д1лянка, яка знаходиться у фрагмент! К1-3, з бензэмхдином не взавмод!в.

5. На П1дстаз1 отриманих даних про л!гандну специф!чн!сть та локал!зад!ю д1лянок ьйжмолекулярно! взавшдГ! плазыхногену запро-поноезно г!потетичний механ!зм спрямовако! дх! плагшну на ф!брин, основою якого в конкуренцхя аргхнхл-зв'язугочих д1лянок з активним центром плазм!ну, що спричинюв розщеплення в ф!брин1 лише л!зиль-них зв'язк!з.

6. Остановлено локал!зац!ю ефекторно"! д!лянкк серинових протехназ та з'ясовано х"! роль як б природному процес! регулювання про-теолхзу, так 1 в цШй нкзц! проявхв останнього в штучних умовах. За мхсцем знаходженкя ефекторна дхлянка серинових протехназ !ден-гична За'-позицИ модел! Шехтера-Бергера. Л!гакдна специф1чн1сгь ефекторно"! д!лянки под!6ка до "г!дрофо5но"! кииен!" х!мотрйлоин~ -трипсинподхбних проте1наз, тобто спостер!гаЕться яскразо виражена спор1дкен1сть до аминокислот г!дрофобно1 та - рхдше - позитивно зарядкено! природи. За силою зв'язування адекватних л1ганд!в ефекторна дхлякка значно поступаёться "гхдрофобнхи кшвекх" ферменту, що накхарактернше для о£-л1мотрипсину.

7. Вмхщекня в ефекторну д1лянку вхдпов1дного за специфхчнхстх) лхгакда призводить до посиленкя як зв'язуйчкх, так х кзтадхтичнкх властивостей фермента сткмулящх), причому доведено, що актк-вацхя в^бувавться на ьсхх трьох стздхях процесу - квкозалектному зв'язуЕанкх субстрату, утворенкх апдп-екзиму та гхдролхзх останнього.

8. -стимуляцхя грав ключову роль щонаименше в трьох видах Ф!з!олог1чно взжливих регуляцхйних процесхв - обмеженн! протеол!зу за рахунок утворенкя фермвнт-серпхновкх комшшксхв, акткващиких розщеплэннях в проформах б!олог!чно актквних б!лк!в та забезпечен-к! "пасткового" механизму !Бак.тивац1! протехназ кг-макроглобул!-ком.

Э. Показано, що основною бхдмхкою бхлковкх хнгхбхторхв серико-вих протехназ вхд хкших и!лга.в, внасл1док якох заыЮть г1дрол1зу в1дбуБавться '/творения стабхльних фермент-серпхнових комплексхв, в консервативна структура реактивного центру, що мхсткть амхнокис-лотн! залишки, ор!5Нтован! в оптимадън!й кокформацх! та в!дпов!дн1 за специфхчн1стЕ! 5в'язуюч!й та ефекторк1й д!ляккзм ферменту.

10. Показано, що числекн1 випадки ефекторкого впливу на ката-лхтичнх та зв'язуючх блзстнвоотх серинових протехназ - активац1я при г!дрол!з! ккзькомолекулярних субстратхв, промотування г1дро-Фобними сполуками г!дрол1зу ацил-ферментних комплекс!5, Пдрофобна хроматограф!я серинових проте!каз - в проявом Ба'-стимуляцИ в штучних нефхз!олог!чних умовах.

11. Показано, що перетвореккя аф1кних л!ганд!в на г!дрофобк1 визначавться можливхстю захоплення двох молекул хмобхлХзаваного лхганду як зв'язуючою, так 1 ефекторною дхлянкамк ферменту. В випадку аф1нно! сорбц!"! серинових проге!каз на сорбентах з кизькомо-

лекулярними лхгандзми роль спейсера полагав не стхльки в забезпе-чешп стерично! доступностх иганда, сгальки в збхльшеннх шов!р-ностх реал1зацх1 Зг'-отймульоЕаного стану сорбованого ферменту.

12. Запропоновано новш, що не мае аналогов, метод дослхдження д!лянок м1жб!лково1 взаемодх! з вккоркстаяням фермент-ф1ксовакого зонду, котрий базуеться на забезпеченн! високо! ймовхрност1 вм1-щення потрхбко! структури в слабозБ'язувчу д!лянку за рахунок створення високо! локально! кондентрадхх л!ганду гарактованш за-хопленням частини його молекули сильнозв'язузачою дхлянкою ферменту.

