Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование лигандной специфичности, локализации и функциональной роли некаталитических участков межмолекулярного взаимодействия сериновых протеиназ

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование лигандной специфичности, локализации и функциональной роли некаталитических участков межмолекулярного взаимодействия сериновых протеиназ"

НАЦЮНАЛЬНА АКАДЕМ 1Я НАУК УКРА1НИ

1НСТИТУТ BIOXÍMIÍ ¡MeHi O.B. ПАЛЛАД1НА

РГб од

о 3 0£3 На правах рукопису

ВЕРЬОВКА Серпй ВЁкторович

Дослщжения лзгандно}' специфичности, локал/зацп та функционально/ рол/ некаталпичних дтянок м'тмолекулярно)' взаемодн серинових протешаз

03.00.04 - Bíoxímíp

Автореферат

дисертац!) на здобуття наукового ступеня доктора бюлопчних наук

Ки Тв - 1 9 9 6

ДисертацДею е рукопис. Робота виконана в в1дд1н1 xiwii та GioxiMi'i фермент!в 1нституту 6ioxiMi'i iM. O.B. Палладхна HAH Украши

0ф1ц1йн1 опоненти: доктор б!олог1чних наук, професор

Бблхк Яков Васильович

доктор б!одог1чних наук, професор Виноградова Руфхна Петрхена

доктор Молог1чних наук, професор KiöipeB Володимир Костянтинович

Пров!дна установа - Iкститут молекудярно! ßiojori'i

i генетики HAH Украши

Захист дисертацГх в1дбудеться "20' £l 1997 р.

о 14 годин1 на засхданн1 спвщадиаоваяо! вчено! ради Д 01.84.01 для захисту дмсертадай в lHCTJwyri ßioxiMii 1м. 0.В.Палладхна HAH Украши за адресов: 252601, м.Кшв-30, вул.Леонтовича,9.

3 дисерчац1БЮ можна ознайомитися в Схбл1отевд 1нституту GioxiMi'i 1 и. 0. В. Палдадi на HAH Укра'1 ни

Автореферат розасданий грудня 1996 р.

Вчений секретар спещалхвовано! вчено: ради канд.6ioi.наук

Кхрсенко 0. В.

ЗАГАЛЬНД ХАРАКТЕРИСТИКА РОЕОТИ

АКТУАЛЬШСТЬ ПРОБЛЕМ. Визначення ыехал1гы1в регуляц!! фермен-тхв б однЗбп з кзрдинальних задач ензшодогП. Серкнов! протеана-зи, маючи б дину для всього класу будову г1дрсштичного центру, з1др1зняютьс-я М2Ж собою за спецкф1чшств, що обумовлюв виконання кожним коккретним ферментом його ф1з!олог!чних функщй. Налравле-Н1сть д!! серинових проте1наз на той чи 1нший пептиднш зв'язок субстраПз чи !нг!б1Тор!в здд.йснювгься некатал!тичними д!лянками м1гшолекуллрно! взаемодП ферментов. На оьогоднх вадомо два види такого роду д!лянок - зв'язуюч1 та ефекторк!. Вважаеться, що бээе-мод!я вв'язуших д!лянок з в!дпов!дшйт ам1нокисдотн1ми залишками субстрату сприяе ор1внтацп г1дрол1тячного центру на в!дпов!дн1Ш П&ПТИДНИЙ ЗВ'ЯЗОК, ТОД! ЯК В1ДаОСНО рол! ефекторно"! д!лянки серинових протегназ людно! з-нформацП немаг. Всеб!чне взгачення д!лянок обох тшпв являб собою задачу, актуальяу як з наукового, так 1 з практичного боку, осидьки стршан! дан! ке т!льки дозволяють зро-зушти механ1ами регуляц!! протеол1Еу, мокуть бути викорнстан! для препаративних гилей, а гакож стзорготь необх!дн! передают для дхлеспрямованого втручання в спосередковзн! сериновими проте1наза-ми б!ох!шчн1 процеси,

?у1ЕТА I ЗАДАЧI. Метою дано! робота було визначення лакайзацп, л1гандно! спецкф!чност1 га функционально! рол! некатал1гичних дх-лянок м!жмолекулярно1 взавмод!! серинових проте1наз двох р!внав структурно! складностх. Вивчення д1лянок основного ферменту ф1бри-нолхтично! системи кров1 - плазм!ну та його проферменту - плазма -ногену - було спрямоване на з'ясування лхгандно! специфхчяост! та розтааування по доменам молекули присунпх в дакому фермент! д!ля-нок зв'яэуваккя. Д1лякки серинових протб1наз найпростшого -- ххмотршскн-трипсккового гкпу - досл!дясувалися ГОЛОВИНЫ ЧИНОМ 3 нашвтехнолоПчною метою створення аф1нних сорбенПв, придатних для видалення та очистки зззначених проге^наз.

В зв'язку з вдбю метою було поставлено тага, задач!:

- коы6з.нованим застосуванняы метод1в зфднно! хроматограф!! та обмеженого дротеолгзу визначкти л!гандну специф!чн!сть та встано-вити локал!зад!ю за знаходжекняы по доменам молекулк зв'язуючих дыянок ллазманогеку людзши;

- скнтезуватк групу аф!нних сорбентхв з нкаькомодекуляркши

л1гандзш та провести !х пор1вняння з точки аору хшотршсик-трип-синово! селективносИ та придатностх для препаративного вщцлення серинових проте!наз;

Отримаш дзн! св1дчим про наявнЮтъ в серинових протеза?ах додатково! далянки ьижмолекулярно! взазмодп. Для П досл1дження було поставлено додатков! задач! розробки принищИв методу фер-мент-ф1ксованаго зонду, сформулювання структурних вимог та синтезу необхаднюс ефэкторхв з падалыцим дослхдженяям лхгандно! специфичности, локал1защ5 та функционально! рол! ц1б1 дыянки.

НАУКОВА НОВИЗНА I ПРАКТИЧНА ЗНАЧИМ!СТЬ. В насл1док проведения дое.лз.дкекь встановлеко ряд нов®: фундаментальна данях щадо специ-ф1чносг1, локзл1зацП та фуккадокалько! рола некзталз.тични>: дз.ля-нок м1жыолекуляряо'1 взагмодзл серинових протехназ. Доведено 1сну-вання в плазшноген1 людини аргШл-ав'язуючих дз.лянок, ¡до дозволило обгрунтувати базовану на 2Х участ1 модель рэгуляцП фхбрино-л!ву. Вперше встановлеко локалз.гаЦ1Ю в активному центр1 та назначено функщональну роль ефекторно! далянки серинових проте!наз, показано и роль в природн!й регуляци прогеол1зу та в ц1л!й низщ аномальких прояв!в ферментативное активности. Виявлення в бхлкових ангЮаторах та проформах б!лк1в д!лянкк гцдвкцеко"! спорадненостх до активного центру серинових щютехназ, котра неоСх1дна для вико-наиня ниш СВ01Х ф!э1одог1чних фунгацй, створюе передумови для ц1-леопрямованого втручання в обумовлен! сериновими проте1казами ре-гуляцхйнх процэои. Синтеговако трупу аф1нних сорбентхв та досл!д-жеко 1х придаттсть для препаративного вщцлення серинових проте!-наз.

ОСНОВНI ШДСЖЕННЯ, ЯК! ЕИНОСЯТЬСЯ НА ЗАХКСТ. В результат! проведено! роботи отршано ряд кових фундаментальная данкх про д!ляк-ки м!жмолекулярно1 взавмодП серинових проте1наз:

- Дослздаено л!гандну специф1чн1отъ та встановлено локал1зац1ю д1дянок ьижмолекулярнох взавмодП плазьиногену (ллаамхну) двдини. Доведено Лснування двох ввд!в зв'язуючих дхлянок плазмхногену -л1зин- та арг1н1л-5б'язуючих. Л1зин-зв*язуюч1 дхлянкк б двол1ганд-ними, тобто взаемодаюгь з зарядженими параш типу лхзил-карбоксил чи арган!л-карбоксил. Доведено, що так! пари не обов'язково магать налекати до однхб! С-к1нцэво1 молекули лазину чи apri.Hi.Hy. Арг1-н1д-зв'яэуюч1 дыянки е однолагандкими, тобто взавмодхвчиыи з ар-Пнильним залишком ползлептидного ланцюгу. Лхзш-зв'язукш д!лянки розташован1 в кркнглах 1 га 4 шлекули плагманогену, тод! як арга-

нхл-гв'язуюч! знаходяться в крингл! 5, легкому ланцюгу та фрагмен-тх К1-3 плазмхну.

- В лхганднхй спедафхчзюстх лавин-зв'яауючих дз.лянок кринглхв 1 та 4 визначеко в:1дтну: коли перший з них здаген однаково ефэк-тивно взавмод1яти як з парою лхзил-карбоксил, так а з парою арг1-н!л-карбоксил, то у другого л1гандна специф1чн1сть обмежена взае-мод1ею з парою лхзкл-карбоксил. Доведено можлкв1сть участ! лхзин-зв'язуючо! дхляккм кринглу 4 в м1жб1лковкх взаемодз.ях.

- Виявлення вхдм1кких в1д лхзин-зв'язуючих аргШл-зв'язуючих дхлянок дозволило обгрунг/вати новий механ1зм направленост1 дЗД плааьаку на ф1брик, в основ1 якого лежать конкуренция арг!н!л--эв'язуючий дхлянок з активним центром, щр спричиняв до розщеплен-ня е ф!брин1 одних лише л1аильних зв'яэк!в.

- Дослхдження дз.лякок м1кмолекулярно1 взаемодИ х1штрипоик--трипсинових серинових проте1нзз привело до виявлення яашца Бг'-сгимуляцП - важливоз складово! частили механхзму регуляц1х протеол!зу. Вперше встаяовлена локал!защя та з'ясовано функщо-налъку роль ефекторноЗ д1лянки серинових проте1наз. Нею в 52*-д1-лякка активного центру, котру задхяяо в основких регуляц1иних процесак протеол!зу - активацП бхлкхв-попередншив до активних форм та обмеження гд.дролз.тичко1 дх1 ферменйв внасл1док утворення стаИльних комплекс1в з сершнами.

- Досл1дженкя явища Бе'-стимулящ! серииових прот£1нзз проведено вперше розроблеким та не мэючим аяалогхв методом фермент-фхк-сованого зонду, що базувться на створеннх передумав для вмщення частини молекули ефектора в слабозв'язуючу д!лянку фермента за рахунок гарантовакого захопленкя з.шкц структура ефекгора сильно-зв'язуючою д1лянкою. Вмщення в ефекторну дхлянку адекватного за специфхчнЮтю лхганду викликае лосилевня як каталхтичних, так 1 зв'язуючих властивостей ферменту (Зг'-стимуляци).

- 0триман1 дан1 дозволили з'ясувати причини, внаслхдок яких б1лков1 1нгЮ1тори серинових проте!наз не гхдролхзуються ферментами, а утворюють в ниш сгабдльш комллекси, а також пояснити висо-ку спорхднешсть фермеятхв-активаторХв до д!лянок активащйного розщеплення в бхлках-попередниках.

- Показано, що явище Зо'-стимуляцП лежить в основ! цхлого ряду аномальних проявхв ферментно! акгивност! в неф1з1ологхчних штучних умовах - субстратной активацП фзрмент1з, перетворешп слабогв'ягузочих сорБент1в в сильногв'язувчх, промогуваннх гхдролх-

зу ацил-екзиьйв та Шшх.

- Синтезовано групу афшнкх сорбентхв та доведено придала сть галъкох з них для препаративного вщцлення серинових протегнаг. Сформульовано структурна вимогк, котрх дозволяють отримувати аф1н-Hi сорбента з наперед заданою специф1чшстю.

Отриманх дан1 мають не лише наукове, але й практичне значения, осшльки створюють передумови для регуляцП ферментативних проде-ciB на бальш високому piBHi та можуть бути використалй для ров-робки нових препаратквшх ыетодхв.

АПРОЕАЦШ РОБОТИ, Основнх положения роботи викладено та обговорено на: IV Всесоюзному сишюзхуш'Инженерна енэшолог1я"(Ки!в, 1883), IV Всесоюзному С1шшз1ум1 "XiMiH бШав та пептидов" (Рига, 1984), Всесоюзна: конференщï"Методи отримання, анализу та засто-сування фермент!в"(Юрмала, 1990), Всесоюзна нарад! "Б1олог1чно активн1 речовини Пдробюкив - HOBi л1карсъко-проф1лактичн1 та TexHi4Hi препарати" (Владивосток, 1991), VI Украхнському 6ioxiMi4-ному б'ïздi (Ки"1вг1992), 2nd Conference on Molecular Recognition (Pecs,Hungary, 18-21 August 1996), З-iö конференцП öiaxiMiKiB Узбек1стонв ( Ташкент,11-13 листопада 1996).

НУБЛ1КАЦН. Основний swicr роботи викладено в 21 науков1й

публ1каци.

СТРУКТУРА I OB'ем РОБОТИ. Дисертавдйна робота включав роздан: вступ, огляд Мтератури (4 п!дрозд1ли), власн! досл!дження (3 п!д-роздхли), обговорення отршаних ревулътапв, виснозки та список Бикоркстанох лИератури (635 дкерел). Робота викладена на 321 сто-piHtüi машинописного тексту. Текст дисертацП хлюстровано 39 малюн-ками та 8 таблицами.

МАТЕР I АЛИ I НЕХОДИ

Ртримааня форы i фрагмент!в плазм1ногену лвдини. ГЛУ-плазм!но-ген людини видхляли is cbxjsoî цитратнох плазми кров i методом афхннох хроматограф!ï на л1вкн-агароз1 (Deutsch, Mert2,i970). Bei егапи ошщення для зашбхгання перетворенню ГЛУ-плазмхногену в JIIS-плазихноген проводили при тешератур1 4°С в присутност! панкреатичного iHrißiTopy трипсину ("Контрикал", НДР).

Л13-плазм1ноген видхляли з фракцП III плазмк за Коном афiннaю хроматограф!вю на лхзин-нгароз! (Deutsch,Mertz,1970). Bei етапи видАлания проводили при к1мнатк!й температур! за в1дсутносП iHriöiTopiB плазм1ну.

Активность отриманкх препарат!в плазм!ногену вкзкзчали казе!-колхтичкщ методом (Robbins.Sustmar 1аД370). Викорксчак! в po6oTi препарата ллазманогену шли потешцйну активн1сть 14-20 каэ«1нол1-тичних одиниць на мШграм б!лка. Препарати Л13-плазм1ногену мали не бальше 5X спонтанно! активность

Для визначення )Ьк!нцево! ашнокислоти використовузався дан-силхлорвдний метод (Chang: J.,Brayer D.1978). N-KiH4eBOSj ашнокис-

JM

LYS-ПЛАЗМIНОГЕН ^f V

|эластол!з| (ме ацетилювання|

щ щ % т Важкий i легкий ланцюги плззману 1

XI-3 К4 МШплазмшоген

¡еластол1з| * Ж. К5

53 S23 GD

© *=» es

EJ ■■

А Н В Г Д Е Ж *

Рис.1. Схема отршакня та ДСН-ел&ктрофореграыи застосованих в робот! форм та фрагмензав плазм!ногену: А - ГДУ-форма плазм!-ногену; Б ~Л13-форма плазманогену; В - валкий ланцюг плазм!ну; Г - легкий лакцог плазм!ну; Д - фрагмент Kl-3; Е - крингл 4; Ж - м!н!-плазм!коген; 3 - крингл 5.

лотою в ГЛУ-плазю.ногек1 була глуташнова кислота, в Л13-плазьино-reHi - Л1вш si айдаш вал!ну та лейцину.

Важкий та легкий ланцюги плазм1ну було отримано обмежениы в1дноЕленням плазм1ну CWiman.1977).- Плазм1ноген активували до плазм!ну стрепгокЗназою ("Streptase", Швещя), п1сля чого Б1ДНОв-лювади м1шанщ)Г0Б1 зв'яэки 0.1 М в-меркаптоетанолом. В!дновлен! сульфг1дрильн1 групи карбоксиметилювали 0.1 М шнойодоцтовою кислотою з подальшим переведениям С!лку в 0.1 М Ыа-фосфатний буфер рН 7.4 за допомогою гель-ф1льтрац1'1 на сефадекс! Б-£5. Важкий та легкий ланцоги плазм1ну роздаляди аф1кною хроматограф!ею на л1эин--araposi, П1сля чого д1ал!зуЕади проти води та п!ддавали л1оф!ль-к!й сущ!.

Фрагмента Kl-З, крингл 4 та шн!плазм!ногек отримували обмеже-ним протеол1зом Л13-плазм!ногену еластазою ("Sigma", США чи "Spo-fa", ЧССР) з подалыш-ш розпод1лом на колонках з л!зин-агарозою та сефадексом G-75 (Novoohatny et al.,1984).

Крингл 5 молекули плазм!ногену отримували обыекеним бластол1зом важкого ланцога глазшну з лодадыпиы в!дд!лекням не ыаючого л1зин-зв"язувчих власгивостей кринглу 5 на л!зин-агарог! (Novoohatny et al.,1984). В досладах використовувались липе еле-ктрофоретично чист! б1лки та !х фрагмент (Рис.1).

Концектрацп б!лк!в в розчшп визначали опектрофотометркчно за поглинанням при 280 нм в!дпов1дно до в1доыих з л1тератури коефгщ-shtIe. Для визначення чистоти препарат!в плазьаногену та кого фрагменив викориотовувзли електрофорез в псл!акрилам!дному гел1 з використанням трис-боратно! системи (Cummins,Perry,1Э73) та сис-теми сечовина-оцтова кислота (Panyim.Chalkey,1969).

1онообм!нна хроматограф!» на ДЕАЕ-сефадекс! А-50 застосовува-лась для роздхлеяня ГЛУ- та Л13-форм плазшногену (Walien,Wii7i3n, 1972), КМ-сефадекс С-50 застосовувався для очищения фрагменту плазм!когену Kl-3 (Winn,Hoohschwender,1980).

Отршання та характеристика препаратib протбол!тичяого комплексу з тдоркчних додатк!в лососевих риб. Назажку л!оф!л!зоваких тлоричних додатк!з гомоген!зували з подалывою екстраквдЕЮ 0.001 М розчином СаС12 та в1докрешюнням нерозчинних компонент1в центрифу-гуванням при 60Q0 g. BMiCT б!дку в центрифуга^ визкачали за методом Лоур! (Lowry,Rosenbrougti,1951). Визначення трипсин- та х!мотрипсин-под1бних активностей проводили спектрофотометрично з використанням для визначення трипсину метилового чи етклозого

ejipis N-66HS0in-L-apriHiHy, для х!мотрш1скну - в!дпов1дних eJipiB N-6eK30ífl-L-TipD3inr/ (Schwert,Такепзка,1955).

Синтез та характеристика афхнник сорбентов для вщцлення та досл1дження форм та фрагмент1в плазм!ногену лгодини. Для вид1лення форм та фрагмент1в плазмшогену, kotpí мали Л1зин-зв'язуюч1 влас-тизост1, використовували 1моб1л1зований на ВгСН-активаван1й агаро-3i л1зин (March et al.,1974). 1моС1л1ваЩю гексаметиленд1ам!ну та гл1цину проводили анзлог!чним способом, з tíbb лише в1дмакою, що замлеть лизину брали у бз.дпов1дн1й пропорцП гексаметилещйашн та гл1щш. Етериф1кац1я кар5оксильни>; груп проводилась етиловим еф!-ром д!азооцтово'1 кислоти (Searle,1956). Руак1дуззнкя ам1ногруп проводили сульфатом метиизосечовини (Roche et al.,1954).

К1льк1сть !мобШзованих атнокислот визначали на автоматичному анаизатор! ААА-881 п!сля 12-годинного Пдрол1зу 6 н соляною кислотою при 105°С. KixbKicTb в1льних ашногруп визначали спектрофотометрично за допомогою 2,4,6-трин!тробензол-сульфоклСДо-ти (Satake et al., 136D).

Синтез аф1нного сорбенту та видалення ка ньому трипсин-подiб-них Ферменг1в з мультиферментного комплексу тдоричних додатк1в лососевих. Синтез аф1нного сорбенту для вид1лення трипокн-под!б-них проте!наз проводився за аналогией} з методом (Kumazaki et al., 1976) 1 складався з синтезу л!ганду - гл!ци1-гл1цил-Ь-арг1н1ну -- та його 1моб1л1защ.1 на активован!й бромц!аном агароз!.

Умови аф1кно-хроматограф1чного ЕкдЛлення трипсину ка колонц1 з отриманим сорбентом було п!д1брано в!дпов1дно до поставлено"! зада-ч1. На заповкену сорбентом колонку наносили розчин экстракту мло-ричних додатк!в лососевих в 0.1 М фосфатному буфер! pH 5.2. Bei xpoMaTorpa$i4Hi операцП проводили при 4°С. Несорбований матер1ал змивали 0.1 м розчином NaCl в 0.15 М фосфатному 6y|epi pH 6.2, п1сля чого елюювали специфхчно зв'язаний б!лок за допомогою 0.1 М розчину 6-SMiH0reKcaH0BG'í кислоти, pH 10.4. Досягкуто 19.5-кратне зб!льшення питомо'1 трипсинова! активност1 за 71,1-ним виходом в!д зэгально!. XiMOTpimcjiHOEG'i активност1 отриманий препарат не мав.

Синтез групи аф1нних сорбент1в з лхгандами г!дрофобно! природи та видхлення на них х1мотрипсин-под!бних проте!наз. За спейсер--вм1щуючу нерозчинку матрица для групи сор5ент!в з л!гандами г1д-рофобно! природи служила аманогексил-агароза, отримана iMMOöiaisa-Ц1вю 1,б-д!ам1ногексану ка ВгСИ-активованш агароз! (Cuatrecasas, 1970). Bmíct в!льних ам!ногруп визначався спектрофотометрично з

- s -

використанням 2,4,б-трин!тробенгол-1-судьфокислоти (Satake,1960). Ы-ббКБс1льк1, К-тозильк!, М-трет-5утилоксикарбон1льн! та N-карбо-бензокси-пох!дк1 в!дпоб!дних ам!нокислот синтезовано за в!дошши методиками з подальшою активатцек отриманих пох1дних хлористим Ионалом та 1ммоб1л1зац1Б!о на ш1ногексил-агароз1. Бм!ст 1моб!л!-зованих аминокислот визначався аналхэом солянокислого г1Дрол1зату наважки сорбенту i в!дпов1дав кхлъкост! в!льккх ам!ногруп на виххдн1й матриц!.

Синтез субстратов та ефектор!в. Використан1 б робот! субстрата та ефектори було синтезовано лзбораторп зг1дно з описаниш в литератур! методиками. Застосован! для вкзначення х1мотрипсин-под!б-ко! активност! еф!ри М-бензо!л-1_-т!разину отримували етериф!кац!вю N-6eH30^-L-Tipo3iïHy в наоиченому сухим хлористим воднем в метиловому чи етиловому спирт! (Kaufman,1949). Для вкзначення трипсин--под!бно! активноот! використозувались в1дпое!дн! еф!ри N-бензо-Ln-L-apriHiHy ф!рмк "Reanal"(Угорщина). М-глутарил-1.-фен!лалан!л--пара-ттроанШд (EPNA) синтезовано взаемод!ею г!дрохлориду Ь-фенолаланол-хлориду з п-штроак!лоном в подалыною обробкою глу-таровим ангидридом (Erlanger et el.,1965). Г!дрохлорид Ь-фен1лала-н1л-хлориду отримували взавмод1ЕЮ Ь-фен1лалан!ну з п'ятихлористим фосфором (Blackwood et al.,1965). Пара-н1трофен!л-ацетат (АсОНР) синтезовано ацшпованням п-н1трофенолу оцтовим анг!дркдом (Huggins, 1947). Ы-карбобензокси-1-ам!но-5-фен!л-пектак отримано карбобенво-ксилованням £-фен1л-н-ашлам!ну (Merck,1911). М-бензо!л-5-ам1но--1-фен!л-пентан отримували сполученням за Фр1делем-Крзфтсом N-бен-зо!л-£-хлорам!лам!ну з бензолом (Merck, 1911). 1ч,1>Г-ди-карбобензок-си-1,3-д!ш!но-пропан синтезовано карбобензокоилюванням l,3-fliaMi-нопропану в лукному середовивд (Гр!кшгейн,В!н!ц,1955). l,5-6ic--дибензиламоно-пентан синтезовано сшлученням 1,5-д!ашнопентаку з бензальдегздом з подалышм в!дновлекням утвореного бензилхдену 6орг1дридом натр!ю (L.erman,1953). 1,2,3-тр!с-три-в-фен!летилам!но--пропзн синтезовано взэбмод!бю в запая^й трубц1 в-фен!летилам1ну з 1,2,3-трибромпроланом в етанолъному розчин! протягом 18 годин при 105°С з подалыпою трикратною лерекристагпзащБю отриманого триг!дробром1ду. З-фешл-етилащн отримано водновленням бензилц!а-н1ду алюмоПдридом л1т!ю (Беккер та iHmi,1979).

Чистота та склад застосованих субстрат1в та ефектор!в контро-лювалась методами тонкошарово! хроматограф!ï, елементного анал!зу та EiflnoBiflKicTE ф1зичких характеристик л!тературним даним.

МбГОДИ БК5Н5Ч9НКЯ СПвЦ51ф1ЧН0РТ1 зв'язуючих ДаЛЯНОК фОрМ 1

фрагмент!в пдазм1ногену людини. Специф1чн1сгь зв'язуючих д1лянок плазманогену та кого фрагментов визначали двома способами:

а) Доазцдженкям десорбуючо! дп лаганду. На ур1вноважену 0.05 M фосфатнкм буфером рН 7.4 колонку з аф!кним сорбентом наносили досл1джуваний б1лок в тому ж буфера. Вад неспецифачнох сорб-цП зв1льнялись промивкою колонки 0.5 M розчином хлориду натр1ю в тому ж буфер! доти, поки поглинання елюаг/ при 280 нм не досягало О. Июля цього промивалк колонку роСочим буфером та елюввали специф1чно сорбованкк бхлок рхзнкмк концентрациями дослхджуваного л1ганду. Bci розчини míстили 0.05 м фосфагкий буфер рН 7.4.

б) Сорбцхя б присуткост! лаганду. Колонку' з сорбентом поперед-ньо уравновакувалп розчином лхгакду. Дослхджувании б1лок наносили на колонку б розчин! л1ганду, nicas чого коленка проминалась роз-41-шом того ж лаганду. Промивали колонку 0.05 M фосфатним буфером рН 7.4 та визначали десорбуючу д!ю авпгого л!ганду.

В хроматографгчнкх досл1дах викорксгозувади реакткви квзлафх-кацП не нижче "ЧДА" або перекристалазовак!.

Методи зизначнння залежност! х1мотрипскн-трипскново1 седектив-hocti аф!нних сорбент!в в1д структуры 1моб1л1зовалого лаганду. Пор1вняльне розд!лекня хшотрилсин-трипсш-под16них протеаназ на труп! cop6eHTiB в л!.гандамк г1дрофобно! природи проводилося по стандартна методищ, розроблешй з урачуванням ранше отриманих даних про рН-оптимум протеол!тично"! активное^ комплексу (Павненко та 1шй,1989) та виходячи з smkícihhx характеристик ран1ше досл1д-жуваних сорбент!в (Аюшин,1986). На колонку, заповнену досладжува-ним сорбентом, наносили розчин л!оф!льно висушеного екстракту пхлоричних додатк!в лососевих в 0.05 M фосфатному буфер! рН 7.7. Bel хроматографхчн1 операщ! проводились при температур! 4°0. Несорбований матер1ал зшшали 0.05 M фосфатним буфером рН 7.7, а потам - 0.04 M натрш-ацетагним буфером рН 5.3. Десорбц!ю специ-ф!чно зв'язаного б!лку проводили 0.001 M НС1 з негайним доведениям рН елкату до 7.8. Отриман! дана щодо Емкостей сорбентав, к1лькост! спецкф1чно зв'нзанога б1лку, кого пктомо! та загально"! трипсиново! та xiMOTpunciffiOBOï актзшностей наведено а Таблиц! 1.