13. На пх.дстзв1 отршаних даник та результата анал!зу первин-них послхдовностей числэнних Ф1з1олог1чна предетерм!нованих роз-щеплень висунуто положения про вдкну для вс!х серинових проте1наз структуру д1лянки функцховального розщепленкя, яка складавться з експонованих на поверхн! б1лка-цхлх та орхЕнтоваких в оптимально конформзцх I зхдпсвхдних за спецнфхчнхстю змхнокислотких залпшкхв ?1 та Р£'.

14. Ровроблено прикципи створекня аф!кних сорС9НТ1Б з заданою видовою специф1чн!стю та запропоновано нову трупу лхганд1в для аффхнно-хроматографхчного видхлення трипсин- та ххмогркпсин-подхб-нлх проте1наз.

ВЫВОДЫ

1. В плазмикогене человека обнаружено два вида участков связывания - двукомпонентные к сднокомпонентные. К двукомлонентным относятся лизин-связывающие участки, эффективно взаимодействующие с заряженной парой лизил-карбоксил или аргинил-карбоксил, к одноком-понектным же - участки, взашодейстзующке с лизильными или арги-кильными остаткам»-! в отсутствие карбоксильной группы.

2. Двукомпонентные участки первого и четвертого крикгла отличаются между собой по лигандной специфичности. Более специфичный участок обладает повышенным сродством к паре лизил-карбоксил, менее же специфичный легко взаимодействует как с парой лизил-карбоксил, так и с парой аргинил-карбоксил. Необходимая для взаимодействия с двукомпояентными связывающими участками пара лигандов не обязательно должна принадлежать одной С-конечной молекуле лизина или аргинина.

3. В нативном плззминогене проявляется лишь один, менее специфичный, лизин-связывающий участок, по отщеплении же преактивацион-ного пептида проявляется и второй - более специфичный. Более еле-

цифичнык дизин-сгязыващий участок локализован в крингле 4, а менее специфичный - в крингле 1. Показана возможность включения связывающего участка кринглз 4 в межмолекулярные взаимодействия и предложен оснований на этой возможности способ разделения ГЛУ- и ЛИЗ-форм плазшшогена.

4. Ярко выраженное сродство однокоыпонентных участков к лиган-дам - аналогам аргинилышх остатков позволяет именовать их арги-нил-связывающнми участками. Аргинил-связывающие участки кркнгда 5 и легкой цепи плазмина идентифицированы как ранее известные бензащцин-связывающие участки. Третий же, находящийся во фрагменте К1-3, с бензамидином не взаимодействует.

Б. Ка основании полученных данных о лигандной специфичности и локализации участков межмолекулярного взаимодействия плазшшогена предложен гипотетический механизм направленного действия пдазмина на фибрин, в основе которого лежит положение о конкуренции арги-нил-связывающих участков с активным центром плазмина, ведущей к •расщеплению в фибрине только лигкльных связей.

6. Проведена локализация эффекторного участка Суриковых проте-иназ и объяснена его роль как в кативных процессах регуляции протеолиза, так и в ряде юкуствекных проявлении последнего. По месту расположения эффекторный участок сериновых протекназ идентичен Ба'-позиции модели Шехтера-Бергера. Лигандная специфичность эффекторного участка подобна "гидрофобному карману" хкмотрипсин--трипсинподобных протекназ, то есть наблюдается ярко выраженное сродство к аминокислотам гидрофобной и - реже - положительно заряженной природы. По силе связывания адекватных лигандов эффекторный участок значительно уступает "гидрофобному карману" фермента, что особенно ярко проявляется в случае а-химотрипсина.

7. Помещение подходящего по специфичности лкгзкда в эффекторный участок приводит к усилению как связывающих, так и каталитических свойств фермента (Б^'-стимуляции), причем активация происходит на всех трех стадиях процесса - нековалектном связывании с субстратом, образовании ацил-энзима и гидролизе последнего.

8. -стимуляция играет ключевую роль в по крайней мере трех видах физиологически важных регуляторкых процессов - при ограничении протеолиза за счет образования фермент-оерпиновых комплексов, при обеспечении активационных расщеплений в белках-предшественниках и в обеспечении срабатывания "ловушечного" механизма оф-мак-роглобулина.

ГИ"* ~ —

9. Основным отличием белковых ингибиторов серинозых протеиназ от остальных белков, предопределяющим образование стабильных фермент- серпиновых комплексов, является консервативная структура реактивного центра, содержащего расположенные в оптимальной кон-формащщ соответствующие по специфичности связывающему и эффектор-ному участкам фермента аминокислотные остатки.