Методи досл1дження впдизу ефекторав на активы!сть а-х1мотрип-сину. Вплив ефектор1в на г!дрол!тичну активкхсть сс-х1мотрщюину визначали з використанням низькомолекулярних сштетичних та висо-комолекулярних балкових субстрат1в. В усах досл!дах застосовано

кристаллчнлй й-х!мотрипсин марки "А" Олайнсьшго заводу хамреакти-EiB (JlaTEis). Визначення естеразно! активностх а-хшотрипсину в присутностi р!знкх конценгращй К-карбоиензокси-1-ам!но-5-фен!.г--пентану проводили опектрофотометрично з використанням субстрату -- Н-бензо1л-Ь-т1розшг-метилового еф!ру (Schwert,Takenaka,1955). Вплив концентрац!! дослЗдауваних ефектор1в на ам1дол1тичну актив-н1сть проводили спектрофотометрично з застосузанням в якост1 субстрату Н-глутарил-Ь-фен!лалан!л-пара-н!троак!л!ду (Erlanger et al.,1966). К!нцевз концентрац!я субстрату становила 400 мкМ, тод! як конценграц!я ефектору поливалась в!д 0 до 12 мМ з концентрац!й-нш 1нтервалом 1 мМ. Протеол! тичну активна оть Еизначали спектрофотометрично по поглияалкю при 280 нм з вкористанням в якост! субстрату 2л~ного розчину кристал!чкого аль6ум1ну людини ("Reanal", Угорщина) та осадэшнням нег1дрол1зованого б1лку 10"-ною трихлороц-товою кислотою. Визначення вплизу концентрацП 1,5-б1о-дибензил-ашно-пенгану на к!нетичн1 парамэтри опосередковачого й-х1мотрип-с.ином каталтгчного процесу проводилося з використанням в якост1 субстрат1в М-глутарил-Ь-фен1лалзк1л-пара-н1троан1л1ду та пара--н1трофбн1л-ацвтету. Внзнач&кня ад1дол1тички1 активное?! по GPNA проводили за дещо зм1нениму методом (Erlanger et al.,1966) в д1апазощ концентрац1й субстрату в!д 0.1 до 1 мМ. Вплив 1,5-ßic--дибензилам1но-пентану на г1дрол1з пфа-н1трофен1л-адетату визна-чали спектрофотометрично (Клесов та iHmi,l974). Концентращя субстрату становила 0.5 мМ чи 1 мМ, концентращя ефектора наливалась в д1апазон1 в!д 0 до 10 ыМ з гнтервалом в 1 мМ. Константа дисогца-цН взаемодп сс-хшогршгаину б 1,5-б1с-дибекзилам1но-пентаном визначена методом флуоресцентно! спектроскоп!"i з п1драхуванням результате за Скетчардом (Chumachenko et al.,1990,Scatchard,1949) i становить 1,6±0.14

РЕЗУЛЬТАТЙ ТА IX ОБГОВОРЕННЯ

1. ХАРАКТЕРИСТИКА ТА Л0КАЛ13АД1Я Д1ЛЯН0К М1Ш0ЛЕКУЛЯРН01

ВЗАбМОДП ПЛАЗМ1Н0ГЕНУ жщини

Для досладження л!гандко1 специф!чност1 зв'язуючих д1лянок плазм1ногену людини було застосовано сорбенти на основ! агарози, котр! метили л!ганди - структура аналоги л1зину та apriHi-ну в полШептидному лакцюз1 (рис.2). Сорбенти А та Б, окр1м анало-riB л!зильних залишйв, м1стять в!льн1 карбоксилып групи. Карбок-скльш групи сорбенту А знаходяться на задая!й структурою молекули

- 11 -

лозину задстак! в!д амхно-груп, ЩО ДОр1ЕНЗОБ 0.68 НМ, тод1 як карбоксильн1 та ам1-когрупзз сорбенту Б знаходять-ся на взизадковз-зх biдеталях. Аналогично, в сорбентах Г та Д карбоксильно групи знахо-дяться або на ф1ксован1й вод-craHi ВЭ1Д гуан1дильяж груп (Г), або на взшадковкх з!д-стзнях (Д). В сорбентах В та Е карбокскльн1 групп блокова-н1 етеркфгкащью i вхлънзми в ише амоно- чи гуанодильн1 Групи.

Л1гандна специфгчнхсть лхзззн-вв'язукчкх дЬоянок плазмхногену ладккк. На рис.3 подано результата взаЕыодо! Л13-плазмоногену з сорбентами, що шстять ашно- та карбоксильн! групи (рис. ЗА) та лише амояогрупи (рис.33). В поровнянно з лхзин-агароэою сорбент з комб1нозаним лхгзндом в1др1знявться большою неспецифхчною та мен-шою саецкфхчною сорбщямм. Оск1лькзз для л!гандов ло зз-ш-зв' язухзчих д!лянок оптимальна в1дстакь м!ж ашно- та карбоксильного групою становить 0.68 нм (Winn et al.,19S0), зрозушло, ¡до лише частина пар ашн-карбоксил виявиться првдатною до вззбмодП з л!зин--зв'язуючими д!лянками плазмхногеку. В той же чао наивность специ-фочнох взаемодН плазтногену з сорбентом, у котрого ам1но- та карбоксильк1 складов! логанду не калекатъ до oflHie'i молекули лозину св!дчить про те, що у вкладку м1жб!лкових взаемод1й логандом л1зин-вв'язувчо1 долянки меже бути не лише С-кхнцевш л1зин, але и пара л1 зил-карбоксил, ¡до налекить до р1зних залишкхв ам1нокислот. BsasMOfiiH плазм1ногену з сорбентом, що мостить лише ам!ногрупи, як i у випадку сорбцП плазшногену кроля на амонопентил-агарозо (Hatten,1975), повн1стю руйнувться 0.5 М розчзпгом NaCl. За менших значень йонно! сили цв взаемоднз може бути зареестровано та досл0джено методами фронталько-к!льк1с .-но! аф1ннох хроматограф^. Отркмало дан1 подтвердкугать лрипузцення (Christensen,1984) про оснування в плазм1ногено в1дмонних вод л1зин-зв*язуючих дглянок, цо потребуюсь в язюсто логанду лзязе валзшзок основноз амонокислоти - л1з!шу чи аргтну.

А i соон ^-очен^мг Г b соон 1 ^-оим^ю-с.' vi

Б J«-{CH2)g.KH2

6 j-N-CCK^-HK;. E 3 ,HH

PrIC.2.

А П

и го. номер фракци

ПрофШ елюцп Л13-пдазш.ногену в сорбенИв, до шстятъ ам1но-та карбоксшгьн! групи (А) та т1льки зм!ногруш (Б). Стр1лками в!дм1чено елкзцП: 1-0.5 М розчкном КзС1; 2 - 0.2 М розчивом 6-аы!ногек-саново! кислоти.

Рис.2.

Вхдмхни в л1тандн1и опециф!чвсст! лгзин-зв'язуючих д!лянок р!зких форм штазм!ногену людинк. Взземодп з константами дисоща-ц11 понад Ю-Зм для афхнно! хроматограф!! практичного значения не мають ((Згауе5,Ш,1974). В ГЛУ-т1азм!ноген! е лше одна, локализована в крингл! 1, достатня для аф: иного зв'язування д!лянка взэб-ыод!1 г ш-амхнокарбоновими кислотами (Матсин е! а1.1930). В Л13--плазм1ноген! таких дШнок двх - в первому та четвертому кринглах (Мзгсиз е1 а1.,1979). Вважавться, що л!зин-зв7язуюча д!лянка крин-гла 4 не пркдатна для афшно! сорбцП, а отже - ! для м!хмолеку-лярних взаЕМодхй плазмГногену 0/аН,Ра1;1т/,1982). Пор1вняння профЬ л!в елшд! сорбованих на л!зин-агароз! ГЛУ- та Л13-форм плазм!но-гену лШйним гард!енгом аргШну (рис.4) дозволяв припусткти участь лхзин-зв'язуючо! д1лянки кринглу 4 в сорбцхйному процес1. Якдо ГЛУ-плазм!ноген елюетьсн гострим сшглетнш пз.ком, то проф!ль елюцП Л13-плагм1ногену мае "плече", котре св!дчз5ть про участь у сорбцшному процесх двох д1лянок взаемодП а л!зш-агарозою, що в!др!зняються М1Ж собою за ст1йкостю до елющ"! аргоном. За елю-цП 0.1 М арг!н!новш розчиком сорбованих на л!зин-агараз1 форм плазм!ногену ГЛУ-плазм!ноген десорСуеться повехстю, тод! як Л13 -- лише частково (рис.5). Отриман! дан1 дозволяють припустити нзяв-н1сть в Л13-плазм1ноген! двох, в1дм!нних м1* собою за л!гандною специф!чн1стю, л!зин-гв'язукчих д!лянок. Менш специф1чнз здатна конкурентно взаьмод1яти як г парою л1зид-кзрбокск1, так ! з парою арг1н!л-карбоксш1. Б1льш слециф!чна перевакно ззавмод!5 з парою

^280

0.8 АРГИНИН, И А 0.5/ 1 \ X

0.6 / 1 . 1 / 1 \ 1 /0-4

А 1 \ ' 1 / / \ у > о.з

0.4 0.2- 1 Д 1 ' Н I ) \1 , \>л 2 / ' ХЛ \ 1 \У\ \ с,. » У' \ 4 /7/ V \ ---------- -■-

0 5 ¡5 15 го 25 30 номер фракцП

Ркс. 4.

Профхл! елющ.1 ГЛУ (-) та Д13 (— -)-форм плазшногену,

сорбованих на лхаш-агарозз., лШйним градхентом зрПнхну. Стрхлками вхдмхчено едюцП: 1 - 0.5 М розчином ИаС!; 2 - лх,-нпшим град1гнтоы арпнхну.

лхзил-карбокскл. Вкзначене язкще паже бути застосоване для в1ддх-лекня натиБного плазмхногену в1д деградованих форм: при нанесеннх на урхвновзжену 0.1 М розчином арПн!ну колонку а .глзин-агарозою сутш розчинеких в тому ж розчкп ГЛУ- та Л13-форм плазм1ногену афхнно зв'язуеться та може бути десорбовака розчином б-ам!ногекса-ново1 кислоти липе Л13-форма шгазм1ногену. ГЛУ-фарма проходить через колонку розгягнутнм шком, що св1дчить про конкуренцхю за л1зкн~зв*язуючу дх.лянку м!к молекулами хмобШзованого лхзину та розчкнеяого аргхкхяу.

Рис.5.

ПрофШ елюцН 0.1 М аргх-шкозим розчином сорбованих на л!зин-агароз1 ГЛУ (- - -)

та 113 (-)-форм плазм1но-

гену. Стр1лками в1дмхчено елшцх: 1 - 0.5 М розчином ЫаИ; 2 - 0.1 М розчином ар-гхн!ну; 3 - 0.2 М розчином 6-змхногексановох кислоти.

Локал1заЩя д!зин-зв'яэудчих делянок пдазШногену людини. Sa нашими даними ГЛУ-плазьйногек маг липе одну, мэнш специф!чну, л1зкн-зв'язуючу дхлянку (рис 4 та 5). В Л13-шгагм1ноген1 наявн! як меня, так i б!льш специфична далянкм вэавмодИ з л1зин-агарозою. Виходячи з даних вдцо докал1зац1! в зазначених формах плазм1ногену д1дянок взавыодИ з а-ашноварбоновими кислотами (Marcus et al., 1879,1980), логачно припустит, що мент специфична лхзан-зв'язуюча д!лянка знаходиться в першому крингд1, а б!льш специф!чна - в четвертому. Для перев!рки цього припущення дослхджувалися аф!няо--зв'язухт властквост! вшщуючих л1вин-зв*язувч1 д!лянки фрагыен-Ив плазм1ногену по вхдношенню до л1зин-агарози та гомоаргШн--агарози - сорбенту з лагандом - аналогом apriHiHy. 3 л1зия-ага-рози фрагмента К1-3 та крквгл 4 повн1стю десорбуються 0.1 М apri-н1новим розчином, тод1 як важкий ланщзг нлаэмхну веде себе под!бно до Л13-шгазм1ногену, тобто частково десорбугться 0.1 М аргавановш розчином 1 nobhicto - розчином б-ам1ногексаново1 кислоте. 0.5 М розчин хлориду натр1ю noBHicmo десорбув з л1зкн-агарози крингл 4 та мало вшшвае на сорбц1в валкого ланцюга плазм1ноу та фрагмента К1-3. При нанесешп 61лк1в на ур!вноважену 0.1 М apriHi-новим розчином колонку л1зкя-агарози зв'кзуеться та десорбувться 0.2 М розчином б-ашногексанов: кислоти один лише важкий ланцюг плазм1ну. з roMoapriHiH-araposoD Л13-плазм1ноген, важкий ланцюг плазм1ну та фрагмент К1-3 взаемодгютг практично хденигчно, тобто специфично сорбуються, частково елшться 0.2 М розчином б-амхно-гексаново! кислоти i повн!стю - 0.1 М розчином apriHiHy. Крингл 4 з rob'oapriHiK-araposora не взазмодЗЕ (рис.6).

Рис.6. Проф1л1 елзощ 1 з

apriHiH-агзрози важкого ланцюга плазмхну (—), фрагменту К1-3 (—) та крингла 4 (—). Стрелками в!дм1чено елюцп: 1 - 0.5 М розчином NaCl; 2 - 0.2 М розчи-

0 5

ю 15 го is- зо

номер фракцН

ном 6-sMiH0reKcaH0B0i кислоти; 3 - 0.1 М роз-

чином apriHiHy.

При нанесена! на вр1внозажеку 0.2 М розчином б-ам1ногексаново1 кислоти колонку з гомоаргШн-агарозою важкий ланцыг плазм!ну та фрагмент К1-3 ведуть себе однаково - сорбуються та можуть бути десорбовак! 0.1 М розчином аргШну. Отримая! дан! дозволяють припустити наявн!сть широкоспециф!чно1 лазин-зв'язукчо"! д!лянки в першому крингл1 молекули плаэманогену, а вуэькоспециф!чно1 - в четвертому крингл!. Десорбц!в !зольованого крингла 4 0.1 М аргШ-новим розчином з л1з1ш-агарози може бути пояснено зменшенням зв'я-зувчих властивоотэй д1лянки крингла 4 в касл!док його азоляцп з нативного оточення. Це припущення п!дтвердкуеться численими даними (ЬегсЬ,1980,У/!пп з1.,1980,Магсиз,1978) про значк! розб!жност1 у зз'язуючих влзстивостях плазмхногену та його фрагмент1в. Нездатшсть !зольованого крингла 4 до сорбцП на гомоарг!н1н--агароз1 св!дчить про слабну спор!днен!сть його зв'язуючо! д!лянки до взаемод!! з парою арг!н!л-карбокскл.

АргШл-зв'язуюч! д1лянки плазм!ногену. Для перевгрки припущення про здатн1сть л^зин-вв'язуючих д1лянок ефективно взашод!яти з парою арг!н!л-карбоксил було синтезовано сорбекти, що мани як гуан!дильн1, гак ! карбоксильн1 групи. В одному випадку в!дстань м1ж гуан1дильнов та карбоксильного групаыи в пор!внянн! з молекулою арПн!ну було зб!лылено на одну метиленову ланку (рис.7А), в другому ж випадку в!дстан! м:ж гуал!дильниш та карбоксильними група-ми носили зкпадковий характер (рис.7Б). Як вт!кае з результат!в аф!нно-хроматограф!чних досл!д!з, зв'язухзч! вдастивост! обох сор-бект!в практично однаков!. В обох зипадках плазм!ноген специфично сорбувться, витримув проыивку 0.5 М розчином Май, частково десор-бувться 0.2 М розчином Б-ам!ногексаново1 кислоти ! повн!стю -- 0.1 М розчином арг!н!ну.

В присутност! 0.1 М аргШну зв'язузання б1лку з сорбентами не в1дбуваэтьоя. Отркман! результати п!дтверджунть припущення про здатн1сть л!зин-зв* язуючих дхлянок ефективно взавмод!яти в парою аргШл-кзрбоксил га св!дчать про нзявн1сть в плазм1ноген1 в!дм!н-них в1д л!зин-зв*язуючих д1лянок взаемодП з арг!н!льними залишка-мк в жшпептидному ланщэз1. Для з'ясування необххдност! для д1ля-нок цього типу каявност! в л1ганд! в!льно1 карбоксильно! групи було сиктезозано сорбент, що М1стить одн! лише аналоП арг!н!льких груп. Плазм!ноген специф!чно зв'язуеться з сорбентом х не десорбу-вться Н1 0.5 М розчином МаС1, н1 0.2 М б-ашногексаново! кислоти. Десорбщя досягагться лише О Л М розчином аргШну (рис. 8).

Рис.?. Проф1л1 елвцП Л13--плазмд.ногену в гомо-арг1н1н-агарози (А) та з сорбенту, що шстить гуан1дильк1 та карбок-сильк1 групп на випад-ковкх в!дстанях (Б). Стрелками в1дм!чено елюцШ 1 - 0.5 М раз-чином N301; 2-0.2 М розчином б-ашногекса-ново! кислоти;3 - 0.1М розчином арг!нану.

Рис.8.

Профаль елхщп Л13-плаз-м1ногеку з сорбенту, що м1стить л1гакди - аналоги аргШлъних залшайв. Стр1лками в1дм!чено блюдах : 1 - 0.5 М розчином Кай; 2-0.2 М розчином 6-ам1ногексзноБо1 кислоти; 3 - 0.1 М розчином арг1н1ну.

Специф1чне зв'язування в1дбува8ться 1 за каявностх 0.2 М розчину 6-ам1ногексановох кислоти. Сорбщя плазм!ногену на сорбент! з л!гандом - аналогом аргд.нхлького залщпка в пол!пептидному ланцюгу як1сно в1др1зняеться в!д сорбцхх на сорбентх з л1гандом - аналогом л1зильких залишк!в (рис.3 Б). Отршак! результати св!дчать про наявн5.сть в плазм1ногенх лвдшш вхдмхнних в1д Л1зин-зв'язуючих дхлякок з яокраво вираженою спорхдненютю до аргШлъних залишив. Попереднъо виоловлене ярипущення про вхдсутнхсть в плазмАногенх лвдини вхдшнних вх.д л1зин-зв'язуючих д1лянок взавмодхЛ з арг1на-ном (Ухпп е! а1.,1980) Сазовано на даних про десорбц!ю сорбованого

на apriKiH-araposi плазм1ногену малыми концентращями б-аманогек-саново1 кислоги - л1ганду лазин-зз'язуючкк д!лянок. Однак 1мо55.л1-зований за «-ам!яогрупу apriHiH не ыоже розглядаткся як аналог арг!н!льного залишку в шШпептидному ланцюгу через близько po3Mi-щену карбокоильну трупу, здатну ефективно взавмодаяти з гуан1дшш-ною та створювати перешкоди для взаемодП з однокомпонентними эв'язувчими д!лякками. В той же час заздяки наявност! негативно'! та позитивно! складових частив 1мобШзований apriHiH придатний до взаемод!! з л1зин-зв*язуючимк д3.лянками, чим i може бути пояснено вразливе до елшц! б-аш.нагексанозов кислотою зв'язування плазм!-ногену з шобШзсваним apriHiHOM (Winn et al.,1980). 3 назедених даних такой випкае, що ран!ше описан! ам1ногекоил-зв*язувч1 д!-лянки (Ciiristensen, 1984) s лише проявою взаемод!! арг1Н1л-зв*язую-чих д1лянок з малолспециф1чкш л!гакдом.

Локал!эад!я арг!н!д-зв* язувчих д!лякок: пдазм!яогену. Для лока-л!захц1 знаходженкя арг!н!д-гз'язукчИл д!лянок досл!джували взаБмод1ю фрагментов плазм!ногеку з roMospriHiK-arapoBDH та з гуатдилгексил-агзрозою. Крингл 4 з цимн сорбентами не взавмод1в. Важкии ланцвг плазм!ну, фрагмент К1-3, монош1азм!наген, легкий лзнцаг плазшку та п'ятий крингл специфично зз'язуються з гомоар-riHiH-атарозога, при чому маюч! лозин-зв'язуючо долянки важкий лан-цюг плазм!ну та фрагмент К1-3 мокуть Сути частково десорбован! розчином 8-ам!ногексанозо1 кнслоти (рис.9), котра не спричкняв до десорбщ! позбавлених л!зин-зв'язукзчих д!лянок мшИшазмокогену,

РИС. 9. Проф!л! елюц!! легкого

ланцюгу плазм1ну (-),

кркнглу 5 (_ -) та фрагменту К1-3 (—) з сорбенту, що MicTi-iTb л1ганди-аналоги арг!-н1лних залгатив. Стр1лкзш вадм1чено елюц!!: 1 - 0.5 М РОЗЧИНОМ NaCl; 2 - 0.2 М розчином Б-амоногекса-ново! кислоти;3 - 0.1М розчином apriHiHy.

легкого ланцюгу плазшку та кринглу 5. Повна десорбщя вс!х дослдауванзк 61лк1е досягаетьея лише 0.1 М розчином арПн!ну. Отриман! результата св!дчать про наявнхсть арг1н1л-зв*язуших дАлянок в крингл1 5 та легкому лзнцкт плазм!ну, що идтверджуБ припущення (УагосИ,РаиЬу,1981) про те, що бензам!дин-зв'язухт д!лянки цих фрагментов б д1лянкаш взавмодИ з аргШном. У фрагмент! К1-3 бенэам1дин-зв*яэуючих д1лянок немав, однак з гомоаргх-н!н-агарози в!н шжйстю десорбувться лише арг1к!новим розчином (рис.6), а з гуак!дклгекскл-агаразов взаемод!Б под1бно до легкого ланцюгу плазм1ну га п'ягого кринглу (рис.9). Отримаш дан! св1д-чать про наявтсгь у фрагмент! К1-3 арг!н!л-зв*язуючо1 д!лянки, котра не б бекзамщш-зв'язуючою.

Анал1з отриыаного експершектального матерз.алу дозволяв зробк-ти ряд висновгав щодо л!гандно! специф!чност1 та докаизацП дхля-нок м1жмолекулярно1 взаемод!'! плазм!ногену (плазмхну) людини. Показано ¿снування двох видЗв д!лянок зв'язування - двокомпанент-них та однокомпоненгних. До двокоыпокентнкх е1дносяться д!зин--эв'язуш! Д2ЛЯНКИ, котр1 ефективно взаемоднгаь з зарядкеною парою Мзил-карбоксид чи арг!нз. л-карбоксил. Доведено, що необх!дна для взавмод11 з двокомпокентними зв'явуючкми дыянками пара Л1ганд!в не обов'язково повинна належати до одн!в'1 С-к3.нцево5 молекули лазину чи аргШну. В частного деградованому плазманоген! знахо-дяться дв! двокомлонентв! дхлякки м!шолекулярно'! взаемодП, що в1др!зняються ь&к собою за специф1чн1стга. Бадьи; специф1чна д!лянка в!ддае перевагу л!хандн!й пар! л!зил-карбоксил, год! як менш специф!чна легко взавмодав як з парою л!зил-карбоксил, так а з парою арг1н1л-карбоксид. В натквному плазм1ноген! проявляеться лше одна - менш специф!чна - двокомпонентна д!лянка зв'язування. На п1дстаЕ1 аф!нно-хроматограф!чвого досл!дкення форм ! фрагменйв плазманогену зроблено висновок про локалхзацхю 0!льш специф!чно! л!зин-зв'язуючо1 дйвгаки в крингл! 4, а менш специф!чно1 - в крин-гл1 1. Доведено ыожлиб1сгь участ! л!эин-зв'язуючо1 д!лянки кринглу 4 в мйкмолекулярних вэаБМОД2ях Л13-плазм!ногеву та плазм1ну. На п1дстава в1дм!чено1 р1знщц в специф1чност! л1зин-зв'язуючих делянок крингл!в 1 та 4 розроблено метод розд!лення нативно! та частково деградовано! форм плазм!ногену на лАзин-вмащуючих сорбентах.

До однокомпенентних д1лянок м!жмолекулярно1 взаемодП взноситься вадмзшп в1д л!зив-вв'язуючих д!лянки взаБмодП з арПнАль-

ними залишками, kotpî не потребузоть приоутностг вальних кзрбок-сильних труп. Експериментально встановлено ïx лггандну специфична сть та локализацию по доменним субодиницям модекули плазм!ногену (плазм1ну). Дв1 з д1лянок такого типу. локал1зован1 в кргаглх 5 та легкому ланцюгу плазм1ну, 1денгифз.ковано як paHime в1дом1 бензам!-дин-зв'язуюч1 д!лянки. Третя ж, що знаходитъся у фрагмент! К1-3, з бензаьйдином не взаемодХв.

На п1дстав1 отриманих даних про л1гандну специф1чн1сть та ло-кал1зац1ю д!лянок м!гшэлекулярно! взаемодГ! плазьЛногену залропо-вовано г!потетичяий мехазпзм направлено! д!"1 плззм1ну на ф!брин, в основ! якого лежить коккуренщя аргШл-зв'язуючих д!лянок з активнш центром плазм1ну, котра веде до розщеплеяня в $i6pHHi лише л1эилъних зв'язкхв.

2. Д0СЛ1ДКЕННЯ ЕФЕКТОРНО! Д1ЛЯНКИ СЕРИНОЕИХ ПР0ТЕ1НАЗ

Аф1нно-хроматограф1чне розд!дення протеод!тичного комплексу з п1лоричнкх додатк1в лососевих на сорбентах з лхгакдаыи г1дрофобно! природи. Результати хроматограф!чних досл!д1в по розд!ленню муль-ткферментного комплексу свЗдчать про !сяування залежност! м1ж структурою !моб!л!эованого л!ганду та властивостями сорбенту: за наявност1 в лаганд! двох г!дрофобних груп зростання ступени ïx стерично! доступност! для контакту з б1лком веде до зростання за-гально! сорбц!! протеолхтичноП активности котре супроводжуеться пад1нкям xiMOTpraicHH-rpmicHHDBo'i селективност1 сорбенту (Табл.1). EiflMi46Hy залежн!схь не можна було пояс-нити з точки гору з!домих даних про зв*язуш1 властивоот1 та будову активного центру сери-нових npDTeiKas, котр! виключалк можлив!сть зв'язування б!льш н!ж oflHisï г!дрофобно! групи. Ферыентативнии г!дрол1з пептидного зв'язку nepeöiras через утворенння ковалентяого ацил-ензиму, при чому карбокси-компонента розщеплюваного зв'язку утворюв ковалент-ний зв'язок з серином г1дрол!тичного центру. Розцешоований пептид под!ляеться на трупу, що залишавться (...-Pg-Pi-COOH) га трупу, до В1дходить (H2N-Pi*-P2*-..•)• За утворення фермент-субстратного комплексу ам1нокислотн1 залшки обох груп взасмод!ють з субд1лян-ками ферменту (S- та S*-зонами, б!дпов1дно) (Schechter I.,Berger А. ,1957). Анал1з числених даних щодо розм!щення низькомолекулярних субстрат1в та !нг1б1тор!в в активному центр! серинових проте!наз (Erlanger,1960,1963, Cohen Д964,1973, Hein,1960,1951,1963 та imii) дозволяв вщЦлити чотири субд1лянки взаемодП з структурами -

Тзблкдя 1А.