10. Показано, что многочисленные случаи аффекторного воздействия на каталитические и связывающие свойства серинових протекназ

- субстратная активация при гидролизе кизкомолекулярных субстратов, промотировакие гидрофобными соединениями гидролиза ацил-фер-ментных комплексов, гидрофобная хроматография сериковых протекназ

- являются проявлением 5%'-стимуляции в иокуственных нефизиологических условиях.

11. Показано, что превращение аффинных лигандов в гидрофобные определяется возможностью захвата двух молекул иммобилизованного лиганда как связывающим участком фермента, так и его зффекторным участком. В случае аффинной сорбции сериковых протеиназ на сорбентах с низкомолекулярными лигандами роль спейсера состоит не столько в обеспечешш стгрической доступности лиганда, сколько в увеличении вероятности реализации Зе'-стимулированного состояния сорбировавшегося фермента.

12. Предложен новый, не имеющий аналогов, способ исследования участков межбелковых взаимодействий методом фермент-фиксированного зонда, основанный на обеспечении высокой вероятности помещения требуемой структуры в слабосвязываощкй участок за счет создания высокой локальной концентрации лиганда гарантированным захватом части молекулы последнего сильносвязыващим участком фермента.

13. На основании полученных данных и результатов анализа первичных последовательностей многочисленных физиологически предопределенных расщеплений выдвинуто положение о единой для сериновых протеиназ структуре участка функционального расщепления, состоящего из экспонированных на поверхности белка-цели и расположенных в оптимальной конформацш адекватных по специфичности аминокислотных остатков Р1 и Рг".

14. Выяснены принципы разрабоки аффинных сорбентов с требуемой видовой селективностью и предложена новая группа лигандов для э$-финно-хроматографического выделения трипсин- и химотрипсин-подобных протеиназ.

- 33 -

СПИСОК ОСНОВНИХ POSIT, ОПУЕЛ1КОБАНЖ ГО TEMI ДИСЕРТАЦП

1. Гриненко Т.В., Третьяченко В.Г., Верезка С.В. Влияние амино-капроновой кислоты и аргинина на взаимодействие плазминогена с фибрином и его фрагментами // IV Всесоюзный симпозиум "Инженерная энзшология", Киев, 1SS3, С.85.

2. Веревка С.В., Кудинов С.А., Гриненко Т.В. Аргинил-связывающие участки плазминогена человека //ДАН УССР. -1985.- N1.-С.56-59.

3. Кудинов С.А., Веревка С.В., Гриненко Т.В. Лигандная специфичность участков белок-Селкового взаимодействия молекулы плазминогена человека / Стрептокиназа в регуляции свертывающей и противосвергывающей систем крови (сборник научных работ), Минск, 1985, С.116-121.

4. Кудинов С. А. ..Колодзейская М.В.,Веревка С.В.,Носкова Н.Ю.,3п-штейн Л.М., Акулин В.Н. Способ получения трипсина /А.с.1370840 СССР, Ш14С12 N3/76.

5. Колодзейская М.В.,Кудинов С.А., Веревка С.В., Носкова Н.Ю., о'пштелк Л.М., Акулин В.Н. Способ очистки протеолкткческого комплекса / А.с.1381386 СССР, МКК4А61К 37/48,37/54.

6. Verevka S.V., Kudinov S.A., Grinenko T.V, Arginyl-binding sites of human plasminogen // Thrombosis Research.- 1386.- 41, N 5. - P.689-698.

7. Веревка С.В. Изучение лигандной специфичности лизил- и арги-нил-сБязызающих участков плазминогена человека // Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. - Киев, 1986.

8. Колодзейская М.В., Веревка С.Е. Гидрофобные взаимодействия а-химотришкка с низкомолекулярными соединениями //Укр.биохим. журк. - 1990. - 62, N 5. - С.3-14.

9. Колодзейская М.В., Веревка С.В. Сравнительное исследование свойств сериноБых протеиназ низших и высших позвоночных // Там же - 1990.- 62, N 6. - С.31-37.

10. Колодзейская М.В., Веревка С.В., Безпалько И.А. Взаимодействие сериновых протеиназ с низкомолекулярными соединениями // Всесоюзная конференция "Методы получения, анализа и применения ферментов", Юрмала, 10-14 декабря 1990 г., С.90.

11. Веревка С.В., Кудинов С.А., Колодзейская М.В. Способ кнгибиро-вания сериновых протеиназ в белковой смеси / А.с.1760762 СССР, МКИ4С12 N 9/00,11/06.