Залелн1сть сорбцП л1ыоар'лпс1Ш-под1йно'1 активност! в!д структур!! Íb506ÍJEÍ3DBaK0rD гхдрофобкого л1гакду.

N На1менуваняя п/п лхганду Дэсорбо-вано ЫГ Активность по БТМЕ Питома, Зб1лыденнп Затальна, ОД/МГ ШТОШП в 7. ь!д активное- нанесено! tí, раз

1 2-тозилам!но- 0.88 £936 22.8 91

-З-нафтоика к-та 21.0 88

2 М-карбобензокси- 0.92 Б523

-D,L~$eRiEaaaHiH 5023 19.1 87

3 о-тозшшьино-бен- 1.00

зойна к-та 81

4 N-бутилоксикарбо- 0.97 4813 18.3

72

5 ы-тозш1ам1но-бек- 1.10 3787 14.4

зойна к-та

Б Ы-тозил-L-лейцин 1.42 2814 10.7 69

7 п-тозилам1но-Сен- 1.47 2630 10.0 67

зойна к-та 10.0 63

8 М-бензо1л-1-глу- 1.39 2530

TawiHOBa к-та 33

9 K-6eK30ií-L-asaHiH 1.27 1499 5.7

10 И-бенго1л-Ь-вал1н 1.05 1210 4.6 22

11 íl-6eHsoií-L-acna- 1.06 710 2.7 13

pariHOBa к-та

- замхснккамк а-вуглбцевого атому субстрату:

~ "гхдрофобка кшпекя", а5о аг-дхлянка, шр взземодхе з Р^-за-

лишком субстрату, задаючи тнм самим взздову специф!чн1ст:ь ферменту;

- ацкламхдна (агп) д1лянка, комплементарна P¿- та Рз-залкшкам субстрату. Структура адекватно! агп-дхлкнцх частики субстрату чк iHri5iropy впливзв на орхентацхв потрхбного зв'язку в зону дхх гхдрол1тичного центру, не вплньзкчи на силу зв'язування ферментом субстрату;

- зона взаемодП з й-водкевим атомом (cí-h), характерна сзозми малыми разм!рамк. Вм1ш,екня в 150 зону скхльки-кебудь o6'smhoí структури piara noripxays реактивкхсть субстрату чи !нг!б!тору;

- четвертою субд1лянков взазшди з субстратами серинових проте1наз е зона, що адекватна "в!дходяч1й труп!" субстрату -залишкзм Pi'-..,-Рэ* в 1»'-к!кця роащеплюваного зв'язку. Скхльки-небудь систематкчких досл1джекь род! адекватнкх ц!й rpyni структур не лроводилося - як через ц!лу низку методичних

Таблица 1Б.

Заяешйсть сорбцп трипсин-под16но! активности вод структура ошбШзовзного л1гакду.

Деоорбо- Активн1сть по БАЕЕ

N На1менувалвя вано Питома, Зб1дьшення Загальна,

п/п б1лку, од/мг ИИТ0М01 в % в!д

л1ганду мг активнос- нанесено!

т1, раз

1 Н-карбобензокси- 0.92 955 4 Л 17.1

-Ю,Ь-фен1лалан1н 885

2 2-тоэгаам1ко-- 0.88 3.8 15.2

-3-нафтокка к-та

3 К- т о з кл-!_- л е йцин 1.42 839 3.6 23.2

4 И- бу тилоксззкарбо- 0.37 629 2.7 11.9

н1л-Ь-лезщзш

5 о-тозиламоно-бен- 1.00 559 2.4 10.9

зойна к-та

б м-тозилам!но-бен- 1.10 512 2.2 11.0

зойна к-та

7 Н-бенгсил-Ь-глу- 1.39 489 2.1 13.3

там!нова к-та

8 К-бенэо1л-Ь-Бал1н 1.05 468 2.0 9.5

9 п-тоззиам1но-бен- 1.47 373 1.5 10.7

зойна к-та

10 Н-бензо1л-Ь-аспа- 1.05 303 1.3 6.3

рапнова к-та 5.8

11 И-бензо1л-Ь-алан1н 1.27 233 1.0

труднощов, тзк 1 через сзого роду -рздгацйкасть досл!дження субстратно! спещзф!чност! фермент1в лише в б1к С-к1нцево"1 часгини молекул субстратов та !нг!б!тор!з.

3 оншого боку, деяку, хоч о вкраи обмежену, !нформац!ю ¡додо зластизостей субд!лянки зв'язування "зодходячоз групи" можш отримати, провгвши сисг&матизац!ю та аналоз наявнз-зх даних про "непродуктивне зв'язування" низькомолекулярних суботратхв а-х!мо-тршсзгаом. Утвореннн непродуктивного зддукту, що не шдлягае подалыюму розщепленню ферментом квляе собою окремий випадок конкурентного 1нПбз.юзаяня ферменту, за якого в ошчботором в сам субстрат, та водбуваетъся за схемою (Антонов,1991):

кг

Е + 5 > £3 -^ Е + Р

Пкз'

ЕБ'

СтуШнь впливу непродуктивного зв'язування субстрату на фермента-

ТНВНИЙ ПрОДеС ВЗЛеЖИТЬ Б1Д СП1ВВ1ДНОШеКНЯ Ks/Ks", тобто б1д сели вв'яэування субстрату в продуктивному та аномальному положениях. Впходячи з неможлизостх вшщенкя в ct-h-зону ск1льки-кебудь об*емких труп та з вхдомох здатностх аг-д1лянки ефективно зв'язувати бензо1лашдну трупу, анал!з структур аномадьних субстрат1в й-xiMO-трипсину (Bergman, 1938, Ebats, 1959, Hogness, 1953 та 1нш1) дозболяе д1йти висновку про те, що ефективне непродуктивне вв'яэування стае ыожливш лшне ва орхвнгздП б зону взаемодГ! з "бхдходячою групок" uo'sMHoi гхдрофобко! сгруктури. Вхдносно до наших експершенталь-ки>: даких дэй висновок дозволяе припустити за найб1льш вхрог1дке ьпсце знаходження дхлянки взагмодШ з додатковою г1дрофобною трупов афхнного лхганду зону взавмодП а "в1дходячою групою"субстрату.

Анал1з Д1тературнкх даних з м?тою локзлхзацН додатково! д!лянки оеринових протехназ. üspesipKa зони взавмодп з "вхдходя-чов групою" субстрату традищёнши методами порхвняння субстратных чи 1нг!61торних вдзетивостей групп псаапепкцЦв потребувала синтезу кхлхкох десяткхв иентапептидхв з вар1вззнняы амхнокпелоткнх залкпшв по Pi'-, Р2'- та Рз'-позицхях. За наявних умов виконакня подАбно! роботк було практично неможливим, не кажучи вже про неод-нознзчнАстть отримуваких у такик cnoci6 даних через можлкв1сть альтернативних зв'язувань. В той же часа необх1дна 1нформац1я щедо локзлхзацх! додатково! д!лякки мхяыодекулярно! взавмодхх серкнових прогехназ могла бути отрицала за допошгою систематичного аналхзу наязних даних про структуру реактивних центрхв бхлкових хкпбхто-рхв серинових протехназ (cepniHXB), котрх за кхкетичними параметрами являють собою чи не адеалън! субстрати в1дпов1дних фермент1в (Lasko!iski,1981). Видова спёцифхчкхсть cepniHa задавться, коч i не строго, природою зм!кокисло~ного залишку в Р1-полоэхешп реактивного центру, причаму шхнокиалотна зам!на в ц!й позицП веде до BiflnoBiflHO'i SMiKH специфАчност! cepniHy. Структуру 51льшост1 сер-niHis коротко фхксовано численими дисульф1дкими зв'язкзш, що вважавться за кеобх1дне для шдтримки реактивного центру в оптимально для взаБмодАх г протеАназаш конформацШ. За велико! р!зноман!тност1 вид1в cepniHiB (на сьогодн1 в!доыо б!лыпе двакад-цяти вхдм1нних мхж собою ciMeficTB) конформацП 'ix резктивних цент-piB практично 1дентичн1 (Laskowski,198Q). Будь-fiKi фактори, що поруиують цю конформац!», приэводять до р!зкого nsfliHHH !Hri6iTop-ких властивостей cepnisy CHolmes,1987, Bruch,1988, Potempa,1991). За утворення фермент-серп1нового комплексу як у фермент!, так i в

iHriOiTopi практично однаков1 поверхк! площиною 14D0 А2 стають екранованими в1д молекул води, при чому на долю F3-...-Рз'-д1дянки реактивного центру припадав до 77% укрито! поверхн! iHri6iTopy (Janin,1976). В склад1 фермент- cepni нов ого комплексу ам!нокислотн! залишки у Pi- та Рг'-положениях мзють п!двицений ступ!нь маскуван-ня та аномально зисоку к1льк1сть контактов з в1дп0в1дними трупами ферменту (Blow,1972). Дан! рентгеноструктурного достижения фермент- cepniноеого комплексу привели до припущення, що Рг'-залишок cepniHy грав в процес! комплекооутворэння не мениу роль, н!ж зали-шк Pi (Sweet,1974). Р2'-положениям реактивних центрхв cepniHiB pisHiix вид!в притаманне яскраво внражене домхнування ам1нокислот г!дрофобно! природи, що неоднораэово в1дм!чалось багатьма авторами (Janin,1976,Carrel,1986,Seemuller,1988 та Imi). Hi для Pi'-, к! для Рз'-положень жодно! законом!рност! не спостер1гаеться. При досл1дженн! к!нетичних параметр!в групп вксокогоыолоМчнлх овому-KOifliB було в!дм1чено, що залнз в Рг'-лоложенн! тирозину на мекш Пдрофобкий ricTiflira приводить до змэкиення !нг1б!торних влаоти-востей, тод! як овомуко1д, що м!стить в цьому положенн! аспарзг!-нову кислоту, ззагал1 не мае властивостей серп!ну (Laskowski,1981).

Наведен! дан! про структуру реактивних центров cepniHiB дозволили висловити припущення про !дентичн!сть додатково! д!лянкн м!жмолекулярно! взаемодп серинових nporeiHas адекватн!й Рг'-за-лишку S2*-д!лянц! активного центру ферменту.

Експершентальна нерев!рка припущення про роль 52'-д1лянки серинових проте1наз. Перев!рку припущекня про ообливу роль S^'-fli-лянки серинових проте!наз було проведено кобим, не мазочим анало-Пв, методом фермент-ф!ксованого зонду, базованим на створенн! передумов для вм!цення в доол!джузану д!лянку одн!б! групи л1ганду зз рахунок гараятовзного зв'язування друго! групи "г!дрофобною кишенею" ферменту з подальшкм вивченням впливу такого роду ефектора на катал1тичн! властивосп ферменту. Досл!джуваним ферментом було вибрано а-ххмотрипсин через в!доыу спор1днен1сть йсго "г!дрофобно"1 кишен!" до лЗгандхв - аналог!в залшк1в г1дрофобних атнокислот. Молекула досл1джуваного ефектора мусила правити за своБр1дний аналог Pi-...-Р2*-району реактивного центру cepniHy. Hi едя ц!ло! низки :топередн!х експеркмент!в було сформу-льовано нзстушп структурн! вимоги:

- молекула ефектора мала Miстити дв! г!дрофо6н1 (наприклад -- бензольн!) групи на в!дстан!, достатк!й для одночасно! взаемод!!

як з 31-, так 1 з Б2'-д1лянкаш ферменту;

- за такого розмщення в занг д!3 г1дрол1Тичного центру мав знаходитись зв'язок, нездатний до вза5мод13 з "ПдролШгчною триадою" ферменту;

- молекула ефектора мала бути симетричноо - для забезпечення однозначного тлумачення отримуваних результата;

- спектральт характеристики досл1джуваного ефектору не повин-К1 спхвпадати а! значениями, котр! вим!ркються при визначешй Пдрол1тично"1 активное?! на в1дпов!дних кизькомолекулярких субстратах;

- ефектор мав бути доотатньо ровчкнкш у еодз..

Зазначенш вимогам в повн!й м!р1 в!дпов1дав диПдрохлорид 1,5-б1с-дибензилам1но-пентану (рис.ЮГ). Вплив ц!в! ополуки на г!дрол1тичну д1ю й-х1мотрипсину ЯКШТНО В1Др!ЗНЯБСЯ в!д дп

Рис.10

Реактивний центр !нг!б!тора х!-мотрипсину та його низькомоле-кулярна структурн! аналоги: А - розмщення реактивного центру !кг!б1тора Баумана-Б1рка в активному центр! а-х!мотршсину (Ьазкошэк!,1981); Б - 1,9-дифен!л-нонан; В - Ы-карбобензокси-1-а}й1но-5--фен!л-пентан;

Г - 1,5-б!с-дибензилам!но-пен-тан;

д - 1,2,3-трис-три-з-фен1летил-ам1но-пропан.

низькомолекудярних конкуренгких !нг!б1тор!в: заш.сть л!н!йного зменшення г1дрол1тично1 д1! зростання концентрацП ефектору викли-кало активащю ферменту як по вхдношэнню до Н-глутарил-Ь-фен!лала-н!л-пара-н!троан!л1Ду (рис.НА), так ! по вадношенню до б!лкового субстрату - альбум1ну людини (ркс.ПБ). Визначена спектрофлуори-метричним методом (ЙишасЬепко еЬ а1.,1990) константа дисощац!'! взазмодП й-х!мотрипсину з 1,5-б!с-дибензилам!но-пентаном станови-ла 1.6 гсМ, щр св!дчило про Ютотко б1льшу силу зв'язування. н!ж

Залегга1стъ г1дрол1тичноЗ д!i а-ххмогркпскну в!д кокцентрац!'! досл1джуваних г1дрофобних ефекторов. Субстраты: А - N-глута-рил-1_-фен1лалан1л-пара-н1триаяШду; Б - альбум!н. Ефектори: 1- 1,5-б1с-дибензилам1но-пентан; 2 - 1,2,3-тркс-три-13~фен1л-етилашно-пропзк; 3 - зн!л1н.

за взаемодп з бензолом, толуолом га ак!л1ном (Кд 25, 13 i 6.8 гпМ, в1дпов1дно (Wallace,1953)). Огриман! дан! дозволяють !дентиф1кува-ти досл!джувану Зй*-д1лянку як давно в!дому, але не локал1зовану за мосцем знаходження, ефекторну дглянку серинових проте!наз. Зростання активноет! ферменту однозначно вказуе на ефекторний характер дослхджувано! дыянки. II зв'язуюч1 властивост1 можуть бути негр1Бнянно слаСшми в!д "Ндрофобно! гастен1", оскглькк захоплення оотакньок oflHis'i з гхдрофобних труп ефектора створив достатньо висок! передумови для вмщення друго! групи в ефекторну д!лянку. Завдяки гкучкост1 ланцюгу, що поедкуе обидв1 групи ефек-тору, вит1сненкя молекулою субстрат/ першо! з них з "гхдрофобно! кишек!" ферменту не веде до обов'язкового випснення друго! групи з ефекторно'1 дхлянки ферменту. Зрозум1ло, що реал1зац1я зазаначе-ного механ!зму мае ускладнюватися га зростання громАздкост! молекул як субстрату, так i ефектору, що й спостерхгавться в випадку 1,2,3-трис-три-з-фенз.летилашно-пропану (рис. 11).

Досл1дження впливу 52'-сткмуляцп ка piSHi стадП г1дрол1зу. Катагпз протеол1тичними ферментами односубстратних реакций проходить через утворення нековалентного фермент-субстратного комплексу ES, котрий перетворюзться в ковалентний ацил-ензим ЕА з видтленням первинного продукту Fi та подальшим г1дрол1зом ацил-ензиму до вiлького ферменту та вторинкого продукту р£ (Антонов,1991):

- 26 -

к! кг кз

Е + г с > Е5 -* ЕА -Е + РЕ

к-1 + Р1

або, в спрощеному виглядх: к! кСаъ

Е + 2 с "' * -* Е + Р

к-1

За гадрсшзу ашдних субстратов швидк1оть процеоу лшхтуеться '/творениям ацил-ензиму, тобто кСаЪ = кг, тод1 як у випадку кдадноефйрних субстратов лш1тушою стадавю б г1дрол!з ацил-энзиму 1 в!дбуваеться його какопичення (кСаЬ = кз).

Порхвняння кхнетичних параметр1в Пдролхзу К-глутарил-1_-фен1л-алан1л-пара-н1троан1л1ду в присуткосз! р!зних концентращй 1,5-б1с-дибензклам1ко-пэктзну (Табл.2) св1дчать про те, що як

ТАБЛЯЦЯ 2. Залежн1сгь к1нетич-них парзметр1в г!д-ролхзу ОРМА а-улио-трипсином в!д кок-центрацН 1,5-С1с--дибензилаьано-пен-тану

ш, Х10_ЭМ кса^ хЮ^ес'1 Кт Х103 М Кт* Х103 и Кщ /Кш*

0 [197] 13.0 0.28 - -

0 12.8 0.33 - -

1 16.4 0.40 О.БЗ 1.32

2 23.9 0.53 0.74 1.40

3 27.2 0.66 0.95 1.44

4 28.8 0.6В 1.16 1.71

5 29.1 0.71 1-36 1.92

утворення нековалекткого фемент-субстраткого комплексу, так 1 процес його перетворення на ацил-ензим п1длягають Ба'-стимуляцП. Зростання у явно! констанги Шха&лЮа ¡V носить нелШйний харктер з наростаючим вадставанням в!д розрахован'1 зз в!домим значениям констакти дисоц1адП взаемодП х1мотрипсину в 1,5-б1с-дибензклам1-но-пентаном величини Ки* (рис.12), що свхдчить про зростання зв'язунзчих власгивостей "Пдрофобяо! кишенх" х1мотрипсину в наош-док '-стимулящ1 активного центру, Таке припущення добре узгод-жувться як з нашими даними про вза»мод1ю оеринових прстегназ з афанними Л1гандами, що м!стять дв1 гхдрофобн! групи, так 1 з!

з61льшенням сили ЗБ'ягування «~х1мторипсином 1моб1д1зованого фен!л-бутил-эм1ну в присутност1 Ы-карбо6ензоксй-пох1дних гхдрофоб-ких амхнокиолот, табто сполук, що м1стять дб1 розк&сена у простор! г1дрофо6ш групп (Биш, 1 Ьег!, 1979). Вшаиканэ Зг'-стимулящею активного центру посилення зв'язуших властивостей "г1дрофобно1 юшенГ' дозволяв також пояснити утворення стабхльних комплегапв

1.5 ■ Кп, X 10®»! Ал ксаЪ|

1.0 - X 103 БВО"1

0.5 ■ в___*---- ---с---окс<^ - 40 - 30 ■ 20

- 10

0

1 1 1 1 1 1 2 3 4 5 ЕфвКТОР, иМ

Рис.12.

Залежн1сть к1нетичних параметр!в г!дрол!зу й-х!мотрипсином

}-1-гхутарил-Ь-фен1лалан1л-пзра-к1троая1л1ду в1д концентрацП

1,5-б1С-ДИбеКВ1'ШЗЗПН0-П&НТ2Ну.

мхж сертнами та анг!дро-ферментами з !нактивованиш за рахунок перетворекня серину в дег1др0алан!н г1дрол1тячяим центром (Ако еЬ а!.,1972). 3 гязгого боку, нкзьку стгйк!сть комплексхв анг1дро--фермент!в з серпанами плазми кроз! - «1-антитрипсином та «2-анти-плззм1ном (Могсп,1375, ЕщЫ1<3 et а!., 1994) - може бути пояснено наявтстю в Р1-положеннях 1х реактивних центр1В мет1он!ну - ам1но-кислоти, не характерно"! по специфхчност! н1 для трипсин-, н! для х!мотрипскн-под!бних фермэнт!в.

За дослгджуваних кояцентрацп субстрату, ферменту та ефектора 1 .б-бЮ-дибензилашно-пентан не вшшвав на г!дрол!з пара-нхтрофе-н!л-ацетату (рис.13). В1дсутн1сть як зктизуючо!, так 1 1нг!буючо1 дГ! може ввзжатися за тдтверджеяня мехатзму Бз'-стимуляцг!, оскхлки досл!джуваний субстрат не конкурув з ефектором за сильно-зв'язуючу д!лянку 51, однак утворення ацил-ензиму веде до

Е400

0.6 -

0.5 • 0.4 ■ -о- 0-0-0-0-0-°-0-0-°-0-0

0.3 •

0.2 •

0.1 ■

0

1 | | 1 1 г 1 1 ] 1 1 1 2 4 а 8 • 10 12. Ефектор. Ш

РИС.13

Пдрпл1з а-х1мотршсинам nspa-н1трофен1л-ацетзту в присутно-cTi р1зних концентраций 1,5--б1с-дибеквилам1но-пентану.

витхснення пентаметкленового лаящзга з зони дП г1дрол1тичного центру, виводячи тш самим друге ядро ефектору б слабогв*язузочо1 ефекторно! дхдянки. Через це л1м1туюча стад1я процесу - г1дрол!з ацкл-ензиму -'вхдбуваеться за ззичзйного, не активовзного стану фермента. Таке ярипущення добре узгоджувться з численими даними про прискоршчу (промотувчу) д1ю велико! к1лъкост1 г!дрофобних сполук на г!дролхз ацетил-сс-замотршзсину (Шоге et al., 1970). Осыльки м!ж промотуючою д1ею Пдрофобних сполук та силою 'ix зв'язувзння "г1дрофобною гашенев" ферменту немав жодно! корелящЗ, трупов автор1в (Клесов и др.,1974) зроблено вшновок про достат-HicTb для промотування г1дрол1ву самого лице факту зв'язувакня сполуки-промотора "г1дрофабнозо кишенею" ферменту. В сб1тл! отримз-них даких про Sa'-стимуляцию серинових протехназ таке пояснения не моке бути визкане за задовхльне. Б1льш в1рог1дним видавться пояснення Промотуючо! ДП Г1ДрОфОиНИл сполук BSaSMOfliEK! останн!х з ефэкторною 52'-Д1Лянкою ферменту г подалыгою активац!ею активного центру га прискоренням стад:! г1дрол!зу ацкл-евзиму. Як в вкладку 1,5-б1с-дибензилзм1но-пентаку, так, ймов1рно, i в вшадку пох!дких азобензолу (Erlaig,er,l976) вхдсутн^ть впливу ефектора на гхдролхз пара-н^рофен1д-ацетзту коже Сути пояснено порушенням молекулою субстрату Н^'-стимульованого стану ферменту.

Наведен1 дан1 дозволквть припуотити вплив мехак!зму Sa'-стиму-ляц1! та Bei три стадН г1дрол1тичного процесу - утворення неко-валенткого комплексу Mixaealca, його перетворення в ковздентний ацил-енэим та Пдрол1з останнього. Наявн1сть такого роду механ1зму становить основу нативного обмеження протеолхзу за рахунок утворення стаб1льнкх фермент-cepniHOBitx кошлеко!в.

АналАз первинних досшдогностей опосередкованих сериновими проте1назами функционально предегерм1кованих розщеплень. Одноею а важливих ф1з1олаг3.чнкх функщй тршсин-под1бних серинових проте-1кзз в зктиващя неактивних бхлк1в-попередник1в (проформ, проензи-м!в) до В1дпов1дних активних форм за рахунок строго визначених розщеплень на*певних стад!ях визр1вання молекули. ОскАльки натив-ний мехашзм обмеження протеолазу базувться на пхдвзяцетй спорхд-K6HOCTi активних дентр1в nporeinaa до реактивких центр1в 1нгхб1то-piB, здавалося за доздльне провести порАвняльний акзл1з первинних поавдовностей дхлянок активащйних розщеплень в проформах якомога ширшого ряду бходопчно активних б!лк1в. В насд1док такого порхвняння встановлеко структурку аналог iB ыхж дхлянкзыи актизадхиних розщеплень та реактквнкми центрами cepniHiB трипсинового ряду: в Pi-положеннях гнаходяться, як правило, аминокислота трипсиново! специф!чностх, тобто apriKiH чи дАзин, тод! як для Ра'-положень характерно яскрззо зкражене домАнування аминокислот гхдрофобнох прзфоди. Основна ж в1дм!ка д!лянок акткваЩйних розщеплень в1д реактивних центр!в cepniHiB полягав в Е1Дсутност1 жорсткох ф1кса-Цхх розщеплюзаного зв'язку, котра спрдоинш подалыв! конформадхйнх активацией зм!ни. СвоерАднзш виявом д!х такого ыехаяАзму s взае-мод1я серинових npaxeiHas з йг-макроглобул1ном - единим бхлковим iKriuiTopoM, що ЗБ'ягуе протешази поза активним центрам. Зв'язу-вання протехнази молекулою ыакроглобулхна в1дбувавться внасл!док конформацхйнзк змАн, викликаних розцепленяям в так ззанАзз приманочно дАлянц! (bait site) на невелико nocaifloBHOCTi -Arg*-Leu--Val"-His-Val-. Трипсин, плазмАн та тромбО г1дрол1зують зв'язок, утворекий apriHisoM, тод1 як елзстаза розцеплюв валАновий (Sot-Äfltrup-Jensen et al.,1SSO,Roberts,1985). В обох випадках в Pg*-—положениях вхдпозхдних розщеплень знаходиться гхдрофобний вад!н.

Результати порхвкяльного анал1гу первинних послАдовностей дАлянок активацОних розщеплень дозволяють з високим ступенем BiporiflHDCTi висловити прзтущення про участь механАзму Sa'-стиму-дяцАз в процесА активацАх бхлкових проформ. Функц1онадьний змАст За'-стимуляцАз фермента-активатора полягав в забезпеченнА зпвзздкоЗ активацАх проформи на в1дпов1дн1й стадАх x'i взззрАвакня, що добре спхввАдноситься з раннАм припущенням про прискорений гАдролАз бАд-ку за одночаснох йог о взаемодП як з основною, так i з ефекторною ц1лянкзми ферменту (Trowbridge et al.,1963). На жаль, доол1дження чонформацО багатьох бАдкових проформ проведено без надежно! уваги

до д!лянок активацхйного розщепленвя, що не даб можливостх провести 1х пор1вняння з кокформацхяыи реактивних центрхв cepniHiB.