12. Веревка С.В., Безпалько И.А., Колодзейская М.В. Аффкнно-хрома-

тографкчеокое исследование селективности субстрат-связывающих участков протеиназ мульткферментного комплекса из пилорических придатков лососевых рыб // Всесоюзное совещание "Биологически активные вещества гкдробионтов - новые лекарственно-профилактические и технические препараты", Владивосток, 23-2? сентября 1991 г., С,12-13.

13. Веревка С.В., Шулежко Л. А., Колодзейская М.В. Гидрофобные взаимодействия сершовых протеиназ с кизкомолекулярными соединениями: роль Ss'-участка в субстратной активации к во взаимодействии с серпиками //Укр.био>:ш.журн.-1991.-БЗ,М5. С.45-51.

14. Верьовка С.В., Щулежко Л.А., Колодзейська М.В. Субстратна активащя як вияз дП нативного мехашгыу обмеженкя протеол!зу // VI Украхнсъкик 63oxiMi4HHK з'1зд, Kin в, 1992, 4.1, С.112.

15. Веревка: С.В., Колодзейская М.В. Гидрофобные взаимодействия сериновых протеиназ с низкомолекулярными соединениями: частичное вытеснение субстратом зффектора из активированного фермента // Укр.6иохйМ.журн.-1932.- 64, N 5.- С. 100-103.

16. Веревка С.В.,Ситник А.И.,Колодзейская М.В. О роли Sa*-стимуляции сериновых протеиназ в регуляции протеолиза //Там же.-1994.

- 66, N 6. - С.32-33.

17. Веревка С.В. О структурном подобии участков актизационных расцеплений белков-предшестзенникоз реактивным центрам серпиков // Там же. - 1395. - 67, N 5. - C.24-2S.

18. Веревка С.В. Кинетические особенности Ss'-стимуляции а-химо-трипсина // Там же. - 1996. - 67, N 3. - С.35-41.

19. Kolodzeyska M.V, Verevka S.V. On the role of effectory site in serine proteinases hydrophobic chromatography //Ibid.- 1995.

- 57, К 5. - С. 87-93.

20. Verevka S.V. On effectory character of recognition by serine proteinases of functionally significant splittings // 2-nd Conference on Molecular Recognition (Pecs, Hungary, 1996).

21. Веревка C.B., Колодзейская М.В. О функциональной роли эффек-торного участка сериновых протеиназ // 3-я конференция биохимиков Узбекистана, Ташкент, 11-13 ноября 1996.

Verevka S.Y. Estimation of ligand specificity, localisation and functional role of noncatalytic intermolecular interacting sites of serine proteinases. (Manuscript).

Dissertation for the obtaining of the scientific degree of the Doctor of Science specialized in 03.00.04 - Biochemistry. A.V.Palladin Institute of Biochemistry of National Academy of Science of Ukraine, Kylv,13S8.

There are defended 18 scientific labors and 3 national patents which include theoretical decision o£ noncatalytic sites of serine proteinases. Localization and functional role of serine proteinases efieotory site зге determined. The latter corresponds to S2*-—site oi the active center and is mcluQed in supply oi high-specificity interactions with functionally predetermined bounds -- serpine reactive sites and protein preform activating splittings. Ligand specificity and localisation on structural subdomains of plasminogen binding sites are estimated. The regulatory role of arginyl-fainding site on fibrinolysis is supposed.

Key words: serine proteinases, effectory regulation, plasminogen, fibrinolysis. Веревка С.В. Исследование лкгандной специфичности, локализации и функциональной роли некаталитических участков межмолекулярного взаимодействия сериновых протеиказ. (Рукопись).

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.04 - Биохимия. Институт биохимии им.А.В.Палладкка НАН Украины, Киев, 1996. Защищается 18 научных работ н 3 авторских свидетельства, содержащие теоретическое исследование яигандной специфичности, локализации и функциональной роли кекзталлткчееккх участков межыолекуляр-ного взаимодействия Сериковых протекназ. Определены локализация и функциональная роль эффекторного участка с ершовых протеиназ, соответствующего S2'-положению активного центра и задействованого в обеспечении высокоспецифических взаимодействий с функционально предопределенными связями - реактивными центрами серпинов и участками активационных расщеплений белковых проформ. Установлены лигандная специфичность и локализация по структурным субдоменам связывающих участков плазш-шогека. Предполагается регуляторная роль аргинин-связывающих участков в процессе фибринолиза.

Ключов! олова: сершов! проте1нази, ефекторна регулящя, плаз-ьйяоген, ф!бринол1з.