Про ефекторний характер переходу аф1нного зв'язування серино-вих протехназ в тпдрофобне. 1дентиф1кащя ефекторно! д!лянки та встановлення П вшгиву на катагйтичн! та зв'язувч! властивост! серинових проте!каз дозволяе пояснити аномалъник характер взаБмо-дз.1 останн1х з аф!нкими сорбентами, до мЮтять низькомолекулярн! г1дрофобн1 лхганди. Зг!дно в класичнши положениями афхнно! хрома-тографх!, вззгмодШ г Ко, большими за 10~3М, не здатнх забезпечи-ти ефективну сорбц!ю, оск!льки ззмхсть вв'язубзнкя mas в1дбуватися розтягнута едюц!я б!дку у вкгляд1 розтягнутого п!ку (Graves,Wu, 1974). В той же час для зид3.лення серинових проте1наз дзвно i ycniEHO застосовуються iMoOtaisoBaai фен1л-бутил-ам1н та метиловии еф!р D-триптофану - речовини, що характеркзувться Kd 2.8 та б!лызе 2 Ш, в1дпов1дно (Tomlinson, 1974,Foster, 1955). Для випадку фен!л--бутил-аыхну показано, що зв*язуюч1 властивост! сорбенту залежать в1д концентрац!! !моб!л!зовакого л!ганду (Hofstee,1973,1975): до досягненкя останньою певно! велкчини спостерхгаеться вкрай слабкэ зв'язування хшотркпсину, тод! як перевищення цього значения веде до виключно сильно! сорбц!!, когру може бути порушено лише так вваними "деформуючими рогчинами". Не менш ц!кавими б властивост! сорбент!в, що MiCTHTb D-триптофан!л-метиловии ефхр: за його !мо51-л1зац!1 безпосередньо на ВгСМ-активовану агарозу спостер1гаеться вкрай слабке зв'язуБЭКня ххмотрипсику, тодх як застосування спей-сера - Б-зшногексаново! кислоти - спричинюе виключно сильне зв'язування, за якого десорбщя досягавться лише "деформуючими p034jik3mh"(Cuatrecasas,1958). Отриыан! нами дан! дають змогу пояскити зазначен1 аномал!! включениям в сорбхцйкий продес додат-ково! - ефекторно! - д1лянки ферменту. Якщо у випадку !моб!лхзова-ного фен!л-бутил-ашну стрибковий характер змхки властивостей сорбенту в наод1дкш досягкення концентращею !моб!л!зованого л1ганду р!вня, що забезпечуе стзтистичну в!рог!дн!сть одночасно! взаемодП эв'язуючо! та ефекторно! д1лянок ферменту з двома молекулами !мобш>зованого л1гакду, то застосування спейсера у вшадку !моб!л1зованого D-триптофанхл-метилового ефхру екв!валентно збхль-шеншо ефективно! концентрац!! оставнього в [(4R+C)/CDZ pasiB, де С - встань, неабхгдна для одночасно! взаемодП двох молекул л1ганду 3i зв'язуючою та ефекторною д!лянками ферменту, a R - ра-д!ус вхльно! Mirpaui'i лхганду на спейсерх (рис.14). За умов Е~С

застосування спейсера екв!валенгно 25-кратному зб!льшенню концен-тращл хмобШзованого лИанду. Тзке пояснения добре узгоджуеться з влзстивостями сорбектхв з в!дносно низьшо концентраЩею !моб!~ л!зованого фея!л-6утил-ашну та !м0б!л130ваним без спейсеру

В-триптофан!л-метиловим еф1ром, ко-тр1 в павн!й в!дпов!дност! до теорП виявляють вкрак слайк! эз'язуюч! властивост!. 1ншкми словами, спричи-некий зростанням ефективно! кояцен-трац!! гм0б!л!з0Еакага лхганду перерос. 14. :<1д в!д аф!нкого до пдрофобяого зв'язуЕакня е н1 чим !ншим, як под!бнкы до вшадку статистичних скнзшив випадком моделювання рэактквнил центр!в серпШз. Ка особлкву узагу заслуговув под1б-к!стъ до вкладку оэринових проте!каз залежост1 характеру зз'язу-вання т-глобулШв в!д концентрац!! !мобШзовакого фенхл-бутил--ашну (НоГз1ее,1973), цо дозволяв поставите питания про подхб-к!сть механ!зму ззавмодИ останках з комплемектарниш структурами до розглякутого вкладку стимуляци сершовкх протехназ.

Результаты лроведеного досл1дження дозволяють зробити ряд висновтв як практичного, зак 1 теоретичного харктеру. Доведено придатн!стъ гл1цил-гл1цш-арг1н!ву для зфгнно-хроматографгчного видалення трипсину риб. При доавдженв! сорОЩккях властквостеи групи аф!нких еорбент!в з л!гандаш г!дрофобно1 природк ке т1льки досягнуто початково! мети - зкаходження яовзк патектнопридатних л!ганд!в для аф1нно-хроштограф1чного зидыеняя х!мотркпсик-пад!5-них проте1наз, алэ й з!дм!чено ц!кзву взкоЕом!рн!сть: в ряд1 сорбенпв з лхгандами Пдрофобно! природа ва ваявност! в молекул! л1ганду дзох Пдрофобнкх труп зростання ступекю доступност! цих труп для контакту з бхлкоы та зб!льшення в1дстан1 м!ж ними веде до пад!ння видов о! селективност1 сорбенту, тод1 як загалька сорбщйна здатн1сть по вхдношенню до проте!наз зростав. Оскхльки зазначену загежтршсть не могло бути пояснено зз'яэувчимн властивостяш* "г1дрофобно1 кишен!" ферменту, було припущено участь в сорбЩкному процес! додатково"! дхдянки м1жмолекулярно1 взаЕыоди. Анал!з даних про числен! аномал!! в субстратних та !кг!б!торн55Х властивостях яиэькомолекулярнкх сполук дозволив визна-ги за наШдьш вгроПдне мЮце зкаходження ц!в! д!лянки гону взавмодП з "в!дходячою

групою" субстрату, огатистична ж обробка даних про структуру та первинну послодозюсть реактиьних центров бИкових !нг!б!торн1в серинових протеонаэ привела до припущення про !дентичн!сть цов! дишнки За'-локусу наиблгакчого оточення годрол!тичного центру ферменту. За логанднсю специфочнЗстю 5£'-долянка под!бка до "гз.дрофобво1 ккшен1" х!мотрипоину, оск!льки в реактивних центрах серпан1в адекватна 1й Ра'-позищя перевалено вайнята г1дрофобними та - р1дше - позитивно зарядженими амонокислоташ. Для експеримен-тально! перев1рки припущення про роль Б&'-д^янки серинових протез.каз розроблено пргащипи та застосовано пркнципово новий, не маючий аналогов, метод доол!дкення активност! ферменту за допомо-гою фермент-ф!ксованого зонду. Дослоджеко вшшв на активн1сть «-х!штрипсину групк ефекторов, що мостять дв1 годрофобк1 групи, одна з котрих гарантовано зв'язуетьоя "годрофобкою кишенею" ферменту, спричинюшк тим самим зисоку в1рог1дк1сть вмщення друга! групи .в досл!джувану 5г'-д1лянку, Отршак! результата не лише подтвердили припущення щодо !дэнтичносто нез!домо! додатково! д1лянки м!жмолекулярно! взаемодп Зг'-дЗлянщ активного центру, але й дозволили визначити ефекторний характер останньоо, що, в свою чергу, призвело до виявлення явища Зг'-стимуляцоо серинових протекав - виклзочно важливо! складово! частини механозму регуляцоо протеол!зу. Вм1цення в Зе'-долянку адекватного за спецн-ф1чк1ст!0 логанда призводить до посилення як кзтало.тичних властивостей г!драл1тичного центру, так о зв'язуичих властивоотей "г1дрофобноо кишен1" ферменту. Наявн! дан! дозболяють обгрунтувати припущеяня про црнайыенше три види ф1з!олог!чно важливих прояв!в Бг'-стимуляцИ серинових проте!наз. За взаемод!! з реактивними центрами серпШз За'-стимулящя забезпечуе утворенкя стаб!льних фермент-!кг!боторних комплэкс!е, тобто б складовою частинои натив-ного механ!зму обмеження протеолозу. В випадку д!лянок активащй-ного щеплення бЗлив-попередников 5г'-стиму^яц!я фермента-активатора забезпечуб ефективне розп1знавання та швидке розщеплення необх!дного зв'кзку, тобто сприяе переходу проформи в активну форму. За взаеюди з "приманочною долянкою" ао-макроглобулону Зг'-стимуляцоя проте1нази сприяе конформац!йним зм!нам в глобул!-к!, котр! ведуть до захоплекня, а фактично - до !кактивацП - ферменту. 0кр1м того, !снуе ц!ла низка прояв1в Ба'-стимуляц!! в втучких неф!з!ологочних умовах. До такого роду прояв1в може бути взнесено субстратну активащю серинових проте1наз, промотувакня I

ПдрофоСними сполуками гхдрол!зу ацшг-ферментних комплексов, гадрофобну хроматограф!ю та !ш! випадки ефекторного внизу на катал1тичн! чи зв'язуюч! властквост1 серинових проте1наз.

вшшовки

1. В плазм1ноген1 лзодини виявлеко два вкди д!лянок зв'язуван-кя - двокошонентн1 та однскомпонентн!. До двокошоневтних належать л1э1ш-зв'зуюч1 д1лянки, котр1 ефективно вэаеыод1ють а заряд-женою парою лазил-карбоксил чк аргШл-карбоксил, тод! як одноком-пок5нтн1 д1лякки взазмод!вть в лхзкльккми чи аргхкилькими заливками за вадсутносгх карбоксклъко! групи.

2. Двокомпокентн1 д!лянки перпюго та четвертого крингл1в моле-кули плазманогеку б!др!знявтъся м!ж собою за л1гакдною опециф1ч-к!стю. В!лып специф!чна дхлянка маз тдвищеву спор!дяен!сть до пари л1зил-карбоксил, тод! як мэнш специфична взазмод!з як з парею л1зил-карбоксил, так ! з парою арМяал-карбокоил. Доведено, що неабх1днз для взагмодП з двокомпонентними зв'язуючими д1лянками пара л!ганд!в не обов'язково мае належати до одного С-к!нцсеого залкшку л!зину чи арг!в!ну.

3. Доведено, що в нативному плазм!ноген1 проявляемся лише одна дцэин-зв'язуюча д!лянка з мэншою специф!чнхстя, а пхеля в1д-щеплеяня преактиващиного пептиду з'язляеться й бхльш еяедифхчнз. Б!лыи специф!чна л!зин-зв*язуюча д!лянка локалхзована в крингл1 4, а менш специфхчна - в кршггл! 1. Показана можливхсть участ! д1лян-ки кринглу 4 в мажмолекулярник взабмод1ях та запропоновано базова-ний на дхй можливост1 спос1б роздхлення ГЛУ- та ИЗ-форм плазшно-гену.

4. Остановлено виражеку спор!днен!сть однокомпонентних д1лянок до лхгандхв - структурних анзлоПв арг!н!дьних залишк!в, що дозволяв хменувати !х аргШл-зв'язузочими. Доведено, що арг!н1л-зв'язу-юч! д1лянки кринглу Б та легкого лакцюгу пдазм!ну хдектичн1 ран!ше в!домим бензамдан-зв'язуючим, третя ж дхлянка, яка знаходиться у фрагмент! К1-3, з бензамхдином не взаемод!б.

5. На п!дстав1 отриманих даних про лхгакдну специф!чн!сть та локал!зац!!о дхлянок ьйжмолекулярноЗ взаемодП плазм1когену запропоновано г!потетичний механизм спрямовано! дх! плазм1ну на фхбрин, основою якого 5 конкурекд!я арг1н!л-гв'язуючих д!лянок з активним центром плазм!ну, що спричинюв розщеплення в ф!бринх лише д!гиль-них зв'язк1в.

6. Вотзновлено локагпгащю ефекторнох дхлянки серинових протекав та в'ясовано хх роль як з природному процес1 регулювання про-теолозу, так 1 в цШй нкзцо проявив остакнього в штучних умовах. За мосцем зкаходкення ефекторна долянка серинових протеоназ идентична Зг'-позицп модел! Шехтера-Бергера. Л1гандна специфхчюсть ефекторнох дадякки под1Сна до "г1дрифобнох кишенз." ххмотрипоин--трилсинподоСних проте1каз, тобто слостерогавться яскраво виражена спор1дкекость до амококзюлог гхдрофобнох та - р1дше - позитивно зарядженох лриродзз. За силою зв'язування адекватних л1гандхв ¿5екторна долянка значно поступазться "гхдрофобкхи кишеко" ферменту, що найхарагсгерк1ше для а-ххмотрипсину.

7'. Вмхщення в ефекторку дхлянку вхдпов1дного за специфочноств лхганда призводить до поокленкн як зв'язуючз'зх, так о каталхтичних властивоотеи фермента (5£'"-сткмулящх), причоыу доведено, що акти-вадхя в1дбувавться на ьсох трьох стадхях процесу - нековаленткому зв'язуваккх субстрату, утБорэкнх ацил-ензиму та годролхз! остакнього.

В. о£*-сткмуляцхя грав ключову роль щокаименше в трьох видах ф1з1олог1чно важливих регуляцхйкю: процес!в - обмеженн! протеол!зу за рахукок утворення ф&рмент-серпонових комплексов, активащйких розщепленнях в проформах бходюг1чко активних болк!в та забезпечен-На "пасткового" механизму хвактззвацП претехназ й£-макроглобулх-ном.

Э. Показано, що основною водыонозо бхлкових онгоботоров оерико-вих протеоназ в!д окшх б!лк1в, вкаслх.док яко! заметь Пдролозу вхдбувзъться утворення стабольких фермент-серп1нивих комплекс!в, в консервативна структура реактивного центру, що м!стить ам1нокис-лотн! залишки, ор!внтовзн1 в оптимальной конфорыацп та вхдповодко за опециф1чностю зв'язуючХй та ефакторнох; дз.ляккам ферменту.

10. Показано, що числекн! випадки ефекторкого впливу на ката-лотично та зв'язуточ! властизоото серинових протеоназ - активацоя при г!дрол1з1 низькомолекулярних субстратов, промотузаянн годро-Фобними сполуками годрол1зу ацил-ферментних комплекс1в, годрофобна хроматограф!я серинових проте1наз - в проявом Бо'-стимулящх в штучккх нефозх.олог!чних умовах.

11. Показано, що перетворення афхкних лхгзнд1в на г1дрофобк1 визначзвться можливостю захоплекня двох молекул 1мобШзавзного лхганду як зв'язузочою, так 1 ефекторною долинками ферменту. В ви-пздку афонкох сорбцо"! серинових протеоназ на сорбентах з нкзькомо-

лекулярними лхгандами роль спейсера полагай не ст1льки в забезпе-ченнх стерично! доступности лхганда, скхльки в зб!льшенн1 ймов1р-ност! реал!зац!1 Бз'-стимулъованого стану сорбованого ферменту.

12. Запролоновшо новий, що не мае аналог !в, метод досл!дження д!лянок м1жбхлково1 взавмодхх з використанням фермент-ф1ксованого зонду, котрий бззуетъся на забеапеченк! високо! йыов!рноот1 вм1-щення потр!бкох отрукг/ри в слабозЕ'язувчу дхлянку за рахунок створення високо! локально'! концентрацП л!гакду гзрантованим за-хоплекням частики його молекули сильнозв'ягуючою дхлянкою ферменту.

13. На пхдстзе! отриманих даних та результат!з аналхзу первинних посл!довностей численккх ф!з!олсг1чно предетермхнозаних розщеплень висукуто положения про едину для вохх серинових проте1наз структуру д!лянки функц!скального розщеплення, яка складавться з експонованих на поверх-п б!лка-цхл! та ор!ентоваких в оптимальн!й конформад! х вхдповхднкх за специфхчнхстю змхнокпслотнкх залишкхв ?1 та Р<?'.

14. Розроблено принцкпи створення аф!кккл сорбеитхв з заданок видовою спедифхчн!стю та запропоновано нову групу л!ганд!в для афф1нко-хроматограф1чНого вЕД1ленкя трипсин- та ххмотрипсин-подхб-них проте1наз.

БЬВОДЫ

1. В плазминогеке человека обнаружено два вида участков связывания - двукомдонентные и однокомпонектные. К двукомпонентным относятся лизин-связывающие участки, эффективно взаимодействующие с заряженной парой лизил-карбокахл или аргинил-карбоксил, к одноком-покентным же - участки, взаимодействующие с лизкльными или арги-кильными остатками в отсутствие карбоксильной группы.

2. Двукомпоненткые участки первого и четвертого крингла отличаются между собой по лигзндной специфичности. Более специфичный участок обладает повышенным сродством к паре лизкл-карбоксил, менее же специфичный легко взаимодействует как с парой ливил-карбоксил, так и с парой аргинил-карбоксил. Необходимая для взаимодействия с двукомпоненгными связывающими участками пара лигандов не обязательно должна принадлежать одной С-конечной молекуле лизина или аргинина.

3. В нативном плазминогене проявляется лишь один, менее специфичный, лизин-связывавдий участок, по отщеплении же преактквацион-ного пептида проявляется и второй - более спехщфйчнки. Более спе-

цифичный лизин-сзязызавдий участок локализован в крингле 4, а менее специфичный - в крингле 1. Показана возможность включения связывающего участка крингла 4 в межмолекулярные взаимодействия и предложен оснований на этой возможности способ разделения ГЛУ- и ЛИЗ-форм пдазш'шогена.

4. Ярко выраженное сродство однокоыпонентных участков к лкган-дам - аналогам аргинильных остатков позволяет именовать их арги-нил-связывающими участками. Аргивид-свяаывакнцие участки крингла 5 и легкой цепи плазмша идентифицированы как ранее известные бэнзашдин-связывающие участки. Третий же, находящийся во фрагменте К1-3, с бензамкдкном не взаимодействует.

5. На основании полученных данных о лигандной специфичности и локализации участков межмолекулярного взаимодействия плазминогека предложен гипотетический механизм направленного действия плазмша на фибрин, в основе которого лежит положение о конкуренции арги-нил-связывающих участков с активным центром плазмпна, ведущей к •расщеплению в фибрине только лизкльных связей.

6. Проведена локализация эффекторясго участка сериновых проте-иназ и объяснена его роль как в натквных процессах регуляции протеолиза, так и в ряде искусственных проявлений последнего. По месту расположения эффекторяый участок сериновых протеиназ идентичен 5о'-позиции модели Шехтера-Бергера. Лигандная специфичность эффекторного участка подобна "гидрофобному урману" химотрипсин--трипсинподобных протеиназ, то есть наблюдается ярко выраженное сродство к аминокислотам гидрофобной и - реже - положительно заряженной природы. По силе связывания адекватных лигандов зффекторный участок значительна уступает "гидрофобному карману" фермента, что особенно ярко проявляется в случае а-химотрипсина.

7. Помещение подходящего по специфичности лиганда в зффектор-нын участок приводит к усилению как связывающих, так и каталитических свойств фермента (За'-стимуляции), причем активация происходит на всех трех стадиях процесса - нековалентном связывании с субстратом, образовании ацил- зкзима к гктгролк эе последнего.

8. 52*-стимуляция играет ключевую роль в по крайней мере трех видах физиологически важных регуляторных процессов - при ограничении протеолиза за счет образования фермент-серпиновых комплексов, при обеспечении активзционных расщеплений в белках-предшественниках и в обеспечении срабатывания "ловушечного" механизма й^-мак-роглобулина.

9. Основным отличием белковых ингибиторов сериновых протеинаэ от остальных белков, предопределявшим образование стабильных фермент- серпиновых комплексов, является консервативная структурз реактивного центра, содержащего расположенные в оптимальной кон-формации соответствующие по специфичности связывающему и эффектор-ному участкам фермента аминокислотные остатки.

10. Показано, что многочисленные случаи эффекторного воздействия на каталитические и связывающие свойства серинозых протеиназ

- субстратная активация при гидролизе низкомолекулярных субстратов, промотировакке гидрофобными соединениями гидролиза ацил-фер-ментных комплексов, гидрофобная хроматография сериновых протеиназ

- являются проявлением -стимуляции в искуственкых нефизиологических условиях.

11. Показано, что превращение аффинных лигандов в гидрофобные определяется возможностью захвата двух молекул иммобилизованного лигандз как связывающим участком фермента, гак и его зффекторным участком. В случае аффинной сорбции сериновых протеиназ на сорбентах с низкомолекулярными лигандами роль спейсера состоит не столько в обеспечении стерическсй доступности лкганда, сколько в увеличении вероятности реализации '-стимулированного состояния сорбировавшегося фермента.

12. Предложен новый, не имеющий аналогов, способ исследования участков межбелковых взаимодействий методом фермент-фккоированного зонда, основанный на обеспечении высокой вероятности помещения требуемой структуры в слабосвязыващий участок за счет создания высокой локальной концентрации лигакда гарантированным захватом части молекулы последнего сильносвязыващим участком фермента.

13. На основании полученных данных и результатов анализа пер-вичкых последовательностей многочисленных физиологически предопределенных расщеплений выдвинуто положение о единой для сериновых протеиназ структуре участка функционального расщепления, состоящего из экспонированных на поверхности белка-цели и расположенных з оптимальной конформации адекватных по специфичности аминокислотных остатков и Ра*.

14. Выяснены принципы разрзбоки аффинных сорбентов с требуемой видовой селективностью и предложена новая группа лигандов для аф-финно-хроматографическаго выделения трипсин- и химотрипсин-подобных протеиназ.

- 38 -

СПИСОК ОСНЭВНИХ POSIT, ОПУЕЛ1КОЕДНЙХ. 110 TEMI ДИСЕРТАЦИ

1. Гриненко Т.В., Третьяченко В.Г., Веревка C.B. Влияние амино-капроновой кислоты и аргинина на взаимодействие плазминогена с фибрином и его фрагментами // IV Всесоюзный симпозиум "Инженерная энзшология", Киев, 1983, С. 85.

2. Веревка C.B., Кудинов С.А., Гриненко Т.В. Аргинил-связывающие участки длззминогена человека //ДАН УССР. -1985.- N1.-С. 56-59.

3. Кудинов С.А., Веревка C.B., Гриненко Т.В. Лигандная специфичность участков белок-белкового взаимодействия молекулы плазминогена человека / Стрептокиназа в регуляции свертывающей и противосвертывающей систем крови (сборник научны}: работ), Минск, 19S5, С.116-121.

4. Кудинов С.А..Колодзейскзя М.В.,Веревка C.B. ,Носкова Н.Ю.,3п-штейн Л.М., Акулкн В.Н. Способ получения трипсина /А.с.1370840 СССР, МКК4С12 НЭ/76.

5. Колодзейскзя М.В.,Кудинов С.А., Веревка С.Е., Носкова Н.Ю., Зпштеик Л.М., Акулик В.Н. Способ очистки протеолитического комплекса / A.c.1381986 СССР, МКК4А61К 37/48,37/54.

6. Verevka S.V., Kudínov S.A., Srinenko T.V, Arginyl-binding sites of human plasminogen // Thrombosis Research.- 1986.- 41, N 5. - P.689-698.

7. Веревка C.B. Изучение лигандяой специфичности лизил- и арги-нил-связывающих участков плазминогека человека // Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. - Киев, 1986.

8. Колодзекская М.В., Веревка C.B. Гидрофобные взаимодействия й-химотркпсина с низкомолекулярнымк соединениями //Укр.биохим. журн. - 1990. - 62, N 5. - С.3-14.

9. Колодзейскзя W.B., Веревка C.B. Сравнительное исследование свойств сериновых протеиназ низших и высших позвоночных // Там же - 1990.- 52, К 6. - С.31-37.

10. Колодзейскзя М.В., Веревка C.B., Безпалько JÍ.A. Взаимодействие сериновых протеиназ с низкомолекулярными соединениями // Всесоюзная конференция "Методы получения, анализа и применения ферментов", Юрмала, 10-14 декабря 1990 г., С.90.

11. Веревка C.B., Кудинов С.А., Колодзейскзя М.В. Способ ингибиро-вания сериновых протеиназ в белковой смеси / А.с.1760762 СССР, МКЙ^г N 9/00,11/06.

12. Веревка C.B., Безпалько И.А., Колодзейская М.В. Аффинно-хрома-

тографкческое исследование селективности субстрат-связывающих участков протеиназ мульткферментного комплекса из пилорических придатков лососевых рыб // Всесоюзное совещание "Биологически активные вещества гидробконтов - новые лекарственно-профшгак-тические и технические препараты", Владивосток, 23-27 сентября 1991 г., С.12-13.

13. Веревка С.в., Шулежко Л.А., Колодзейская М.В. Гидрофобные взаимодействия сериновых протеиназ с низкомолекулярными соединениями: роль Sg*-участка в субстратной активации и во взаимодействии с серпиками //Укр.биохим.журн.-1991.-63,Н5. С.45-51.

14. Верьовка С.В., Шулежко Л.А., Колодзейська М.В. Субстратна активацхя як зияв дП нативного «ехан!гму обмеження протеол!зу // VI УкраЗнсъкий б!ох1м1чний з'Зэд, КиЗв, 1992, чЛ, С. 112.

15. Веревка' С.В., Колодзейская М.В. Гидрофобные взаимодействия сериноЕых протеиназ с кизкомолекуляряыми соединениями: частичное вытеснение субстратом зффектора из активированного фермента //' Укр. бИОХШ.журн. -1932. - 64, К 5.- С. 100-103.

16. Веревка С.В.,Сытник А.И. .Колодзейская М.В. О роли 5г*-стимуляции сериновых протеиназ в регуляции протеолиаа //Там же.-1994.

- 66, N 6. - C.32-3S.

17. Веревка С.В. О структурном подобии участков активационных расщеплений белков-предшественников реактивным центрам серпиков // Там же. - 1995. - 67, N 5. - С. 24-28.

18. Веревка С.В. Кинетические особенности Sa'-стимуляции ос-хима-трипсша // Там же. - 1998. - 67, N 3. - С.36-41.

19. Kolodseyska M.V, Verevka 5.V. On the role of effectory site in serine proteinases hydrophobic chromatography //Ibid.- 1996.

- 67, N 6. - C.87-93.

20. Verevka S.V. On effectory character of recognition by serine proteinases of functionally significant splittings // 2-nd Conference on Molecular Recognition (Pecs, Hungary, 1996).

21. ВереЕка С,В., Колодзейская М.В. О функциональной роли зффек-торного участка сериновых протеиназ // 3-я конференция биохимиков Узбекистана, Ташкент, 11-13 ноября 1996.

Verevka S.Y. Estimation of ligand specificity, localisation and functional role of noncatalvtio intermolscalar interacting1 sites of serine proteinases. (Manuscript).

Dissertation for the obtaining1 of the scientific degree of the . Doctor of Science specialized in 03.00.04 - Biochemistry. A.V.Palladin Institute of Biochemistry of National Academy of Science of Ukraine, Kyiv^lSSS.

There are defended 18 scientific labors and 3 national patents which include theoretical decision oi noncatalytic sites of serine proteinases. Localisation and iunctions! role oi serine proteinases eit eotory site are deterrniried. The latter corresponds to S2'--site oi the active center and is incluQed in supply oi high-spe-oificity interactions with functionally predetermined bounds -- serplne reactive sites and protein preform activating1 splitting's. Ligand specificity and localisation on structural subdo-iri3ins of plasminogen binding- sites are estimated. The regnlatory role of arginyl-binding- site on fibrinolysis is supposed.

Key words: serine proteinases, effectory regulation, plasminogen, fibrinolysis. Веревка С.В. Исследование лигакдной специфичности, локализации и функциональной роли некаталитических участков мекмолекулярного взаимодействия сериновьк протекказ. (Рукопись).

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.04 - Биохимия. Институт биохимии им.А.В.Паллздина НАК Украины, Киев, 19Э8. Защищается 18 научных работ и 3 авторских свидетельства, содержащие теоретическое исследование лигакдной специфичности, локализации и функциональной роли некаталитических участков межмолэкуляр-кого взаимодеистзкя сороковых протеиназ. Определены локализация и функциональная роль зффекгоркого участка Сериковых протеиназ, соответствующего SS*-положению активного центра и вадействованого в обеспечении высокоспецифических взаимодействий с функционально предопределенными связями - реактивными центрами серпинов и участками активационных расщеплений белковых проформ. Установлены лигаядная специфичность и локализация по структурным субдоменам связывающих участков плазминогека. Предполагается рег-уляторная роль аргинил-связывающих участков в процессе фибринолиза.

Ключов1 слова: серинов! проте1кази, ефекторна регулящя, плаз-

MiHOrSH, ф1брИН0Л13.

t